BRPI0308630B1

BRPI0308630B1 - Candida utilis transgênica, comida ou bebida, extrato de levedura, e, processo para produzir alimento contendo y-glutamilcisteína ou cisteína

Info

Publication number: BRPI0308630B1
Authority: BR
Inventors: Hiroaki Nishiuchi; Yasushi Nishimura; Motonaka Kuroda
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2002-03-26
Filing date: 2003-03-26
Publication date: 2015-05-12
Also published as: PE20031013A1; ATE528407T1; JPWO2003080832A1; JP4453781B2; EP2213734A1; EP1489173A1; EP2213734B1; US20050042328A1; BR0308630A; MY142328A; ATE532864T1; US7553638B2; CN1774505B; JP2009060920A; JP4561099B2; EP1489173B1; CN1774505A; WO2003080832A1; EP1489173A4

Description

“CANDIDA UTILIS TRANSGÊNICA, COMIDA OU BEBIDA, EXTRATO DE LEVEDURA, E, PROCESSO PARA PRODUZIR ALIMENTO CONTENDO γ-GLUTAMILCISTEÍNA OU CISTEÍNA” Campo...técnico A presente invenção refere-se a Candida uiiíis que produz γ-glutamilcisteína e a alimento que utiliza a mesma. Gama-glutamilcisteína e cisteína produzidas do mesmo são úteis no campo dos alimentos.

Arte anterior Cisteína é usada com a finalidade de melhorar aroma, sabor, etc. de alimentos. Embora um método de proteólise, um método de semi-síntese e assim por diante sejam conhecidos como métodos para produzir cisteína, presentemente utiliza-se predominantemente o método de proteólise e o método de semi-síntese. Visando utilizar cisteína para melhoramento do aroma e do sabor do alimento, requer-se material nutricional natural apresentando um elevado teor de cisteína. No entanto, quase nenhum material nutricional natural do tipo referido é conhecido até hoje. Enquanto isso, reportou-se que é possível obter um material nutricional que apresenta um alto teor de cisteína quando se aquece ou trata com uma enzima extrato de levedura contendo γ-glutamilcisteína (WO00/30474).

Em Saccharomyces cerevisiae, γ-glutamilcisteína é sintetizada pela ação de γ-glutamilcisteína sintetase utilizando-se cisteína e ácido glutâmico como substratos. Adicionalmente, glutationa é sintetizada pela ação de glutationa sintetase utilizando-se γ-glutamilcisteína e glicina como substratos. Leveduras apresentando um alio teor de γ-glutamilcisteína foram reportadas cm WG0G/30474; Otake et al., Agri. Biol. Cbem., 54 (12): 3145-3150 (1990); Chris et al., Molecular Biology of the Cell, 8, 1699-1707 (1997); Inoue et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1395, 315-320 (1998) etc. No entanto, todos estes relatos referem-se a investigações utilizando Saccharomyces cerevisíae, e não houve qualquer tipo de relato acerca de investigações utilizando Candida utilis.

Candida utilis já foi classificado como incluído no gênero Pichia ou Hansenula, mas é classificado correntemente no gênero Candida. Este gênero Candida é um de 15 gêneros de leveduras imperfeitas, que não realizam reprodução sexual ou que não se verificou realizarem reprodução sexual, e é apenas um gênero de coleta considerando-se as sistemáticas filogenéticas ("Kobo Kenkyu Giho No Shintenkai", pp. 124-125 (ISBN: 4-7622-4670-0)). Leveduras do gênero Candida freqüentemente apresentam características distintas em comparação com Saccharomyces cerevisiae. Por exemplo, Candida utilis apresenta características de obter a maior parte de sua energia do ciclo de fosfato de pentose produzindo uma base de piridina (Biotechnology, 3,30 (1983) (ISBN: 3-527-25765-9)), repressão de catabólito fraco (Biotechnology, 3, 30 (1983)) etc. Adicionalmente, como Saccharomyces cerevisiae é comumente utilizada como uma levedura de pesquisa, tem havido poucas descobertas envolvendo Candida utilis. Nessas circunstâncias, não houve relato acerca de como Candida utilis biossintetiza glutationa, e só tem havido relatos de que um Candida utilis específico, obtido mediante a utilização de resistência ao zinco ou análogo, apresenta uma temperatura à qual ele produz uma grande quantidade de glutationa que é inferior à temperatura normalmente observada em tomo de 5°C ou mais (Publicação de Patente Japonesa (Kokoku) n° 03-18872) etc.

Assim, a relação entre a atividade de glutationa sintetase e o acúmulo de γ-glutamilcisteína em Candida utilis permanece desconhecida, e ainda não está claro se γ-glutamilcisteína pode ser acumulada por meio da redução da atividade de glutationa sintetase.

Descrição da invenção Reportou-se que o desenvolvimento de Candida utilis por unidade de sacarídeo é melhor do que aquele de Saccharomyces cerevisiae (Biotechnology, 3, 30 (1983)). Adicionalmente, como não apresenta subprodução de etanol numa condição estritamente aeróbica (Kondo et al. (J. Bacteriology, dezembro de 1995, pp. 7171-7177)), há menos necessidade de prestar atenção à subprodução de etanol nesta cultura. Portanto, os inventores da presente invenção consideraram que extrato de levedura produzido mediante utilização de Candida utilis apresentando um alto conteúdo de γ-glutamilcisteína podería tomar-se menos caro do que extrato de levedura produzido mediante utilização de Saccharomyces cerevisiae e, portanto, isto seria desejável para produção industrial. A presente invenção foi realizada sob o ponto de vista indicado acima, e um objeto da presente invenção consiste em proporcionar Candida utilis apresentando um alto teor de γ-glutamilcisteína, extrato de levedura produzido com o uso da mesma, alimento contendo γ-glutamilcisteína ou cisterna produzido com a utilização da mesma, e um método para produzir os mesmos.

Os inventores da presente invenção estudaram assiduamente com o objetivo de atingir o objeto acima. Como um resultado, eles conseguiram êxito na produção de γ-glutamilcisteína em Candida utilis mediante a obtenção de um fragmento de gene que, esperava-se, codificaria glutationa sintetase de Candida utilis com base em homologias com aqueles de outros organismos, e na redução de uma atividade de glutationa sintetase mediante a utilização deste fragmento. Adicionalmente, eles tiveram êxito em obter um fragmento de gene que, esperava-se, codificaria γ-glutamilcisteína sintetase de Candida utilis, e, assim, realizaram a presente invenção. A presente invenção proporciona essencialmente o seguinte: (1) Candida utilis que contém 1% em peso ou mais de γ-glutamilcisteína em células secas em fase de crescimento logarítmico quando cultivadas em um meio mínimo. (2) O Candida utilis de acordo com (1), em que o meio mínimo é meio SD. (3) 0 Candida utilis de acordo com (1) ou (2), que mostra atividade de glutationa sintetase de 0,005 μιηοΐ GSH/mg proteína/hora ou inferior. (4) O Candida utilis de acordo com qualquer um de (1) a (3), sendo que um gene que codifica glutationa sintetase é modificado de tal forma a reduzir que a atividade intracelular de glutationa sintetase é reduzida. (5) O Candida utilis de acordo com qualquer um de (1) a (4), que é modificado de tal forma que a quantidade de expressão de um gene que codifica γ-glutamilcisteína sintetase é incrementada. (6) Comida ou bebida compreende cultura obtida pelo cultivo de Candida utilis de acordo com qualquer um de (1) a (5) numa condição apropriada, uma fração da cultura contendo γ-glutamilcisteína, ou a cultura ou a fração em que cisteína é produzida por meio de tratamento com calor. (7) A comida ou bebida de acordo com (6) que é um tempero de alimento fermentado. (8) Extrato de levedura produzido pelo uso de cultura obtida mediante cultivo de Candida utilis de acordo com qualquer um de (1) a (5) em uma condição apropriada. (9) Um método de produzir alimento contendo γ-glutamilcisteína ou cisteína, que compreende cultivar o Candida utilis de acordo com qualquer um de (1) a (5) em uma condição apropriada e misturar a cultura obtida, ou uma fração da mesma, ou a cultura ou a fração da mesma sujeita a um tratamento com calor, com uma matéria-prima de comida ou bebida para produzir comida ou bebida. (10) Um DNA que codifica uma proteína definida nos (A) ou (B) a seguir: (A) uma proteína que apresenta a seqüência de aminoácidos da SEQIDNO: 43;

(B) uma proteína que tem a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 incluindo substituição, deleção, inserção ou adição de um ou de vários aminoácidos, e tem uma atividade de γ-glutamilcisteína. (11) O DNA de acordo com (10) que é um DNA definido no (a) ou (b) a seguir: (a) um DNA que compreende a seqüência de nucleotídeos dos números de nucleotídeos de 110 a 2101 da SEQ ID NO: 42; (b) um DNA que é hibridizável com a seqüência de nucleotídeos compreende a seqüência dos números de nucleotídeos de 110 a 2101 da SEQ ID NO: 42 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeos numa condição estringente, e codifica uma proteína que apresenta uma atividade de γ-glutamilcisteína sintetase.

Breve descrição dos desenhos A Fig. 1 mostra construção (primeira metade) de uma cassete de disrupção de gene de glutationa sintetase para Candida utilis. A Fig. 2 Mostra construção (segunda metade) de uma cassete de disrupção de gene de glutationa sintetase para Candida utilis. A Fig. 3 mostra construção de uma cassete de substituição de gene de γ-glutamilcisteína sintetase para Candida utilis. A Fig. 4 mostra construção de uma cepa substituída de gene de γ-glutamilcisteína sintetase de Candida utilis. A Fig. 5 mostra construção de um vetor de expressão de um homólogo de γ-glutamilcisteína sintetase derivado de Candida utilis.

Melhor modo de realiza- a invenção A presente invenção será explicada a seguir de forma detalhada. <1> Candida utilis da presente invenção Candida utilis da presente invenção contém 1% em peso ou mais, de preferência 1,5% em peso ou mais, mais preferivelmente 2,0% em peso ou mais, de γ-glutamilcisteína em células de levedura seca na fase de crescimento logarítmico quando é cultivada em um meio mínimo.

Como o meio mínimo, pode-se mencionar meio SD apresentando a composição a seguir. [Composição do meio SD] Glucose: 2% Base de nitrogênio: concentração de 1 vez (Base de nitrogênio apresentando uma concentração de 10 vezes é obtida misturando-se 1,7 g de Base de Nitrogênio de Bacto Levedura sem Aminoácidos e Sulfato de Amônio (Difco) e 5 g de sulfato de amônio, dissolvendo-se esta mistura em 100 ml de água esterilizada, ajustando-se a solução em cerca de pH 5,2 e esterilizando-se a solução por meio de filtração). O termo "fase de crescimento logarítmico" refere-se a um período em que o número de células na cultura cresce logaritmicamente relativamente ao tempo de cultura. Embora a cultura possa ser uma cultura agitada ou cultura estacionária, prefere-se cultura agitada. O teor de γ-glutamilcisteína é o conteúdo (%) de γ-glutamilcisteína baseado no peso de células de levedura seca, ou seja, componentes sólidos de células, por exemplo, células após aquecimento a 105°C durante 4 horas. O teor de γ-glutamilcisteína previamente indicado não precisa ser mantido durante toda a fase de crescimento logarítmico, e é suficiente que o valor acima seja mostrado pelo menos em qualquer ponto da fase de crescimento logarítmico, de preferência na fase de crescimento logarítmico mostrando o estado a seguir. Ou seja, o estado previamente indicado é uma fase de crescimento logarítmico em que o caldo de cultura mostra uma absorbância maior do que uma metade da absorbância do caldo de cultura na fase estacionária imediatamente após a fase de crescimento logarítmico. O Candida utilis da presente invenção apresenta, de preferência, uma atividade de glutationa sintetase de 0,005 pmol GSH/mg proteína/hora ou menos, mais preferivelmente 0,001 pmol GSH/mg proteína/hora ou menos ("GSH" representa glutationa). Prefere-se adicionalmente que a atividade de glutationa sintetase deveria ser abaixo do limite de detecção. A atividade de glutationa sintetase pode ser medida por meio do método de Gushima et al (T. Gushima et al, J. Appl. Biochem., 5, 210(1983)). A Candida utilis da presente invenção pode ser obtido modificando-se uma cepa apropriada, por exemplo, uma cepa de tipo selvagem, de Candida utilis, por meio de tratamento de mutagênese ou uma técnica de recombinação de gene (por exemplo, é possível utilizar as técnicas descritas nas publicações a seguir; FEMS Microbiology Letters, 165,335-340 (1998); J. Bacteriology, dezembro de 1995, pp. 7171-7177; Curr. Genet. 10 (8): 573-578 (1986); W098/14600) de forma que a atividade intracelular de glutationa sintetase deveria ser reduzida. A redução da atividade de glutationa sintetase inclui eliminação da atividade de glutationa sintetase. Adicionalmente, Candida utilis contendo γ-glutamilcisteína também pode ser desenvolvido modificando-se uma cepa de tal forma a se poder incrementar atividade de γ-glutamilcisteína sintetase intracelular. A atividade de γ-glutamilcisteína sintetase pode ser medida por meio do método de Jackson (R.C. Jackson, Biochem. J., 111,309 (1969)).

Conforme o tratamento de mutagênese, pode ser mencionado um tratamento por irradiação de raio ultravioleta, ou um tratamento usando um agente de mutagênese usado para tratamento de mutagênese, tal como MNNG, metanossulfonato de etila (EMS) ou metanossulfonato de etila (MMS).

Adicionalmente, como um método para reduzir a atividade de glutationa sintetase através da utilização de uma técnica de recombinação de genes, é possível mencionar um método de modificar um gene que codifica glutationa sintetase de tal forma que deveria ser possível reduzir a atividade de ghitationa sintetase. A seqüência de nucleotídeos de uma parte do gene que codifica glutationa sintetase da cepa de Candida utilis ATCC15239 é mostrada como SEQ Π) NO: 17. Qualquer gene de glutationa sintetase de levedura do gênero Candida ainda não era desconhecida previamente. Os inventores da presente invenção investigaram seqüências de aminoácidos de glutationa sintetase de diversos organismos quanto a uma região altamente conservada e verificaram as regiões das SEQ ID NOS: de 1 a 8. Em seguida, eles amplificaram com êxito um fragmento de gene que se esperava codificar glutationa sintetase de DNA cromossômico de Candida utilis realizando-se PCR utilizando iniciadores correspondentes às seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOS: de 6 a 8 entre as regiões previamente indicadas. Como os iniciadores para obtenção de fragmento de gene, é possível indicar os iniciadores das SEQ ID NOS: 15 e 16. Adicionalmente, embora a cepa de Candida utilis não seja particularmente limitada, por exemplo, é possível indicar, por exemplo, a cepa ATCC 15239. Esta cepa pode ser obtida da American Type Culture Collection (endereço: 10801 University Boulevard. Manassas, VA 20110-2209, Estados Unidos da América).

Quanto ao método de reduzir a atividade de glutationa sintetase por meio de modificação de um gene que codifica glutationa sintetase, por exemplo, é possível indicar um método de modificar uma seqüência reguladora de expressão do gene de tal forma que a expressão de glutationa sintetase deveria ser reduzida, ou de modificar a região codificante de tal forma que glutationa sintetase apresentando uma atividade não deveria ser expressa. Especificamente, por exemplo, o gene no cromossoma pode ser rompido transformando-se Candida utilis com DNA recombinante incluindo um gene de glutationa sintetase mutante de que as pontas 5' e 3' são deletadas, e induzindo-se recombinação entre o gene mutante e o gene de tipo selvagem no cromossoma. Neste método, operações tomam-se mais fáceis se um gene marcador for incluído previamente no DNA recombinante de acordo com uma característica de um hospedeiro, como auxotrofia. Adicionalmente, se o DNA recombinante for linearizado previamente por meio de digestão com uma enzima de restrição ou análogo, é possível obter de forma eficiente uma cepa em que o DNA recombinante é incorporado no cromossoma.

Adicionalmente, o gene no cromossoma também pode ser rompido mediante a introdução de DNA recombinante incluindo um gene mutante modificado de forma a não produzir glutationa sintetase normalmente funcional através da deleção de uma região interna no gene de glutationa sintetase em Candida utilis e induzindo-se recombinação entre o gene mutante e o gene normal no cromossoma.

Na cepa em que o DNA recombinante é incorporado no cromossoma como descrito acima, recombinação é causada com uma seqüência de gene de glutationa sintetase que existe originalmente no cromossoma, e, assim, dois de genes de fusão do gene de glutationa sintetase de tipo selvagem e o gene de glutationa sintetase mutante são inseridos no cromossoma de forma a embutir em forma de um "sanduíche" as outras porções do DNA recombinante (porção de vetor e gene marcador). Portanto, o gene de glutationa sintetase de tipo selvagem funciona neste estado.

Subseqüentemente, visando deixar apenas o gene de glutationa sintetase mutante no DNA cromossômico, uma cópia do gene de glutationa sintetase é eliminada do DNA cromossômico juntamente com a porção de vetor (que inclui o gene marcador) por meio de recombinação de dois dos genes de glutationa sintetase. Após esta etapa, o gene de tipo selvagem de glutationa sintetase é deixado no DNA cromossômico, e o gene mutante de glutationa sintetase é excisado ou, inversamente, o gene mutante de glutationa sintetase é deixada no DNA cromossômico, e o gene de tipo selvagem de glutationa sintetase é excisado. Como o gene marcador é eliminado em qualquer caso, é possível ocorrer ocorrência da segunda recombinação com base no fenótipo correspondente ao gene marcador. Adicionalmente, é possível selecionar uma cepa substituída por gene-alvo mediante amplificação do gene de glutationa sintetase por meio de PCR e examinando-se sua estrutura.

Como o gene de glutationa sintetase ou um fragmento do mesmo usado para a disrupção de gene, adicionalmente a DNA apresentando a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 17, pode-se mencionar DNA hibridizável com esta seqüência de nucleotídeos em uma condição estringente e DNA apresentando homologia de 90% ou mais, de preferência 95% ou mais, mais preferivelmente 99% ou mais, com a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 17. A condição estringente é exemplificada através de uma condição em que DNAs são hibridizados mutuamente numa concentração de sal correspondente a uma condição ordinária de lavagem em hibridização, i.e., 1 x SSC, 0,1% de SDS, de preferência 0,1 x SSC, 0,1% de SDS, a 60°C. A disrupção do gene de glutationa sintetase de Saccharomyces cerevisiae é divulgada no WO00/30474. Exemplos do método para introduzir o DNA recombinante em Candida utilis incluem o método de eletroporação (Luis et al., FEMS Microbiology Letters, 165,335-340 (1998)). A cepa em que atividade de glutationa sintase é reduzida pode ser selecionada utilizando-se a suscetibilidade ao metilglioxal como índice (Y. Ohtake et al., Agri. Biol. Chem., 54 (12) 3145-3150 (1990)). Uma cepa que pode biossintetizar uma determinada quantidade de glutationa (uma cepa apresentando a atividade de glutationa sintetase e atividade de γ-GC sintetase) apresenta resistência ao metilglioxal. Adicionalmente, a redução da atividade de glutationa sintetase também pode ser confirmada através de exame do crescimento em um meio que não contém glutationa. Adicionalmente, uma cepa apresentando atividade reduzida de glutationa sintetase pode ser obtida eficientemente mediante utilização de uma placa de gradiente de concentração de MNNG (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina).

Redução da atividade de glutationa sintetase pode ser confirmada como no exemplo a seguir. Colocou-se um filtro no centro de uma placa de ágar YPD, e a quantidade total de uma solução de 1 mg de MNNG dissolvido em 30 μΐ de DMSO foi infiltrada no filtro para se preparar um meio de ágar de gradiente de concentração de MNNG, em que a concentração de MNNG toma-se menor numa posição mais distante do ponto central. Uma cepa de Nal haplóide e cepa Na3 de Saccharomyces cerevisiae cultivada no meio YPD foram espalhadas no meio de ágar indicado acima. Após [deixar] a cultura a 30°C [ilegível] durante 70 horas, mediu-se as distâncias do centro do meio de ágar até uma posição em que as leveduras formaram uma colônia. Como um resultado, a distância para a cepa Nal foi de 2,3 cm, e aquela para a cepa Na3 foi de 1,8 cm. A cepa Na3 é uma cepa obtida modificando-se a cepa Nal como uma cepa parental de tal forma que a seqüência de, e após, o 370° radical arginina da glutationa sintetase deveria ser deletada. Portanto, a cepa Na3 é caracterizada por apresentar glutationa sintetase atenuada e por conter apenas traços de glutationa. O Candida utilis da presente invenção pode apresentar uma atividade incrementada de γ-glutamilcisteína adicionalmente à atividade reduzida de glutationa sintetase. A atividade de γ-glutamilcisteína sintetase pode ser incrementada através da introdução do gene de γ-glutamilcisteína sintetase em Candida utilis numa forma que pode ser expressa. Exemplos do gene de γ-glutamilcisteína sintetase incluem, por exemplo, o gene derivado de Saccharomyces cerevisiae e o gene derivado de Candida utilis, que serão descritos mais tarde.

Exemplos do método de introduzir o gene de γ-glutamilcisteína sintetase em Candida utilis, por exemplo, um método de transformar Candida utilis com DNA recombinante incluem este gene e uma seqüência de DNA existente no cromossoma de Candida utilis para incorporar o DNA recombinante no cromossoma (K. Kondo et al., J. Bacteriol., 177, 7171-7177 (1995)). Especificamente, a introdução pode ser realizada da mesma maneira que a substituição de gene previamente indicada.

Adicionalmente, também é possível introduzir um gene-alvo em Candida utitís através do emprego de um plasmídeo incluindo uma seqüência replicável autonomamente (ARS: autonomously replicable i sequence) existente no DNA cromossômico. A ARS de Candida utilis e a transformação utilizando a mesma encontram-se descritas no Pedido de Patente Internacional W095/32289.

Como o método de transformação de Candida utilis, empregam-se métodos usuais para transformação de levedura, como o método ) do proteoplasto, método KU (H. Ito et al., J. Bateriol., 153-163 (1983)), método KUR (Hakko para Kogyo (Fermentation and Industry), 43, 630-637 (1985)) e pode-se utilizar método de eletroporação. Adicionalmente, operações de esporulação de levedura, isolamento de levedura haplóide etc. encontram-se descritas em “Chemistry and Biology, Experiment Line vol. 31 ! Experimental Techniques for Yeast”, primeira edição, Yodosha etc.

Adicionalmente, pode-se mencionar exemplos do método para incrementar a atividade de γ-glutamilcisteína sintetase em uma célula de Candida utilis incluem um método de substituir um promotor do gene de γ-glutamilcisteína sintetase no cromossoma com um promotor de transcrição l forte (Y. Ohtake et al., Bioscience and Industry, 50 (10) 989-994 (1992)). <2> Gene de Gama-glutamilcisteína sintetase de Candida utilis O DNA da presente invenção é um DNA que codifica uma proteína definida a seguir em (A) ou (B): (A) uma proteína que apresenta a seqüência de aminoácidos da SEQIDNO: 43; (B) uma proteína que apresenta uma seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 43 incluindo substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos, e que apresenta uma atividade de γ-glutamilcisteína sintetase. 0 termo "atividade de γ-glutamilcisteína sintetase" refere-se a uma atividade de catalisar uma reação para produzir γ-glutamilcisteína de cisteína e ácido glutâmico. A γ-glutamilcisteína sintetase codificada pelo DNA da presente invenção pode incluir substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos em um ou mais sítios numa sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 desde que sua atividade enzimática previamente indicada não seja degradada. Embora o número de "vários" aminoácidos aqui referidos seja diferente dependendo da posição ou do tipo de radicais de aminoácidos em uma estrutura tridimensional da proteína, ele pode ser especificamente de 2 a 15, de preferência de 2 a 8, mais preferivelmente de 2 a 5.

Um DNA codificando uma proteína substancialmente idêntica à γ-glutamilcisteína sintetase previamente indicada pode ser obtido modificando-se a seqüência de nucleotídeos, por exemplo, por meio de mutagênese direcionada-para-sítio, de forma que radicais de aminoácidos em um sítio especifico deveríam incluir substituição, deleção, inserção, adição ou inversão. Adicionalmente, um tal DNA modificado como descrito acima também pode ser obtido por meio de um tratamento conhecido de mutagênese. Exemplos do tratamento de mutagênese incluem um método de tratar um DNA que codifica γ-glutamilcisteína sintetase in vitro com hidroxilamina ou análogo, e um método de tratar um microorganismo contendo um DNA que codifica γ-glutamilcisteína sintetase, por exemplo, uma bactéria do gênero Escherichia, com irradiação de raios ultravioletas ou [com] um agente de mutagênese usado na mutagênese usual, como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NG) ou EMS.

Adicionalmente, as operações previamente indicadas de substituição, deleção, inserção, adição, inversão ou análogos de radicais de aminoácidos incluem uma mutação (mutação ou variação) que ocorre naturalmente, por exemplo, uma mutação atribuível a uma diferença em cepas de Candida utilis contendo γ-glutamilcisteína sintetase. O DNA que codifica uma proteína substancialmente idêntica à γ-glutamilcisteína sintetase pode ser obtido mediante expressão de um DNA apresentando uma mutação do tipo referido acima em uma célula adequada de Saccharomyces cerevisiae ou análogo, e examinando-se a atividade de γ-glutamilcisteína sintetase na célula. Adicionalmente, o DNA que codifica uma proteína substancialmente idêntica à γ-glutamilcisteína sintetase também pode ser obtido, por exemplo, por meio de isolamento de um DNA que é hibridizável com uma sonda apresentando a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 42 ou uma parte da mesmo em uma condição estringente e codificando uma proteína apresentando uma atividade de γ-glutamilcisteína sintetase de um DNA que codifica γ-glutamilcisteína sintetase que apresenta uma mutação ou uma célula contendo o mesmo. A "condição estringente" aqui referida é uma condição em que se forma um assim-chamado híbrido específico, e em que não se forma um híbrido não-específíco. É difícil expressar claramente esta condição através do uso de qualquer valor numérico. No entanto, por exemplo, a condição estringente inclui uma condição em que DNAs apresentando elevada homologia, por exemplo, DNAs apresentando homologia de 75% ou mais, de preferência de 85% ou mais, mais preferivelmente de 95% ou mais, são hibridizados mutuamente, porém DNAs apresentando homologia inferior àquela acima não são hibridizados mutuamente. Mais especificamente, a condição estringente é exemplificada por uma condição em que DNAs são hibridizados mutuamente numa concentração salina correspondente a uma condição ordinária de lavagem em hibridização Southern, i.e., 1 x SSC, 0,1% de SDS, de preferência 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS, a 60°C.

Como a sonda, também é possível utilizar uma parte da seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 42. Uma sonda do tipo referido pode ser preparada por meio de PCR utilizando-se oligonucleotídeos preparados por meio de PCR utilizando-se oligonucleotídeos preparados com base na seqüência de nucleotídeos da SEQID NO: 42 como iniciadores e um fragmento de DNA incluindo a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 42 como um padrão. Quando se utiliza um fragmento de DNA apresentando um comprimento de cerca de 300 bp como a sonda, uma condição de lavagem em hibridização pode consistir, por exemplo, de 2 x SSC, 0,1% de SDS, a 50°C.

Os genes hibridizados na condição previamente indicada incluem aqueles em que um códon de parada é gerado, ou aqueles com deficiência na atividade devido à mutação. No entanto, estes podem ser selecionados examinando-se a atividade enzimática do produto de expressão. O DNA apresentando a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 42 foi confirmada para codificar γ-glutamilcisteína sintetase, porque a síntese de glutationa foi acelerada por meio de sua introdução em Saccharomyces cerevisiae apresentando γ-glutamilcisteína sintetase atenuada como mostrado nos exemplos descritos mais tarde.

Como um resultado da pesquisa de homologia de uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 em um banco de dados, mostrou-se homologias de 50,93% e 42,88% com as seqüências de aminoácidos de γ-glutationa sintetases de Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe, respectivamente. <3> Extrato de levedura e comida ou bebida da presente invenção e método para produzir os mesmos A cultura obtida por meio do cultivo da levedura produzindo-se γ-glutamilcisteína obtida como descrito acima contém γ-glutationa sintetase. A cultura pode ser um caldo de cultura contendo células de levedura, ou células de levedura, células rompidas ou extrato de células (extrato de levedura) obtido da cultura. Altemativamente, uma fração contendo γ-glutamilcisteína pode ser obtida de células rompidas ou de extrato de levedura.

Como a γ-glutamilcisteína é decomposta em cisteína e ácido pirrolidona carboxílico quando a cultura previamente indicada contendo γ-glutamilcisteína ou uma fração da mesma é aquecida, cisteína pode ser liberada. Especificamente, cisteína pode ser produzida mantendo-se a cultura ou uma fração da mesma na presença de água em uma condição ácida a neutra, especificamente a pH 1 até 7 a de 50 a 120°C durante 3 a 300 horas.

Adicionalmente, cisteína também pode ser produzida ajustando-se a cultura contendo γ-glutamilcisteína ou uma fração da mesma a pH de 3 a 9, adicionando-se uma enzima que decompõe peptídeo de γ-glutamila (γ-glutamiltransferase, γ-glutamilciclotransferase, glutaminase etc.) e deixando-a atuar sobre a γ-glutamilcisteína a de 15 a 70°C durante de 1 a 300 minutos. O meio usado para a cultura não é particularmente limitada desde que a levedura da presente invenção se desenvolva favoravelmente e γ-glutamilcisteína seja produzida eficientemente. Se requerido, adiciona-se nutrientes necessários ao meio dependendo das características da levedura.

As condições de cultura, a preparação do extrato de levedura e análogos podem ser realizados da mesma maneira que aqueles em cultura usual de levedura ou preparação usual de extrato de levedura. O extrato de levedura pode ser extraído de células de levedura com água quente ou obtido por meio de digestão de células de levedura. Adicionalmente, o extrato de levedura da presente invenção pode ser usado após tratamento com calor ou tratamento enzimático, ou pode ser submetido a tratamento com calor quando for processado, ou após ter sido processado a comida ou bebida com outras matérias-primas do comida ou bebida.

Especificamente, o tratamento com calor do extrato de levedura pode ser realizado como a seguir. Adiciona-se água ao pó de extrato de levedura, e a mistura é ajustada a pH 5 com ácido clorídrico para preparar uma solução aquosa a uma concentração de 2%. Em seguida, esta solução é aquecida a 98°C durante 180 minutos. A cultura contendo γ-glutamilcisteína ou cisteína ou uma fração desta pode ser usada para produção de comida ou bebida. Pode-se mencionar exemplos do comida ou bebida incluem bebidas alcoólicas, pães, e temperos de comida fermentada. A produção de cisteína de γ-glutamilcisteína por meio de um tratamento com calor pode ser realizada durante ou após a produção da comida ou bebida. Adicionalmente, antes da produção da comida ou bebida, a cultura de levedura ou uma fração da mesma pode ser submetida a um tratamento com calor. A comida ou bebida previamente indicada é produzida misturando-se uma cultura contendo γ-glutamilcisteína ou cisteína ou uma fração disto com matérias-primas da comida ou bebida e processando-se a mistura à comida ou bebida. A comida ou bebida da presente invenção pode ser produzida com o uso das mesmas matérias-primas que aquelas de comida ou bebida usual por meio de um método semelhante, exceto quanto ao uso da cultura previamente indicada acima ou da fração. Exemplos de matérias-primas do tipo referido incluem arroz, cevada, amido de milho etc., para bebidas alcoólicas, farinha de trigo, açúcar, sal, manteiga, levedura para fermentação etc., para pães, e soja, trigo, etc. para temperos de comida fermentada. Adicionalmente, extrato de levedura ou seu concentrado, ou produtos secos destes, podem ser usados tal qual como um tempero de comida fermentada.

Exemplos A presente invenção será explicada mais especificamente com referência aos exemplos a seguir.

Exemplo 1: Construção de Candida utilis produzindo y-glutamilcisteína <1> Aquisição de fragmento de gene que se espera codificar para glutationa sintetase de Candida utilis A cepa de Candida utilis ATCC15239 foi cultivada a 30°C com agitação em um meio de tubo de teste YPD, e cromossoma foi recuperado das células utilizando-se Dr. GenTLE para Levedura (Takara Shuzo, código 9084). [Composição de meio YPD] Glucose 2% Peptona 2% Extrato de levedura 1% (pH 5,0) As seqüências a seguir e que apresentam elevada homologia foram selecionadas a partir de seqüências de aminoácidos de glutationa sintetases de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe e rato (para estas, Chris et al, Molecular Biology of the Cell., 8,1699-1707 (1997)). (i) QEVAWYYR (SEQID NO: 1) (ii) GSKKIQQ (SEQ ID NO: 2) (iii) VLKPQREGGGNN (SEQ ID NO: 3) (iv) ISELGIYG (SEQ ID NO: 4) (v) GGVAAGF (SEQ ID NO: 5) Projetaram-se iniciadores degenerados com base nestas seqüências de aminoácidos seqüências de aminoácidos, e realizou-se PCR degenerada com o uso de iniciadores degenerados correspondentes a cada par de (i) e (ii), (i) e (iii), (i) e (iv), (i) e (v), (ii) e (iii), (ii) e (iv), (ii) e (v), (iii) e (iv), (iii) e (v), e (iv) e (v). Cada produto de PCR foi submetido a eletroforese de gel de agarose, e uma região para o tamanho esperado foi excisada para recuperar DNA. Adicionalmente, embora PCR embutida fosse realizada utilizando-se este DNA recuperado como um modelo, não foi possível obter um ffagmento-alvo.

Subseqüentemente, projetaram-se iniciadores correspondentes às seqüências de aminoácidos a seguir, com referência à freqüência de códons usados em Condida utilis. (vi) GSKKIQQ (SEQID NO: 6 (vii) EGGGNN (SEQ ID NO: 7) (viii) PQREGGG (SEQ ID NO: 8) PCR foi realizada utilizando-se um iniciador correspondente à seqüência de aminoácidos de (vi) acima (GGT TCY AAG AAG ATY CAR CA, SEQ ID NO; 9) e um iniciador correspondente à seqüência de aminoácidos de (vii) acima (CCA CCA CCY TCT CTY TGT GG, SEQ ID NO: 10). PCR foi realizada empregando-se KOD Dash (TOYOBO, Código LDP-101) de acordo com a instrução do fabricante, com as condições de uma reação a 94°C durante 2 minutos, seguida de reações a 94°C durante 1 minuto, 55°C (diminuindo-se a temperatura em 0,5°C a cada ciclo) durante 1 minuto, e 74°C durante 40 segundos repetidos durante 22 ciclos, e reações a 94°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto, e 74°C durante 40 segundos repetidos durante 15 ciclos. O produto de PCR foi submetido a eletroforese em gel de agarose (Nusieve 3:1 agarose 3%, 1 x solução de TAE (Takara Shuzo, código F5180A)). O gel foi manchado com o uso de uma solução de brometo de etídio, depois excisou-se uma região correspondente a de 100 a 300 bp, e DNA foi recuperado do gel com o uso de MagExtractor (TOYOBO, código NPK-601).

Quando se realizou PCR embutida com o uso deste DNA como um padrão, um iniciador correspondente à região de (vi) (SEQ ID NO: 9) e um iniciador projetado de forma a corresponder à região de (viii) (GTT GTT ACC ACC ACC YTC, SEQ ID NO 11), detectou-se três bandas na região correspondente a de 100 a 300 bp. PCR foi realizada na mesma condição como descrito acima. Cada uma destas três bandas foi excisada, e DNA foi recuperado do gel. DNA de cada banda foi ligado a um vetor pGEM-T Easy (Promega) com o uso de um kit de ligação de DNA Ver. 2 (TaKara Shuzo) e usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo, código 9052). Entre os transformantes obtidos, um dos transformantes foi obtido como um transformante que se esperava conter um fragmento de gene que se esperava codificar glutationa sintetase de Candida utilis. A seqüência de nucleotídeos do inserto incluído no transformante foi determinada de uma maneira convencional.

Amplificação rápida a 3' de pontas de cDNA (RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends) foi realizada com base na seqüência de nucleotídeos determinada como descrito acima com o uso do sistema 3'-RACE para amplificação rápida de pontas de cDNA (Gibco BRL, número de catálogo 18373-027). Preparou-se uma cepa primária de cDNA a partir de mRNA preparado de Candida utilis com o emprego do Rneasy Mini Kit (QIAGEN, número de catálogo 74104), e realizou-se PCR três vezes. Os iniciadores usados são mostrados abaixo.

Primeira PCR: AAG ATA TAC CCA TTG GAT GG (SEQID NO: 12) e iniciador AUAP ligado ao kit 3' RACE

Segunda PCR: TCA GAT CTT GGT AAA GAG GC (SEQ ID NO: 13) e iniciador AUAP ligado ao kit 3' RACE

Terceira PCR: AGA CTG GCA TTT GAG TCT CC (SEQ ID NO: 14) e iniciador AUAP ligado ao kit 3' RACE PCR foi realizada utilizando-se KOD Dash (TOYOBO, código LDP-101) de acordo com a instrução do fabricante com as condições de uma reação a 94°C durante 2 minutos, seguida de reações a 94°C durante 1 minuto, 50°C durante 30 segundos e 74°C durante 40 segundos repetidas durante 30 ciclos. O produto de PCR foi ligado ao vetor pGEM-T Easy e usado para transformar Escherichia coli. A seqüência de nucleotídeos do inserto incluído no transformante obtido foi analisada para se obter informação de um fragmento de gene que se esperava codificar glutationa sintetase de Candida utilis.

Iniciadores (GGT TCT AAG AAG ATT CAG CA, SEQ ID NO: 15) e CCC TCG GAA AAG GAG ACG AAG G, SEQ ID NO: 16) foram projetados com base na informação encontrada com as operações acima, PCR foi realizada empregando-se DNA cromossômico recuperado da cepa de Condida utilis ATCC15239 como um padrão, e determinou-se a seqüência de nucleotídeos do produto de amplificação. Realizou-se PCR com o emprego de Pyrobest (Takara Shuzo, código R0005A) de acordo com a instrução do fabricante com as condições de uma reação a 98°C durante 2 minutos, seguida de reações a 98°C durante 20 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos repetidas durante 40 ciclos. O resultado é mostrado na SEQ ID NO: 17. A seqüência de aminoácidos de glutationa sintetase que se esperava estivesse codificada por esta seqüência de nucleotídeos é mostrada na SEQ ID NO: 18. <2> Produção de cassete de disrupcão de gene nara glutationa sintetase de Candida utilis Realizou-se PCR utilizando-se DNA cromossômico recuperado de Candida utilis ATCC15239 como um padrão e os iniciadores previamente indicados das SEQ ID NOS: 15 e 16. Realizou-se PCR com o emprego de Pyrobest (Takara Shuzo) de acordo com a instrução do fabricante com as condições de uma reação a 98 °C durante 2 minutos, seguida de reações a 98°C durante 20 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos repetidas durante 40 ciclos. O produto de amplificação foi purificado empregando-se kit de purificação de PCR QIA Quick (QIAGEN, número de catálogo 28106), e o produto de purificação foi adicionado com adenina nas pontas e ligado ao vetor pGEM-T Easy. A adição de adenina foi realizada empregando-se AmpliTag (ABI, código N808-0161) e 2,5 mM de dATP em lugar de dNTP por meio de uma reação a 72°C durante 10 minutos. Subseqüentemente, seqüências de nucleotídeos em dois sítios no fragmento clonado foram substituídas por meio de recombinação direcionada-para-sítio empregando-se kit QuikChange de mutagênese direcionada-para-sítio (STRATAGENE, número de catálogo 200518) para introduzir sítios de digestão HindIII e Kpnl e, com isto, obter um vetor CGSH2Ctermi/pGEMT-Easy. Os iniciadores usados para a recombinação direcionada-para-sítio são mostrados abaixo. rPrimeira introdução de mutação (introdução de sítio de dieestão HindIII)! GAA GCC TCA GCA TGA AGC TTG TGG TAA TAA CAT TTA C (SEQ IDNO: 19) G TAA ATG TTA TTA CCA CAA GCT TCA TGC TGA GGC TTC (SEQ IDNO: 20) fSegunda introdução de mutação (introdução de sítio de digestão KnnDl CGA CCA ATC GAC TGG TAC CGT TAT CAA AAA CTC TG (SEQ ID NO: 21) CA GAG TTT TTG ATA ACG GTA CCA GTC GAT TGG TCG (SEQ ID NO: 22) Adicionalmente, realizou-se PCR empregando-se DNA cromossômico recuperado de Candida utilis ATCC15239 como um padrão e os iniciadores a seguir para amplificar um fragmento incluindo o gene URA3. PCR foi realizada empregando-se KOD Dash (TOYOBO, código LDP-141) de acordo com a instrução do fabricante com as condições de uma reação a 94°C durante 2 minutos, seguida de reações a 94°C durante 1 minuto, 54°C durante 30 segundos e 74°C durante 40 segundos repetidas durante 30 ciclos. CCC AAG CTT CTC TAC TTG CTT CTG CTC AAC (SEQ ID NO: 23) GCA GGT ACC AAC TTC CGA AAA CAG TAA TGA AC (SEQ ID NO: 24) O produto de amplificação foi introduzido no vetor pGEMT-Easy para se obter um vetor CURA3/pGEMT-Easy. Cada um dos vetores CGSH2Ctermi/pGEMT-Easy e o vetor CURA3/pGEMT-Easy foi digerido com HindIII e KpnL Um fragmento incluindo CGSH2 e uma parte principal de pGEMT-Easy do vetor CGSH2Ctermi/pGEMT-Easy, e um fragmento incluindo CURA3 foi recuperado do vetor CURA3/pGEMT-Easy. Estes fragmentos recuperados foram ligados entre si e usados para transformar Escherichia coli JM109. Assim produziu-se um vetor CURA3ACGSH2/pGEMT-Easy.

Amplificação de PCR foi realizada utilizando-se o vetor CURA3ACGSH2/pGEMT-Easy digerido com uma enzima de restrição Notl como um padrão e os iniciadores das SEQ E) NOS: 15 e 16. Assim produziu-se uma cassete de disrupção de gene para glutationa sintetase de Candida utilis (Figs. 1 e 2) <3> Aquisição de cena de Candida utilis ATCC15239ura- auxotrófica para uracila Cepa ATCC15239ura-, uma cepa auxotrófica para uracila derivada de ATCC15239, foi obtida de uma maneira convencional (a técnica de Luis et al., referir a FEMS Microbiology Letters 165, 335-340 (1998)). Como a cepa ATCC 1523 9ura- foi complementada pelo gene URA3 como descrito mais tarde, espera-se que esta cepa seja um mutante ura3. <4> Aquisição de levedura produtora de y-elutamilcisteína (cena ATCC15239Agsh21 derivada de Candida utilis.

Primeiramente, cultivou-se a cepa ATCC15239ura- de um dia para o outro a 30°C em um meio de tubo de ensaio YPD. O produto de cultura foi inoculado em um meio de frasco YPD (frasco Sakaguchi de 500 ml, enchido com 50 ml) e cultivado a 30°C com agitação. As células foram coletadas na fase de crescimento logarítmico e lavadas três vezes com uma solução 1 M de sorbitol resfriada a 4°C. As células lavadas foram suspensas em uma solução resfriada de sorbitol 1 Μ. A suspensão recebeu a adição de 50 μΐ (2 pg) da cassete de disrupção do gene de glutationa sintetase, bem misturada em uma cubeta de 0,2 cm e submetida a eletroporação com o uso de um sistema Gene Pulser System (BioRad) com impedância de 200 U, capacitância de 125 μΡ e voltagem ajustada em 1,5 kV. Numa quantidade de 1 ml de sorbitol 1 M resfriado foi despejado na cubeta [sic], e a cubeta foi resfriada sobre gelo durante 10 minutos. A suspensão de células foi espalhada sobre uma placa SD e cultivada a 30°C como cultura estacionária.

As cepas desenvolvidas sobre a placa foram replicadas sobre uma placa SD e uma placa SD contendo 10 mM de metilglioxal e cultivadas a 30°C como cultura estacionária. Selecionou-se sete cepas apresentando suscetibilidade ao metilglioxal. Cada uma destas 7 cepas foi cultivada de um dia para o outro a 30°C em um meio de tubo de ensaio YPD com agitação. O caldo de cultura foi inoculado, numa quantidade de 2%, em um meio SD (frasco Sakaguchi de 500 ml, enchido com 50 ml) e cultivado a 30°C com agitação. As células na fase de crescimento logarítmico foram recolhidas e lavadas duas vezes com água esterilizada. As células lavadas foram extraídas com água quente a 70°C durante 10 minutos e γ-glutamilcisteína extraída das células de levedura foi isolada e quantificada por meio de HPLC. Adicionalmente, após se colocar as células de levedura lavadas contidas numa determinada quantidade de meio sobre filtro de papel e isto foi aquecido a 105°C durante 4 horas, o peso das células remanescentes foi medido como o peso de células secas da levedura. Assim, a cepa ATCC15239Agsh2 foi obtida como uma cepa de Candida utilis contendo 1% ou mais de γ-glutamilcisteína com base nas células de levedura secas. A cepa ATCC15239Agsh2 foi inoculada em um meio SD e cultivada a 30°C durante 2 dias com agitação. A cultura foi inoculada a uma concentração de 2% em um meio SD e cultivada a 30°C com agitação. Os teores de γ-glutamilcisteína medidos foram de 1,08% e 1,12% após 7 horas e 9 horas, respectivamente. O teor de glutationa foi abaixo do limite de detecção. <5> Medição da atividade de glutationa sintetase da cepa ATCC15239Agsh2 A cepa ATCC 15239Agsh2 foi inoculada em um meio YPD e cultivada a 30°C com agitação. A cultura foi inoculada a uma concentração de 2% em um meio SD (frasco cônico aletado de 2 1, enchido com 400 ml) e cultivada a 30°C com agitação. Células na fase de crescimento logarítmico foram recolhidas e lavadas duas vezes com sorbitol 1 M resfriado a 4°C. As células lavadas foram suspensas em 0,5 ml de tamponador Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) contendo 0,1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonila (sigla em inglês: PMSF). A suspensão foi adicionada com pérolas de vidro (GLASS BEADS 425-600 mícrons lavadas com ácido (SIGMA, código G-8772)), e as células foram rompidas com BEAD-BEATER (WAKENYAKU). A dismpção de células foi confirmada microscopicamente. Em seguida adicionou-se 1 ml do tamponador previamente indicado, e as pérolas de vidro e fragmentos celulares foram removidos por centrifiigação. Assim obteve-se um extrato de células bruto. O extrato de células bruto foi purificado com ULTRAFREE-15 Biomax 10 (MILLIPORE, número de catálogo UFV2BGC40) para se obter uma solução de enzima. O teor de proteína na solução de enzima obtida foi quantificada com o método Bradford. Obteve-se desenvolvimento de cor com o uso de solução CBB de ensaio de proteína (Nakarai, código 29449-15), e mediu-se a absorbância a 595 nm. Criou-se uma curva padrão com o uso de Albumina Padrão (PIERCE, No. 23210). A atividade de glutationa sintetase na solução de enzima obtida como descrito acima foi medida de acordo com o método de Gushima et al. (T. Gushima et al., J. Appl. Biochem., 5,210 (1983)) como a seguir. [Mistura de reacãol 100 mM de γ-glutamilcisteína 100 μΐ 100 mM de MgCl2 100 μΐ 50 mM de ATP 100 μΐ lOOmMdeGly 100 μΐ 1M Tris-HCl (pH 8,0) 85,5 μΐ 160mMdePEP 12,5 μΐ 1 mg/ml de PK 2 μΐ Solução de enzima (de 1 a 10 mg de proteína) água purificada Total 2 ml PEP: sigla em inglês para ácido fosfoenolpirúvico (SIGMA, código P-7127) PK: sigla em inglês para piruvato quinase (SIGMA, código P-1903) A mistura de reação apresentando a composição acima foi deixada reagir a 30°C durante de 0 a 2 horas na presença da enzima numa quantidade de 1 a 10 mg de proteína. A mistura de reação recebeu a adição de 1/5 equivalente de ácido metacrílico para se terminar a reação e, depois, ajustou-se a mesma em pH 8,0, e determinou-se a quantidade do GSH produzido. Neste momento a atividade enzimática foi abaixo do limite de detecção e não foi detectada.

Subseqüentemente, a atividade de glutationa sintetase da cepa ATCC15239, que é uma cepa parental da cepa ATCC15239Agsh2, foi medida de maneira semelhante. Como um resultado, a atividade de glutationa sintetase da cepa ATCC 15239 foi de 0,383 pmol-GSH/mg de proteína/hora. Exemplo 2: Aquisição de gene de γ-glutamilcisteína sintetase <1> Aquisição de homólogo de gene de γ-glutamilcisteína sintetase As seqüências a seguir apresentando elevada homologia foram selecionadas das seqüências de aminoácidos de γ-glutamilcisteína sintetases de Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe (Ohtake et al., Yeast, 7 (9): 953-961 (dezembro de 1991); Mutoh et al., J. Hiochem. (Tokyo), 117 (2): 283-288 (fevereiro de 1995)). (i) MGFGMG (SEQID NO: 25) (ii) GWRVEFR (SEQ Π) NO: 26) Projetaram-se iniciadores degenerados com base em cada seqüência de aminoácidos, e realizou-se PCR degenerada. Um iniciador F1 (ATC CCN TTY GGN ATG GG, SEQ ID NO: 28) foi projetado como um iniciador correspondente à região de (i), e um iniciador RI (RAA YTC NAC NCK CCA, SEQ ID NO: 28) foi projetado como um iniciador correspondente à região de (ii). Realizou-se PCR empregando KOD Dash (TOYOBO) como DNA polimerase de acordo com a instrução do fabricante com as condições de uma reação a 94 C durante 3 minutos, seguida de reações a 94°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto e 74°C durante 1 minuto repetidas durante 30 ciclos. O produto de PCR foi submetido a eletroforese em gel de agarose, excisou-se uma região correspondente ao tamanho esperado de cerca de 700 bp, e recuperou-se DNA do gel utilizando-se MagExtractor (TOYOBO, código NPK-601).

Adicionalmente, realizou-se PCR embutida empregando este DNA recuperado como um padrão. Realizou-se PCR da mesma maneira como descrito acima. O produto de amplificação foi submetido a eletroforese em gel de agarose e, depois, manchado utilizando-se uma solução de brometo de etídio, uma região correspondente a cerca de 700 bp foi excisada, e DNA foi recuperado do gel empregando-se MagExtractor. O DNA recuperado foi ligado ao vetor pGEM-T Easy com o emprego de um kit de ligação de DNA Ver. 2 (Takara Shuzo) e usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109. Entre os transformantes obtidos, um foi obtido como um transformante que se considera conter um fragmento de gene que se espera codificar γ-glutamilcisteína sintetase de Candida utilis. A seqüência de nucleotídeos do inserto incluída no transformante foi determinada de uma maneira convencional.

Realizou-se 3' RACE com base na seqüência de nucleotídeos determinada como descrito acima com o emprego do sistema 3' RACE para amplificação rápida de pontas de cDNA (GIBCO BRL). Sintetizou-se um filamento primário de cDNA a partir de mRNA preparado de Candida utilis empregando-se kit Rneasy Mini Kit, e realizou-se PCR 3 vezes.

Os iniciadores usados são mostrados abaixo.

Primeira PCR: TGA ACA GAG CTC GTT ACC TC (SEQ ID NO: 29) e iniciador AUAP ligado ao kit 3' RACE

Segunda PCR: TCA TGG GCT AAT TTT GCA CC (SEQ ID NO: 30) e iniciador AUAP ligado ao kit 3' RACE

Terceira PCR: TTC CTA GCA TTG ACG GCA GC (SEQ Π) NO: 31) e iniciador AUAP ligado ao kit 3' RACE

Realizou-se PCR empregando-se KOD Dash de acordo com a instrução do fabricante com as condições de uma reação a 94°C durante 2 minutos, seguida de reações a 94°C durante 1 minuto, 50°C durante 30 segundos e 74°C durante 40 segundos repetidas durante 30 ciclos. O produto de PCR foi ligado ao vetor pGEM-T Easy e usado para transformar Escherichia coli. A seqüência de nucleotídeos do inserto incluído no transformante foi analisada para se obter informação acerca do fragmento de gene que se espera conter o gene de γ-glutamilcisteína sintetase de Candida utilis.

Subseqüentemente, realizou-se 5' RACE com base nas sequências de nucleotídeos previamente elucidadas. O kit usado foi o sistema 5' RACE System para amplificação rápida de pontas de cDNA, Reagent Assembly versão 2.0 (GIBCO BRL). É mostrado abaixo o iniciador usado para RT [reverse transcription] transcrição reversa para preparação de um cepa primária de cDNA. AGC ACC AGA AAT GAC GTT C (SEQ ID NO: 32) Realizou-se PCR 3 vezes empregando-se uma coleção de cDNA construída de acordo com a instrução do fabricante e os iniciadores a seguir. Realizou-se PCR empregando-se KOD Dash de acordo com a instrução do fabricante com as condições de uma reação a 94°C durante 2 minutos, seguida de reações a 94°C durante 1 minuto, 50°c for 30 segundos e 74°C durante 40 segundos repetidas durante 30 ciclos.

Os iniciadores usados são mostrados abaixo.

Primeira PCR: CCA TCT GAC GAC ATC CTG CTG (SEQ ID NO: 33) e iniciador AUAP ligado ao kit Segunda PCR: GTC AGC TAA GTG GCC TTT G (SEQ ID NO: 34) e iniciador AUAP ligado ao kit Terceira PCR: CAC TGG CGC TGC TGC CGT C (SEQ ID NO: 35) e iniciador AUAP ligado ao kit O produto de PCR foi ligado ao vetor pGEM-T Easy e usado para transformar Escherichia coli. A seqüência de nucleotídeos do inserto incluído no transformante foi analisada para se obter informação acerca do fragmento de gene que se espera conter o gene de γ-glutamilcisteína sintetase de Candida utilis. Com base em homologias realizadas com aquelas de outros organismos, considerou-se que o comprimento pleno não havia sido clonado, e realizou-se 5' RACE adicional. O iniciador usado na transcritase reversa para a preparação de uma cepa primária de cDNA é mostrado abaixo. TGA TCT TCT GCT GTT CAT GTT (SEQ ID NO: 36) Realizou-se PCR 3 vezes empregando-se a coleção de cDNA construída de acordo com a instrução do fabricante.

Os iniciadores usados são mostrados abaixo.

Primeira PCR: CTC CAC GTA CAA GTA GTT CTC (SEQ ID NO: 37) e iniciador AUAP ligado ao kit Segunda PCR: CAG CGA ATC ACC GTT GTA CGG (SEQ ID NO: 38) e iniciador AUAP ligado ao kit Terceira PCR: AGC CAG CGG TGT CGC CTC (SEQ ID NO: 39) e iniciador AUAP ligado ao kit O produto de PCR foi ligado ao vetor pGEM-T Easy e usado para transformar Escherichia colL A seqüência de nucleotídeos do inserto incluído no transformante foi analisada para se obter informação acerca do fragmento de gene que se espera conter o gene de γ-glutamilcisteína sintetase de Candida utilis.

Projetou-se iniciadores com base na informação obtida como descrito acima, realizou-se PCR, e determinou-se a seqüência de nucleotídeos do produto de amplificação. Realizou-se PCR com o emprego Pyrobest (Takara Shuzo) de acordo com a instrução do fabricante com as condições de uma reação a 98°C durante 2 minutos, seguida de reações a 98°C durante 20 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos repetidas durante 40 ciclos.

Os iniciadores usados são mostrados abaixo.

Mciador F2: GGG TTT GTT GTC TAT CGG CTT AAG (SEQIDNO: 40) Iniciador R2: AGC TGT CTT GGT CGT CAT ATC CAT (SEQIDNO: 41) A seqüência de nucleotídeos do produto de PCR amplificado como descrito acima foi determinada de uma maneira convencional. O resultado é mostrado na SEQ ID NO: 42. Adicionalmente, a seqüência de aminoácidos de γ-glutamilcisteína sintetase que se espera ser codificada por esta seqüência de nucleotídeos é mostrada na SEQ ID NO: 43. Assim obteve-se um homólogo do gene de γ-glutamilcisteína sintetase de Candida utilis. Exemplo 3: Expressão do gene de v-glutamilcisteína sintetase em Saccharomvces cerevisiae <1> Saccharomvces cerevisiae apresentando reduzida atividade de glutationa sintetase Como Saccharomyces cerevisiae apresenta uma reduzida atividade de glutationa sintetase, utilizou-se a cepa de Saccharomyces cerevisiae Να3 descrita na Publicação de Patente Internacional WOO1/90310. A cepa Noc3 é uma cepa construída como uma cepa substituídas por gene de glutationa sintetase atenuada mediante o emprego da cepa Nal (descrita na Publicação de Patente Internacional WOO 1/90310) como uma cepa parental, que é uma cepa haplóide auxotrófíca para uracila de Saccharomyces cerevisiae. <2> Aquisição de Saccharomvces cerevisiae apresentando reduzida atividade de Y-glutamilcisteína sintetase IO Produção de cassete de substituição de gene de GSH1 Primeiramente, o fragmento abrangendo da região de fluxo intermediário até a região terminal do gene de γ-glutamilcisteína sintetase (SEQ ID NO; 44) foi amplificado por meio de PCR utilizando-se DNA cromossômico da cepa Nal previamente indicada como um padrão. Realizou-se PCR empregando-se KOD Dash (TOYOBO) e uma mistura de reação apresentando a composição a seguir de acordo com a instrução do fabricante com as condições de uma reação a 94°C durante 1 minuto, seguida de reações a 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 40 segundos e 74°C durante 1 minuto repetidas durante 30 ciclos. Como iniciadores utilizou-se GF1 (gtg gac gac cgt act cog aag, SEQ ID NO: 46) e GR1 (acc caa ate gat aat gtc aac, SEQ ID NO: 47). O fragmento de gene de GSH1 amplificado como descrito acima foi ligado ao plasmídeo pGEM-T Easy (Promega) de acordo com a instrução do fabricante para se obter GSHldash/pGEM.

Subseqüentemente, por meio de mutagênese direcionada-para-sítio, códons no gene de γ-glutamilcisteína sintetase (SEQ ID NO: 44) incluídos em GSHldash/pGEM correspondente aos aminoácidos da posição 372 e 373, serina e lisina, em γ-glutamilcisteína sintetase (SEQ ID NO: 45) codificados por este gene foram substituídos por um códon stop. Esta operação foi realizada empregando-se kit de mutagênese direcionada-para-sítio Quick Change (STRATAGENE) de acordo com o protocolo do fabricante. Como iniciadores utilizou-se QCF1 (ctt ttc ttg ggt ggg tag taa ttt ttc aat agg act, SEQ NO NO: 48) e QCR1 (agt cct att gaa aaa tta cta ccc acc caa gaa aag, SEQ Π) NO: 49). Assim produziu-se o plasmídeo GSH1 Mdash/pGEM. A y-glutamilcisteína sintetase introduzida com uma mutação como descrito acima apresenta um fraca atividade enzimática (glutationa sintetase atenuada, Publicação de Patente Internacional WOO1/90310). Subseqüentemente, os plasmídeos pYES2dash (um plasmídeo obtido mediante eliminação de 2μ ori do plasmídeo pYES2 (Invitrogen)) descritos na Publicação de Patente Internacional WOO1/90310 e o GSH 1 Mdash/pGEM previamente indicado foram ambos digeridos com enzimas de restrição Saci e Sphl. Um fragmento incluindo o gene URA3 foi excisado de pYES2dash, uma região que inclui uma sequência parcial de gene de y-glutamilcisteína sintetase foi excisada de GSH 1 Mdash/pGEM, e estes foram ligados entre si para preparar um plasmídeo GSHlMdash/pYES2dash. GSHlMdash/pYES2dash foi digerido com uma enzima de restrição Bbel para se obter uma cassete de substituição de gene (Fig. 3). (2) Construção de cena substituída nor gene de y-glutamilcisteína sintetase Substituição gênica do gene de γ-glutamilcisteína sintetase na cepa Nal foi realizada utilizando-se a cassete de substituição de gene produzida como descrito acima. A cepa Nal foi pré-cultivada, e a cultura foi subcultivada em 50 ml de meio YPD até que todas as células atingissem a fase de crescimento logarítmico. As células cultivadas foram suspensas em 1 M de sorbitol, misturadas com a cassete de substituição de gene e transformadas por meio de eletroporação. As cepas transformantes foram cultivadas numa placa SD contendo 1 mM de glutationa, e selecionou-se cepa desenvolvidas. Confirmou-se por meio de PCR que a cassete de substituição de gene havia sido incorporada no cromossoma na posição-alvo, e a cepa obtida foi denominada como um intermediário de Na4. Subseqüentemente, a operação a seguir foi realizada para deixar apenas o gene mutante de γ-glutamilcisteína sintetase no cromossoma. O intermediário de Na4 foi cultivado em um meio YPD contendo 1 mM de glutationa, e o produto de cultura foi inoculado sobre uma placa SDPOA contendo 1 mM glutationa. O gene de glutationa sintetase de uma cepa desenvolvida sobre a placa foi seqüenciado para confirmar se a sequência no sítio-alvo foi corretamente substituída, e assim obteve-se a cepa Na4 (Fig. 4). (3) Confirmação da atenuação da atividade de γ-glutamilcisteína sintetase em cena Na4.

Subseqüentemente examinou-se a atividade de γ-glutamilcisteína sintetase como descrito acima para determinar se a mesma foi atenuada ou não. Ohtake et al. mediram a atividade de γ-glutamilcisteína sintetase da cepa YH1 obtida da cepa de Saccharomyces cerevisiae YNN27 por meio de tratamento de mutagênese (Agric. Biol. Chem., 54 (12): 3145-3150 (1990)). A atividade foi medida de acordo com este método. Como um resultado, a atividade de γ-glutamilcisteína sintetase da cepa Na4 foi abaixo do limite de detecção. Em seguida, a cepa Na4 foi cultivada em um meio SD, e mediu-se os teores de γ-glutamilcisteína e glutationa nas células na fase de crescimento logarítmico. No entanto, não se detectou γ-glutamilcisteína, e a concentração de glutationa foi de 0,01%. Adicionalmente, como a cepa Na4 apresentou suscetibilidade a 2 mM de metilglioxal, confirmou-se que o gene de γ-glutamilcisteína sintetase fora substituído como no caso da cepa YH1. <2> Construção de vetor de expressão de homólogo de v-glutamilcisteína sintetase derivado de Candida utilis Realizou-se PCR com o emprego de DNA cromossômico de Candida utilis como um padrão para amplificar a região ORF (sigla em inglês para Matriz de Leitura Aberta) do homólogo de gene de γ-glutamilcisteína sintetase de Candida utilis. Realizou-se PCR com o emprego de Pyrobest (Takara Shuzo) de acordo com a instrução do fabricante com as condições de uma reação a 98°C durante 2 minutos, seguida de reações a 98°C durante 20 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos repetidas durante 40 ciclos. Realizou-se PCR com o emprego de um iniciador N-terminal CGSH1F1 (GAG TAC GGT ACC ATG GGG CTG CTA TCA TTA GGG AC, SEQ ID NO: 50), a que se adicionou um sítio de digestão Kpnl, e de um iniciador C-terminal CGSH1R1 (CCC TTA TCT AGA TTA AGC CTT TGG GTT GTT TAT C, SEQ ID NO: 51), a que se adicionou um sítio de digestão Xbal, sob a condição indicada acima, e o produto de amplificação foi purificado com o emprego de kit de purificação de PCR QIAquick. O produto de PCR purificado e o vetor pAUR123 (Takara Shuzo) foram digeridos com enzimas de restrição Kpnl e Xbal, depois ligados entre si e usados para transformar células competentes de Escherichia coli JM109. Assim produziu-se o vetor CGSHl/pAUR123. Subseqüentemente, o vetor CGSHl/pAUR123 e o vetor pYES2 foram digeridos com uma enzima de restrição BamHI. Uma região incluindo ORF de CGSH1 e um promotor derivado do vetor pAUR123 foi recuperada do vetor CGSHl/pAUR123, ligada ao vetor pXES2 cujas pontas digeridas foram desfosforiladas, e usadas para transformar células competentes de Escherichia coli JM109. Assim produziu-se o vetor CGSHl/pYES2, um vetor de expressão do homólogo de γ-glutamilcisteína sintetase de Candida utilis (Fig. 5). <3> Teste de comnlementacão Subseqüentemente obtiveram-se transformantes mediante introdução do vetor CGSHl/pYES2 na cepa Na3 e na cepa Να4. A cepa Na3 ou a cepa Na4 foi pré-cultivada e sub-cultivada em 50 ml de um meio líquido (meio YPD contendo 1 mM de glutationa) até que as células atingissem a fase de crescimento logarítmico. As células cultivadas foram suspensas em 1 M de sorbitol, misturadas com o vetor CGSHl/pYES2 e transformadas por meio de eletroporação. As cepas transformadas foram cultivadas numa placa SD contendo 1 mM de glutationa, e selecionou-se cepas desenvolvidas. A cepa Να3 e a cepa Να4 apresentaram auxotrofia para uracila e só puderam crescer no meio SD quando se incluiu o vetor CGSHl/pYES2. Confirmou-se que os transformantes obtidos incluíam o vetor CGSHl/pYES2 de uma maneira convencional.

Assim, obtiveram-se transformantes, as cepas Na3/CGSH1 e Na4/CGSH1. Na3/CGSH1 apresentou suscetibilidade a 2 mM de metilglioxal, enquanto que a cepa a4/CGSHl na apresentou suscetibilidade a 2 mM de metilglioxal. Adicionalmente, quando cultivada no meio SD, a cepa Na3/CGSH1 quase não continha glutationa na fase de crescimento logarítmico, enquanto que a cepa Na4/CGSH1 continha 0,4% de glutationa. A cepa Na3 apresentou uma reduzida capacidade de síntese de glutationa devido à mutação ocorrida na glutationa sintetase de Saccharamyces cerevisiae, enquanto que a cepa Na4 apresentou uma reduzida capacidade de síntese de glutationa devido à ocorrência de uma mutação na γ-glutamilcisteína sintetase de Saccharomyces cerevisiae. Assim demonstrou-se que CGSH1 complementou γ-glutationa sintetase de Saccharomyces cerevisiae.

Aplicabilidade industrial A presente invenção proporciona Candida utilis apresentando um alto teor de γ-glutamilcisteína. Extrato de levedura que pode ser usado para proporcionar aroma e sabor de alimentos etc. pode ser produzido com baixo custo com o emprego do Candida utilis da presente invenção.

LISTAGEM DE SEOÜÊNCIAS <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Candida utilis contendo γ-glutamilcisteína <130> C075MKOPP1520 <140> <141> 26.03.2003 <150> JP 2002-85058 <151> 26.03.2002 <160> 51 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: seqüência consensus <400> 1 Gin Glu Vai Ala Vai Vai Tyr Tyr Arg 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: seqüência consensus <400> 2 Gly Ser Lys Lys Ile Gin Gin 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: seqüência consensus <400> 3 Vai Leu Lys Pro Gin Arg Glu Gly Gly Gly Asn Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: seç[üência consensus <400> 4 Ile Ser Glu Leu Gly Ile Tyr Gly 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Seç[üência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: seqüência consensus <400> 5 Gly Gly Vai Ala Ala Gly Phe 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: seqüência consensus <400> 6 Gly Ser Lys Lys Ile Gin Gin 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: seqüência consensus <400> 7 Glu Gly Gly Gly Asn Asn 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: seqüência consensus <400> 8 Pro Gin Arg Glu Gly Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 9 ggttcyaaga agatycarca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 10 ccaccaccyt ctctytgtgg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 11 gttgttacca ccaccytc 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 12 aagatatacc cattggatgg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 13 tcagatcttg gtaaagaggc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 14 agactggcat ttgagtctcc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 15 ggttctaaga agattcagca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 16 cctcggaaa aggagacgaa gg 22 <210> 17 <211> 573 <212> DNA <213> Candida utilis <220> <221> CDS <222> (1).. (510) <400> 17 ggt tct aag aag aíí cag caa aíc ttg acg gat gag aag gta ctc tcc 48 Gly Ser lys Lys íle Gin Gin Ile Lee Thr Asp Glu Lys Vai Leu Ser 1 5 10 15 aag tit att aag tct gat gtc tcc gag ttg gtg tea aca ttt gtc aag 96 Lys Phe I1e Lys Ser Asp Vai Ser Glu Leu Vai Ser Thr Phe Vai Lys 20 25 30 ata tac cca ttg gat ggt tea gat ctt ggt aaa gag gct aaa aga ctg 144 Ile Tyr Pro Leu Asp Gly Ser Asp Leu Gly Lys Glu Ala Lys Arg Leu 35 40 45 gea ttt gag tct cca gag gag tac gtg ttg aag cct cag cat gaa ggt 192 Ala Phe Glu Ser Pro Glu Glu Tyr Vai Leu Lys Pro Gin His Glu Gly 50 55 60 ggt ggt aat aac att tac aaa gaa gat ata cct ggt ttc tta aga tct 240 Gly Gly Asn Asn Ile Tyr Lys Glu Asp Ile Pro Gly Phe Leu Arg Ser 65 70 75 80 att cca gaa gat gaa tgg caa gga tac att cta atg caa ttg ate cat 288 Ile Pro Glu Asp Glu Trp Gin Gly Tyr Ile Leu Met Glu Leu lie His 85 90 95 cca cct ctg aat aag aat aaa ctc gtc cgt gag ggt gag gta ttt aca 336 Pro Pro Leu Asn Lys Asn Lys Leu Vai Arg Glu Gly Glu Vai Phe Thr 100 105 110 gat gag ata gtt tct gag ctt ggc cgt ttc ggc acc ate tta ttc gac 384 Asp Glu Ile Vai Ser Glu Leu Gly Arg Phe Gly Thr Ile Leu Phe Asp 115 120 125 caa tcg act ggt gag gtt ate aaa aac tct gat gct ggc tgg ttg ttg 432 Gin Ser Thr Gly Glu Vai I1e Lys Asn Ser Asp Ala Gly Trp Leu Leu 130 135 140 aga tcg aaa ttc tca age tcc aac gaa ggt ggt gtt gct gea ggg ttt 480 Arg Ser Lys Phe Ser Ser Ser Asn Glu Gly Gly Vai Ala Ala Gly Phe 145 150 155 IfiO gga tgt gtt gat ggt gtt gct ctc caa tag atggagccgc atttagalat 530 Gly Cys Vai Asp Gly Vai Ala Leu Gin 165 170 ccacctcacg aattagaatt ccttcgtctc cttttccgag ggc 573 <210> 18 <211> 169 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 18 Gly Ser Lys Lys lie Gin Gin Ile Leu Thr Asp Glu Lys Vai Leu Ser 1 5 10 15 Lys Phe Ile Lys Ser Asp Vai Ser Glu Leu Vai Ser Thr Phe Vai Lys 20 25 30 lie Tyr Pro Leu Asp Gly Ser Asp Leu Gly Lys Glu Ala Lys Arg Leu 35 40 45 Ala Phe Glu Ser Pro Glu Glu Tyr Vai Leu Lys Pro Gin Hls Glu Gly 50 55 60 Gly Gly Asn Asn Ile Tyr Lys Glu Asp Ile Pro Gly Phe Leu Arg Ser 65 70 75 80 Ile Pro Glu Asp Glu Trp Glu Gly Tyr Ile Leu Met Gin Leu Ile flis 85 90 95 Pro Pro Leu Asn Lys Asn Lys Leu Vai Arg Glu Gly Glu Vai Phe Thr 100 105 110 Asp Glu Ile Vai Ser Glu Leu Gly Arg Phe Gly Thr Ile Leu Phe Asp 115 120 125 Gin Ser Thr Gly Glu Vai Ile Lys Asn Ser Asp Ala Gly Trp leu Leu 130 135 140 Arg Ser Lys Phe Ser Ser Ser Asn Glu Gly Gly Vai Ala Ala Gly Phe 145 150 155 160 Gly Cys Vai Asp Gly Vai Ala Leu Gin 165 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador <400> 19 gaagcctcag catgaagctt gtggtaataa catttac 37 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 20 gtaaatgtta ttaccacaag cttcatgctg aggcttc 37 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 21 cgaccaatcg actggtaccg ttatcaaaaa ctctg 35 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 22 cagagttttt gataacggta ccagtcgatt ggtcg 35 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Següência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 23 cccaagcttc tctacttgct tctgctcaac 30 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 24 gcaggtacca acttccgaaa acagtaatga ac 32 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 25 Met Gly Phe Gly Met Gly 1 5 <210> 26 <211> 7 <212 > PRT <213> Candida utilis <400> 26 Gly Trp Arg Vai Glu Phe Arg 1 5 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Sequência Artificial: iniciador <220> <221> caract_misc <222> (6) <223> η = a, c, g ou t <220> <221> caract_misc <222> (12) <223> n = a, c, g ou t <400> 27 atgggnttyg gnatggg 17 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <220> <221> caract_misc <222> (7) <223> n = a, c, g ou t <220> <221> caract_misc <222> (10) <223> η = a, c, g ou t <400> 28 raaytcnacn ckcca 15 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 29 tgaacagagc tcgttacctc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 30 tcatgggcta attttgcacc 20 <210> 31 <211> 20 <212) DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 31 ttcctagcat tgacggcagc 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 32 agcaccagaaatgacgttc 19 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 33 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 34 gtcagctaag tggcctttg 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 35 cactggcgct gctgccgtc 19 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Segúência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador <400> 36 tgatcttctg ctgttcatgt t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 37 ctccacgtac aagtagttct c 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 38 cagcgaatca ccgttgtacg g 21 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição of Seqüência Artificial: iniciador <400> 39 agccagcggt gtcgcctc 18 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> gggtttgttg tctatcggct taag 24 <210> 41 <221> 24 <212> DNA <213> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador <400> 41 agctgtcttg gtcgtcatat ccat 24 <210> 42 <211> 2224 <212> DNA <213> Candida utilis <220>

<221> CDS <222> (110)..(2101) <400> 42 gggtttgttg tctatcggct taaggtttag tcgggaggaa caagaagcga cacacacagc 60 gaaccgacac acttgggaac ccattgctla agctattgag taccatacg atg ggg ctg 118 Mel Gly Leu 1 cta tca tta ggg act ccg ctt cct tgg gaa cag aca agg gag tac gcg 166 Leu Ser Leu Gly Thr Pro Leu Pro Trp Glu Gin Thr Arg Glu Tyr Ala 5 10 15 gag cac gtc cgc act gag ggt ate gaa cag ttg ate aag atg ttc aag 214 Glu Bis Yal Arg Thr Giu Gly Ile Glu Gin Leu Ile Lys «et Phe Lys 20 25 30 35 gct gca tat gca aga acc ggt gat ggc tal eta tgg gga gac gaa gtg 2Θ2 Ala Ala Tyr Ala Arg Thr Gly Asp Gly Tyr Leu Trp Gly Asp Glu Yal (O 4$ 50 gag lat acc ctg gtc aag ttt gat cat ggt cgt ggt ctt gct ctg ttg 310 Glu Tyr Thr Leu Yal Lys Phe Asp His Gly Arg Gly Leu Ala Leu Leu 55 60 65 agt ate gat aag gac age gta ttg gct gat ctc aac gag ggc gga tea 358 Ser Ile Asp Lys Asp Ser Yal Leu Ala Asp Leu Asn Glu Gly Gly Ser 70 75 80 ctg gca cag ttg tet gtg gac aat gat ctc aac ttc cac ccg gaa tat 406 Leu Ala Glu Leu Ser Yal Asp Asn Asp Leu Asn Phe Hls Pro Glu Tyr 85 90 95 ggc cgç ttc atg ctg gag gcg aca ccg ctg gct ccg tac aac ggt gat 454 Gly Arg Phe Met Leu Glu Ala Thr Pro Leu Ala Pro Tyr Asn Gly Asp 100 105 110 115 tcg ctg gag aac tac ttg tac gtg gag agg aac atg aac age aga aga 502 Ser Leu Glu Asn Tyr Leu Tyr Vai Glu Arg Asn Met Asn Ser Arg Arg 120 125 130 tea gtg gcg cag act gcg att gct gac ggc acc ate aag ccg ttg acc 550 Ser Vai Ala Gin Thr Ala Ile Ala Asp Gly Thr lie Lys Pro Leu Thr 135 140 145 ata acg gtg tac cca ttg atg ggc ate aac acc ttc acc ttc ccx tea 598 Ile Thr Vai Tyr Pro Leu Met Gly Ile Asn Thr Phe Thr Phe Pro Ser 150 155 160 gcg gtg gct aac ggc gag gca tea caa tcg ctg ttc Üa ccg gat gag 646 Ala Yal Ala Asn Gly Glu Ala Ser Gín Ser Leu Phe Leu Pro Asp Glu 165 170 175 alc afe aac aga cat gcg aga ttc cca aca ttg acg gcc aac att cgg 694 Ile Ile Asn Arg His Ala Arg Phe Pro Thr Leu Thr Ala Asn Ile Arg 180 185 190 195 aaa cgc cgt ggt gag aag gtg gcc ate aac gta ccg ctc tac aag gat 742 Lys Arg Arg Gly Glu Lys Yal Ala Ile Asn Vai Pro Lea Tyr Lys Asp 200 205 210 aca aat acg tta tcc att gac gag tea att cca aag gga cgc tcc ctg 790 Thr Asn Thr Leu Ser Ile Asp Glu Ser Ile Pro Lys Gly Arg Ser Leu 215 220 225 ttc aag cac gac gaa gaa cca gag ctc ggt gca gca ctg cca ggg cat 838 Phe Lys His Asp Glu Glu Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Pro Gly Hís 230 235 240 ata tac atg gac tcc atg gga ttc ggt atg gga tgc tca tgt cta caa 886 Ile Tyr Met Asp Ser Met Gly Phe Gly Mçt Gly Çys Ser Cys Leu Gin 245 250 255 gta aca gtg caa gca cca aac ttg aac aga gct cgt tac ctc tat gat 934 Vai Thr Vai Gin Ala Pro Asn Leu Asn Arg Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp 260 265 270 275 tca tgg gct aat ttt gca cca ttg ttc cta gca ttg acg gca gca gcg 982 Ser Trp Ala Asn Phe Ala Pro Leu Phe Leu Ala Leu Thr Ala Ala Ala 280 285 290 cca gtg ttc aaa ggc cac tta gct gac cag gat gtc aga tgg aac gtc 1030 Pro Vai Phe Lys Gly His Leu Ala Asp Gin Asp Vai Arg Trp Asn Vai 295 300 305 att tct ggt gct gtt gat gat cgt act gcc tac gag cgt gat gtt aag 1078 Ile Ser Gly Ala Vai Asp Ásp Arg Thr Ala Tyr Glu Arg Asp Vai Lys 310 315 320 cct ctg cat age gat ggc gca ttt ggt gga atg aca gac gaa gcc aaa 1126 Pro Leu His Ser Asp Gly Ala Phe Gly Gly Met Thr Asp Glu Ala Lys 32$ 330 335 gct cgg gct cag aag ate cct aaa tct cgt tac gat ggc ate gat tct 1174 Ala Arg Ala Gin Lys lie Pro Lys Ser Arg Tyr Asp Gly Ile Asp Ser 340 345 350 355 ttc ctt ggt gat att cag aac gat ttc gca aaa gat ggg gaa gca gtg 1222 Phe Leu Gly Asp Ile Gin Asn Asp Phe Ala Lys Asp Gly Glu Ala Vai 360 365 870 ttc aag tac ttc tct cca gag ttg aac gac ate age cct cca ate aac 1270 Phe Lys Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Asn Asp Ile Ser Pro Pro Ile Asn 375 380 385 gag agg acg cta cag aga ctc gca cag gaa cct cag ttt gac cct gtc 1318 Glu Arg Thr Leu Gin Arg Leu Ala Gin Glu Pro Gtn Phe Asp Pro Vai 390 395 400 ctl gct cgt cac ttl gca cac lig tac gtt cgt gat cca att gtg ata 1366 Leu Ala Arg His Phe Ala His Leu Tyr Vai Arg Asp Pro Ile Vai Ile 405 410 415 ttc gaa gaa cgt ata cac caa gac aat gac gat gaa acg gat cac ttt 1414 Phe Glu Glu Arg Ile His Gin Asp Asn Asp Asp Glu Thr Asp His Phe 420 425 430 435 gag aac ait caa tcc act aat tgg cag acg ttg agg ttc aag cca cca 1462 Glu Asn Ile Gin Ser Thr Asn Trp Gin Thr Leu Arg Phe Lys Pro Pro 440 445 450 act caa cag gca aca ccg gat aac aaa tcc gtt cca gga tgg aga gtg 1510 Thr Glu Gin Ala Thr Pro Asp Asn Lys Ser Vai Pro Gly Trp Arg Yal 455 460 4Ι>(> gaa ttc aga aca atg gag ate cag etc aca gat ttt gag aat gct gct 1558 Glu Phe Atg nr Met Glu He Gin Leu mr A$p Phe Glo Asn Ala Ala 470 475 480 ttc tea ate ttc att gt( etc ctg gga cag gea ata ctt gcg aca gat 1606 phe Ser Ile Phe Ile Vai Leu Leu Gly Gin Ala Ile Lett Ala Thr Asp 485 490 495 tcc aac tgg tac alt cea ate tcc aag att gaa gat aac atg aaa cgt 1654 Ser Asn Trp Tyr Ile Pro Ile Ser Lys Ile Glü Asp Asn Met Lys Arg 500 505 510 515 gea cat cac agg gac gea gta ttg aag gac aag ttc cat ttc aaa gct 1702 Ala His His Arg Asp Ala Yal Leu Lys Asp Lys Phe His Phe Lys Ala 520 525 530. gat ate age tcg cea gea ttc gac acg gtg gag ctg tea ctg gac gag 1750 ASP Ue Ser Ser Pro Ala Phe Asp Thr Vai Glu leu Ser Leu Asp Glu 535 540 545 att gtc aat ggc tgc gat age ttt ate gga ttg atg gea ctt gtg aag 1798 Ile Vai Asn Gly Cys Asp Ser Phe Ile Gly Leu Met Ala Leu Vâl Lys 550 555 560 aag cac ttg gaa tet cgc ttt gga att act ggt gac gac tta tcg cca 1846 Lys His Leu Gin Ser Arg Phe Gly Ile Thr Gly Asp Asp Leu Ser Pro 565 570 575 aag ggt aca cac gct agg ate tac tac tac ttg gaa ttg ate tcc aag 1894 Lys Gly Tlir His Ala Arg He Tyr Tyr Tyr Leu Glu Leu Ile Ser Lys 580 585 590 595 aga gcc agt ggc gag cta cca act gct gct aaa ttc ata aga agg ttc 1942 Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro Thr Ala Ala Lys Phe Ile Arg Arg Phe 600 605 610 ttg etc gac cat aag gac tat caa cac gac tcc aaa ata act gct aga 1990 Leu Leu Asp His Lys Asp Tyr Gin His Asp Ser Lys Ile Thr Ala Arg 015 620 025 atg aat tac gat ttg ttg aac acg Itg aat age att tea gaa ctt ggc 2038 Met Asn Tyr Asp Leu Leu Asn Thr leu Asn Ser lie Ser Glu Leu Gly 630 635 640 gaa gat gtt aga cag ttg ttg ggt gat gac att ggc aac tac ttg ata 2086 Glu Asp Vai Arg Gin Leu Leu Gly Asp Asp Ile Gly Asn Tyr Leu Ue 645 650 655 aac aac cca aag gct taatgacact aagggggagg aaactcgcca ttttgcatat 2141 Asn Asn Pro Lys Ala 660 aaacatagac ãscgtcctât acagtattta attataaaag agttcagctc gtgatatçga 2201 tggatatgac gaccaagaca gct 2224 <210> 43 <211> 664 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 43 Met Gly Leu Leu Ser Leu Gly Thr Pro Leu Fro Trp Glu Gin Thr Arg 15 10 IS

Claims

1. Candida utilis transgênica, caracterizada pelo fato de que contém 1 % em peso ou mais de γ-glutamilcisteína por células secas em sua fase de crescimento logarítmíco, quando cultivada em um meio mínimo, em que um gene que codifica para glutationa sintetase que compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 17 é interrompido de modo que a atividade intracelular de glutationa sintetase é reduzida,

2. Candida utilis transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o meio mínimo é meio SD,

3. Candida utilis transgênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que apresenta atividade de glutationa sintetase de 0,005 pmol de GSH/mg de proteína/hora ou menos.

4. Candida utilis transgênica de acordo com qualquer uma das reivindicações l a 3, caracterizada pelo fato de que é modificada pela transformação com um vetor que compreende um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos de 110 a 2101 da SEQ ID NO: 42 de forma que a quantidade de expressão de um gene que codifica para γ-glutamilcisteína sintetase seja aumentada.

5. Comida ou bebida, caracterizada pelo fato de que compreende cultura obtida por meio de cultivo de Candida utilis como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 em uma condição apropriada, uma fração da cultura que contém γ-glutamilcisteína, ou uma fração na qual a cisterna é produzida por meio de tratamento com calor da cultura ou fração da mesma.

6. Comida ou bebida de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é um tempero de comida fermentada.

7. Extrato de levedura, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo uso de cultura obtida por meio de cultivo da Candida utilis como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 em uma condição apropriada.

8. Método para produzir alimento contendo γ-glutamílcisteína ou eisteína, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a Candida utilis como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 sob uma condição apropriada, e misturar a cultura obtida ou uma fração da mesma ou a cultura ou uma fração da mesma submetida a tratamento com calor com uma matéria-prima de comida ou bebida para produzir comida ou bebida.