KR101083040B1 - 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법 - Google Patents

높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 4차 변이체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 야생형 브라제인의 감미 단백질 보다 높은 단맛을 나타내는 브라제인 4차 변이체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 당도 증진용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 브라제인 4차 변이체는 종래의 브라제인과 비교하였을 때 동등한 열 안정성을 가지면서 종래의 브라제인에 비해 최소 15 ~ 50배 이상의 단맛을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 브라제인 4차 변이체는 적은 양으로도 더 많은 양의 설탕(수크로오스)과 같은 다른 감미료와 혼용 사용이 가능하며 더 나아가 이를 대체할 수 있으며, 식품 제조시 첨가물로서 다양하게 이용될 수 있다.

Description

높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법{Method for preparing novel multi-mutated Brazzein having higher sweetness}
본 발명은 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 4차 변이체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
백색 설탕(정백당)은 당류의 하나로, 더욱 정확히 말하면 수크로오스(sucrose, 설탕)라는 간단한 탄수화물의 하나로 사카로오스(saccharose, 설탕의 화학적 용어)라고도 하는 이당류이다. 오랜 기간 동안 설탕은 감미료로서 흔하게 사용되어 왔다. 하지만 설탕의 유해성 문제로 최근 세계보건기구(WHO)에서는 설탕 사용을 현재의 10%로 제한하자는 권고안을 제시하였으며, 미국의 주 정부(뉴욕시 2003.7월, 뉴저지주 2004.9월, 일리노이주 2006.3월, 코네티컷주 2006.4월)에서는 설탕 주성분 식품 및 고함유 음료 판매를 전면 금지시켰다. 또한, 한국의 경우, 국가비만대책위원회를 구성하여 설탕 위험 경고문구 표기 방침 발표하였으며, 2010년 이후부터 설탕 기준치 이상 식품 광고 규제를 실시할 예정이다. 따라서, 설탕을 대체할 수 있는 새로운 감미료의 등장이 요구되고 있다. 1879년 미국의 아이라 렘슨과 독일의 콘스탄틴 팔베르크는 설탕보다 5백배 단맛을 내는 사카린(saccharin)을 발견하였다. 사카린은 체내에서 분해되지 않고 배설되는 장점을 가졌으나 발암성 물질이라는 논란을 불러일으켰다. 결국 인체에 무해하다고 결론이 났지만, 뒷맛이 쓰다는 단점 때문에 최근에는 많이 사용되지 않는다. 1937년 미국 일리노이대에서 사이클로헥실설파민산 나트륨이 단맛을 내는 것을 발견하였다. 상품명으로 사이클라메이트(cyclamate)로 불리면서 1950년 초부터 사용이 시작돼, 1960년대 세계 감미료 시장을 석권했다. 그러나, 발암성 물질로 판명되면서 우리나라에서는 1970년대부터 사용이 전면 금지되었다. 최근에 가장 널리 사용되는 인공 감미료는 1965년 제임스 쉬레터에 의해 발견된 아스파탐(aspartame)이다. 아스파탐은 설탕보다 약 180~200배 정도 높은 당도를 가지고 있다. 현재 시판되는 대다수의 다이어트 음료에는 아스파탐이 포함되어 있는데, 체내에 들어가면 대사과정 중 페닐알라닌을 생성한다. 따라서, 페닐알라닌을 분해하는 특정 효소 (phenylalanine hydroxylase)가 선천적으로 결핍된 페닐케톤뇨증 환자들은 이용할 수 없다는 단점을 지닌다.
이 같은 인공 감미료뿐만 아니라 천연 감미료를 개발하기 위한 연구도 계속되어 왔으며, 그 결과로서, 허브로 분류되고 있는 국화과의 다년생 식물(Stevia rabaudiana)의 잎에는 스테비오사이드(stevioside)라는 물질이 존재한다. 파라과이와 브라질의 국경 지대 원주민들은 이 물질을 4백년 이상 감미료로 사용했다. 우리나라의 소주에 첨가되기도 하는데, 설탕 보다 200배 단맛을 갖고 있다.
한편, 최근에는 열대 과일에서 추출한 감미 단백질에 대한 관심이 증대하고 있는데, 타우마틴(Thaumatin)은 서아프리카에서 기적의 과일이라고 불리는 다년생 식물(Thaumatococcus daniellii)의 과실 중에 포함되어 있는 단백질로서, 설탕 보다 2,000~3,000배나 단맛을 나타낸다. 모넬린(Monellin)은 아프리카의 다우림 지대에 생육하는 세렌디퍼티 베리(Serendipiti berry)라고 하는 넝쿨상 식물의 열매로부터 얻어지는 단백질로 설탕 보다 무려 3,000배가 달다. 그러나, 재배가 쉽지 않으며 열매로부터의 추출도 어렵다. 더욱이 열 안정성이 낮아서 식품 가공 과정에서 열 처리를 하면 삼차원적인 단백질 구조를 잃어버려 단맛을 내지 못하는 단점을 갖고 있다. 현재에는 이런 단점을 극복하기 위해서 단백질 공학 기술을 이용하여 열 안정성을 증진시키는 연구가 진행되고 있다.
한편, 브라제인(brazzein)은 서아프리카의 펜타디플란드라 브라제나 바이론(Pentadipladra brazzeana Baillon)의 열매에서 처음 추출된 감미 단백질이다[Ming et al., FEBS Letters, 355: 106-108, 1994]. 브라제인은 수크로오스(sucrose)와 비교했을 때 약 500배 내지 2,000배 이상의 단 맛을 나타내며[Jin et al., Chem . Senses . 28: 491-498, 2003], 주(major) 타입과 부(minor) 타입의 2가지 형태가 있다. 식물에서 추출한 브라제인의 대부분인 주(major) 타입은 아미노 말단 부위에 피로글루탐산(pyroglutamic acid) 잔기를 포함하여 54개의 아미노산을 가진다. 반면, 부(minor) 타입의 브라제인은 아미노 말단 부위의 피로글루탐산 잔기 없이 53개의 아미노산 잔기만을 가지며 주(major) 타입의 브라제인에 비해 약 2배 정도 강한 단 맛을 보인다[Assadi-Porter et al., Arch .. Biochem . Biophys. 376: 259-265, 2000]. 브라제인은 감미 단백질 중 가장 작은 크기로 약 6.5 kDa의 분자량을 갖고 있으며, 1개의 서브유닛(subunit)으로 구성된 단량체(monomer)이다. 단일 폴리펩티드(single polypeptide)로 이루어져 있으며 1개의 α-나선(helix)과 2개의 β-병풍구조(sheet)로 구성된다. 브라제인은 8개의 시스테인(cysteine) 잔기를 가져 분자 내에 4개의 이황화 결합(disulfide bond)를 형성하고 있어 열 안정성이 매우 높다. 또한, 물에 대한 용해도 및 pH 안정성이 매우 높다[Gao et al., Int . J. Biol . macromol . 24: 351-359, 1999].
미국 특허 제 6,274,707호 및 아사디 포터 등(Assadi-Porter et al., Arch.. Biochem. Biophys. 376: 259-265, 2000)은 상기와 같은 브라제인을 대장균을 이용한 유전공학적 방법으로 재조합 브라제인을 생산하는 방법을 기술하고 있는데, 브라제인을 암호화하고 있는 유전자를 합성하여 이를 SNase를 포함하고 있는 재조합 벡터에 삽입하여 새로운 형질전환 벡터를 생성한 후, 이를 다시 대장균에 도입하여 최종 SNase와 연결된 융합 단백질을 발현, 정제하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, SNase와 융합되어 발현된 브라제인은 불용성 응집체(Inclusion body)를 생성하며 이를 다시 리폴딩(refolding)시키고 시아노브로마이드(cyanobromide, CNBr)을 이용하여 SNase와 메티오닌(Met)을 제거하는 방법으로 분리, 정제하기 때문에 기술적으로 복잡하고 어려워 대량 생산에 의한 상업화가 곤란한 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 기존 연구의 단점을 해결하고자 선행연구를 통해 대장균 pelB 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 브라제인의 제조방법을 특허 등록(국내 특허 등록 제809100호)한 바 있다. 또한, 본 발명자는 열 안정성이 높고, 우수한 단맛을 나타내는 천연 감미료를 찾기 위해 브라제인을 구성하고 있는 아미노산 중 구조에 영향을 주지 않을 것이라 예상되는 특정 위치의 아미노산의 변이체 및 다중 변이체의 제조방법을 특허 출원(국내 특허 출원 제2007-0117013호, 국내 특허 출원 제2008-0019008호, 국제 특허 출원 PCT/KR2009/04855호)한 바 있다.
본 발명자들은 종래의 브라제인과 동등한 열 안정성을 가지면서 보다 더 높은 단맛을 나타내는 4차 변이체를 탐색 및 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래의 브라제인 부타입의 단백질과 동등한 열 안정성을 가지면서 15 ~ 50배 이상의 단맛을 나타내는 새로운 브라제인 4차 변이체 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단 맛이 종래의 천연형의 브라제인 보다 우수한 새로운 브라제인 4차변이체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 브라제인 4차 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 이용한 브라제인 4차 변이체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 브라제인 4차 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 브라제인 4차 변이체는 종래의 브라제인과 같이 우수한 열 안정성을 가지면서 종래의 브라제인에 비해 최소 15배에서 최대 50배 이상의 단맛을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 브라제인 4차 변이체는 적은 양으로도 더 많은 양의 설탕(수크로오스)과 같은 다른 감미료를 대체할 수 있어 식품 조성물 등에 감미료로서 다양하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 브라제인 4차 변이체를 작성하기 위한 재조합 발현벡터를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 브라제인 다중 4차 변이체의 발현을 확인하기 위한 전기영동 결과를 나타낸 것이다[레인 M: 분자량 마커, 레인 1: 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52K) 조추출물, 레인 2: 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52R) 조추출물, 레인 3: 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52A) 조추출물, 레인 4: 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52H) 조추출물, 레인 5: 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52D)] 조추출물].
도 3은 본 발명에 따른 브라제인 다중 4차 변이체의 정제를 확인하기 위한 전기영동 결과를 나타낸 것이다[레인 M: 분자량 마커, 레인 1: 정제된 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52K), 레인 2: 정제된 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52R), 레인 3: 정제된 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52A), 레인 4: 정제된 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52H), 레인 5: 정제된 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52D)].
도 4는 본 발명에 따른 브라제인 변이체의 단맛 측정 후 높은 단맛을 나타내는 브라제인 변이체를 선별하여 열 안정성을 수행한 결과이다[레인 1: 열 처리 후 브라제인 부타입(minor type)의 상대 활성도, 레인 2: 열처리 후 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52K)의 상대 활성도, 레인 3: 열 처리 후 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52R)의 상대 활성도, 레인 4: 열 처리 후 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52A)의 상대 활성도, 레인 5: 열 처리 후 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52H)의 상대 활성도, 레인 6: 열 처리 후 브라제인 4차 변이체(H30R_E35D_E40A_E52D)의 상대 활성도].
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 당도가 종래의 야생형 브라제인에 비해 우수한 새로운 브라제인 4차 변이체를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 브라제인 4차 변이체는 서열번호 31의 아미노산 서열을 가지는 브라제인 3차 변이체(H30R_E35D_E40A)의 52번째 아미노산인 글루타민산(glutamic acid) 잔기가, 라이신(lysine) 잔기로 치환된 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 브라제인 변이체, 아르기닌(arginine) 잔기로 치환된 서열번호 19의 아미노산을 가지는 브라제인 변이체, 알라닌(alanine) 잔기로 치환된 서열번호 20의 아미노산을 가지는 브라제인 변이체, 히스티딘(histidine) 잔기로 치환된 서열번호 21의 아미노산을 가지는 브라제인 변이체, 아스파르트산(aspartic acid) 잔기로 치환된 서열번호 22의 아미노산을 가지는 브라제인 변이체일 수 있다.
한편, 본 발명은 대장균 pelB 신호서열 및 상기 브라제인 4차 변이체의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 대장균 pelB 신호서열은 대장균의 세포막 간극 신호서열의 일종으로(Rietsch et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 93: 130408-13053, 1996, Raina et al., Ann . Rev . Microbiol . 51: 179-202, 1997, Sone et al., J. Biol . Chem . 272: 10349-10352, 1997), 본 발명의 브라제인이 합성되면 대장균의 세포막 간극으로 이동시켜 정확한 이황화 결합을 유도하게 하고, 브라제인 단백질의 불용성 응집체 형성을 억제하며, 불필요한 대장균 유래의 단백질을 최소로 하여 정제과정을 용이하게 할 수 있다. 본 발명의 대장균 pelB 신호서열은 바람직하게는 서열번호 28의 염기서열을 가지며, 본 발명의 브라제인 변이체의 뉴클레오티드 서열의 5' 상단에 단백질로의 번역시 동일한 프레임을 가지도록 연결된다.
상기 브라제인 4차 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지며, 바람직한 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18의 아미노산 서열에 대해서는 서열번호 12의 염기서열, 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해서는 서열번호 13의 염기서열, 서열번호 20의 아미노산 서열에 대해서는 서열번호 14의 염기서열, 서열번호 21의 아미노산 서열에 대해서는 서열번호 15의 염기서열, 서열번호 22의 아미노산 서열에 대해서는 서열번호 16의 염기서열을 가질 수 있다.
아울러, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브라제인 4차 변이체 발현용 재조합 발현벡터를 제공한다.
상기 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, "작동 가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 대장균 pelB 프로모터, U6 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy 7:24-30, 2000?, CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호, 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 본 발명에서 가장 바람직한 프로모터로 대장균 pelB 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 '재조합 발현벡터' 숙주세포에서 목적 단백질 발현(expression) 또는 목적 RNA을 전사(transcription)할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진 유전자)와 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
상기에서 본 발명의 브라제인 4차 변이체 발현을 위한 재조합 발현벡터는 바람직하게는 pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52K), pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52R), pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52A), pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52H), pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_ E40A_E52D)일 수 있으며, 이는 pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_E40A)를 주형(template)으로 하여 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11의 프라이머를 이용한 위치-지정 돌연변이유도(site-directed mutagenesis)법에 의하여 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다. 상기 대장균은 상기 재조합 발현벡터로 통상의 형질전환방법에 따라 형질전환되고, 이때, 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기천공법(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 대장균을 배양하고, 배양된 대장균에서 세포막간극 단백질을 분리하고, 브라제인을 정제하기 위해 열 처리하는 것을 포함하는 브라제인 4차 변이체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환된 대장균은 브라제인 4차 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양될 수 있으며, 이는 통상적인 대장균의 배양 조건과 동일 또는 유사하다. 상기 형질전환된 대장균이 배양되는 동안, 발현벡터 내의 발현 조절 서열에 의해 pelB 신호서열을 포함하는 브라제인이 발현되고, 이러한 본 발명에서의 브라제인의 발현은 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)와 같은 통상적인 유도성 프로모터의 발현을 촉진하는 화합물 없이도 이루어진다. 발현된 pelB 신호서열을 포함하는 브라제인은 신호서열에 의해 대장균의 세포막간극으로 이동하게 되고, 대장균의 시그널 펩티다제(signal peptidase)에 의해 신호서열이 제거되어 브라제인이 합성되게 된다.
형질전환된 세포에서 발현된 브라제인을 대장균의 세포막 간극에서 분리하기 위해서는 대장균의 세포막 간극에서 단백질을 분리하는 공지의 방법(Snyder et al., J. Bacteriology 177: 953963, 1995)을 이용할 수 있으며, 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어, 배양된 대장균을 집균한 뒤, 20% 수크로오스(Sucrose)가 포함된 30 mM 트리스-염산(Tri-HCl, pH 8) 용액으로 현탁하고, EDTA(pH 8) 용액 및 MgSO4를 이용하여 대장균의 세포막 간극의 단백질을 용출시키는 방법에 의해 수행될 수 있다.
대장균의 세포막 간극 단백질에서 본 발명의 브라제인을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제방법을 통해 수행할 수 있으며, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 브라제인을 분리할 수 있다. 본 발명의 브라제인은 열에 안정하므로 바람직하게는 브라제인을 분리하는 방법은 열 처리를 하여 수행될 수 있다. 이에 한정되지는 않으나 열 처리는 바람직하게는 70 내지 90 ℃에서 15 내지 60분간 가열하여 브라제인을 제외한 다른 단백질을 열 변성시킨 뒤 4 ℃에서 18000 g에서 30분간 원심분리를 통하여 열 변성된 단백질과 브라제인을 분리할 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명에서 더 높은 단맛을 가지며 높은 열 안정성을 가지는 서열번호 18, 19, 20, 21, 22로 이루어진 아미노산을 가지는 브라제인 4차 변이체 효소학적 특성을 정리하면 하기와 같다.
1) 분자량: 6.5 kDa
2) 높은 열 안정성 및 내산성
3) 높은 수용성
4) 브라제인의 부타입의 단백질 기준 브라제인 4차 변이체 단맛 비율: 15 ~ 50배 이상
5) 1g/100ml의 수크로오스 대비 브라제인 4차 변이체 단맛 비율: 약 30,000 ~ 100,000배 이상
이와 같이 본 발명에 따른 브라제인 4차 변이체는 본 발명자의 특허 등록(국내 특허 등록 제809100호)에서 발현, 정제된 브라제인의 부타입의 단백질, 즉 야생형의 브라제인의 부타입의 단백질과 본 발명자의 국내 특허 출원 제 2007-0117013호, 국내 특허 출원 제 2008-0019008호에서 발현, 정제된 브라제인 변이체와 비교하였을 때 열 안정성 및 내산성 및 수용성 등의 특성이 야생형의 브라제인과 유사하며 더 높은 단맛을 나타내는 신규 아미노산 서열을 가지는 것을 그 특징으로 한다.
또한, 이러한 본 발명에서의 브라제인 4차 변이체는 미국 특허 제6,274,707호; 제7,153,535호에 의해 공지된 브라제인 변이체 보다 더 높은 단맛을 나타내며 효과가 있다.
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
본 발명의 실시예에서는 3차 변이체(H30R_E35D_E40A)를 바탕으로 브라제인 부타입의 52번째 글루타민산 잔기를 라이신 잔기, 아르기닌 잔기, 알라닌 잔기로 변이시킨 3종의 다중 4차 변이체를 암호화하는 재조합 벡터를 제조하여 상기의 실시예와 동일한 방법으로 발현, 정제 및 활성(단맛)을 측정하였다. 그 결과, 순도 높은 브라제인 다중 4차 변이체를 얻을 수 있었으며, 브라제인 부타입 단백질과 동일한 안정성을 가지며 브라제인 부타입 단백질과 비교하였을 때 최소 15배에서 최대 50배 이상의 단맛을 나타내는 브라제인 4차 변이체를 제작할 수 있었다. 이를 통해 상기에서 제작한 브라제인 4차 변이체 역시 우수한 감미료로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 브라제인 4차 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 브라제인 4차 변이체를 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 브라제인 4차 변이체를 함유하는 식품 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 본 발명의 브라제인 4차 변이체의 바람직한 함유량으로는 전체 조성 중량에 대해 약 0.01 내지 10중량%를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 브라제인 4차 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 클로닝
브라제인 보다 높은 단맛을 나타내는 브라제인 다중 변이체를 제조하기 위해 먼저 브라제인의 3차 변이체(H30R_E35D_E40A)을 구성하고 있는 하나의 특정 아미노산을 선택하여 다른 특정 아미노산으로 변이시키는 작업을 수행하였다.
먼저, 변이시킬 특정 아미노산으로 브라제인의 구조 분석을 통하여 외부 잔기(side chain)가 밖으로 향해 있으며, 극성을 가지는 52번째 잔기를 선택하였다. 이러한 구조적 정보를 바탕으로 본 발명자의 특허 등록(국내 특허 등록 제809100호)에서 사용한 대장균 내에서 브라제인의 3차 변이체(H30R_E35D_E40A)의 단백질이 합성되도록 불필요한 "ATG" 서열을 제거한 서열번호 1의 서열을 포함하는 재조합 발현벡터(pET26B(+)-Brazzein(H30R_E35D_E40A), 국내 특허 공재 제2009-93470호)를 주형으로 하기의 표 1에 명시된 5개의 프라이머와 각각의 프라이머와 상보적인 서열을 갖는 프라이머 쌍을 합성하였다. 상기 프라이머들은 브라제인 3차 변이체(H30R_E35D_E40A) 단백질을 구성하고 있는 특정 아미노산(서열번호 17)의 외부잔기 길이 및 전기적 성격을 고려하여 설계되었다[표 1 참조]. 하기 표 1의 프라이머와 QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, 미국)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 브라제인 3차 변이체(H30R_E35D_E40A) 단백질의 52번 위치를 치환시킨 5종의 브라제인 변이체를 암호화하고 있는 뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 얻을 수 있었다. 이때, 하기 표 1의 프라이머 서열 중 아래 밑줄 부분은 브라제인 변이체를 위해 변화된 서열을 나타낸다.
브라제인 4차 변이체 제작을 위해 사용된 프라이머
위치 변이 전
아미노산 잔기		 변이 후
아미노산 잔기		 사용된
프라이머		 비 고
변이 전 변이 후 서열번호
52 Glu (E) Lys (K) tac tgc aag tac taa
(서열번호 23)		 positive positive 서열번호 2, 3
Arg (R) tac tgc cgt tac taa
(서열번호 24)		 positive 서열번호 4, 5
Ala (E) tac tgc gct tac taa
(서열번호 25)		 neutral 서열번호 6, 7
His (H) tac tgc cac tac taa
(서열번호 26)		 positive 서열번호 8, 9
Asp (D) tac tgc gac tac taa
(서열번호 27)		 negative 서열번호 10, 11
구체적으로, pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_E40A) 벡터 10 ng, 각각 최종 농도 0.2 mM의 dNTP 혼합물, 각각 125 ng의 상기 표 1에 명시된 프라이머, 10× 반응버퍼 5 ㎕, PfuTurbo DNA 폴리머라제(2.5 U/㎕, Stratagene, 미국) 1 ㎕를 포함하는 전체 50 ㎕를 반응액으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 반응은 95 ℃ 1분간 전변성시킨 다음 95 ℃ 30초, 55 ℃ 1분. 68 ℃ 15분을 20회 반응시키고 68 ℃에서 15분간 최종 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후 1.0% 아가로스(agarose) 겔 전기영동에 의해 증폭된 생성물을 확인하고 증폭이 이루어진 생성물을 37 ℃에서 1시간 동안 DpnⅠ으로 처리하였다. 그런 다음, 바로 슈퍼컴페턴트 세포(supercompetent cell)인 대장균 XL1-Blue를 형질전환하였다. 상기 형질전환된 XL1-Blue는 50 ㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)이 함유된 LB-아가 플레이트(LB-agar plate)에서 12시간 배양하여 선별하고, 선별된 콜로니를 LB-아가 배지에서 배양하여 대장균으로부터 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 DNA에 대해서 대장균 pelB 신호서열과 각각의 브라제인 변이체를 암호화하고 있는 뉴클레오티드가 연결되어 있음을 유전자 분석을 통하여 확인하였다. 이는 하기 표 2의 명시되어 있는 서열번호 및 뉴클레오티드 명으로 명명하였다. 각각의 아미노산을 지칭하는 1문자는 공지된 아미노산 코드에 따라 지정하였다.
브라제인 4차 변이체를 암호화하고 있는 폴리뉴클레오티드 명 및 서열번호
브라제인 4차 변이체 위치 각각의 브라제인 4차 변이체를
암호화하고 있는 뉴클레오티드 명 		서열번호
H30R_E35D_E40A_E52K E. coli pelB +Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52K) gene 서열번호 12
H30R_E35D_E40A_E52R E. coli pelB +Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52R) gene 서열번호 13
H30R_E35D_E40A_E52A E. coli pelB +Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52A) gene 서열번호 14
H30R_E35D_E40A_E52H E. coli pelB +Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52H) gene 서열번호 15
H30R_E35D_E40A_E52D E. coli pelB +Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52D) gene 서열번호 16
상기 실험결과 총 5종의 브라제인 4차 변이체를 위한 재조합 발현벡터(pET26B(+)-Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52K), pET26B(+)-Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52R), pET26B(+)-Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52A), pET26B(+)-Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52H), pET26B(+)-Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52D))를 제작할 수 있었으며, 이를 다시 대장균 BL21(star)로 형질전환하여 대량 발현에 이용하였다(도 1 참조).
실시예 2: 브라제인 4차 변이체의 발현 및 정제
<2-1> 브라제인 4차 변이체의 발현
상기 실시예 1에서 제작한 브라제인 4차 변이체를 위한 5종의 재조합 발현벡터를 도입한 각각의 대장균 BL21(star)을 30 ㎕/㎖의 카나마이신(kanamycin)이 포함된 LB 배지 1 ℓ에서 단백질 유도제인 IPTG(isopropyl β-D-thoigalactopyranoside)의 첨가 없이 37 ℃에서 12시간 배양하여 각각의 형질전환된 대장균에서 각각의 브라제인 변이체가 발현되도록 하였다[도 2 참조].
<2-2> 브라제인 4차 변이체의 정제
상시 실시예 <2-1>에서 배양된 각각의 대장균을 8,000 g에서 10분간 원심 분리하여 집균하였다. 집균 후, 20% 수크로오스(Sucrose)가 포함된 30 mM 트리스-염산(Tri-HCl, pH 8.0) 용액으로 현탁시킨 뒤, 0.5 M EDTA(pH 8.0) 용액을 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하고 상온에서 10분 동안 천천히 교반시켰다. 이를 10,000 g, 4 ℃에서 10분 동안 원심분리를 하고 상층액을 제거한 뒤, 차가운 5 mM MgSO4를 첨가하고, 얼음 위에서 10분 동안 천천히 교반시켰다. 이 과정에서 세포막간극(periplasm)의 단백질이 완충용액으로 이탈되어 나온다. 이 후, 10,000 g, 4 ℃에서 10분 동안 원심분리를 수행하여 상층액을 분리하고, 세포막간극(periplasm)에 존재하는 브라제인 4차 변이체를 정제하기 위하여 80 ℃에서 30분간 열 처리를 하였다. 이 후, 증류수로 24시간 동안 투석 후 동결 건조하여 하기 표 3의 서열번호로 표시되는 정제된 브라제인 4차 변이체를 얻을 수 있었으며, 정제도는 일차적으로 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
브라제인 4차 변이체명 및 서열번호
브라제인 4차
변이체 위치
각각의 브라제인 변이체 명
 서열번호
H30R_E35D_E40A_E52K Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52K) 서열번호 18
H30R_E35D_E40A_E52R Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52R) 서열번호 19
H30R_E35D_E40A_E52A Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52A) 서열번호 20
H30R_E35D_E40A_E52H Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52H) 서열번호 21
H30R_E35D_E40A_E52D Brazzein(H30R_E35D_E40A_E52D) 서열번호 22
상기 실험결과, 브라제인 단백질이 순도 높게 정제되었으며, 그 분자량은 약 6.5 kDa인 것으로 나타났다[도 3 참조].
실시예 3: 브라제인 4차 변이체의 활성(단맛) 및 열 안정성 측정
<3-1> 브라제인 4차 변이체의 단맛 측정
본 발명에서의 재조합 브라제인은 고리환을 가지는 당계열의 화합물이 아니기 때문에 당도계를 이용하여 단맛을 측정할 수 없어 사람의 미각을 이용하여 활성을 측정하였다. 당도 측정은 수크로오스(sucrose)를 용액을 이용하여 최초 단맛을 느낄 수 있는 수크로오스 최소의 농도가 거의 유사하도록 훈련된 20명의 피실험자를 대상으로 하였고, 각각의 변이체를 이용하여 최초 단맛을 느낄 수 있는 농도를 측정하였다. 또한, 브라제인 비교 단맛 비율은 수크로오스 용액의 경우 단맛을 느끼는 최저 자극량이 1g/100㎖이었으며, 브라제인 부타입의 단백질의 경우 단맛을 느끼는 최저 자극양은 500㎍/100㎖이었으므로 이를 기준으로 산정하였다(즉, 브라제인 부타입의 경우 1/0.0005 = 2000).
각각의 브라제인 4차 변이체에 대한 단 맛 테스트 결과
1차 변이체
위치		 서열번호 초기 단맛을 느끼는 최저 자극양
(㎍/100㎖) 		수크로오스 (1g/100㎖) 대비 브라제인 4차 변이체 비교 단맛 비율
(브라제인 부타입: 2000)		 브라제인 부타입 비교 단맛
증가 배수
H30R_E35D_E40A_E52K 서열번호 18 110 100,000 50
H30R_E35D_E40A_E52R 서열번호 19 230 56,000 28
H30R_E35D_E40A_E52A 서열번호 20 270 42,000 21
H30R_E35D_E40A_E52H 서열번호 21 280 38,000 19
H30R_E35D_E40A_E52D 서열번호 22 300 30,000 15
그 결과, 상기의 표 4에서 나타난 바와 같이 서열번호 18로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52K), 서열번호 19으로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52R), 서열번호 20로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52A), 서열번호 21로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52H), 서열번호 22로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52D)를 브라제인 부타입의 단백질과 비교하였을 경우 최소 15배에서 최대 약 50배 이상(1 g/100㎖의 수크로오스 대비 최소 약 30,000배에서 최대 약 100,000배)의 단맛을 나타내는 것으로 확인되었다. 특히, 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52K)의 경우, 가장 높은 단맛 증가율을 나타내었다.
<3-2> 브라제인 4차 변이체의 열 안정성 측정
상기 실시예 <3-1>에서 측정된 결과를 바탕으로 높은 단맛을 나타내는 브라제인 변이체, 즉 서열번호 18로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52K), 서열번호 19로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52R), 서열번호 20으로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52A), 서열번호 21로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52H), 서열번호 22로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52D)와 같은 브라제인 변이체 100㎎을 50 mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 8.0) 용액에 용해시킨 후 80 ℃에서 4시간동안 가열 후 각각의 브라제인 4차 변이체에 대해 열처리 전의 단맛을 기준으로 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 20명의 피실험자를 대상으로 단맛 변화 정도를 측정하고, 그 결과를 상대 활성으로 나타내어 도 4에 기재하였다.
그 결과, 서열번호 18로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52K), 서열번호 19로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52R), 서열번호 20으로 표시되는 브라제인(H30R_E35D_E40A_E52A)과 같은 브라제인 4차 변이체에서 브라제인의 열 안정성을 그대로 유지하는 것으로 나타났다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 브라제인 4차 변이체.
  2. 대장균 pelB 신호서열 및 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 브라제인 4차 변이체 발현용 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 대장균 pelB 신호서열은 서열번호 28의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 브라제인 4차 변이체 발현용 재조합 발현벡터.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 프로모터는 대장균 pelB 프로모터인 재조합 발현벡터.
  7. 제5항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52K), pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_ E40A_E52R), pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52A), pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52H) 및 pET26B(+)-브라제인(H30R_E35D_E40A_E52D)로 이루어진 군에서 선택된 재조합 발현벡터.
  8. 제5항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균.
  9. 제8항의 대장균을 배양하는 단계;
    상기 배양된 대장균의 세포막간극의 단백질을 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 세포막간극 단백질을 열 처리하는 단계
    를 포함하는 브라제인 4차 변이체의 제조방법.
  10. 제1항의 브라제인 4차 변이제를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물.
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