JP5625061B2

JP5625061B2 - 高い甘味を有する新規なブラゼイン変異体及び多重変異体の製造方法

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Publication number: JP5625061B2
Application number: JP2012526611A
Authority: JP
Inventors: クワァン・フン・コン
Original assignee: チュンアンユニヴァーシティインダストリーアカデミーコーペレーションファウンデーション
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2029-08-28
Also published as: US20120220756A1; JP2013502920A; WO2011025077A1; US8592181B2

Description

本発明は、高い甘味を有する新規なブラゼイン多重変異体及びその用途に関し、より詳細には、野生型のブラゼイン副タイプ（ｍｉｎｏｒｔｙｐｅ）のタンパク質より高い甘味を示すブラゼイン変異体、その製造方法及びこれを含む糖度増進用食品組成物に関する。

白砂糖（精白糖）は、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ、砂糖）という簡単な炭水化物の１つであって、サッカロース（ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ、砂糖の化学的用語）とも言う二糖類である。長期間、砂糖は、甘味料として多く使用されてきた。しかし、砂糖の有害性問題に起因して、最近、世界保健機構（ＷＨＯ）では、砂糖使用を現在の１０％に制限するような勧告案を提示し、米国の州政府（ニューヨーク市２００３年７月、ニュージャジー州２００４年９月、イリノイ州２００６年３月、コネティカット州２００６年４月）では、砂糖主成分食品及び高含有飲料販売を全面禁止させた。また、韓国の場合、国家肥満対策委員会を構成し、砂糖危険警告文句表記方針を発表し、２０１０年以後から砂糖基準値以上食品広告規制を実施する予定である。したがって、砂糖を代替することができる新しい甘味料の登場が要求されている。

１８７９年米国のアイララムスンとドイツのコンスタンチンパルベルクは、砂糖より約５００倍の甘味を出すサッカリン（ｓａｃｃｈａｒｉｎ）を発見した。サッカリンは、体内で分解せずに、排泄される長所を有するが、発癌性物質という論難を呼び起こした。結局、人体に無害であると結論が出たが、後味が苦いという短所があるため、最近には多く使用されていない。１９３７年米国イリノイ大学でシクロヘキシルスルファミン酸ナトリウムが甘味を出すことを発見した。商品名としてシクラメート（ｃｙｃｌａｍａｔｅ）と呼ばれながら１９５０年初から使用し始まり、１９６０年代に世界甘味料市場を席巻した。しかし、発癌性物質として判明されながら韓国では１９７０年代から使用が全面禁止された。最近、最も広く使用される人工甘味料は、１９６５年ジェイムシュラッターによって発見されたアスパルテーム（ａｓｐａｒｔａｍｅ）である。アスパルテームは、砂糖より約１８０〜２００倍程度高い糖度を有している。現在市販される大部分のダイエット飲料には、アスパルテームが含まれているが、体内に入れば、代謝過程中にフェニルアラニンを生成する。したがって、フェニルアラニンを分解する特定酵素（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）が先天的に欠乏されたフェニルケトン尿症患者は利用することができないという短所を有する。

このような人工甘味料だけでなく天然甘味料を開発するための研究も継続されてきており、その結果として、ハーブに分類されている菊科の多年生植物（Ｓｔｅｖｉａｒａｂａｕｄｉａｎａ）の葉には、ステビオシド（ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）という物質が存在する。パラグアイとブラジルの国境地帯原住民は、この物質を４百年以上甘味料として使用した。韓国の焼酒に添加されたりするが、砂糖より２００倍の甘味を有している。

一方、最近には、熱帯果物で抽出した甘味タンパク質に対する関心が増大している。タウマチン（Ｔｈａｕｍａｔｉｎ）は、西アフリカで奇蹟の果物と呼ばれる多年生植物（Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｄａｎｉｅｌｌｉｉ）の果実中に含まれているタンパク質であって、砂糖より２，０００〜３，０００倍程度の甘味を示す。モネルリン（Ｍｏｎｅｌｌｉｎ）は、アフリカの多雨林地帯に生育するセレンディピティベリー（Ｓｅｒｅｎｄｉｐｉｔｉｂｅｒｒｙ）と言うつる状植物の実から得られるタンパク質であって、砂糖より略３，０００倍が甘い。しかし、栽培が容易でなく、実からの抽出も難しい。さらに、熱安定性が低く、食品加工過程で熱処理をすれば、三次元的なタンパク質構造を失ってしまい、甘味を出しない短所を有している。現在には、このような短所を克服するために、タンパク質工学技術を利用して熱安定性を増進させる研究が進行されている。

一方、ブラゼイン（ｂｒａｚｚｅｉｎ）は、西アフリカのペンタジプランドラブラゼナバイロン（ＰｅｎｔａｄｉｐｌａｎｄｒａｂｒａｚｚｅａｎａＢａｉｌｌｏｎ）の実から初めて抽出された甘味タンパク質である（Ｍｉｎｇｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、３５５：１０６−１０８、１９９４）。ブラゼインは、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）と比較した時、約５００倍〜２，０００倍以上の甘味を示し（Ｊｉｎｅｔａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｓｅｎｓｅｓ．２８：４９１−４９８、２００３）、主タイプ（ｍａｊｏｒｔｙｐｅ）と副タイプ（ｍｉｎｏｒｔｙｐｅ）の２つの形態がある。植物から抽出したブラゼインの大部分である主タイプは、アミノ末端部位にピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）残基を含んで５４個のアミノ酸を有する。一方、副タイプのブラゼインは、アミノ末端部位のピログルタミン酸残基なしに５３個のアミノ酸残基のみを有し、副タイプのブラゼインに比べて約２倍程度強い甘味を示す（Ａｓｓａｄｉ−Ｐｏｒｔｅｒｅｔａｌ．、Ａｒｃｈ．．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７６：２５９−２６５、２０００）。ブラゼインは、甘味タンパク質のうち最も小さい大きさで約６．５ｋＤａの分子量を有していて、１個のサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）で構成された単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）である。単一のポリペプチド（ｓｉｎｇｌｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）よりなり、１個のα−螺旋（ｈｅｌｉｘ）と２個のβ−シート構造（ｓｈｅｅｔ）で構成される。ブラゼインは、８個のシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）残基を有し、分子内に４個の二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄ）を形成していて、熱安定性が非常に高い。また、水に対する溶解度及びｐＨ安定性が非常に高い（Ｇａｏｅｔａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｍａｃｒｏｍｏｌ．２４：３５１−３５９、１９９９）。

米国特許（ＵＰ６，２７４，７０７Ｂ１）及びアサジ−ポーターなど（Ａｓｓａｄｉ−Ｐｏｒｔｅｒｅｔａｌ．、Ａｒｃｈ．．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７６：２５９−２６５、２０００）は、上記のようなブラゼインを大腸菌を利用した遺伝工学的方法で組換えブラゼインを生産する方法を記述しているが、ブラゼインを暗号化している遺伝子を合成し、これをＳＮａｓｅを含んでいる組換えベクターに挿入し、新しい形質転換ベクターを生成した後、これを再び大腸菌に導入し、最終ＳＮａｓｅと連結された融合タンパク質を発現、精製する方法が開示されている。しかし、ＳＮａｓｅと融合されて発現されたブラゼインは、不溶性凝集体（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）を生成し、これをさらにリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）させ、シアノブロマイド（ｃｙａｎｏｂｒｏｍｉｄｅ、ＣＮＢｒ）を利用してＳＮａｓｅとメチオニン（Ｍｅｔ）を除去する方法で分離、精製するので、技術的に複雑で且つ難しいため、大量生産による商業化が困難であるという短所があった。これより、本発明者らは、既存研究の短所を解決するために、先行研究を通じて大腸菌ｐｅｌＢ信号配列及びブラゼイン遺伝子を含むポリヌクレオチド及びこれを利用したブラゼインの製造方法を特許出願（韓国特許出願第２００６−９７６１９号）したことがある。

これより、本発明者は、熱安定性が高く、優れた甘味を示す天然甘味料を探すために、ブラゼインを構成しているアミノ酸のうち構造に影響を与えないと予想される特定位置のアミノ酸の変異体及び多重変異体を製造し、これらのうち従来のブラゼインと同等な熱安定性及びｐＨ安定性及び高い水溶性などの特性を有しながらさらに高い甘味を示す変異体及び多重変異体を探索及び開発することによって本発明を完成した。

米国特許第６，２７４，７０７Ｂ１

したがって、本発明の目的は、従来のブラゼイン副タイプのタンパク質と同等な高い熱安定性及びｐＨ安定性及び高い水溶性などの特性を有しながら少なくは２倍から多くは２０倍以上の甘味を示す新しいブラゼイン変異体及び多重変異体及びその用途を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は、甘味が従来の天然型のブラゼインより優れた新しいブラゼイン変異体を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、上記ブラゼイン変異体及び多重変異体を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、上記ベクターで形質転換された大腸菌及び上記大腸菌を利用したブラゼイン変異体の製造方法を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、ブラゼイン変異体及び多重変異体を有効成分として含む糖度増進用食品組成物を提供する。

以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、糖度が従来の天然型に比べて優れた新しいブラゼイン変異体及び多重変異体を提供することを特徴とする。

本発明の一実施例では、位置−指定突然変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法によりブラゼイン副タイプの５番目アミノ酸であるリシン残基、２８番目アミノ酸であるアスパラギン酸残基、３０番目アミノ酸であるヒスチジン残基、３５番目アミノ酸であるグルタミン酸残基、４０番目アミノ酸であるグルタミン酸残基または４２番目アミノ酸であるアルギニン残基を他のアミノ酸に置換した４０種のブラゼイン変異体を暗号化する組換えベクターを製造した。

本発明の他の実施例では、上記で製造した組換えベクターを利用して各々のブラゼイン変異体を発現し、これを精製し、その結果、純度高いブラゼイン変異体を得ることができた。

本発明のさらに他の実施例では、上記で製造したブラゼイン変異体とブラゼイン副タイプタンパク質活性（甘味）と熱安定性を測定した。その結果、ブラゼイン副タイプのタンパク質の３０番目アミノ酸であるヒスチジン残基がアルギニン残基に、３５番目アミノ酸であるグルタミン酸残基がアスパラギン酸残基に、４０番目グルタミン酸残基がアルラニン残基、アスパラギン酸残基、リシン残基及びアルギニン残基に置換した変異体がブラゼイン副タイプタンパク質に比べて活性（甘味）が高く、対等な熱安定性を有し、さらに高い甘味を示すためのブラゼイン多重変異体の製作のために選別され、その自体で優れた甘味料として使用されることができることが分かった。

本発明のさらに他の実施例では、上記で製造したブラゼイン変異体を適切に組み合わせて、ブラゼイン９種の２次変異体、４種の３次変異体及び３次変異体に基づいてブラゼイン副タイプの２９番目リシン残基と３０番目ヒスチジン残基との間にリシン残基を挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）した４種の４次変異体、全体１７種のブラゼイン多重変異体を暗号化する組換えベクターを製造し、上記の実施例と同一の方法で発現、精製及び活性（甘味）を測定した。その結果、純度高いブラゼイン変異体を得ることができ、ブラゼイン副タイプタンパク質と同一の安定性を有し、ブラゼイン副タイプタンパク質と比較した時、最小４から最大２０倍以上の甘味を示すブラゼイン変異体を製作することができた。これにより、上記で選別されたブラゼイン変異体を利用して製作したブラゼイン多重変異体もやはり優れた甘味料として使用されることができることが分かった。

したがって、本発明は、ブラゼイン副タイプの３０番目アミノ酸であるヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基、３５番目アミノ酸であるグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）残基または４０番目グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）残基が他のアミノ酸に置換されたブラゼイン変異体を提供する。

一具体例において、本発明のブラゼイン変異体は、例えば、３０番目アミノ酸であるヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基がアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）残基に置換された配列番号１００のアミノ酸配列を有するブラゼイン変異体、３５番目アミノ酸であるグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）残基がアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ）残基に置換された配列番号１０９のアミノ酸配列を有するブラゼイン変異体、または４０番目グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）残基が各々アルラニン（ａｌａｎｉｎｅ）残基、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ）残基、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）残基またはアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）残基に置換された配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５または配列番号１１７のアミノ酸配列を有するブラゼイン変異体であることができる。

他の具体例において、本発明のブラゼイン変異体は、上記で言及した３０番目アミノ酸であるヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基、３５番目アミノ酸であるグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）残基または４０番目グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）残基が２つ以上変形された多重変異体であることができ、例えば、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３または配列番号１５４のアミノ酸配列を有するブラゼイン変異体であることができる。

また、本発明のブラゼイン変異体は、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３及び配列番号１５４のアミノ酸配列を有するブラゼイン変異体の２９番目リシン（ｌｙｓｉｎｅ）残基と３０番目ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基との間にリシン（ｌｙｓｉｎｅ）残基が挿入されたものであって、好ましくは、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７または配列番号１５８のアミノ酸配列を有することができる。

一方、本発明は、上記ブラゼイン変異体を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。上記ポリヌクレオチドは、配列番号１００、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５または配列番号１１７のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチドであることができ、好ましくは、配列番号１００のアミノ酸配列に対しては配列番号５９の塩基配列、配列番号１０９のアミノ酸配列に対しては配列番号６８の塩基配列、配列番号１１３のアミノ酸配列に対しては、配列番号７２の塩基配列、配列番号１１４のアミノ酸配列に対しては配列番号７３の塩基配列、配列番号１１５のアミノ酸配列に対しては配列番号７４の塩基配列、配列番号１１７のアミノ酸配列に対しては配列番号７６の塩基配列を有することができる。

また、本発明の上記ブラゼイン多重変異体を暗号化するポリヌクレオチドは、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７または配列番号１５８のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチドであることができ、好ましくは、配列番号１４２のアミノ酸配列に対しては配列番号１２３の塩基配列、配列番号１４３のアミノ酸配列に対しては配列番号１２４の塩基配列、配列番号１４４のアミノ酸配列に対しては配列番号１２５の塩基配列、配列番号１４５のアミノ酸配列に対しては配列番号１２６の塩基配列、配列番号１４６のアミノ酸配列に対しては配列番号１２７の塩基配列、配列番号１４７のアミノ酸配列に対しては配列番号１２８の塩基配列、配列番号１４８のアミノ酸配列に対しては配列番号１２９の塩基配列、配列番号１４９のアミノ酸配列に対しては配列番号１３０の塩基配列、配列番号１５０のアミノ酸配列に対しては配列番号１３１の塩基配列、配列番号１５１のアミノ酸配列に対しては配列番号１３２の塩基配列、配列番号１５２のアミノ酸配列に対しては配列番号１３３の塩基配列、配列番号１５３のアミノ酸配列に対しては配列番号１３４の塩基配列、配列番号１５４のアミノ酸配列に対しては配列番号１３５の塩基配列、配列番号１５５のアミノ酸配列に対しては配列番号１３８の塩基配列、配列番号１５６のアミノ酸配列に対しては配列番号１３９の塩基配列、配列番号１５７のアミノ酸配列に対しては配列番号１４０の塩基配列、配列番号１５８のアミノ酸配列に対しては配列番号１４１の塩基配列を有することができる。

同時に、本発明は、プロモーター及びこれと作動可能に連結された上記ポリヌクレオチドを含むブラゼイン変異体及び多重変異体発現用組換え発現ベクターを提供する。

上記「プロモーター」というのは、特定の宿主細胞で作動可能に連結された核酸配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）」というのは、１つの核酸断片が他の核酸断片と結合され、その機能または発現が他の核酸断片によって影響を受けることを言う。また、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列及び転写及び解読の終決を調節する配列をさらに含むことができる。上記プロモーターとしては、すべての時間帯に常時的に目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）または特定の位置、時期に目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）を使用することができ、その例としては、大腸菌ｐｅｌＢプロモーター、Ｕ６プロモーター、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター（ＨｉｔｏｓｈｉＮｉｗａｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ、１０８：１９３−１９９、１９９１；Ｍｏｎａｈａｎｅｔａｌ．、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、７：２４−３０、２０００）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２、１９８５）、Ｒｓｙｎ７プロモーター（米国特許出願第０８／９９１、６０１号）、ライスアクチン（ｒｉｃｅａｃｔｉｎ）プロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙｅｔａｌ．、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：１６３−１７１、１９９０）、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｔａｌ．、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２、１９８９）、ＡＬＳプロモーター（米国特許出願第０８／４０９、２９７）などがある。その他、米国特許第５、６０８、１４９；第５、６０８、１４４号、第５、６０４、１２１号、第５、５６９、５９７号、第５、４６６、７８５号、第５、３９９、６８０号、第５、２６８、４６３号及び第５、６０８、１４２号などに開示されたプロモーターをすべて使用することができる。好ましくは、上記プロモーターは、大腸菌ｐｅｌＢプロモーターを使用することができる。

大腸菌ｐｅｌＢ信号配列は、大腸菌の細胞膜間隙信号配列の一種であって（Ｒｉｅｔｓｃｈｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１３０４０８−１３０５３、１９９６、Ｒａｉｎａｅｔａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：１７９−２０２、１９９７、Ｓｏｎｅｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０３４９−１０３５２、１９９７）、本発明のブラゼインが合成されれば、大腸菌の細胞膜間隙に移動させて、正確な二硫化結合を誘導するようにし、ブラゼインタンパク質の不溶性凝集体形成を抑制し、不要な大腸菌由来のタンパク質を最小にして精製過程が容易にすることができる。本発明の大腸菌ｐｅｌＢ信号配列は、好ましくは、配列番号１３７の塩基配列を有し、本発明のブラゼイン変異体のヌクレオチド配列の５’上端にタンパク質への翻訳時に同一のフレームを有するように連結される。

本発明において「組換え発現ベクター」というのは、宿主細胞で目的タンパク質発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）または目的ＲＮＡを転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）することができるベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子製作物を言う。

本発明のベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。適当な発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサー（促進遺伝子）のような発現調節配列以外にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的によって多様に製造されることができる。また、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起点を含む。

上記で、本発明のブラゼイン変異体発現のための組換え発現ベクターは、好ましくは、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ４０Ａ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ４０Ｄ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ４０Ｋ）またはｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ４０Ｒ）であることができ、これは、各々ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｍｅｔ−）を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にしてｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ）の場合は配列番号１９、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ）の場合は配列番号２８、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ４０Ａ）の場合は配列番号３２、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ４０Ｄ）の場合は配列番号３３、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ４０Ｋ）の場合は配列番号３４、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ４０Ｒ）の場合は、配列番号３６を利用した位置−指定突然変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法により製造することができる。

また、上記で、本発明のブラゼイン多重変異体のうちブラゼイン２次変異体の発現のための組換え発現ベクターは、好ましくは、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ａ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ｄ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ｋ）またはｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ｒ）であることができ、これは、各々ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ）を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にして、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ）の場合は配列番号２８、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ａ）の場合は配列番号３２、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ｄ）の場合は配列番号３３、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ｋ）の場合は配列番号３４、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ｒ）の場合は配列番号３６を利用して位置−指定突然変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法により製造することができる。

また、上記で、本発明のブラゼイン多重変異体のうちブラゼインの他の２次変異体の発現のための組換え発現ベクターは、好ましくは、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）またはｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）であることができ、これは、各々ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ）を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にして、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）の場合は配列番号３２、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）の場合は配列番号３３、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）の場合は配列番号３４、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）の場合は配列番号３６を利用して位置−指定突然変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法により製造することができる。

また、上記で、本発明のブラゼイン多重変異体のうちブラゼイン３次変異体の発現のための組換え発現ベクターは、好ましくは、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）またはｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）であることができ、これは、各々ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ）を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にしてｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）の場合は配列番号３２、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）の場合は配列番号３３、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）の場合は配列番号３４、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）の場合は配列番号３６を利用して位置−指定突然変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法により製造することができる。

また、上記で、本発明のブラゼイン多重変異体のうちブラゼイン４次変異体の発現のための組換え発現ベクターは、好ましくは、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）またはｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）であることができ、これは、各々配列番号１３６のプライマーとして使用してｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）の場合はｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）を、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）の場合はｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）を、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）の場合はｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）を、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）の場合はｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）を各々鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にして位置−指定突然変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法により製造することができる。

また、本発明は、上記組換え発現ベクターを含む大腸菌を提供する。上記大腸菌は、上記組換え発現ベクターで通常の形質転換方法により形質転換され、この際、形質転換は、核酸を宿主細胞に導入するいずれの方法をも含まれ、当分野において公知されたように、宿主細胞によって適した標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、微細射出法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＰＥＧ−媒介融合法（ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄｆｕｓｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リポソーム媒介法（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ）などが含まれるが、これに制限されない。

本発明は、上記形質転換された大腸菌を培養し、培養された大腸菌から細胞膜間隙タンパク質を分離し、ブラゼインを精製するために熱処理することを含むブラゼイン変異体の製造方法を提供する。

本発明のポリヌクレオチドを含むように形質転換された大腸菌は、ブラゼイン変異体をコーディングするポリヌクレオチドが発現されるように適切な培地及び条件下で培養されることができ、これは、通常的な大腸菌の培養条件と同一または類似である。上記形質転換された大腸菌が培養される間に、発現ベクター内の発現調節配列によってｐｅｌＢ信号配列を含むブラゼインが発現され、このような本発明においてブラゼインの発現は、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）のような通常的な誘導性プロモーターの発現を促進する化合物なしも行われる。発現されたｐｅｌＢ信号配列を含むブラゼインは、信号配列によって大腸菌の細胞膜間隙に移動するようになり、大腸菌のシグナルペプチダーゼ（ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ）によって信号配列が除去され、ブラゼインが合成されるようになる。

形質転換された細胞で発現されたブラゼインを大腸菌の細胞膜間隙から分離するためには、大腸菌の細胞膜間隙でタンパク質を分離する公知の方法（Ｓｎｙｄｅｒｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７７：９５３９６３、１９９５）を利用することができ、これに限定されないが、例えば、培養された大腸菌を集菌した後、２０％スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）が含まれた３０ｍＭトリス−塩酸（Ｔｒｉ−ＨＣｌ、ｐＨ８）溶液に懸濁し、ＥＤＴＡ（ｐＨ８）溶液及びＭｇＳＯ_４を利用して大腸菌の細胞膜間隙のタンパク質を溶出させる方法により行われることができる。

大腸菌の細胞膜間隙タンパク質から本発明のブラゼインを分離する方法は、当業界に公知された多様な分離及び精製方法を用いて行うことができ、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿及びリン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノールなどを利用したタンパク質分画沈殿）、透析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィーなどの技法を単独または組合で適用させて、本発明のブラゼインを分離することができる。本発明のブラゼインは、熱に安定しているので、好ましくは、ブラゼインを分離する方法は、熱処理をして行われることができる。これに限定されないが、熱処理は、好ましくは、７０〜９０℃で１５〜６０分間加熱し、ブラゼインを除いた他のタンパク質を熱変性させた後、４℃で１８０００ｇで３０分間遠心分離を通じて熱変性されたタンパク質とブラゼインを分離することができる。

参照として、上記で言及したヌクレオチド及びタンパク質作業には、次の文献を参照することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、２ｄＥｄ．、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍ．、ＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８２．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０））。

前述したように、本発明においてさらに高い甘味を有し且つ高い熱安定性を有する配列番号１００、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５または配列番号１１７のアミノ酸配列を有するブラゼイン変異体及び配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７または配列番号１５８のアミノ酸配列を有するブラゼイン多重変異体の酵素学的特性を整理すれば、下記の通りである。
１）分子量：６．５ｋＤａ
２）高い熱安定性及び耐酸性
３）高い水溶性
４）ブラゼイン副タイプのタンパク質基準ブラゼイン変異体甘味比率：２〜３．３倍以上
５）１ｇ／１００ｍＬのスクロース対比ブラゼイン変異体甘味比率：約４，０００〜約６，６００倍以上
６）ブラゼインの副タイプのタンパク質基準ブラゼイン多重変異体甘味比率：４〜２０倍以上
７）１ｇ／１００ｍＬのスクロース対比ブラゼイン多重変異体甘味比率：約８、０００〜約４０，０００倍以上

このように本発明によるブラゼイン変異体及びこれを基本にして作成されたブラゼイン多重変異体は、本発明者の特許出願（韓国特許出願第２００６−９７６１９号）で発現、精製されたブラゼインの副タイプのタンパク質、すなわち天然型のブラゼインの副タイプのタンパク質と韓国特許出願出願番号第１０−２００７−０１１７０１３号で発現、精製されたブラゼイン変異体と比較した時、熱安定性及び耐酸性及び水溶性の特性は、天然型のブラゼインと類似し、且つさらに高い甘味を示す新規アミノ酸配列を有することを特徴とする。

また、このような本発明においてブラゼイン変異体は、米国特許（ＵＳ６、２７４、７０７Ｂ１；ＵＳ７、１５３、５３５）によって公知されたブラゼイン変異体よりさらに高い甘味を示し、効果がある。

したがって、本発明のブラゼイン変異体は、砂糖、果糖、オリゴ糖のような天然甘味料またはアスパルテームのような人工甘味料の代わりに使用されることができる。したがって、本発明は、また甘味料の製造のための上記ブラゼイン変異体の用途、食品糖度増進のための上記ブラゼイン変異体の用途、上記ブラゼイン変異体を含む甘味料、及び上記ブラゼイン変異体を甘味料として含む食品組成物を提供する。

本発明の食品組成物は、機能性食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｏｏｄ）、栄養補助剤（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、健康食品（ｈｅａｌｔｈｆｏｏｄ）及び食品添加剤（ｆｏｏｄａｄｄｉｔｉｖｅｓ）などのすべての形態を含む。上記類型の食品組成物は、当業界に公知された通常的な方法により多様な形態で製造することができる。

例えば、飲料（アルコール性飲料を含む）、果実及びその加工食品（例：果物缶詰め、瓶詰め、ジャム、マーマレードなど）、魚類、肉類及びその加工食品（例：ハム、ソーセージコンビーフなど）、パン類及び麺類（例：うどん、そば、ラーメン、スパゲッティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チイズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例：みそ、しょうゆ、ソースなど）などに本発明のブラゼイン変異体を添加して製造することができる。

また、本発明のブラゼイン変異体を含有する食品組成物を甘味料のような食品添加剤の形態で使用するためには、粉末または濃縮液形態で製造して使用することができる。

本発明の食品組成物のうち本発明のブラゼイン変異体の好ましい含有量としては、食品の全体重量に対して約０．０１〜１０重量％を含むことができる。

以上説明したように、本発明のブラゼイン変異体は、従来のブラゼインより優れた熱安定性及び耐酸性及び水溶性などの特性を有し、且つ従来のブラゼインに比べて最小２倍から最大３．３倍以上の甘味を有していて、ブラゼイン多重変異体の場合、ブラゼイン変異体と同様に、ブラゼイン副タイプのタンパク質と同一の安定性及び最小４倍から最大２０倍以上の甘味を有している。したがって、本発明のブラゼイン変異体は、少ない量でもさらに多い量の砂糖（スクロース）のような他の甘味料を代替することができ、食品組成物などに甘味料として多様に使用されることができる。

図１は、本発明によるブラゼイン変異体を発現するための組換え発現ベクターを製作する過程を示す模式図である。図２は、本発明によるブラゼイン変異体とブラゼイン多重変異体を製作する過程を示す模式図である。図３は、本発明によるブラゼイン変異体とブラゼイン多重変異体を製作する過程を示す模式図である。図４は、本発明によるブラゼイン変異体とブラゼイン多重変異体を製作する過程を示す模式図である。図５は、本発明によるブラゼイン変異体の甘味測定後に高い甘味を示すブラゼイン変異体を選別し、熱安定性を行った結果である。レーン１：熱処理後、ブラゼイン副タイプ（ｍｉｎｏｒｔｙｐｅ）の相対活性度レーン２：熱処理後、ブラゼイン変異体（Ｈ３０Ｋ）の相対活性度レーン３：熱処理後、ブラゼイン変異体（Ｈ３０Ｒ）の相対活性度レーン４：熱処理後、ブラゼイン変異体（Ｅ３５Ｄ）の相対活性度レーン５：熱処理後、ブラゼイン変異体（Ｅ４０Ａ）の相対活性度レーン６：熱処理後、ブラゼイン変異体（Ｅ４０Ｄ）の相対活性度レーン７：熱処理後、ブラゼイン変異体（Ｅ４０Ｋ）の相対活性度レーン８：熱処理後、ブラゼイン変異体（Ｅ４０Ｈ）の相対活性度レーン９：熱処理後、ブラゼイン変異体（Ｅ４０Ｒ）の相対活性度図６は、本発明によるブラゼイン多重変異体を確認するための電気泳動結果を示すものである。レーンＭ：分子量マーカーレーン１：精製されたブラゼイン２次変異体（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ）レーン２：精製されたブラゼイン２次変異体（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ａ）レーン３：精製されたブラゼイン２次変異体（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ｄ）レーン４：精製されたブラゼイン２次変異体（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ｋ）レーン５：精製されたブラゼイン２次変異体（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ４０Ｒ）レーン６：精製されたブラゼイン２次変異体（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）レーン７：精製されたブラゼイン２次変異体（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）レーン８：精製されたブラゼイン２次変異体（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）レーン９：精製されたブラゼイン２次変異体（Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）レーン１０：精製されたブラゼイン３次変異体（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）レーン１１：精製されたブラゼイン３次変異体（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）レーン１２：精製されたブラゼイン３次変異体（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）レーン１３：精製されたブラゼイン３次変異体（Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）レーン１４：精製されたブラゼイン４次変異体（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）レーン１５：精製されたブラゼイン４次変異体（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）レーン１６：精製されたブラゼイン４次変異体（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）レーン１７：精製されたブラゼイン４次変異体（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）図７は、本発明によるブラゼイン変異体の精製度及び構造的差異を比較するために逆相クロマトグラフィーを行った結果を示すものである。Ａ：精製されたブラゼイン副タイプ（ｍｉｎｏｒｔｙｐｅ）Ｂ：精製されたブラゼイン４次変異体（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ａ）Ｃ：精製されたブラゼイン４次変異体（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｄ）Ｄ：精製されたブラゼイン４次変異体（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｋ）Ｅ：精製されたブラゼイン４次変異体（２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄ＿Ｅ４０Ｒ）

以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。

〈実施例１〉
ブラゼイン１次変異体を暗号化するポリヌクレオチドのクローニング
ブラゼインより高い甘味を示すブラゼイン変異体を製造するために、まず、ブラゼインの副タイプ（ｍｉｎｏｒｔｙｐｅ）を構成している１つの特定アミノ酸を選択し、他の特定アミノ酸に変異させる作業を行った。

まず、変異させる特定アミノ酸でブラゼインの構造分析を通じて外部残基（ｓｉｄｅｃｈａｉｎ）が外方に向かっていて、極性を有する残基を選択した。このような構造的情報に基づいて本発明者の特許出願（韓国特許出願第２００６−９７６１９号）で使用した大腸菌内でブラゼインの副タイプのタンパク質が合成されるように不要な「ＡＴＧ」配列を除去した配列番号１の配列を含む組換え発現ベクター（ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｍｅｔ−）、実施例６参照）を鋳型にして下記の表１に明示された４０個のプライマーと各々のプライマーと相補的な配列を有するプライマーを合成した。上記プライマーは、ブラゼイン副タイプタンパク質を構成している特定アミノ酸（表１参照）の外部残基長さ及び電気的性格を考慮して設計された。下記表１のプライマーとＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を利用して製造社の指針によってブラゼイン副タイプのタンパク質の特定位置を置換させた４０種のブラゼイン変異体を暗号化しているヌクレオチドを含む発現ベクターを得ることができた。この際、下記表１のプライマー配列のうち下線部分は、ブラゼイン変異体のために変化した配列を示す。

具体的に、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｍｅｔ−）ベクター１０ｎｇ、各々最終濃度０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物、各々１２５ｎｇの上記表１に明示されたプライマー、１０×反応バッファー５μＬ、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）１μＬを含む全体５０μＬを反応液としてＰＣＲを行った。上記ＰＣＲ反応は、９５℃１分間前変性させた後、９５℃３０秒、５５℃１分、６８℃１５分を２０回反応させ、６８℃で１５分間最終反応をさせた。反応が終わった後、１．０％アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）ゲル電気泳動によって増幅された生成物を確認し、増幅が行われた生成物を３７℃で１時間ＤｐｎＩで処理した。その後、すぐスーパーコンピテント細胞（ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ）である大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した。上記形質転換されたＸＬ１−Ｂｌｕｅは、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が含有されたＬＢ−寒天プレート（ＬＢ−ａｇａｒｐｌａｔｅ）で１２時間培養して選別し、選別されたコロニーをＬＢ−寒天培地で培養し、大腸菌からＤＮＡを分離した。上記分離したＤＮＡに対してｐｅｌＢ信号配列と各々のブラゼイン変異体を暗号化しているヌクレオチドが連結されていることを遺伝子分析を通じて確認した。これは、下記表２に明示されている配列番号及びヌクレオチド名で命名した。この際、下記表２及び以下で変異体を指称する方法は、例えば、Ｋ５Ｄの場合、ブラゼインの副（ｍｉｎｏｒ）タイプタンパク質の５番位置のリシン（ｌｙｓｉｎｅ）残基をアスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ）残基に置換したことを示す。各々のアミノ酸を指称する１文字は、公知されたアミノ酸コードによって指定した。

上記実験結果、全体種のブラゼイン変異体のための発現ベクターを製作することができ、これを再び大腸菌ＢＬ２１（ｓｔａｒ）に形質転換し、大量発現に利用した（図１参照）。

〈実施例２〉
ブラゼイン１次変異体の発現及び精製
〈２−１〉ブラゼイン１次変異体の発現
上記実施例１で製作したブラゼイン１次変異体のための３２種の発現ベクターを導入した各々の大腸菌ＢＬ２１（ｓｔａｒ）を３０μＬ／ｍＬのカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が含まれたＬＢ培地１Ｌでタンパク質誘導剤であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−ｔｈｏｉｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）の添加なしに３７℃で１２時間培養し、各々の形質転換された大腸菌で各々のブラゼイン変異体が発現されるようにした。

〈２−２〉ブラゼイン変異体の精製
常時〈実施例２−１〉で培養された各々の大腸菌を８，０００ｇで１０分間遠心分離し、集菌した。集菌後、２０％スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）が含まれた３０ｍＭトリス−塩酸（Ｔｒｉ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）溶液に懸濁させた後、０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液を最終濃度が１ｍＭとなるように添加し、常温で１０分間ゆっくり撹拌させた。これを１０，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離をし、上澄み液を除去した後、冷たい５ｍＭＭｇＳＯ_４を添加し、氷上で１０分間ゆっくり撹拌させた。この過程で、細胞膜間隙（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）のタンパク質が緩衝溶液に離脱されて出る。その後、１０，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上澄み液を分離し、細胞膜間隙（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）に存在するブラゼイン変異体を精製するために、８０℃で３０分間熱処理をした。その後、蒸溜水で２４時間透析後、凍結乾燥し、下記の表３の配列番号で表示される精製されたブラゼイン１次変異体を得ることができ、精製度は、一次的にＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて確認した。

上記実験結果、ブラゼインタンパク質が純度高く精製され、その分子量は、約６．５ｋＤａであるものと現われた。

〈２−３〉ブラゼイン１次変異体の精製度確認及び構造変化確認
精製されたブラゼインの副タイプのタンパク質と上記〈実施例２−２〉から精製された各々のブラゼイン変異体の精製度を確認した後、構造的差異を分析するために、Ｖａｒｉｎａ社の高性能液体クロマトグラフィー（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に逆相クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｌｕｍｎ）であるＶｙｄａｃ２１４ＴＰ５４（米国）カラムを利用して分析した。溶媒条件は、水に０．０５％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）が含まれた溶媒Ａとアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）に０．０５％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）が含まれた溶媒Ｂを分当たり１ｍＬの流速で３０分間溶媒Ｂが１０％〜５０％となるように順次に勾配（ｌｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔ）されるように溶出させた。溶出させた溶液は、２１０ｎｍで吸光度の変化を観察した。

その結果、大部分のブラゼイン変異体が１５分の遅延時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ）が経過した後、溶出されていることを確認することができ、これは、発現されたブラゼイン変異体の構造的差異がほとんどないことを示す結果である。

〈実施例３〉
ブラゼイン１次変異体の活性（甘味）及び熱安定性測定
〈３−１〉ブラゼイン１次変異体の甘味測定
本発明での組換えブラゼインは、環を有する糖系の化合物ではないので、糖度計を利用して甘味を測定することができないので、人間の味覚を利用して活性を測定した。糖度測定は、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）溶液を利用して最初甘味を感じることができるスクロース最小の濃度がほぼ類似するように訓練された２０名の被実験者を対象とし、各々の変異体を利用して最初甘味を感じることができる濃度を測定した。また、ブラゼイン比較甘味比率は、スクロース溶液の場合、甘味を感じる最低刺激量が１ｇ／１００ｍＬであり、ブラゼイン副タイプのタンパク質の場合、甘味を感じる最低刺激量は、５００μｇ／１００ｍＬであるので、これを基準にして算定した（すなわち、ブラゼイン副タイプの場合、１／０．０００５＝２０００）。

その結果、上記の表４から明らかなように、配列番号９９で表示されるブラゼイン（Ｈ３０Ｋ）、配列番号１００で表示されるブラゼイン（Ｈ３０Ｒ）、配列番号１０９で表示されるブラゼイン（Ｅ３５Ｄ）、配列番号１１３で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ａ）、配列番号１１３で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ａ）、配列番号１１４で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ｄ）、配列番号１１５で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ｋ）、配列番号１１６で表示される変異体（Ｅ４０Ｈ）及び配列番号１１７で表示される変異体（Ｅ４０Ｒ）をブラゼイン副タイプのタンパク質と比較した場合、最小２倍から最大約３．３倍以上（１ｇ／１００ｍＬのスクロース対比最小約４，０００倍から最大約６，６００倍）の甘味を示すものと確認された。特に、ブラゼイン（Ｅ４０Ｄ）の場合、最も高い甘味増加率を示す。

〈３−２〉ブラゼイン１次変異体の熱安定性測定
上記〈実施例３−１〉で測定された結果に基づいて高い甘味を示すブラゼイン変異体、すなわち配列番号９９で表示されるブラゼイン（Ｈ３０Ｋ）、配列番号１００で表示されるブラゼイン（Ｈ３０Ｒ）、配列番号１０９で表示されるブラゼイン（Ｅ３５Ｄ）、配列番号１１３で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ａ）、配列番号１１３で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ａ）、配列番号１１４で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ｄ）、配列番号１１５で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ｋ）、配列番号１１６で表示される変異体（Ｅ４０Ｈ）及び配列番号１１７で表示される変異体（Ｅ４０Ｒ）のようなブラゼイン変異体１００ｍｇを５０ｍＭトリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）溶液に溶解させた後、８０℃で４時間加熱後、各々のブラゼイン１次変異体に対して熱処理前の甘味を基準にして上記〈実施例３−１〉と同一の方法で２０名の被実験者を対象にして甘味変化程度を測定し、その結果を相対活性で示し、図５に記載した。

その結果、図５に示されたように、配列番号１００で表示されるブラゼイン（Ｈ３０Ｒ）、配列番号１０９で表示されるブラゼイン（Ｅ３５Ｄ）、配列番号１１３で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ａ）、配列番号１１３で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ａ）、配列番号１１４で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ｄ）、配列番号１１５で表示されるブラゼイン（Ｅ４０Ｋ）及び配列番号１１７で表示される変異体（Ｅ４０Ｒ）のようなブラゼイン変異体がブラゼインの熱安定性をそのまま維持するものと現われた。

〈実施例４〉
ブラゼイン多重変異体を暗号化しているポリヌクレオチドのクローニング
上記〈実施例３−２〉の結果に基づいてブラゼイン副タイプタンパク質と類似の安定性を有し、これと比較した時、高い甘味を示すブラゼイン１次変異体（Ｈ３０Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ４０Ａ、Ｅ４０Ｄ、Ｅ４０Ｒ、Ｅ４０Ｋ）を利用してさらに高い甘味を示すブラゼイン２次変異体を作成した。

具体的に、ブラゼイン２次変異体を作成するために、下記表５〜表７に鋳型（ブラゼイン１次変異体を暗号化するポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクター）と１次変異体作成のために使用したプライマーを利用して上記〈実施例１〉の位置−指定突然変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法でブラゼイン２次変異体を暗号化している全体９種のポリヌクレオチドを作成した。この際、下記表５〜表７での命名法は、例えば、Ｈ３０Ｒ＿Ｅ３５Ｄの意味は、ブラゼインの副タイプ（ｍｉｎｏｒｔｙｐｅ）タンパク質の３０番位置のヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）残基がアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）残基に、３５番位置のグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）残基がアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃａｉｃｄ）残基に同時に置換されたことを意味し、２９ｉｎｓ３０Ｌｙｓ＿は、２９番と３０番位置にリシン残基が挿入されたことを意味する。また、プライマー配列において下線部分は、ブラゼイン変異体のために変化した配列を意味する。

また、さらに高い甘味を示すブラゼイン３次変異体を作成するために、上記表５に鋳型（ブラゼイン２次変異体を暗号化するポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクター）と１次変異体作成のために使用したプライマーを利用して上記〈実施例１〉の位置−指定突然変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法でブラゼイン３次変異体を暗号化している全体４種のポリヌクレオチドを作成した。

また、上記〈実施例３〉のブラゼイン１次変異体の甘味テスト結果を通じてブラゼイン副タイプタンパク質の２９番位置のリシン残基と３０番位置のヒスチジン残基が甘味を示すのに重要な位置であると仮定し、ブラゼイン３次変異体の２９番位置のリシン残基と３０番位置のアルギニン残基との間にリシン残基を挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）し、ブラゼイン４次変異体を作成した。このために、上記表５に記載された鋳型（ブラゼイン３次変異体を暗号化するポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクター）、配列番号１３６で表示されるリシン残基を暗号化しているプライマーとこれに相補的な配列を有するプライマーを合成し、上記〈実施例１〉の位置−指定突然変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法でブラゼイン４次変異体を暗号化している全体４種のポリヌクレオチド作成した。これを下記表８の明示されている配列番号及びヌクレオチド名で命名した。

その結果、全体１７種のブラゼイン多重変異体のための発現ベクターを製作することができ、これを再び大腸菌ＢＬ２１（ｓｔａｒ）に形質転換し、大量発現に利用した。

〈実施例５〉
ブラゼイン多重変異体発現精製及び特性調査
上記実施例４で製作したブラゼイン多重変異体のための１７種の発現ベクターを導入した各々の大腸菌ＢＬ２１（ｓｔａｒ）を利用して上記〈実施例２−１〉と〈実施例２−２〉と同一発現及び精製をし、表９〜表１１の配列番号で表示される精製されたブラゼイン変異体を得ることができ、精製度は、一次的にＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて確認した。

その結果、図６に示されたように、ブラゼインタンパク質が純度高く精製され、その分子量は、約６．５ｋＤａであるもの現われた。

また、上記〈実施例２−３〉と同一の方法でＶａｒｉｎａ社の高性能液体クロマトグラフィー（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用してブラゼイン多重変異体の構造的差異を分析し、その結果、ブラゼイン４次変異体を除いた大部分のブラゼイン多重変異体は、ブラゼイン変異体と同様に約１５分の遅延時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ）が経過した後、溶出されていることを確認することができた。しかし、ブラゼイン４次変異体の場合、約２０分の遅延時間後に溶出されたことを確認した。このような結果は、ブラゼイン３次変異体の２９番位置のリシン残基と３０番位置のアルギニン残基との間にリシン残基が挿入されることによって、本然のブラゼインタンパク質との構造的差異が誘発されたと考えられた（図７参照）。

また、上記〈実施例３−１〉と同一の方法でブラゼイン多重変異体に対する活性（甘味）測定を行い、その結果を下記表１２に記載した。

上記の表１２に示されたように、すべてのブラゼイン多重変異体は、ブラゼイン副タイプのタンパク質と比較した場合、最小４倍から最大約２０倍以上（１ｇ／１００ｍＬのスクロース対比最小約８，０００倍から最大約４０，０００倍）の甘味を示すものと現われた。

また、〈実施例３−２〉と同一の方法で、上記のブラゼイン多重変異体を利用して熱安定性を測定した結果、すべてのブラゼイン多重変異体がブラゼイン副タイプのタンパク質と同一の熱安定性を示す。ブラゼイン多重変異体のうち４次変異体の高性能液体クロマトグラフィー（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析結果、ブラゼイン副タイプのタンパク質と異なる構造的特性を示すにもかかわらず、熱安定性は、同一に維持されていることを確認した。

このような結果を総合して、ブラゼイン副タイプ（ｍｉｎｏｒｔｙｐｅ）のタンパク質の構造及び構成しているアミノ酸を分析し、外部残基（ｓｉｄｅｃｈａｉｎ）がタンパク質の外部に向けていて、電気的極性を有している特定アミノ酸を選択し、４０種のブラゼイン１次変異体を作成した。それらのうちブラゼイン副タイプのタンパク質と比較した時、同一の熱安定性及び最小２倍から最大３．３倍までの高い甘味を示すブラゼイン６種のブラゼイン（Ｈ３０Ｒ、Ｅ３５Ｄ、Ｅ４０Ａ、Ｅ４０Ｄ、Ｅ４０Ｒ、Ｅ４０Ｋ）１次変異体を選別した。選別されたブラゼイン１次変異体を利用して副タイプのタンパク質と比較した時、同一の熱安定性及びさらに高い甘味を示すブラゼイン多重変異体を作成した。ブラゼイン３次変異体の２９番位置のリシン残基と３０番位置のアルギニン残基との間にリシン残基を挿入したブラゼイン４次変異体を除いた大部分のブラゼイン多重変異体は、ブラゼイン副タイプのタンパク質と同一の構造を形成した。ブラゼイン４次変異体の構造的差異は、挿入されたリシン残基による影響であると考えられる。しかし、ブラゼイン４次変異体を含むすべてのブラゼイン多重変異体がブラゼイン副タイプのタンパク質と同一の熱安定性を示し、最小４倍から最大４０倍までの甘味が増加することを確認することができた。

〈実施例６〉
組換え発現ベクターｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｍｅｔ−）の製作
〈６−１〉ブラゼインを暗号化している新しい人工遺伝子合成
ペンタジプランドラブラゼナバイロン（ＰｅｎｔａｄｉｐｌａｎｄｒａｂｒａｚｚｅａｎａＢａｉｌｌｏｎ）の実の抽出物であるブラゼインの配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ５６５５２）で一番目の配列（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）を除いたアミノ酸配列に基づいていて、大腸菌内部に多く存在するコドン（Ｅ．ｃｏｌｉｕｓａｇｅｃｏｄｏｎ）を利用して以下のような配列番号１５９の配列を決定した。この際、ボルド体で示す部分は、大腸菌内部に多く存在するコドンに基づいてＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ５６５５２の配列で変形させた部分を示す：ＧＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣＧＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＧＴＴＴＣＴＡＡＧＴＧＣＣＡＡＣＴＴＧＣＴＡＡＴＣＡＡＴＧＣＡＡＴＴＡＣＧＡＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＡＡＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＴＧＣＴＴＴＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＣＧＡＴＴＡＣＴＧＣＧＡＡＴＡＣＴＡＡ。

上記配列番号１５９の配列情報に基づいてタカラコリアバイオメディカルに依頼し、人工的にブラゼイン遺伝子のポリヌクレオチドを合成した。

〈６−２〉プライマー製作
上記合成されたポリヌクレオチドをｐＥＴ２６Ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）のｐｅｌＢシグナル配列と連結するために、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）のＭＣＳ（ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）に含まれている制限酵素サイトＮｃｏＩとＸｈｏＩが含まれるようにプライマーを合成し、これを各々配列番号１６０（正方向プライマー、ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣ）及び配列番号１６１（逆方向プライマー、ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＡＴＴＣＧＣＡＧＴＡＡＴＣＧ）と言った。この時、ＮｃｏＩとＸｈｏＩサイトは、各々下線で表示した。

〈６−３〉ＰＣＲによるブラゼイン遺伝子の増幅
上記実施例６−１で合成したブラゼイン遺伝子を鋳型にし、〈実施例６−２〉で合成した２つのプライマーを使用してブラゼイン遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応は、鋳型遺伝子（合成したブラゼイン遺伝子、配列番号１５９）１．５μＬ、正方向プライマー（配列番号１６０）２μＬ、逆方向プライマー（配列番号１６１）１μＬ、２５ｍＭＭｇＣｌ_２３μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰ４μＬ、１０×Ｅｘ−ｔａｑｂｕｆｆｅｒ５μＬ、Ｅｘ−ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ、日本国）１μＬ、Ｈ_２Ｏ３１．５μＬを含む最終体積５０μＬを反応液としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間前変性させた後、９８℃３０秒、５８℃２分、７４℃３分を３５回反応させ、７４℃で１０分間最終反応をさせた。反応が終わった後、２．０％アガロースゲル電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって増幅されたブラゼイン遺伝子を確認した後、アガロースゲルで増幅されたブラゼイン遺伝子を回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を利用して抽出、精製した。抽出したブラゼイン遺伝子は、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）に挿入した後（これをｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−Ｂｒａｚｚｅｉｎという）、上記ブラゼイン遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクターを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換させた。これを５０μｇ／ｍＬアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれた平板Ｌ−ブロス（Ｂｒｏｔｈ）培地上で培養し、形質転換された大腸菌を選別し、これをさらに液体Ｌ−ブロス培地で培養した後、これからブラゼイン遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクターを多量で収得した。

〈６−４〉組換え発現ベクターｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｍｅｔ−）の製作
上記〈実施例６−３〉でクローニングしたｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−Ｂｒａｚｚｅｉｎベクターを制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩ（１０×Ｋｂｕｆｆｅｒ及び０．１％ＢＳＡ使用）を使用して３７℃で６時間切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した。Ｔ７ｐｒｏｍｏｔｅｒを有する発現ベクターｐＥＴ２６Ｂ（＋）ベクターも上記条件と同一の条件で切断した。ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ−Ｂｒａｚｚｅｉｎベクターでブラゼイン遺伝子部分と切断されたｐＥＴ２６Ｂ（＋）ベクターをＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を使用して精製した。これを混合し、Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ、日本国）を使用して１６℃で１２時間反応させた後、ＪＭ１０９感応細胞（ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ）に形質転換した（図２〜図４参照）。ライゲイション結果、生成された組換え発現ベクターをｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎと命名した。

一方、本発明の組換えブラゼインは、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）後、翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）過程が進行されることによって、大腸菌の細胞膜間隙（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）に移動した後、大腸菌内シグナルペプチダーゼ（ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ）によって組換えブラゼインと融合されたｐｅｌＢ信号配列が除去される。しかし、プライマー内の制限酵素ＮｃｏＩ内部のＡＴＧによって翻訳されるＭｅｔは、シグナルペプチダーゼによって除去されない。

したがって、天然物から抽出したマイナー（ｍｉｎｏｒ）形態のブラゼインと同一の形態のブラゼインを発現させるために、ＰＣＲを利用した部位特異的変異法を通じてｐＥＴ２６Ｂ（＋）−ＢｒａｚｚｅｉｎベクターでｐｅｌＢシグナル配列後につながる制限酵素（ＮｃｏＩ）内部の「ＡＴＧ」を除去した（図２〜図４参照）。これを詳しく説明すれば、次の通りである。

ブラゼイン遺伝子のうち除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）させようとする塩基を中心にして両側にブラゼインの塩基配列と同一に約１５ｂｐ長さにして配列番号１６２（ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡ）及び配列番号１６３（ＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＧＴＣＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧ）のプライマーを合成し、これらは、各々除去されるＡＴＧを除いてブラゼインの各単一鎖と互いに相補的に結合することができるものである。上記ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎベクターを鋳型にして、配列番号１６２及び配列番号１６３のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を使用してＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を利用して製造社の指針によって上記記載したもののようにｐＥＴ２６Ｂ（＋）−ＢｒａｚｚｅｉｎベクターでＡＴＧが除去されたｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｍｅｔ−）を得た。すなわち、ｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎベクター１０ｎｇ、各々最終濃度０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合物、各々１２５ｎｇの配列番号１６２及び配列番号１６３のプライマー、１０×反応バッファー５μＬ、Ｐｆｕ−ＴｕｒｂｏＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）１μＬを含む全体５０μＬを反応液としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分間前変性させた後、９８℃３０秒、５５℃１分、６８℃１５分を１５回反応させて、６８℃で１０分間最終反応をさせた。反応が終わった後、１．０％アガロースゲル電気泳動によって増幅された生成物を確認し、増幅が行われた生成物を３７℃で１時間ＤｐｎＩで処理した。その後、すぐスーパーコンピテント細胞（ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ）である大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換した。形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅは、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が含有されたＬＢ−ａｇａｒｐｌａｔｅで１２時間培養して選別し、選別されたｃｏｌｏｎｙをＬＢ−ａｇａｒ培地で培養し、大腸菌からＤＮＡを分離した。分離したＤＮＡに対して各々塩基配列分析を通じてＡＴＧが除去された変異体として確認されたベクターをさらに大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−Ｓｔａｒに形質転換し、大量発現に利用した。部位特異的変異法により生成された組換え発現ベクターをｐＥＴ２６Ｂ（＋）−Ｂｒａｚｚｅｉｎ（Ｍｅｔ−）と命名した。

本発明のブラゼイン変異体は、従来のブラゼインより優れた熱安定性及び耐酸性及び水溶性などの特性を有し、且つ従来のブラゼインに比べて最小２倍から最大３．３倍以上の甘味を有していて、ブラゼイン多重変異体の場合、ブラゼイン変異体と同様にブラゼイン副タイプのタンパク質と同一の安定性及び最小４倍から最大２０倍以上の甘味を有している。したがって、本発明のブラゼイン変異体は、少ない量でもさらに多い量の砂糖（スクロース）のような他の甘味料を代替することができ、食品組成物などに甘味料として多様に使用されることができる。

Claims

（ａ）大腸菌ｐｅｌＢ信号配列、並びに、配列番号８２に対して、３０番目アミノ酸残基であるヒスチジンがアルギニン残基で置換された、配列番号１００；配列番号８２に対して、３５番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアスパラギン酸残基で置換された、配列番号１０９；配列番号８２に対して、３０番目アミノ酸残基であるヒスチジンがアルギニン残基で置換され、３５番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアスパラギン酸残基で置換された、配列番号１４２；配列番号８２に対して、３５番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアスパラギン酸残基で置換され、４０番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアルギニン残基で置換された、配列番号１５０；配列番号８２に対して、３０番目アミノ酸残基であるヒスチジンがアルギニン残基で置換され、３５番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアスパラギン酸残基で置換され、４０番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアルギニン残基で置換された、配列番号１５４；及び、配列番号８２に対して、２９番目リジン残基と３０番目ヒスチジン残基との間にリジン残基が挿入され、３０番目アミノ酸残基であるヒスチジンがアルギニン残基で置換され、３５番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアスパラギン酸残基で置換され、４０番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアルギニン残基で置換された、配列番号１５８よりなる群から選択されたアミノ酸配列を有するブラゼイン変異体を暗号化するブラゼイン変異体遺伝子で形質転換された大腸菌を培養する段階と；
（ｂ）上記培養された大腸菌の細胞膜間隙のタンパク質を分離する段階と；
（ｃ）上記分離した細胞膜間隙タンパク質を熱処理する段階と；を含むブラゼイン変異体の製造方法。
配列番号８２に対して、３０番目アミノ酸残基であるヒスチジンがアルギニン残基で置換された、配列番号１００；配列番号８２に対して、３５番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアスパラギン酸残基で置換された、配列番号１０９；配列番号８２に対して、３０番目アミノ酸残基であるヒスチジンがアルギニン残基で置換され、３５番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアスパラギン酸残基で置換された、配列番号１４２；配列番号８２に対して、３５番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアスパラギン酸残基で置換され、４０番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアルギニン残基で置換された、配列番号１５０；配列番号８２に対して、３０番目アミノ酸残基であるヒスチジンがアルギニン残基で置換され、３５番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアスパラギン酸残基で置換され、４０番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアルギニン残基で置換された、配列番号１５４；及び、配列番号８２に対して、２９番目リジン残基と３０番目ヒスチジン残基との間にリジン残基が挿入され、３０番目アミノ酸残基であるヒスチジンがアルギニン残基で置換され、３５番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアスパラギン酸残基で置換され、４０番目アミノ酸残基であるグルタミン酸がアルギニン残基で置換された、配列番号１５８よりなる群から選択されたアミノ酸配列を有するブラゼイン変異体。
請求項２に記載のブラゼイン変異体を暗号化するポリヌクレオチド。
配列番号５９、配列番号６８、配列番号１２３、配列番号１３１、配列番号１３５及び配列番号１４１よりなる群から選択された塩基配列を有することを特徴とする請求項３に記載のポリヌクレオチド。
プロモーター及びこれと作動可能に連結された請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むブラゼイン変異体発現用組換え発現ベクター。
請求項５に記載の組換え発現ベクターで形質転換させた大腸菌。
（ａ）請求項６に記載の大腸菌を培養する段階と；
（ｂ）上記培養された大腸菌の細胞膜間隙のタンパク質を分離する段階と；
（ｃ）上記分離した細胞膜間隙タンパク質を熱処理する段階と；を含むブラゼイン変異体の製造方法。
請求項２に記載のブラゼイン変異体を含む甘味料。
請求項２に記載のブラゼイン変異体を甘味料として含む食品組成物。