KR101416894B1

KR101416894B1 - 이황화결합이 도입되어 안정성이 향상된 신규의 브라제인 변이체

Info

Publication number: KR101416894B1
Application number: KR1020120083474A
Authority: KR
Inventors: 공광훈; 도현동; 김현수
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2012-07-30
Publication date: 2014-07-09
Also published as: KR20140017124A

Abstract

본 발명은 안정성이 증가된 신규한 브라제인 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 변이체를 생산하는 방법 및 상기 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 브라제인 변이체는 동일한 양의 수크로오스(설탕)과 비교하여 약 2백만배 이상 단맛이 높으며, 야생형의 브라제인과 비교하여 단맛이 약 25배 증가되어 있으며, 열 안정성도 향상되어 있다. 따라서, 본 발명의 브라제인 변이체는 열안정성이 향상되어 있으며, 적은 양으로도 단맛을 낼 수 있고, 식품에서 설탕을 비롯한 다른 감미제를 대체하여 사용될 수 있다.

Description

이황화결합이 도입되어 안정성이 향상된 신규의 브라제인 변이체{Novel Brazzein Variants Introduced a Disulfide Bond for Enhanced Stability}

본 발명은 이황화결합이 도입되어 안정성이 보다 향상된 신규한 브라제인 변이체에 관한 것이다.

백색 설탕(정백당)은 당류의 하나로, 더욱 정확히 말하면 수크로오스(sucrose, 설탕)라는 간단한 탄수화물의 하나로 사카로오스(saccharose, 설탕의 화학적 용어)라고도 하는 이당류이다. 오랜 기간 동안 설탕은 감미료로서 흔하게 사용되어 왔다. 하지만 설탕의 유해성 문제로 최근 세계보건기구(WHO)에서는 설탕 사용을 현재의 10％로 제한하자는 권고안을 제시하였으며, 미국의 주 정부에서는 설탕 주성분 식품 및 고함유 음료 판매를 전면 금지시켰다. 또한, 한국의 경우, 국가비만대책위원회를 구성하여 설탕 위험 경고문구 표기 방침 발표하였으며, 2010년 이후부터 설탕 기준치 이상 식품 광고 규제를 실시할 예정이다. 따라서, 설탕을 대체할 수 있는 새로운 감미료의 등장이 요구 되고 있다. 1879년 미국의 아이라 렘슨과 독일의 콘스탄틴 팔베르크는 설탕보다 5백배 단맛을 내는 사카린(saccharin)을 발견하였다. 사카린은 체내에서 분해되지 않고 배설되는 장점을 가졌으나 발암성 물질이라는 논란을 불러일으켰다. 결국 인체에 무해하다고 결론이 났지만, 뒷맛이 쓰다는 단점 때문에 최근에는 많이 사용되지 않는다. 1937년 미국 일리노이대에서 사이클로헥실설파민산 나트륨이 단맛을 내는 것을 발견하였다. 상품명으로 사이클라메이트(cyclamate)로 불리면서 1950년 초부터 사용이 시작돼, 1960년대 세계 감미료 시장을 석권 했다. 그러나, 발암성 물질로 판명되면서 우리나라에서는 1970년대부터 사용이 전면 금지되었다. 최근에 가장 널리 사용되는 인공 감미료는 1965년 제임스 쉬레터에 의해 발견된 아스파탐(aspartame)이다. 아스파탐은 설탕 보다 약 180~200배 정도 높은 당도를 가지고 있다. 현재 시판되는 대다수의 다이어트 음료에는 아스파탐이 포함되어 있는데, 체내에 들어가면 대사과정 중 페닐알라닌을 생성한다. 따라서, 페닐알라닌을 분해하는 특정 효소 (phenylalanine hydroxylase)가 선천적으로 결핍된 페닐케톤뇨증 환자들은 이용할 수 없다는 단점을 지닌다.

이 같은 인공 감미료뿐만 아니라 천연 감미료를 개발하기 위한 연구도 계속되어 왔으며, 그 결과로서, 허브로 분류되고 있는 국화과의 다년생 식물(Stevia rabaudiana)의 잎에는 스테비오사이드(stevioside)라는 물질이 존재한다. 파라과이와 브라질의 국경 지대 원주민들은 이 물질을 4백년 이상 감미료로 사용했다. 우리나라의 소주에 첨가되기도 하는데, 설탕 보다 200배 단맛을 갖고 있다. 한편, 최근에는 열대 과일에서 추출한 감미 단백질에 대한 관심이 증대하고 있는데, 타우마틴(Thaumatin)은 서아프리카에서 기적의 과일이라고 불리는 다년생 식물(Thaumatococcus daniellii)의 과실 중에 포함되어 있는 단백질로서, 설탕 보다 2,000 - 3,000배나 단맛을 나타낸다. 모넬린(Monellin)은 아프리카의 다우림 지대에 생육하는 세렌디퍼티 베리(Serendipiti berry)라고 하는 넝쿨상 식물의 열매로부터 얻어지는 단백질로 설탕 보다 무려 3,000배가 달다. 그러나, 재배가 쉽지 않으며 열매로부터의 추출도 어렵다. 더욱이 열 안정성이 낮아서 식품 가공 과정에서 열처리를 하면 삼차원적인 단백질 구조를 잃어버려 단맛을 내지 못하는 단점을 갖고 있다. 현재에는 이런 단점을 극복하기 위해서 단백질 공학 기술을 이용하여 열 안정성을 증진시키는 연구가 진행되고 있다.

한편, 브라제인(brazzein)은 서아프리카의 펜타디플란드라 브라제나 바이론(Pentadipladra brazzeana Baillon)의 열매에서 처음 추출된 감미 단백질이다[Ming et al., FEBS Letters, 355: 106-108, 1994]. 브라제인은 수크로오스(sucrose)와 비교했을 때 약 500배 내지 2,000배 이상의 단 맛을 나타내며[Jin et al., Chem. Senses. 28: 491-498, 2003], 주(major) 타입과 부(minor) 타입의 2가지 형태가 있다. 식물에서 추출한 브라제인의 대부분인 주(major) 타입은 아미노 말단 부위에 피로글루탐산(pyroglutamic acid) 잔기를 포함하여 54개의 아미노산을 가진다. 반면, 부(minor) 타입의 브라제인은 아미노 말단 부위의 피로글루탐산 잔기 없이 53개의 아미노산 잔기만을 가지며 주(major) 타입의 브라제인에 비해 약 2배 정도 강한 단 맛을 보인다[Assadi-Porter et al., Arch.. Biochem. Biophys. 376: 259-265, 2000]. 브라제인은 감미 단백질 중 가장 작은 크기로 약 6.5 kDa의 분자량을 갖고 있으며, 1개의 서브유닛(subunit)으로 구성된 단량체(monomer)이다. 단일 폴리 펩티드(single polypeptide)로 이루어져 있으며 1개의 α-나선(helix)과 2개의 β-병풍구조(sheet)로 구성된다. 브라제인은 8개의 시스테인(cysteine) 잔기를 가져 분자 내에 4개의 이황화 결합(disulfide bond)을 형성하고 있어 열 안정성이 매우 높다. 또한, 물에 대한 용해도 및 pH 안정성이 매우 높다[Gao et al., Int. J. Biol. macromol. 24: 351-359, 1999].

브라제인이 식품 첨가물로 사용되기 위해서는, 더욱 높은 안정성을 가져야 하며 그로 인한 응용성이 늘어날 것이다. 대부분의 단백질은 접힘(folding)이 되어 있는 상태에서 안정성을 유지한다. 많은 경우 이 안정성은 이황화 결합(disulfide bond)에 의존한다. 야생형 브라제인은 본래 자신의 접힘 구조 내에 4개의 이황화 결합을 가짐으로써 높은 안정성을 가진다. Walters 등은 브라제인의 4번 잔기인 시스테인(cystein)을 변이 시켜서 이황화 결합 하나를 붕괴 시켰더니 단맛이 사라 졌음을 보고하였다[Walters, D. E. et al., (2009). Chem Senses., 34(8), 679-683]. 이러한 결과는 이황화 결합의 붕괴로 인한 구조적 변화로 단맛이 사라진다는 사실을 시사한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

한국특허출원 제2007-0117013호, 한국특허출원 제2008-0019008호, 한국특허출원 제2010-0016660호, 국제특허출원 PCT/KR2009/04855호

본 발명자들은 안정성이 증가된 브라제인 변이체를 제조하기 위해 연구 노력한 결과, 브라제인의 고차 구조를 통해 서로 인접하여 이황화 결합을 할 수 있는 두 잔기를 선정하고 부위특이적 변이법을 통해 브라제인 내에 이황화 결합을 도입함으로써 총 5쌍의 이황화 결합을 가진 새로운 변이체를 성공적으로 구축하였으며, 이 변이체의 열안정성이 크게 향상됨을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 안정성이 증가된 브라제인 변이체를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 브라제인 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 브라제인 변이체를 생산하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 브라제인 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 브라제인 변이체를 제공한다.

본 발명의 브라제인 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 브라제인 다중 변이체에서, 31번 알라닌(alanine)과 50번 티로신(tyrosine) 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 변이체(서열번호 10), 또는 33번 세린(serine)과 49번 아스파르트산(aspartic acid) 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 변이체(서열번호 11)이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브라제인 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 핵산 분자는 서열번호 12, 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 프로모터 및 (ⅱ) 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 상기 브라제인 변이체 코딩 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 재조합 벡터에서 상기 브라제인 변이체 코딩 핵산 분자는 대장균 pelB 신호서열을 코딩하는 핵산분자에 연결될 수 있다.

상기 대장균 pelB 신호서열은 대장균의 세포막 간극 신호서열의 일종으로(Rietsch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 130408-13053, 1996, Raina et al., Ann. Rev. Microbiol. 51: 179-202, 1997, Sone et al., J. Biol. Chem. 272: 10349-10352, 1997), 브라제인 변이체 단백질이 합성되면 대장균의 세포막 간극으로 이동시켜 정확한 이황화 결합을 유도하게 하고, 브라제인 단백질의 불용성 응집체 형성을 억제하며, 불필요한 대장균 유래의 단백질을 최소로 하여 정제과정을 용이하게 하는 작용을 한다.

상기 pelB 신호서열은 본 발명의 브라제인 다중 변이체를 코딩하는 핵산 분자의 5' 상단에 단백질로의 번역시 동일한 프레임을 가지도록 연결되며, 바람직하게는 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

상기 용어 “프로모터”는 단백질 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다.

상기 용어 “작동가능하게 연결된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예컨대 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명에서의 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 재조합 벡터는 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있으며, 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)가 이용되는 경우, 대장균(E. coli) 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터에서 가장 바람직한 프로모터는 대장균(E. coli) pelB 프로모터이다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 항생제 내성 유전자는 이의 발현을 위한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 벡터는 바람직하게는 원핵세포용 벡터이며, 원핵 숙주세포, 특히 대장균(E. coli)에서 복제가 가능하도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 벡터는 colE1 또는 p15A의 박테리아의 복제 원점 또는 f1 origin과 같은 박테리오파아지의 복제 원점을 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포로서는 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic.Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 브라제인 변이체를 생산하는 방법을 제공한다: (a) 상술된 브라제인 변이체를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주세포로부터 브라제인 변이체 단백질을 분리하는 단계.

본 발명의 브라제인 변이체를 발현하는 벡터로 형질전환된 숙주세포를 브라제인 변이체의 발현을 유도할 수 있는 적절한 배지를 사용하여 적합한 배양 조건 하에서 배양한다. 숙주세포 배양을 위한 배지 및 배양 조건은 당업자에 공지되어 있으며, 당업자는 공지된 배지 및 배양 조건을 본 발명에 적합하게 변형하여 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 브라제인 변이체를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 대장균(E. coli)이다.

상기 숙주세포로서 대장균이 배양되는 동안, 발현벡터 내의 핵산 발현 조절 서열에 의해 브라제인 변이체가 발현된다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면, 본 발명의 브라제인 변이체는 pelB 신호서열을 포함하며, 브라제인 변이체 단백질은 pelB 신호서열에 의해 대장균의 세포막 간극으로 이동하게 되고, 대장균의 시그널 펩티다제(signal peptidase)에 의해 pelB 신호서열이 제거된다.

대장균에서 발현된 브라제인 변이체는 대장균의 세포막 간극에 포함되어 있으므로, 대장균의 세포막 간극에서 단백질을 분리하는 공지의 방법(Snyder et al., J. Bacteriology 177: 953963, 1995)을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 배양된 대장균을 집균한 뒤, 20％ 수크로오스(Sucrose)가 포함된 30 mM 트리스-염산(Tri-HCl, pH 8) 용액으로 현탁하고, EDTA(pH 8) 용액 및 MgSO₄를 이용하여 대장균의 세포막 간극의 단백질을 용출시키는 방법에 의해 수행될 수 있다.

대장균의 세포막 간극 단백질로부터 본 발명의 브라제인 변이체 단백질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합을 사용할 수 있다.

브라제인 단백질은 열에 안정하므로 본 발명의 브라제인 다중 변이체의 분리는 열처리를 하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 70 - 90℃에서 15 - 60분간 가열하여 브라제인을 제외한 다른 단백질을 열 변성시킨 뒤 4℃에서 18000 g에서 30분간 원심분리를 통하여 열 변성된 단백질로부터 브라제인 변이체 단백질만을 분리할 수 있다.

본 발명의 브라제인 변이체 단백질의 특성을 정리하면 다음과 같다.

(ⅰ) 분자량: 6328 - 6360 Da

(ⅱ) 높은 열 안정성 및 내산성

(ⅲ) 높은 수용성

(ⅳ) 수크로오스 대비 단맛 증가도: 1,300 - 20,000배

(ⅴ) 야생형 브라제인 부타입 대비 단맛 증가도: 2.6 - 25배

본 발명의 브라제인 변이체는 야생형의 브라제인에 비해 안정성, 특히 열안정성이 크게 향상되어 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브라제인 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등을 포함한다.

본 발명의 브라제인 변이체를 함유하는 식품 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 본 발명의 브라제인 변이체는 전체 조성물 중량에 대해 0.01 - 10 중량％의 함유량 범위로 포함될 수 있다.

도 1은 대장균(E. coli)에서 열처리 없이 정제한 본 발명의 브라제인 변이체를 SDS-PAGE 분석을 실시한 결과이다(16.5％ Tris-tricine gel). Lane M: SDS-PAGE 폴리펩타이드 분자량 마커, Lane 1: 야생형 브라제인 (부타입: minor type); Lane 2 : 브라제인 변이체 (A31C-Y50C); Lane 3: 브라제인 변이체 (S33C_D40C).
도 2는 열처리하여 정제한 본 발명의 브라제인 변이체를 SDS-PAGE 분석을 실시한 결과이다(16.5％ Tris-tricine gel). Lane M: SDS-PAGE 폴리펩타이드 분자량 마커, Lane 1: 야생형 브라제인(부타입); Lane 2 : 브라제인 변이체 (A31C-Y50C); Lane 3: 브라제인 변이체 (S33C_D49C).
도 3a 내지 도 3c는 본 발명의 브라제인 변이체의 HPLC 분석 결과를 보여준다. 약 9분 위치에서 보여지는 피크는 브라제인 단백질을 지시하고, 2.5 - 3.5 분에서의 피크는 완충액(buffer)를 지시한다. 도 3a는 정제한 야생형 브라제인의 HPLC 분석결과이며, 도 3b는 브라제인 변이체 (A31C-Y50C)의 HPLC 분석결과이며, 도 3c는 브라제인 변이체 (S33C_D40C)의 HPLC 분석결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1 : 브라제인 이황화 결합(disulfide bond) 도입 변이체의 제조

1. 프라이머 설계

브라제인 4차 변이체 (H30R_E35D_E40K_E52K) (서열번호 1)에 이황화 결합을 도입시키기 위해, 3Å 이내에 서로 근접한 곳에 위치하고 있는 잔기를 치환시킬 잔기로 선택하였다. 첫 번째 이황화결합 도입 위치로서 31번의 알라닌(Alanine)과 50번의 티로신(Tyrosine)을 각각 시스테인(cystein)으로 치환시켜 1쌍의 이황화 결합을 도입시키기로 하였으며, 다른 또 하나의 이황화결합 도입 위치로서 33번의 세린(serine)과 49번의 글루타민(glutamine)을 각각 시스테인으로 치환시켜 다른 1쌍의 이황화 결합을 도입시키기로 하였다. 상기 아미노산 치환을 위해 부위 특이적 변이법(site-directed mutagenesis)을 사용하였다. 부위 특이적 변이법에 사용할 올리고뉴클레오타이드 프라이머(oligonucleotide primer)는 야생형 브라제인의 염기서열을 기준으로 설계한 후, (주) Cosmo Genetech (Seoul, Korea)에 의뢰하여 합성하였다(표 1). 변이체에 변환시켜야 할 염기들의 효율을 높이기 위해 합성할 프라이머는 길이가 30 mer 이하가 되도록 하였다. 변환시키고자 하는 염기를 중심으로 양 옆에 브라제인의 염기서열을 나열하였으며 하나의 변이체를 만들기 위해 설계한 두 개의 프라이머는 브라제인의 각 단일 가닥과 서로 상보적이 되도록 하였다.

2. 변이체의 제작

변이체 제작을 위해 치환시키고자 하는 아미노산의 DNA 서열을 포함하는 프라이머를 합성한 후, 변이체의 작성은 Stratagene의 QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit를 이용하였다. 브라제인 변이체 제작에 있어서는 발현 및 정제 과정이 단순한 pET-26b(+)-Brazzein (H30R_E35D_E40K_E52K) 벡터를 이용하였다. 상기 주형 벡터는 브라제인 부타입 아미노산 서열 기준으로 30번째, 35번째, 40번째 및 52번째 아미노산이 변이된 H30R_E35D_E40K_E52K 변이체 (서열번호 1) 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터이다. 먼저 주형 DNA 핵산 분자 10 ng, 각각 최종농도 0.2 mM의 dNTP 혼합물, 125 ng의 변이된 염기가 포함된 합성한 프라이머, 10X 반응 버퍼 5 ㎕, PfuTurbo DNA 중합효소 (2.5 U/㎕) 1 ㎕를 포함하는 총 부피 50 ㎕를 반응액으로 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하였다. PCR 반응 조건은 먼저 95 ℃에서 30초 동안 열변성(denaturing) 한 후 55 ℃에서 1분 동안 서냉복원(annealing)하였다. 그런 후 중합효소에 의한 유전자의 합성은 68 ℃에서 15분 동안 실시하였다. 이 조건을 1 사이클(cycle)로 하고, 이 사이클을 반복하여 16 사이클 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1.0％ 아가로스(agarose) 겔 전기영동에 의해 증폭된 생성물을 확인하였다. 확인된 생성물은 37 ℃에서 1 시간 동안 DpnⅠ제한효소로 처리한 후, 대장균(E. coli) DH5α 세포에 형질전환시켰다(도 1). 형질전환된 대장균 DH5α 세포는 30 ㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)이 함유된 LB-한천 플레이트에서 12시간 동안 배양하여 형질전환체를 선별하였다. 선별된 콜로니를 배양하여 대장균으로부터 DNA를 분리하였다. 염기서열 분석을 통해 변이체로 확인된 유전자는 대장균 BL21 star(DE3)에 형질전환시켜 대량발현에 이용하였다. 2개 변이체 모두 성공적으로 제조되었으며, pET-26b(+)-brazzein (Met-)유전자에서 발현된 재조합 브라제인과 동일한 방법을 통해 정제하였다. 브라제인 부타입 4차 변이체 H30R_E35D_E40K_E52K을 기반으로 제조한 이황화 결합 도입 변이체는 각각 A31C-Y50C (서열번호 10) 및 S33C-D49C (서열번호 11) 이라 명명하였다(표 2).

3. DNA 염기 서열 분석

PCR에 의해 얻어진 변이된 염기서열을 포함하는 브라제인 변이체 유전자를 포함하는 변이체 벡터 pET-Brazzein [pET-26b(+)-Brazzein (A31C-Y50C), 및 pET-26b(+)-Brazzein (S33C-D49C)]을 형질전환된 대장균 DH5α로부터 정제하여 유전자 염기 서열을 확인하였다. 유전자 염기서열은 (주)Cosmo Genetech에 의뢰하여 분석을 하였다.

실시예 2 : 브라제인 이황화 결합 도입 변이체의 발현 및 정제

1. 변이체의 대량 발현

상기 실시예 1에서 제작한 pET-Brazzein 변이체/BL21 star(DE3)는 장기 보관을 위해 액체배양 한 샘플을 20 ％ 글리세롤 스탁(glycerol stock) 상태로 만들어 -70 ℃에 냉동 보관하였다. pET-Brazzein 변이체/BL21 star(DE3) 대량 발현을 위해 30 ㎍/㎖의 카나마이신이 포함된 1L LB 배지에 발현유도제인 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)의 첨가 없이 8 시간 이상을 배양하여 대량발현을 유도하였다. 대량 발현된 배양액은 냉동원심분리기를 이용하여 4℃, 8,000 g, 10분간 집균한 뒤, 정제에 사용하기 전까지 -20 ℃에서 냉동 보관하였다.

2. 변이체 단백질의 정제

대량 발현된 pET-26b(+)-Brazzein 변이체를 20 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)를 이용하여 덩어리가 생기지 않게 잘 풀어준 다음, 초음파 파쇄기를 이용하여 보통의 대장균 파쇄조건인 4℃, 30-40 watts, 진폭(amplitude) 8 ％ 조건으로 15분간 세포막을 파괴하였다. 세포 파쇄 후 30,000 g, 4℃에서 20분간 원심 분리하여 단백질과 다른 세포 불순물들을 분리하였다. 브라제인 변이체의 정제는 이전의 연구방법에 기술한대로 실험하였다(Lee et al., 2010). 단백질 발현과정에서 봉입체(inclusion body)를 생성하여 대부분 불용성 분획에서 얻을 수 있었다. 얻어진 불용성 분획을 가용화 버퍼(solubilization buffer)로 가용화 한 후 24 시간 재접힘(refolding) 시킴으로써 활성을 갖는 가용화 된 브라제인을 얻을 수 있었다. 이를 24 시간 동안 3차 증류수에 투석하였다. 마지막으로 85 ℃에서 30분간 가열하고 원심분리를 통해 순수한 브라제인을 얻을 수 있었다.

3. 변이체 단백질의 정량

브라제인 변이체 단백질의 정량은 BCA assay (Pierce Chemical Co, Rockford IL, USA) 방법에 따라 측정하였으며, 562 nm에서 BSA(bovine serum albumin)과 야생형 브라제인을 표준단백질로 사용하여 표준 곡선을 작성한 뒤, 단백질 농도를 측정하는데 이용하였다. Bio-Rad사의 단백질 정량 시약과 정제된 브라제인 변이체를 60℃에서 30분간 반응시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 결정하였다.

4. 변이체 단백질의 전기영동 분석

단백질의 순도를 측정하기 위해 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. Tris-tricine 겔은 Schagger and von Jagow(1987) 방법에 따라 16.5％의 겔을 만들어 사용하였다. 전기영동이 끝난 겔은 coomassie brilliant blue R-250을 사용하여 염색하였고, 충분한 탈색을 통해 단백질의 순도를 확인하였다. 이 때 사용한 분자량 표준 단백질은 Triosephosphate isomerase (26.6 kDa), Myoglobin (17 kDa), α-Lactalbumin (14.4 kDa), Aprotinin (6.5 kDa)을 포함하고 있는 Bio-rad 사의 Polypeptide SDS-PAGE Melocular Weight Standards를 사용하였다. SDS-PAGE 결과 약 6.5 kDa을 갖는 순수한 브라제인 밴드를 확인할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조).

5. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석

정제한 브라제인 변이체가 활성형인지를 확인하기 위하여 HPLC 분석을 행하였다. HPLC 기기는 Gilson사의 305 system을 사용하였으며, HPLC 분석을 위한 컬럼은 C18 5micron 150 X 4.6 컬럼을 사용하였고, 검출파장은 210 nm, 컬럼온도는 상온, 분당유속은 0.5 ㎖, 이동상 용매로는 A용매로 0.05 ％ TFA - 증류수, B 용매로 0.05 ％ TFA - 아세토니트릴을 사용하여 농도구배조건으로 분석하였다. HPLC 분석 결과, 약 9 분대에 하나의 큰 peak로 용출됨을 확인하였다(도 4a 내지 도 4c 참조). 본 발명의 변이체는 이황화 결합을 하나 더 도입함으로써 총 5쌍의 이황화 결합을 가지고 있으므로 정제 과정 중에 한 부분인 재접힘(refolding) 과정을 진행할 시 인위적으로 이황화 결합을 끊어 접힘(folding)을 풀었다가 재접힘을 하는 과정에서 많은 부분이 엉킴(aggregation)이 일어나 잘못접힘(misfolding)과 같은 현상이 발생했으며 그로 인해 수득률에 많은 손실을 입었다. 버퍼용액은 같은 조건에서 약 2.5 - 3.5 분 사이에 용출되었으며, 12 - 15분 사이에 접힘이 잘못된 브라제인의 피크가 나타났다(도 3a 내지 도 3c 참조).

실시예 3 : 브라제인 변이체의 활성 측정

1. 단맛의 측정

브라제인은 당이 아닌 단백질이기 때문에 당도계를 이용하여 단맛을 측정할 수 없다. 따라서 사람의 미각을 이용하여 활성을 측정하였다. 사람마다 단맛을 처음 느끼게 되는 역치의 값(threshold value)은 다르기 때문에 설탕용액과 브라제인 용액의 단맛을 처음 느끼는 농도를 비교하여 활성을 측정하였다. 피실험자는 사전에 훈련된 남성 10명, 여성 10명으로 구성하였다. 먼저 표준 설탕용액을 차례로 맛을 보고, 처음으로 단맛을 느끼는 농도를 체크하였다. 브라제인은 증류수에(10.0 mg/mL) 녹여 희석하여 1-20 ng/mL이 되게 범위를 정하였으며 용액의 단맛을 보고 역치 값으로 느끼는 단계의 농도를 체크하여 설탕과 브라제인 야생형 및 브라제인 변이체와의 단맛의 상대 활성을 측정하였다. 구체적으로 활성 측정은 다음과 같이 진행 하였다. 활성 측정 전 미리 피실험자에게 테스트 시행 날짜 및 시간을 공고하여 최상의 컨디션에서 맛을 보게끔 하였으며 테스트 전날 음주 및 테스트 직전 음식 섭취를 금하였다. 피실험자는 준비 된 생수로 입안을 헹군 후 각 종류별 농도에 따른 샘플을 100μl씩 저농도에서 고농도 별로 순차적으로 맛을 보았다. 결과 데이터는 Q 테스트 통해 의심스러운 값은 버리고 표준편차를 최소화 하였으며 평균을 통해 데이터를 얻었다. 수크로오스에 비해 야생형 브라제인은 약 800배 더 단맛을 내는 것으로 나타내었다. 4차 변이체를 기반으로 고안정성을 위해 이황화결합을 추가 도입하여 변이시킨 A31C-Y50C와 S33C-D49C 변이체는 수크로오스에 비해 각각 약 1300배, 20,000배의 단맛을 나타내었다(표 3). A31C-Y50C와 S33C-D49C 변이체는 야생형 브라제인에 비해 각각 약 1,6배, 25배의 단맛을 나타내는 것으로 나타났다.

2. 열안정성의 측정

4차 변이체를 기반으로 고안정성을 위해 변이시킨 A31C-Y50C와 S33C-D49C 변이체 각각 100㎎을 50mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 8.0)용액에 용해시킨 후 80℃, 85℃, 90℃, 95℃에서 4시간동안 가열 후 각각의 브라제인 변이체에 대해 열처리 전의 단맛을 기준으로 20명의 피실험자를 대상으로 단맛 변화 정도를 측정한 결과, 야생형 브라제인의 경우 80℃에서 4시간 동안 가열 조건에서 안정한 반면, 본 발명의 A31C-Y50C 변이체와 S33C-D49C 변이체는 90℃에서 4시간 동안 가열하여도 안정함으로써 야생형 브라제인에 비해 열안정성이 향상되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

서열번호 10 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는, 90 ℃에서 열 안정성이 향상된 브라제인 변이체.
상기 제 1 항의 브라제인 변이체를 코딩하는 핵산 분자.
(i) 프로모터 및 (ⅱ) 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 상기 제 2 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
상기 제 3 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
다음의 단계를 포함하는 브라제인 다중 변이체를 생산하는 방법:
(a) 상기 제 4 항의 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 숙주세포로부터 브라제인 다중 변이체 단백질을 분리하는 단계.
상기 제 1 항의 브라제인 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물.