KR100809100B1 - 대장균 ｐｅｌＢ 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 브라제인의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대장균 pelB 신호 서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대장균 pelB 신호 서열 및 서열번호 1로 표시되는 브라제인 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 대장균 pelB 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 IPTG에 의한 유도 없이 다량으로 브라제인을 합성하는 데에 이용될 수 있으며, 본 발명의 브라제인의 제조방법은 다량의 브라제인을 효율적으로 생산 및 정제할 수 있는 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 브라제인의 제조방법은 감미료인 브라제인의 생산을 위한 목적으로 사용될 수 있다.
감미단백질, 브라제인(Brazzein), pelB 신호서열
Description
도 1은 본 발명에 따른 재조합 발현벡터 pET26B(+)-Brazzein의 제작과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 부위특이적 변이법을 통하여 pET26B(+)-Brazzein에서 본 발명에 따른 재조합 발현벡터 pET26B(+)-Brazzein(Met-)를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3는 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 브라제인을 확인하기 위한 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
레인 M : 분자량 마커
레인 1 : 열처리 과정 후 정제된 브라제인
레인 2 : 대장균 세포막간극(periplasm) 분획의 조추출물
본 발명은 대장균 pelB 신호 서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 것을 특징 으로 하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대장균 pelB 신호 서열 및 서열번호 1로 표시되는 브라제인 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
백색 설탕(정백당)은 당류의 하나로, 더욱 정확히 말하면 수크로오스(sucrose, 설탕)라는 간단한 탄수화물의 하나로 사카로오스(saccharose, 설탕의 화학적 용어)라고도 하는 이당류이다. 당류(saccharides)에는 많은 화합물들이 속해 있어 포도당(glucose)과 같이 당 하나로 이루어진 단당류로부터 수백 개의 당이 긴 사슬로 이어져 있는 전분, 셀룰로오스(cellulose)와 같은 다당류까지 다양한 종류가 있다. (Mauricio et al., Pichia pastoris. Biotechnol . Bioeng . 85: 761-769, 2003) 설탕은 쉽게 소화되어 절반이 포도당으로 제공된다. 다른 절반은 과당으로 흡수가 되며, 과당은 설탕보다 더 달지만 흡수 속도가 느리다. 과거에는 설탕이 그 순수함 때문에 건강에 좋은 음식으로 간주되어 가정에서 빵을 굽거나, 애플파이, 커피와 잼을 만드는데 많이 사용되었지만 최근에는 설탕이 건강에 유해하다고 판단되어 영양사, 치과의사, 의사는 환자에서 설탕의 과다 복용을 금지하고 있다. 영양사는 체중 감소를 위한 다이어트 음식에서 설탕을 빼라고 비만 환자에게 권고하고 있다. 비만은 건강에 심각한 영향을 야기하며 활동성을 떨어뜨리고 고혈압과 심장 질환을 일으킨다(Dixon et al., Obesity Research. 13: 1727-1738, 2005). 치과 의사는 설탕이 치아를 감싸고 있는 플라그 막을 통과해서 충치를 일으킨다는 사실을 발견하였고 플라그 박테리아, 특히 스트렙토코쿠스 무탄 스(Streptococcus mutans)라는 세균이 당을 분해해 만들어내는 젖산과 같은 유기산이 치아의 에나멜 표면을 구성하는 인산 칼슘(calcium phosphate)을 마모시키는 것으로 밝혀졌다. 일단 충치가 생기면 치아의 깊은 부분까지 갉아먹어 들어가게 되고, 심지어 뿌리 아래까지 감염되어 농양이 생긴다. 의사들은 한때 어떠한 희생을 감수하더라도 설탕을 피하라고 당뇨 환자에게 경고했다. 당뇨 환자들은 포도당을 이용해 에너지를 생산하고 이용하는 데 필요한 인슐린(insulin)이 부족하기 때문이다. 인슐린이 치료약으로 쓰이기 전에는 의사들이 당뇨 환자에게 고지방, 저탄수화물 식품을 섭취하도록 권장하였다. 당뇨 환자들은 지방과 단백질은 소화시켜 저장할 수 있으나 탄수화물은 소화시켜 저장할 수 없기 때문이었다. 따라서 당뇨환자들은 단 음식을 섭취할 때는 포도당에서 만들어지는 단당류인 솔비톨(sorbitol)과 같은 덕용 감미료로 만들어진 당뇨 식품을 섭취 하였다. 시간이 지남에 따라 심장 질환뿐만 아니라 맹장염, 담석증, 헤르니아 등도 설탕과 관련이 있다는 주장이 제기됐고, 1983년에는 런던의 왕립 의과 대학이 설탕의 국가적인 소비량을 절반으로 줄여야 한다고 경고했다. 이 시기에 설탕이 유방암과 정맥류조차 일으킨다는 의견이 제기되었다(Sanchez et al., J. Clinical Nutrition . 11: 1180-1184, 1983). 이러한 여러 가지 문제점이 제기되면서 점차 설탕의 사용은 감소하고 있으며 이를 대체할 새로운 감미료의 등장이 요구되었다.
1879년 미국의 아이라 렘슨과 독일의 콘스탄틴 팔베르크는 설탕보다 5백배 단맛을 내는 사카린(saccharin)을 발견하였다. 사카린은 체내에서 분해되지 않고 배설되는 장점을 가졌으나 발암성 물질이라는 논란을 불러일으켰다. 결국 인체에 무해하다고 결론이 났지만, 뒷맛이 쓰다는 단점 때문에 최근에는 많이 사용되지 않는다. 1937년 미국 일리노이대에서 사이클로헥실설파민산 나트륨이 단맛을 내는 것을 발견하였다. 상품명으로 사이클라메이트(cyclamate)로 불리면서 1950년 초부터 사용이 시작돼, 1960년대 세계 감미료 시장을 석권했다. 그러나 발암성 물질로 판명되면서 우리나라에서는 1970년대부터 사용이 전면 금지되었다. 최근에 가장 널리 사용되는 인공감미료는 1965년 제임스 쉬레터에 의해 발견된 아스파탐(aspartame)이다. 아스파탐은 설탕보다 약 180~200배 정도 높은 당도를 가지고 있다. 현재 시판되는 대다수의 다이어트 음료에는 아스파탐이 포함되어 있는데, 체내에 들어가면 대사과정 중 페닐알라닌을 생성한다. 따라서 페닐알라닌을 분해하는 특정 효소 (phenylalanine hydroxylase)가 선천적으로 결핍된 페닐케톤뇨증 환자들은 이용할 수 없다는 단점을 지닌다. 이 같은 인공 감미료 뿐만 아니라 천연 감미료 역시 여럿 개발되고 있다. 허브로 분류되고 있는 국화과의 다년생 식물(Stevia rabaudiana)의 잎에는 스테비오사이드(stevioside)라는 물질이 존재한다. 파라과이와 브라질의 국경 지대 원주민들은 이 물질을 4백년 이상 감미료로 사용했다. 우리나라의 소주에 첨가되기도 하는데, 설탕보다 200배 단맛을 갖고 있다. 저분자 화학물질 외에도 고분자인 단백질도 단맛을 내는 것으로 알려져 있다. 타우마틴(Thaumatin)은 서아프리카에서 기적의 과일이라고 불리는 다년생 식물(Thaumatococcus daniellii)의 과실 중에 포함되어 있다. 이 단백질은 207개의 아미노산으로 구성된 단백질로 설탕보다 2,000~3,000배나 단맛을 나타낸다. 모넬 린(Monellin)은 아프리카의 다우림 지대에 생육하는 세렌디퍼티 베리(Serendipiti berry)라고 하는 넝쿨상 식물의 열매로부터 얻어지는 단백질로 설탕보다 무려 3,000배가 달다. 그러나 재배가 쉽지 않으며 열매로부터의 추출도 어렵다. 더욱이 열안정성이 낮아서 식품가공과정에서 열처리를 하면 삼차원적인 단백질 구조를 잃어버려 단맛을 내지 못하는 단점을 갖고 있다. 현재에는 이런 단점을 극복하기 위해서 단백질공학기술을 이용하여 열안정성을 증진시키는 연구가 활발히 진행되고 있다.
브라제인(brazzein)은 서아프리카의 펜타디플란드라 브라제나 바이론(Pentadipladra brazzeana Baillon)의 열매에서 처음 추출된 감미 단백질이다(Ming et al., FEBS Letters , 355: 106-108, 1994). 브라제인은 수크로오스(sucrose)와 비교했을 때 약 500배 내지 2,000배 이상의 단맛을 나타내며(Jin et al., Chem . Senses . 28: 491-498, 2003), 주(major) 타입과 부(minor) 타입의 2가지 형태가 있다. 식물에서 추출한 브라제인의 대부분인 주(major) 타입은 아미노 말단 부위에 피로글루탐산(pyroglutamic acid) 잔기를 포함하여 54개의 아미노산을 가진다. 반면 부(minor) 타입의 브라제인은 아미노 말단 부위의 피로글루탐산 잔기 없이 53개의 아미노산 잔기만을 가지며 주(major) 타입의 브라제인에 비해 약 2배 정도 강한 단맛을 보인다(Assadi-Porter et al., Arch .. Biochem . Biophys . 376: 259-265, 2000). 브라제인은 감미 단백질 중 가장 작은 크기로 약 6.5 kDa의 분자량을 갖고 있으며, 1개의 서브유닛(subunit)으로 구성된 단량체(monomer)이다. 단 일 폴리펩티드(single polypeptide)로 이루어져 있으며 1개의 α-나선(helix)과 2개의 β-병풍구조(sheet)로 구성된다. 브라제인은 8개의 시스테인(cycsteine) 잔기를 가져 분자 내에 4개의 이황화 결합(disulfide bond)를 형성하고 있어 열안정성이 매우 높다. 또한 물에 대한 용해도 및 pH 안정성이 매우 높다(Gao et al., Int . J. Biol . macromol . 24: 351-359, 1999). 미국특허(UP 6,274,707 B1) 및 아사디 포터 등(Assadi-Porter et al., Arch .. Biochem . Biophys. 376: 259-265, 2000)은 상기와 같은 브라제인을 대장균을 이용한 유전공학적 방법으로 재조합 브라제인을 생산하는 방법을 기술하고 있는데, 브라제인을 암호화하고 있는 유전자를 합성하여 이를 SNase를 포함하고 있는 재조합 벡터에 삽입하여 새로운 형질전환 벡터를 생성한 후, 이를 다시 대장균에 도입하여 최종 SNase와 연결된 융합 단백질을 발현, 정제하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, SNase와 융합되어 발현된 브라제인은 불용성응집체(Inclusion body)를 생성하며 이를 다시 리폴딩(refolding)시키고 시아노브로마이드(cyanobromide, CNBr)을 이용하여 SNase와 메티오닌(Met)을 제거하는 방법으로 분리, 정제하기 때문에 기술적으로 복잡하고 어려워 대량 생산에 의한 상업화가 곤란한 단점이 있었다.
이에 본 발명자들은 기존 연구의 단점을 해결하고자 브라제인을 연구하던 중 대장균 pelB 신호서열 및 브라제인 유전자의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용하면 대장균내에서 재조합 단백질을 유도하기 위해 사용하는 IPTG의 사용없이 많은 발현양을 보이며 불용성응집체가 아닌 수용성 상태로 발현이 되고, 이를 시아 노브로마이드(CNBr)와 같은 유독한 유기 용매를 사용하지 않고 열처리를 이용한 단순한 방법으로 브라제인을 정제할 수 있다는 것을 밝혀 냄으로서 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 대장균 pelB 신호서열 및 브라제인의 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하고, 기존의 방법보다 우수한 정제방법을 사용하여 브라제인을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균 pelB 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 형질전환 대장균을 배양 및 정제하는 것을 포함하는 브라제인의 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 대장균 pelB 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 특징으로 한다.
대장균 pelB 신호서열은 대장균의 세포막 간극 신호서열의 일종으로(Rietsch et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 93: 130408-13053, 1996, Raina et al., Ann . Rev. Microbiol . 51: 179-202, 1997, Sone et al., J. Biol . Chem . 272: 10349-10352, 1997), 본 발명의 브라제인이 합성되면 대장균의 세포막 간극으로 이동시켜 정확한 이황화 결합을 유도하게 하고, 브라제인 단백질의 불용성 응집체 형성을 억제하며, 불필요한 대장균 유래의 단백질을 최소로 하여 정제과정을 용이하게 할 목적으로 사용되었다. 본 발명의 대장균 pelB 신호서열은 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 본 발명의 브라제인 뉴클레오티드 서열의 5´ 상단에 단백질로의 번역시 동일한 프레임을 가지도록 연결된다.
본 발명의 브라제인 유전자는 브라제인 단백질의 주(major) 타입 또는 부(minor) 타입의 서열 중 어느 것일 수 있으며, 공지된 자연 상태에서 존재하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 물론, 대장균에서의 발현을 증진하기 위해서 바람직하게는 대장균 내부에 많이 존재하는 코돈(E. coli usage codon)을 이용하여 개량된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
브라제인 유전자는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지된 클로닝 방법에 따 라서 수득할 수 있으며, 예를들어, DNA 라이브러리를 통한 클로닝, PCR 증폭을 이용한 클로닝, 염기서열의 직접 합성 등의 방법을 통해 수득할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 브라제인 뉴클레오티드 서열은 공지된 아미노산 서열(Genbank Accession No. P56552)중 첫 번째 서열 즉, 피로글루탐산(pyroglutamic acid)이 제외된 브라제인의 부(minor) 타입의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있으며 더 바람직하게는 본 발명의 브라제인 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 대장균 pelB 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
아울러, 본 발명은 대장균 pelB 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 “재조합 발현벡터”란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다.
본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능 을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동가능하게 연결하는 것은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소, 예를 들면, 제한효소 또는 연결효소(ligase) 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible) 일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서는 공지된 서열(Genbank Accession No. P56552)을 바탕으로 대장균 내부에 많이 존재하는 서열(E. coli usage codon)을 이용하여 브라제인이 합성되도록 서열을 정하고, 이를 화학적으로 폴리뉴클레오티드를 합성하 였다. 합성된 폴리뉴클레오티드를 PCR을 이용해 증폭하고, 대장균의 pelB 서열의 하단에 클로닝한 후 이를 발현벡터로 사용하거나, 브라제인의 부(minor) 타입의 단백질이 합성되도록 불필요한 "ATG" 서열을 제거하여 본 발명의 재조합 발현벡터를 제조하였다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환하고, 형질전환된 대장균을 배양하며, 배양된 대장균에서 세포막간극 단백질을 분리하고, 브라제인을 정제하기 위해 열처리하는 것을 포함하는 브라제인의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 것은 상기 기술한 바와 같으며, 이를 이용하여 대장균을 형질전환하는 것도 상기 기술한 바와 같다.
본원발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 형질전환된 대장균은 브라제인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양될 수 있으며, 이는 통상적인 대장균의 배양 조건과 동일 또는 유사하다. 상기 형질전환된 대장균이 배양되는 동안, 발현벡터내의 발현 조절 서열에 의해 pelB 신호서열을 포함하는 브라제인이 발현되고, 이러한 본원발명에서의 브라제인의 발현은 IPTG와 같은 통상적인 유도성 프로모터의 발현을 촉진하는 화합물 없이도 이루어진다. 발현된 pelB 신호서열을 포함하는 브라제인은 신호서열에 의해 대장균의 세포막간극으로 이동하게 되고, 대장균의 시그널 펩티다제(signal peptidase)에 의해 신호서열이 제거되어 브라제인이 합성되게 된다.
형질전환된 세포에서 발현된 브라제인을 대장균의 세포막 간극에서 분리하기 위해서는 대장균의 세포막 간극에서 단백질을 분리하는 공지의 방법(Snyder et al., J. Bacteriology, 177: 953?963, 1995)을 이용할 수 있으며, 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어, 배양된 대장균을 집균한 뒤, 20% 수크로우즈(Sucrose)가 포함된 30 mM 트리스-염산(Tri-HCl, pH 8)용액으로 현탁하고, EDTA(pH 8)용액 및 MgSO4를 이용하여 대장균의 세포막 간극의 단백질을 용출시키는 방법에 의해 수행될 수 있다.
대장균의 세포막 간극 단백질에서 본 발명의 브라제인을 분리하는 방법은 당 업계에 공지된 다양한 분리 및 정제방법을 통해 수행할 수 있으며, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 브라제인을 분리할 수 있다. 본 발명의 브라제인은 열에 안정하므로 바람직하게는 브라제인을 분리하는 방법은 열처리를 하여 수행될 수 있다. 이에 한정되지는 않으나 열처리는 바람직하게는 70 내지 90℃에서 30 내지 60분간 가열하여 브라제인을 제외한 다른 단백질을 열변성시킨 뒤 4℃에서 18000g에서 30분간 원심분리를 통하여 열변성된 단백질과 브라제인을 분리할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 브라제인을 생산하기 위하여, 본 발명의 발현벡터 pET26B(+)-Brazzein 및 pET26B(+)-Brazzein(Met-)를 도입한 대장균을 각각 배양하여 브라제인을 발현시키고, 발현된 브라제인을 세포막간극에서 분리하고, 열처리를 하여 브라제인을 분리하였다. 이 때, 대장균에서의 브라제인의 발현은 IPTG(isopropyl β-D-thoigalactopyranoside)를 첨가하지 않고 유도한 것으로 고가의 IPTG를 사용하지 않고 다량의 단백질을 유도할 수 있었다. 이러한 브라제인의 발현은 pET26B 발현벡터가 효율적인 발현을 위해서 IPTG가 필요하다는 점에 비추어 볼 때, IPTG를 사용하지 않고 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 장점이 있는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 브라제인의 당도를 나타내는 활성을 측정하였다. 그 결과, pET26B(+)-Brazzein에 의해 제조된 브라제인은 주(major) 타입 브라제인이었으며, 설탕에 비해 약 800배의 당도를 가지고 있었으며, pET26B(+)-Brazzein(Met-)에 의해 제조된 브라제인은 부(minor) 타입 브라제인이었으며, 설탕에 비해 약 2000배의 당도를 가지고 있었다.
본 발명의 브라제인의 효소학적 특성을 정리하면 하기와 같다.
1) 분자량: 6.5kDa
2) 높은 열안정성 및 내산성
3) 높은 수용성
4) 브라제인의 주(major) 타입 : 설탕의 단위 그램당 800배 이상의 당도
5) 브라제인의 부(minor) 타입 : 설탕의 단위 그램당 2000배 이상의 당도
이와 같이 본 발명에 따른 브라제인의 생산방법은 대장균의 시그널 펩티다아제(signal peptidase)를 이용하여 pelB 신호 서열을 제거하며, 특별한 컬럼을 사용하지 않고 브라제인의 내열성을 이용한 열처리를 통하여 정제하는 것을 그 특징으로 한다.
이러한 본 발명에 따른 브라제인의 생산방법은 미국특허(US6,274,707B1) 및 아사디-포터 등(Assadi-Porter et al., Arch.. Biochem. Biophys. 376: 259-265, 2000)에 의해 공지된 방법, 즉, 브라제인의 발현을 위하여 제조된 pET3a/SNase-SW 발현 벡터를 대장균에 삽입하고, 최종농도가 0.1mM이 되도록 IPTG(isopropyl β-D-thoigalactopyranoside)를 첨가하여 SNase와 융합된 브라제인을 발현시킨 다음, 상기 SNase와 융합된 브라제인은 불용성 응집체를 형성하기 때문에 계면활성제인 triton X-100을 이용하여 리폴딩(refolding) 과정을 수행하고, 이후 SNase와 메티오닌(Met)을 제거하기 위하여 시아노브로마이드(CNBr)을 사용하여 정제를 수행한 방법에 비해 IPTG를 첨가하지 않고 다량의 브라제인을 생산하며, 불용성 응집체(inclusion body)를 제거하고 리폴딩(refolding)을 시킬 필요가 없으며, 브라제인의 분리를 위하여 유독성 물질인 시아노브로마이드(CNBr)을 사용할 필요가 없는 잇점이 있다.
그 밖에 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
신호서열과
결합된
브라제인
유전자의
클로닝
<1-1>
브라제인을
암호화하고 있는 새로운 인공 유전자 합성
펜타디플란드라 브라제나 바이론(Pentadipladra brazzeana Baillon)의 열매 추출물인 브라제인의 서열(Genbank 등록번호 P56552)에서 첫번째 서열(pyroglutamic acid)을 제외한 아미노산 서열을 바탕으로 하고, 대장균 내부에 많이 존재하는 코돈(E. coli usage codon)을 이용하여 이하와 같은 서열번호 1의 서열을 정하였다. 이 때, 볼드체로 나타낸 부분은 대장균 내부에 많이 존재하는 코돈을 바탕으로 Genbank 등록번호 P56552의 서열에서 변형시킨 부분을 나타낸다: GATAAGTGCAAGAAGGTTTACGAAAATTACCCAGTTTCTAAGTGCCAACTTGCTAATCAATGCAATTACGATTGCAAGCTTGCTAAGCATGCTAGATCTGGAGAATGCTTTTACGATGAAAAGAGAAATCTTCAATGCATTTGCGATTACTGCGAATACTAA.
상기 서열번호 1의 서열정보를 바탕으로 다카라 코리아 바이오 메디칼에 의뢰하여 인공적으로 브라제인 유전자의 폴리뉴클레오티드를 합성하였다.
<1-2>
프라이머
제작
상기 합성된 폴리뉴클레오티드를 pET26B(+)(Novagen, 미국)의 pelB 시그널 서열과 연결하기 위하여 pET26B(+)의 MCS(multi cloning site)에 포함되어 있는 제 한효소자리 Nco I과 Xho I이 포함되도록 프라이머를 합성하여 이를 각각 서열번호 5(정방향 프라이머, CATG CCATGG ATAAGTGCAAGAAGGTTTAC) 및 서열번호 6(역방향 프라이머, CCG CTCGAG TTAGTATTCGCAGTAATCG)라고 하였다. 이 때, NcoⅠ과 XhoⅠ사이트는 각각 밑줄로 표시하였다.
<1-3>
PCR
에 의한
브라제인
유전자의 증폭
상기 실시예 1-1에서 합성한 브라제인 유전자를 주형으로 하고, 실시예 1-2에서 합성한 두 개의 프라이머를 사용하여 브라제인 유전자를 증폭하였다. PCR 반응은 주형 유전자(합성한 브라제인 유전자, 서열번호 1) 1.5 ㎕, 정방향 프라이머(서열번호 5) 2 ㎕, 역방향 프라이머(서열번호 6) 1 ㎕, 25 mM MgCl2 3 ㎕, 2.5 mM dNTP 4 ㎕, 10×Ex-taq buffer 5 ㎕, Ex-taq polymerase (Takara, 일본) 1 ㎕, H2O 31.5 ㎕를 포함하는 최종 부피 50 ㎕를 반응액으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 2분간 전변성시킨 다음 98℃ 30초, 58℃ 2분, 74℃ 3분을 35회 반응시키고, 74℃에서 10분간 최종반응을 시켰다. 반응이 끝난 후 2.0% 아가로즈 겔 전기영동 (electrophoresis)에 의해 증폭된 브라제인 유전자를 확인한 뒤, 아가로즈 겔에서 증폭된 브라제인 유전자를 회수하여 QIAquick Gel extraction kit (Qiagen, 미국)를 이용하여 추출, 정제하였다. 추출한 브라제인 유전자는 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, 미국)에 삽입한 후(이를 pGEM-T Easy-Brazzein라고 함), 상기 브라제인 유전자가 삽입된 pGEM-T Easy 벡터를 대장균 JM109에 형질전환시켰다. 이를 50㎍/ ㎖ 암피실린(Ampicillin)이 포함된 평판 L-브로쓰(Broth) 배지 상에서 배양하여 형질전환된 대장균을 선별하고, 이를 다시 다시 액체 L-브로쓰 배지에서 배양한 후, 이로부터 브라제인 유전자가 삽입된 pGEM-T Easy 벡터를 다량으로 수득하였다.
<1-4> 재조합 발현벡터
pET26B
(+)-
Brazzein
(
Met
-)의 제작
상기 실시예 1-3에서 클로닝한 pGEM-T Easy-Brazzein 벡터를 제한효소 Nco I과 Xho I (10×K buffer 및 0.1 % BSA 사용)을 사용해 37℃에서 6시간 절단 (digestion)하였다. T7 promoter를 가진 발현 벡터 pET26B(+) 벡터도 상기 조건과 동일한 조건으로 절단하였다. pGEM-T Easy-Brazzein 벡터에서 브라제인 유전자 부분과 절단된 pET26B(+) 벡터를 QIAquick Gel extraction kit (Qiagen, 미국)을 사용하여 정제하였다. 이를 혼합하여 T4 DNA ligase(Takara, 일본)를 사용하여 16℃에서 12시간 반응시킨 후, JM109 감응세포(supercompetent cell)에 형질전환 하였다(도 1 참조). 라이게이션 결과 생성된 재조합 발현 벡터를 pET26B(+)-Brazzein이라 명명하였다.
한편, 본 발명의 재조합 브라제인은 전사(transcription)후 번역(translation)과정이 진행됨에 따라 대장균의 세포막간극(periplasm)으로 이동한 뒤 대장균내 시그날 펩티다아제(signal peptidase)에 의하여 재조합 브라제인과 융합된 pelB 신호 서열이 제거된다. 하지만 프라이머내의 제한효소 Nco I 내부의 ATG에 의하여 번역되는 Met은 시그날 펩티다아제에 의해 제거되지 않는다.
따라서 천연물에서 추출한 마이너(minor) 형태의 브라제인과 동일한 형태의 브라제인을 발현시키기 위해서 PCR을 이용한 부위특이적 변이법을 통해 pET26B(+)-Brazzein 벡터에서 pelB 시그날 서열 뒤에 이어지는 제한효소(Nco I) 내부의 “ATG”를 제거하였다(도 2 참조). 이를 상세히 설명하면 다음과 같다.
브라제인 유전자 중 제거(deletion)시키고자 하는 염기를 중심으로 하여 양 옆에 브라제인의 염기서열과 동일하게 약 15bp길이로 하여 서열번호 7(CAGCCGGCGATGGCCGACAAATGCAAAAAA) 및 서열번호 8(TTTTTTGCATTTGTCGGCCATCGCCGGCTG)의 프라이머를 합성하였으며, 이들은 각각 제거되는 ATG를 제외하고는 브라제인의 각 단일가닥과 서로 상보적으로 결합할 수 있는 것이다. 상기 pET26B(+)-Brazzein 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머(primer)를 사용하여 QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, 미국)를 이용하여 제조사의 지침에 따라서 상기 기재한 것과 같이 pET26B(+)-Brazzein 벡터에서 ATG가 제거된 pET26B(+)-Brazzein(Met-)를 얻었다. 즉, pET26B(+)-Brazzein 벡터 10 ng, 각각 최종농도 0.2 mM의 dNTP 혼합물, 각각 125 ng의 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머, 10× 반응버퍼 5 ㎕, Pfu -Turbo DNA polymerase(2.5 U/㎕, Stratagene, 미국) 1 ㎕를 포함하는 전체 50 ㎕를 반응액으로 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 2분간 전변성시킨 다음 98℃ 30초, 55℃ 1분. 68℃ 15분을 15회 반응시키고 68℃에서 10분간 최종반응을 시켰다. 반응 이 끝난 후 1.0% agarose 겔 전기영동에 의해 증폭된 생성물을 확인하고 증폭이 이루어진 생성물을 37℃에서 1시간동안 DpnⅠ으로 처리하였다. 그런 후 바로 슈퍼컴페턴트 세포(supercompetent cell)인 대장균 XL1-Blue로 형질전환하였다. 형질전환된 대장균 XL1-Blue는 50 ㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)이 함유된 LB-agar plate에서 12시간 배양하여 선별하고, 선별된 colony를 LB-agar 배지에서 배양하여 대장균으로부터 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA에 대해서 각각 염기서열 분석을 통해 ATG가 제거된 변이체로 확인된 벡터를 다시 대장균 BL21(DE3)-Star로 형질 전환하여 대량발현에 이용하였다. 부위특이적 변이법에 의해 생성된 재조합 발현 벡터를 pET26B(+)-Brazzein(Met-)이라 명명하였다.
<
실시예
2>
pET26B
(+)-
Brazzein
(
Met
-)을 이용한 재조합
브라제인의
발현 및 정제
<2-1>
pET26B
(+)-
Brazzein
(
Met
-)을 이용한
브라제인의
발현
본원발명의 발현 벡터 pET26B(+)-Brazzein(Met-)를 도입한 대장균 BL21(DE3)-Star를 30 μl/ml의 카나마이신(kanamycin)이 포함된 LB 배지 1L에서 단백질 유도제인 IPTG(isopropyl β-D-thoigalactopyranoside)의 첨가없이 25℃에서 12시간 배양하였다.
<2-2> 재조합
브라제인의
정제
배양된 대장균을 8,000g에서 10분간 원심 분리하여 집균하였다. 집균 후, 20% 수크로우즈(Sucrose)가 포함된 30 mM 트리스-염산(Tri-HCl, pH 8)용액으로 현탁시킨 뒤, 0.5 M EDTA(pH 8)용액을 최종농도가 1 mM이 되도록 첨가하고 상온에서 10분 동안 천천히 교반시켰다. 이를 10,000g, 4℃에서 10분 동안 원심분리를 하고 상층액을 제거한 뒤, 차가운 5 mM MgSO4를 첨가하고, 얼음위에서 10분 동안 천천히 교반시켰다. 이 과정에서 세포막간극(periplasm)의 단백질이 완충용액으로 이탈되어 나온다. 이 후, 10,000g, 4℃에서 10분 동안 원심분리를 수행하여 상층액을 분리하고, 세포막간극(periplasm)에 존재하는 재조합 브라제인을 정제하기 위하여 80℃에서 30분간 열처리를 하였다. 이 후, 증류수로 24시간 동안 투석 후 동결 건조하였고 정제된 효소의 순수도는 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 브라제인 단백질이 순도 높게 정제되었으며, 그 분자량은 약 6.5kDa인 것으로 나타났다.
<
실시예
3>
pET26B
(+)-
Brazzein
을 이용한 재조합
브라제인의
발현 및 정제
pET26B(+)-Brazzein을 이용한 브라제인의 발현 및 이의 정제는 pET26B(+)-Brazzein(Met-) 대신 pET26B(+)-Brazzein를 사용하였다는 것을 제외하고 각각 실시예 <2-1> 및 <2-2>과 동일하게 하여 브라제인의 발현 및 정제를 하였다(결과미도시).
<
실시예
4>
재조합
브라제인의
활성 측정
<4-1>
pET26B
(+)-
Brazzein
(
Met
-)에 의해 제조된
브라제인의
활성 측정
본 발명에서의 재조합 브라제인은 당이 아니므로 당도계를 이용하여 단맛을 측정할 수 없기 때문에 사람의 미각을 이용하여 활성을 측정하였다. 50 ml에 각각 2.5 g, 5 g, 10 g, 15 g, 20 g, 25 g, 30 g의 수크로오스(sucrose)가 녹아있는 각각의 샘플을 훈련된 피실험자 20명에게 농도를 모르는 상태로 제공하고, 2.5 mg/10 ml 농도를 가지는 실시예 2에서 제조된 브라제인을 맛보게 하였다. 맛을 본 20명의 피실험자들에게 브라제인과 가장 단맛이 비슷한 수크로오스(sucrose) 샘플을 선택하게 하여 그 활성을 측정하였다.
그 결과, 표 1에서 나타난 것과 같이 피실험자 대부분(20명 중 17명)이 50 ml 안에 25 g이 녹아있는 수크로오스와 그 단맛이 비슷하다고 느꼈다. 따라서, 실시예 2에서 제조된 본원발명의 브라제인은 수크로오스(sucrose)의 비해 약 2000배의 당도를 가지며, 이는 천연물에서 추출한 브라제인의 마이너(minor) 형태와 유사한 활성을 가짐을 알 수 있었다.
| 설탕농도(g/50ml) | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| 인원(명) | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 17 | 2 |
<4-2>
pET26B
(+)-
Brazzein
에 의해 제조된
브라제인의
활성 측정
pET26B(+)-Brazzein에 의해 제조된 브라제인의 활성은 실시예 2에서 제조된 브라제인 대신 실시예 3에서 제조된 브라제인을 사용하였다는 것을 제외하고는 상기 실시예 <4-1>과 동일하게 하여 측정하였다.
그 결과, 표 2에서 나타난 것과 같이 피실험자 대부분(20명 중 16명)이 50 ml 안에 10 g이 녹아있는 수크로오스와 그 단맛이 비슷하다고 느꼈다. 따라서, 실시예 3에서 제조된 본원발명의 브라제인은 수크로오스(sucrose)의 비해 약 800배의 당도를 가지며, 이는 천연물에서 추출한 브라제인의 메이져(major) 형태와 유사한 활성을 가짐을 알 수 있었다.
| 설탕농도(g/50ml) | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| 인원(명) | 0 | 2 | 16 | 2 | 0 | 0 | 0 |
이와 같은 결과를 종합하여 볼 때, 브라제인 생산에 있어서 메티오닌(Met)을 제거한 pET26B(+)-Brazzein(Met-)를 이용하는 것이 pET26B(+)-Brazzein를 이용하는 것에 비해 브라제인의 활성을 나타내는데 있어 더 뛰어난 효과를 가짐을 알 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 대장균 pelB 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 IPTG에 의한 유도 없이 다량으로 브라제인을 합성하는 데에 이용될 수 있으며, 본 발명의 브라제인의 제조방법은 다량의 브라제인을 효율적으로 생산 및 정제할 수 있는 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 브라제인의 제조방법은 감미료인 브라제인의 생산을 위한 목적으로 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (8)
- 서열번호 3 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 표시되며, 대장균 pelB 신호 서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 브라제인 발현용 폴리뉴클레오티드.
- 삭제
- 삭제
- 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pET26B(+)-Brazzein 또는 pET26B(+)-Brazzein(Met-)인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제4항 또는 제5항의 재조합 발현벡터를 포함하는 대장균.
- (a) 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 대장균을 형질전환시키는 단계;(b) 상기 형질전환된 대장균을 배양하는 단계;(c) 상기 배양된 대장균의 세포막간극의 단백질을 분리하는 단계; 및(d) 상기 분리된 세포막간극 단백질에서 브라제인을 분리하는 단계를 포함하는 브라제인의 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 (d)단계의 브라제인의 분리는 상기 (c)단계에서 분리된 세포막간극 단백질을 70 내지 90℃에서 15 내지 60분간 가열하여 수행되는 것을 특징으로 하는 브라제인의 제조방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060097619A KR100809100B1 (ko) | 2006-10-04 | 2006-10-04 | 대장균 ｐｅｌＢ 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 브라제인의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060097619A KR100809100B1 (ko) | 2006-10-04 | 2006-10-04 | 대장균 ｐｅｌＢ 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 브라제인의 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR100809100B1 true KR100809100B1 (ko) | 2008-03-10 |
Family
ID=39397379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020060097619A KR100809100B1 (ko) | 2006-10-04 | 2006-10-04 | 대장균 ｐｅｌＢ 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 브라제인의 제조방법 |
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| Country | Link |
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| KR (1) | KR100809100B1 (ko) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100981087B1 (ko) | 2008-02-29 | 2010-09-08 | 중앙대학교 산학협력단 | 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 변이체 및 다중변이체의 제조방법 |
| WO2011105841A2 (ko) * | 2010-02-24 | 2011-09-01 | 중앙대학교 산학협력단 | 브라제인 발현용 재조합 발현벡터 및 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체 |
| KR101083040B1 (ko) | 2010-02-24 | 2011-11-16 | 중앙대학교 산학협력단 | 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법 |
| US20120220756A1 (en) * | 2009-08-28 | 2012-08-30 | Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation | Novel Brazzein Variant Having Higher Sweetness and Method for Preparing Multi-Variant |
-
2006
- 2006-10-04 KR KR1020060097619A patent/KR100809100B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Biochim. Biophys. Acta. 1638(3):257-266 (2003.7.30) |
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| US20120220756A1 (en) * | 2009-08-28 | 2012-08-30 | Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation | Novel Brazzein Variant Having Higher Sweetness and Method for Preparing Multi-Variant |
| US8592181B2 (en) * | 2009-08-28 | 2013-11-26 | Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation | Brazzein variant having higher sweetness and method for preparing multi-variant |
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| KR101083040B1 (ko) | 2010-02-24 | 2011-11-16 | 중앙대학교 산학협력단 | 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법 |
| WO2011105841A3 (ko) * | 2010-02-24 | 2012-04-05 | 중앙대학교 산학협력단 | 브라제인 발현용 재조합 발현벡터 및 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체 |
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