KR102123012B1 - 기능성 감미료의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기능성 감미료 생산용 효소 및 이를 이용한 기능성 감미료를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

기능성 감미료의 제조방법{Production for functional sweetener}

본 발명은 기능성 감미료, 예를 들면 타가토스 생산용 효소 및 이를 이용한 타가토스 생산에 관한 것으로서, 과당으로부터 타가토스를 전환하는 효소, 상기 효소를 이용하여 타가토스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

설탕 및 전분당으로 대변되는 일반당류가 전세계 약 65조 정도로 가장 큰 시장을 형성하고 있지만, 전세계적으로 건강지향 기능성 및 프리미엄 제품으로 소비자 니즈(needs)가 강해지면서, 자일리톨 같은 당알콜류, 프락토 올리고당과 같은 올리고당 류, 그리고 결정 과당과 같은 기능성 당류, 수크랄로스나 아스파팜과 같은 감미료 등의 기능성 감미료 시장이 성장하고 있다.

단맛을 느끼게 하는 조미료 및 식품첨가물을 총칭하는 감미료. 수많은 감미료 중에서 설탕, 포도당, 과당 등은 식품 중의 자연성분으로 가장 널리 분포하고 있으며, 가공식품 제조 시에도 가장 널리 사용되고 있다. 그러나‘설탕’이 충치, 비만, 당뇨병 등을 유발한다는 부정적인 측면이 부각되면서 세계적으로 설탕을 대신하여 사용할 수 있는 기능성 대체 감미료가 주목을 받고 있다.

타가토스는 과당(D-fructose)의 에피머이다. 주로 과일, 우유, 치즈 등에 소량 존재하는 천연 감미료로, 설탕과 매우 유사한 단맛을 가지며 물리적 성질도 유사하여 제품 적용에 적합한 특징을 가진다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이고 혈당 지수(GI, Glycemic index)는 3으로 설탕의 5% 수준이며 식후 혈당 조절에 도움을 주는 건강 기능성을 가진다.

종래 알려진 타가토스의 생산방법은 갈락토스를 원료로 한 화학적 방법과 생물학적 효소 반응 방법이 있다. 갈락토스를 이용한 타가토스 생산 시, 갈락토스의 원료인 유당은 원유 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량에 따라 가격이 불안정한 단점이 있다. 따라서, 안정적인 수급이 가능하며 대량 생산에 적합한 원료인 설탕, 과당 등을 사용한 타가토스 생산 방법 개발이 필요한 실정이다.

본 발명은 과당의 4번째 탄소 위치를 에피머화 하여 과당에서 타가토스의 전환이 가능한 타가토스 생산용 효소를 개발함으로써, 과당으로부터 타가토스 제조를 가능하게 한다.

본 발명의 일 예는 과당의 4-에피머화 효소 단백질을 제공한다. 상기 효소 단백질은 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 과당을 타가토스로 전환시키는 활성을 갖는다.

다른 예는 상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다.

다른 예는 상기 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 타가토스 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 과당의 4번째 탄소 위치를 에피머화 하여 과당에서 타가토스의 전환이 가능한 타가토스 생산용 효소를 개발함으로써, 보편화된 원료인 과당을 사용하여 제조원가를 절감시킴으로써 경제적이면서도 높은 수율의 타가토스의 제조를 가능하게 한다.

과당을 포도당 또는 설탕으로부터 공업적으로 제조 가능함은 매우 널리 알려져 있는 사실이므로, 본 발명에서 제시하는 공정의 원료는 과당 이외에, 보다 저렴한 생산을 위하여 과당을 전체에 혹은 일부 함유한 형태로 사용하는 경우까지 확장하여 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은 타가토스를 전분질, 원당 또는 설탕으로부터 효소적 전환을 통하여 생산하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 과당 기질로부터 타가토스 생산용 효소를 개발함으로써, 저렴한 원료인 과당에서 타가토스를 생산을 가능하게 한다. 본 발명은 과당을 이용하여 타가토스를 제조하여 오늘날 중요한 식품 소재로 각광받고 있는 타가토스를 효율적으로 대량 생산할 수 있다.

구체적 일 예에서, 본 발명에 따른 타가토스 생산용 효소는 프럭토스 4-에피머화 효소는 Cohnella laeviribosi 로부터 유래되며, 과당의 4번째 탄소 위치를 에피머화 하여 과당에서 타가토스의 전환이 가능한 타가토스 생산용 효소로서, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 효소 단백질은, Cohnella laeviribosi 로부터 유래되며, 야생형 효소로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 또한 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환된 변이형 효소일 수 있다.

본 발명에 따른 효소 단백질은, 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질은 하기 특성으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 특성을 갖는 효소 단백질일 수 있다:

(a) 효소 단백질의 분자량이 55 kDa ± 3kDa,

(b) 최적온도가 50 내지 90℃,

(c) 최적 pH가 6 내지 9, 및

(d) 코발트, 니켈 또는 철 이온에 의한 효소 활성 증가.

상기 효소 단백질은 Cohnella laeviribosi 또는 이의 변이주로부터 유래된 것으로서 야생형 효소 또는 변이형 효소일 수 있다. 구체적으로, 상기 효소 단백질은, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화함으로써 과당을 타가토스로 전환하는 기능을 유지하는 조건에서, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산으로 치환되거나, 삽입 또는 결실된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 효소 단백질은, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화함으로써 과당을 타가토스로 전환하는 기능을 유지하면서, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 92%이상, 약 93%이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97%이상, 또는 약 98% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 변이형 효소의 일 예는, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 120, 123, 124, 161, 163, 179, 181, 183, 182, 183, 185, 269, 270, 274, 298, 299, 308, 310, 336, 338, 363, 370, 371, 387, 403 및 404번 위치의 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 위치에서 치환 가능한 아미노산은 하기 표 1에 표시하였다. 하기 표 1에 기재된 하나의 잔기 위치에서 각각 치환 가능한 아미노산 중 선택된 1개가 치환된 변이 효소를 얻거나, 서열번호 1의 치환 가능한 아미노산 잔기를 선택된 2종 이상의 잔기에서, 각각 치환 가능한 아미노산 중 선택된 1개가 치환된 변이 효소를 얻을 수 있다.

서열번호 1의 아미노산 위치	치환 가능한 아미노산
A120	D, K, L, V
S123	D, C, Y, E, T, N
I124	D, W
L161	V, A, C, G
K163	R, P, O
E165	A, G, M
T179	A, D, L, V
D181	A, E, G, H, K, N, R, S, Y
C182	A, D, F, G, I, L, Q, V, Y
S183	Q, A, G, H, K, R
Q185	A, C, D, F, G, K, P Q, S, T, V, W
I269	M, W, C, L, V
S270	T, C,F,A
T274	D, A, E, F, G, H, I, K, L, M, Q, R, S, V, Y
F298	A, L, N, S, W
S299	I, L, V
F308	M, H, V, W
K310	R, S
G336	F, W
K338	W, E, F, N, P, S, T, W, Y
H363	F, L, T, W
N370	W
W371	W
R387	V
Y403	F, C, Y
Y404	T, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L M, N, P, Q, R, S, T, V, W

구체적인 일예에서, 본 발명에 따른 변이형 효소는, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 120, 123, 124, 161, 163, 179, 181, 183, 182, 183, 185, 269, 270, 274, 298, 299, 308, 310, 336, 338, 363, 370, 371, 387, 403 및 404번 위치의 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 123, 269, 270, 274, 298, 299, 308 및 404번 위치의 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 상기 변이 아미노산 위치에서 치환 가능한 아미노산의 예를 들면, S123은 D, C, Y, E, T, 또는 N, 바람직하게는 D에 의해 치환될 수 있으며, I269는 C, L, V 또는 M, 바람직하게는 M에 의해 치환될 수 있으며, S270은 T, C, F, 또는 A, 바람직하게는 F 또는 T에 의해 치환될 수 있으며, T274는 D, A, E, F, G, H, I, K, L, M, Q, R, S, V, 또는 Y, 바람직하게는 D, E, K, L 또는 Y, 더욱 바람직하게는 E 또는 D, 에 의해 치환될 수 있으며, F298은 A, L, N, S 또는 W, 바람직하게는 N에 의해 치환될 수 있으며, S299는 I, L 또는 V, 바람직하게는 L에 의해 치환될 수 있으며, F308은 M, H, V, 또는 W, 바람직하게는 M에 의해 치환될 수 있으며, Y404는 T, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W, 바람직하게는 A, I 또는 T, 더욱 바람직하게는 T에 의해 치환될 수 있다.

상기 효소 단백질은 서열번호 1과 상기 치환 아미노산을 포함하는 변이 효소일 수 있다. 상기 변이 효소 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 효소에 비해 D-타가토스 생성 활성이 약 5배 증가된 효소이며, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 S123D, I269M, S270T, T274D, F308M 및 Y404T 변이를 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 변이 효소의 일예는 하기 표 2에 나타낸 것일 수 있다.

효소	123	269	270	274	298	299	308	404	R.A (%)
M1	D	I	S	T	F	S	F	Y	100
M2	D	I	F	E	F	S	F	Y	222
M3	D	M	T	T	F	S	F	Y	245
M4	D	M	T	E	F	S	F	Y	263
M5	D	I	T	D	N	S	F	Y	316
M6	D	I	T	D	F	L	F	Y	350
M7	D	M	T	D	F	S	M	T	495

본 발명의 또 다른 일예에서, 프럭토스 4-에피머화 효소를 암호화 하는 핵산분자는 서열번호 1과 상기 치환 아미노산을 포함하는 변이 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, 서열번호 2, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자이다. 서열번호 2는 야생형 Cohnella laeviribosi 의 프럭토스 4-에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고, 서열번호 3은 서열번호 1의 효소 단백질을 암호화하는 대장균에 최적화된 뉴클레오타이드 서열이다. 상기 핵산 분자의 폴리뉴클레오타이드는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 본 명세서에서 "실질적인 동일성"이라 함은, 상기한 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 92%이상, 약 93%이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97%이상, 또는 약 98% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 갖는 것을 의미한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체로 이용되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 이용될 수 있다.

본 발명의 추가 일예는, 프럭토스 4-에피머화 효소를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다.

상기 재조합 벡터란 목적한 폴리뉴클레오타이드와, 특정 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현하는데 필요한 발현 조절 요소를 포함하는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 발현 조절 요소는 전사 및 번역 종결인자(terminator), 전사 및 번역 개시 서열, 및/또는 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 예컨대, 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및/또는 온도 민감성 요소(temperature sensitive element) 등과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소(inducible element)는 lac 오페론, T7 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, pL 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 T7 프로모터는 바이러스인 T7 파지에서 유래된 것으로 프로모터와 함께 T7 터미네이터를 포함한다.

상기 벡터 시스템은 당업계에 널리 알려진 다양한 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421).

상기 벡터에는, 예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 말한다. 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예컨대, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예컨대, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 대장균 내 발현에 적합한 pET, pBR, pTrc, pLex, pUC, pKK 벡터 등을 사용할 수 있으나, 상기 효소 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 보다 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하고, 도 1의 개열지도에 나타난 구조를 갖는 것일 수 있다.

상기 재조합 균주는 숙주 세포를 상기한 재조합 벡터로 형질전환시킨 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 1의 적어도 1종 이상의 아미노산 잔기기 치환된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 포함하고, 이를 발현할 수 있는 세포이다. 본 명세서에서 "형질전환"은 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 있는 DNA 사슬 조각 또는 플라스미드가 세포에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합하여, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 현상을 말한다.

상기 재조합 벡터를 안정적이며 연속적으로 클로닝 및/또는 발현시킬 수 있는 형질전환 대상 미생물(숙주 세포)로는 활성형의 상기 효소 단백질을 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지되어 있는 어떠한 미생물도 이용할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 E.coli, 바실러스속 균주, 코리네박테리움속 균주, 또는 살모넬라 속 균주, 세라티아속 균주, 슈도모나스속 균주 사카로마이세스속 균주, 아스퍼질러스속 균주, 피키아속 균주, 등을 포함할 수 있다.

구체적인 숙주세포는 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli ER2566, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등의 다양한 대장균, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네박테리아 속 그리고 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬사속 균주, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등으로 이루어진 군에서 선택된 미생물일 수 있다.

상기 벡터를 사용하여 형질전환시키기 위한 방법으로, 특별한 제한은 없으며, 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격(projectile bombardment), 바이러스 벡터를 사용한 감염 등과 같이 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

다른 예는 상기 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다. 상기 타가토스 생산용 조성물은 과당을 타가토스로 전환하는 활성, 보다 구체적으로 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 타가토스로 전환하는 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 재조합 균주의 배양물은 세포를 포함하는 배양물 또는 세포를 포함하지 않는(cell-free) 배양물, 또는 상기 배양물의 농축물 또는 건조물일 수 있다. 상기 재조합 균주의 파쇄물은 상기 재조합 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소 단백질을 포함하는 것이다.

또한, 상기 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성을 갖는 효소 단백질은 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme) 특성을 가질 수 있다. 따라서, 상기 타가토스 생산용 조성물은 금속 이온을 추가로 포함함으로써 타가토스의 생산 수율을 증진시킬 수 있다. 타가토스 생산 수율에 기여할 수 있는 금속이온은 코발트(Co), 니켈(Ni) 및 철(Fe) 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 금속 이온의 함량은 0.1 mM 내지 10 mM, 0.1 내지 5 mM, 0.1 내지 2 mM, 0.5 내지 1.5 mM, 또는 약 1 mM일 수 있다. 상기 범위는 효소 단백질의 활성 증가 효과를 고려하여 설정한 것이다.

다른 예는 상기 타가토스 생산용 조성물을 사용하는 타가토스의 생산 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 생산 방법은 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하며, 반응 단계 이전에 상기 타가토스 생산용 조성물을 준비하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 타가토스 생산용 조성물을 사용하는 타가토스의 생산 방법에 있어서, 효소 단백질, 재조합 벡터 및 균주 등은 상술한 바와 같다.

구체적으로, 보다 구체적으로, 상기 생산 방법은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질을 준비하는 단계; 및 상기 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

다른 구현예에서, 재조합 균주를 사용하는 경우, 상기 생산 방법은 상기 재조합 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양단계를 거쳐 얻어진 배양물 (세포 포함 또는 무세포) 또는 상기 배양물로부터 회수된 균체 또는 균체 파쇄물을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양 단계는 사용되는 세포의 종류 및/또는 특성에 따라 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배양 방법, 배양 배지 및/또는 배양조건하에서 이루어질 수 있다. 상기 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 방법, 예컨대, 회분식, 연속식, 유가식 배양 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 배양에 사용되는 배지는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 예컨대, 2YT 배지, LB 배지, SOB 배지, TB 배지 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 배양 조건은 일반적으로 해당 숙주 세포 (예컨대, 대장균)를 배양하는데 적합한 조건일 수 있다.

예컨대, 상기 배양은 전 배양액(예컨대, 3 ml LB-카나마이신 액체배지가 들어있는 15 mL test tube에 한 개의 colony를 접종하여 37℃, 250rpm에서 16시간을 배양한 액)을 본 배양액(예컨대, 50ml LB-카나마이신 액체배지가 들어있는 250 mL 플라스크)의 1%(v/v)로 접종 시킨 후, 35℃ 내지 37℃ 및 150 내지 250rpm 조건하에서 배양하여 O.D600nm에서 0.5 내지 0.8까지 배양 후, 유도제를 첨가하고 16℃ 내지 30℃ 및 150 내지 250rpm 조건하에서 추가로 배양하여, 단백질 과발현을 유도할 수 있다. 상기 유도제는 단백질의 발현을 유도할 수 있는 물질로, 예컨대 IPTG (Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside), 유당(lactose) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 유도제의 첨가량은 0.01 내지 1 mM, 0.05 내지 0.5 mM, 또는 약 0.1 mM 정도로 할 수 있다.

상기 균체는 상기 재조합 균주의 배양물에 대하여 원심분리, 및/또는 여과 등을 수행하여 수득될 수 있다.

또한, 상기 균체의 파쇄물은 상기 회수된 균체를 균질화시키고 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계, 상기 상등액을 분획화하는 단계, 및/또는 상기 상등액 또는 분획물에 대하여 크로마토그래피 등을 수행하여 효소 단백질을 분리 및/또는 정제하는 단계에 의하여 수득될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 회수된 균체를 소정의 완충용액 (예컨대, 약 10 mM 농도의 이미다졸이 포함된 50 mM 인산 완충용액)으로 현탁한 후 파쇄하여 원심분리한 후, 상등액만 취하여 적절한 컬럼 (예컨대, 니켈-NTA 컬럼 (Qiagen))에서 흡착시킨 후, 약 20 mM 농도의 이미다졸을 사용하여 약하게 흡착한 대장균 유래 단백질을 씻어낸 뒤 약 200 mM 농도의 이미다졸을 사용하여 목적하는 효소 단백질을 회수할 수 있다.

상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 반응시키는 단계는 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 타가토스 생산용 조성물이 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 반응시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 상기 타가토스 생산용 조성물을 과당과 반응시킴으로써 과당을 타가토스로 전환하여 과당으로부터 타가토스를 생산할 수 있다.

상기 과당과 반응시키는 단계는 바람직하게는 상기 효소 단백질의 활성화 조건하에 이루어질 수 있다. 예컨대, 상기 과당과 반응시키는 단계는 pH 6 내지 9, pH 6.5 내지 8.5, 또는 약 pH 7.0에서 수행될 수 있으며, 또한 50 내지 90℃, 55 내지 85℃, 또는 55 내지 75℃의 온도 조건하에 수행되는 것일 수 있다. 또한 상기 재조합 균주의 배양물로부터 회수된 균체를 사용할 경우, 상기 과당과 반응시키는 단계 전에, 상기 회수된 균체를 예컨대, 0.1 내지 1.5%(w/v) 또는 0.5 내지 1%(w/v), 예컨대 0.85%(w/v)의 NaCl 등을 사용하여 2회 이상 세척하여 사용할 수 있다. 상기 과당은 상기 효소 단백질의 기질로서, 효율적인 반응을 위하여, 상기 반응 단계에서의 과당의 사용량은 전체 반응 혼합물 기준으로 1 내지 60 %(w/v), 예를 들면 5 내지 60 %(w/v) 범위일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않고 오히려 효소 반응의 저해가 일어날 수 있으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

효율적인 타가토스 생산을 위하여, 상기 과당과 반응시키는 단계에 사용되는 효소 단백질의 양은 전체 반응물 기준으로 0.001 mg/ml 내지 1.0 mg/ml, 0.005 mg/ml 내지 1.0 mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 1.0 mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 또는 0.05 mg/ml 내지 0.1 mg/ml일 수 있다. 효소 단백질의 사용량이 상기 농도보다 낮으면 사이코스 전환 효율이 낮아질 수 있고, 상기 농도보다 높으면 산업에서의 경제성이 낮아지므로 상기 범위가 적당하다. 재조합 균주를 사용하는 경우, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물을 기준으로 0.1 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 0.1 내지 100 mg(dcw)/ml, 0.1 내지 50 mg(dcw)/ml, 0.1 내지 10 mg(dcw)/ml, 1 내지 100 mg(dcw)/ml, 1 내지 50 mg(dcw)/ml, 1 내지 10 mg(dcw)/ml, 2 내지 100 mg(dcw)/ml, 2 내지 50 mg(dcw)/ml, 2 내지 10 mg(dcw)/ml, 3 내지 100 mg(dcw)/ml 3 내지 50 mg(dcw)/ml, 또는 내지 3 내지 10 mg(dcw)/ml 일 수 있다.

또한, 상기 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성을 갖는 효소 단백질은 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme) 특성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효소 단백질에 의한 반응을 금속 이온 존재 하에서 수행함으로써 타가토스의 생산 수율을 증진시킬 수 있다. 따라서, 상기 과당과 반응시키는 단계는 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 타가토스 생산 수율에 기여할 수 있는 금속이온은 코발트(Co), 니켈(Ni) 및 철(Fe) 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이다.

상기 금속 이온의 첨가량은 0.1 mM 내지 10 mM, 0.1 mM 내지 5 mM, 0.1 내지 2 mM, 0.5 내지 1.5 mM, 또는 약 1 mM 범위로 할 수 있다. 상기 범위에 미달할 경우 효소 단백질의 활성 증가 효과를 고려하여 선택될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 금속 이온은 기질인 과당에 첨가되거나, 상기 타가토스 생산용 조성물과 과당과의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 금속 이온은 상기 타가토스 생산용 조성물이 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 타가토스 생산용 조성물이 고정화된 담체와 과당과의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가시에 과당과 혼합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다. 재조합 균주를 사용하는 경우, 상기 금속 이온은 배양물에 첨가되거나, 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 배양이 수행될 수 있다.

또한, 상기 타가토스 생산 방법은 상기 과당과 반응시키는 단계 이후에 생산된(과당으로부터 전환된) 타가토스를 회수(분리) 및/또는 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 타가토스를 회수(분리) 및/또는 정제하는 단계는 특별한 제한이 없으며 당업계에 공지된 모든 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 타가토스를 회수(분리) 및/또는 정제하는 단계는 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, 상기 기질로 사용되는 과당은, 경제적 측면으로 고려하여, 전환효소에 의해 분해된 설탕에서 얻어지거나 또는 액상과당으로부터 수득한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 타가토스 생산용 효소 및 이를 이용한 타가토스 생산에 관한 것으로서, 과당으로부터 타가토스를 전환하는 효소, 상기 효소를 이용하여 타가토스를 생산하는 방법을 제공하여, 저렴한 원료인 과당에서 고수율로 타가토스를 생산을 가능하게 한다.

도 1은 본 발명의 일예에 따라 제조된 타가토스를 전환하는 효소를 코딩하는유전자를 포함하는 pET28a-CL-UxaE의 벡터 개열지도를 나타낸다.
도 2는 실시예 2에 따른 효소의 SDS-PAGE 사진을 나타낸다.
도 3은 과당으로부터 타가토스가 생산된 것을 HPLC 분석으로 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

하기 예시적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1: 효소를 생산하는 재조합 균주 제조

Cohnella laeviribosi 유래된 서열번호 1의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 3)를 ㈜프리케어진에서 합성하였다. 합성된 폴리뉴클레오타이드를 제한효소 NheI과 HindIII(NEB)를 사용하여 pET-28a 벡터에 삽입하였고, E. coli DH10B 균주에 형질전환하였다. 이로부터 플라스미드를 추출하여 발현용 균주인 E. coli BL21에 다시 형질전환하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 균주, E. coli pET28a-CL-UxaE를 제조하였다(도 1의 개열지도 참조).

상기 형질 전환된 재조합 균주를 3 mL LB-kanamycine 배지(Difco)에 접종한 후 600 nm에서 흡광도가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕 배양한 후, 이 배양액을 100 mL LB-kanamycine 배지에 접종하여 37℃, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이 배양액의 600 nm에서 흡광도가 0.4 내지 0.6에 도달하면 0.1 mM IPTG(Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 목적 효소의 발현을 유도하였다.

단백질 발현이 완료된 배양액은 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 회수한 후, 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 효소 정제에 사용하였다.

실시예 2: 효소 정제

미생물 내에서 발현된 효소의 활성을 측정하기 위해서 먼저 단백질 정제를 실시하였다.

실시예 1에서 회수한 균체를 lysis buffer(300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 혼탁시킨 후 음파진동기(Ultrasonic prosessor, ColeParmer)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 이를 13,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였고, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni-NTA컬럼(Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 통액시킨 다음 300 mM NaCl 및 20 mM immidazole을 함유한 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)와 300 mM NaCl 및 200 mM immidazole을 함유한 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충 용액을 순차적으로 흘려주어 목적 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액(100 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0)으로 전환하여 실험에 사용하였다. 정제된 효소는 BCA protein assay를 이용하여 단백질을 정량하였다.

또한 부분 정제된 D-프럭토스 4-에피머화 효소는 SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기가 약 56.1 kDa인 것을 확인하였다. 균주를 1L 배양시, 약 35mg의 정제된 효소를 얻을 수 있었으며, SDS-PAGE상에서 볼 수 있는 순도는 약 95% 이상이다. 부분 정제된 효소는 SDS-PAGE를 통하여 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타냈다. 상기 효소의 분자량은 약 56.1 kDa임을 확인하였다.

실시예 3. 효소 특성 확인

3-1: 반응 온도 변화에 따른 효소 활성 비교

반응 온도 변화에 따른 효소 활성 변화를 확인하기 위해 상기 실시예 2에서 정제한 효소를 50 mM 과당, 1 mM CoCl₂를 함유한 100 mM sodium phosphate(pH 8.0) 완충 용액에 첨가한 후 50-75℃ 조건에서 2시간 동안 반응을 실시하였고, 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지하였다.

그 결과, 표 3 에 나타낸 바와 같이 70℃까지 온도가 증가할수록 활성이 증가하며, 75℃ 이상에서 활성이 감소하였다.

반응온도 (℃)	Relative activity (%)
50	33.4
55	52.8
60	73.1
65	98.3
70	100.0
75	16.9

상기 다양한 온도에서 효소 활성을 분석하였으며, 가장 높은 활성을 나타낸 70℃를 100으로 하여 다른 온도 범위에서 효소의 상대적인 활성을 나타냈다.

3-2: 반응 pH 변화에 따른 효소 활성 비교

반응 pH 변화에 따른 효소 활성 변화를 확인하기 위해 실시예 2에서 정제한 효소를 50 mM 과당, 1 mM CoCl₂, Mcilvaine buffer(pH 6.5-9.0) 완충 용액에 첨가한 후 60℃ 조건에서 2시간 동안 반응을 실시하였고, 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지하였다.

표 4 에 나타난 바와 같이 pH가 증가할수록 활성이 증가하는 경향을 나타내었다.

pH	Relative activity (%)
6.5	13.1
7.0	42.9
7.5	68.6
8.0	87.4
8.5	97.9
9.0	100.0

상기 분석 결과를 토대로 효소의 상대적 활성(relative activity)을 계산한 것으로서, 상기 다양한 pH 범위에서 효소 활성을 분석하였으며, 가장 높은 활성을 나타낸 pH=9.0을 100으로 하여 다른 pH에서 효소의 상대적인 활성을 나타냈다.

3-3: 금속이온에 따른 효소 활성 비교

금속이온 종류에 따른 효소 활성 변화를 확인하기 위해 실시예 2에서 정제한 효소에 CaCl₂, CuCl₂, CoCl₂, FeSO₄, MgCl₂, MnCl₂, NiSO₄, ZnSO₄를 각각 1 mM씩 처리하고 50 mM 과당, 100 mM sodium phosphate buffer(pH 8.0) 완충 용액을 첨가한 후 60℃ 조건에서 2시간 동안 반응을 실시하였다. 효소 반응 정지를 위해 100℃ 에서 5분간 가열하였다. 상기 실험결과를 표 5에 나타낸 바와 같이 CoCl₂, NiSO₄, FeSO₄ 높은 활성을 나타내었다.

금속 이온	Relative activity (%)
Co	100
Ni	80
Fe	37

상기 실험결과 금속이온을 첨가하지 않을 경우 활성은 거의 나타나지 않았고, 여러 금속이온 첨가 시, 가장 높은 활성을 나타낸 Co를 100으로 하여 다른 금속이온의 relative activity를 나타냈다. CaCl₂, CuCl₂, MgCl₂, MnCl₂, ZnSO₄ 처리 후에는 금속이온 무처리군과 동일하게 활성이 거의 나타나지 않았다.

실시예 4. 고활성 변이주 제작 및 선별

4-1: 무작위 돌연변이에 의한 돌연변이주 라이브러리 제조

실시예 1의 C. laviribosi 유래 유전자를 주형으로 하여 무작위 돌연변이를 실시하여 돌연변이주 라이브러리를 확보하였다. 무작위 돌연변이는 ClonTech 사의 Diversity random mutagenesis kit를 이용하여 유도하였고, 증폭된 유전자는 pET-28a 벡터에 삽입하여 E. coli ER2566 균주에 형질전환시켰다. 상기 확보된 라이브러리로부터 활성 변이주를 스크리닝하기 위해 발색 측정법을 이용하였다. 반응액에 Mcilvaine buffer(pH4.5), 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide) 및 D-fructose dehydrogenase 혼합액 첨가 후 37℃에서 20분간 반응 후, 황산제이철(ferric sulfate) 용액을 넣어 37℃에서 20분간 반응하였다.

그 다음 660nm에서 흡광도를 측정하여 활성 증가 변이주를 선별하였고, 야생형 효소와 비교하여 총 26종 아미노산 변이를 확인하였다.

야생형 효소와 비교하여 활성이 증가된 변이체를 발현하는 26종 변이주를 1차 선발하였고, 염기서열 및 아미노산 서열을 분석하여 변위 부위를 확인하였다 상기 아미노산 서열 분석결과 변이위치는, 야생형 효소의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서, N-말단으로부터 120, 123, 124, 161, 163, 165, 179, 181, 182, 183, 185, 269, 270, 274, 298, 299, 308, 610, 336, 338, 363, 370, 371, 387, 403, 또는 404 번 위치의 아미노산 잔기가 치환된 아미노산임을 확인하였다.

4-2: 단일 부위 포화 돌연변이에 의한 고활성 변이주 제조

실시예 4-1에서 선별한 라이브러리 정보를 바탕으로 단일 부위 포화 돌연변이(saturation mutagenesis)를 실시하여, 상기 26개 아미노산 위치에서 다양한 아미노산으로 치환을 수행하였다. 각각의 변위 부위를 치환할 염기 3bp를 포함하여 약 40~50bp의 정방향 및 역방향 프라이머를 제작하여 이용하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 50초 변성, 57℃ 50초 어닐링, 72℃ 12분 신장을 16회 반복한 후, 72℃에서 10분간 신장반응을 실시하였다. 변이 부위별 포화돌연변이 라이브러리를 제작한 다음, 실시예 4-1과 같이 발색 측정법을 이용하여 활성 증가 변이주를 선별하였다. 표 5의 선별주는 야생주 대비 10~50% 증가한 활성을 나타내었다. 하기 표 6에서는 각 아미노산 잔기의 위치에서 각각 아미노산 1개가 치환된 변이 효소와 상기 변이 효소의 상대적 활성도를 서열번호 1의 효소를 기준으로 표시한 것이다.

서열번호 1의 아미노산 위치	치환 아미노산	Relative activity (%)
S123	D	100
I269	C	111
	L	115
	M	120
	V	112
S270	F	148
	T	130
T274	D	132
	E	129
	K	121
	L	110
	Y	110
F298	A	115
	L	120
	N	133
	S	111
	W	118
S299	I	120
	L	148
	V	110
F308	M	120
	H	110
	V	110
	W	115
Y404	A	110
	I	115
	T	118

4-3. 활성 개량 다중 변이효소 제작

실시예 4-2에서 단일 부위 개량에 의해 선별된 활성 증가 변이주를 조합하여 지정 돌연변이 (site-directed mutagenesis)를 이용하여 다중부위 변이효소를 제작하였다.

상세하게는 Stratagene (USA)의 QuickChange 방법을 변형하여 PCR을 실시하였다. 돌연변이를 일으키고자 하는 자리를 가운데에 포함하고 있는 40~50bp 길이의 정방향 및 역방향 프라이머를 제작하여 사용하였다.

변이	방향	서열(5'-> 3')	서열 번호
S123D	정방향	CATCCATCCCATTTTGGCTCAGCAAGACATACGCGAACTTGCGCTTACCG	4
	역방향	CGGTAAGCGCAAGTTCGCGTATGTCTTGCTGAGCCAAAATGGGATGGATG	5
I269M	정방향	CGCGCCGTCGACTTCGAAATGACGATCGACGAGGATCTGACG	6
	역방향	CGTCAGATCCTCGTCGATCGTCATTTCGAAGTCGACGGCGCG	7
S270F	정방향	GTCGTGCGGTTGACTTCGAAATGTTCATCGACGAAGACCTGACCCC	8
	역방향	GGGGTCAGGTCTTCGTCGATGAACATTTCGAAGTCAACCGCACGAC	9
S270T	정방향	GCGCCGTCGACTTCGAAATGACGATCGACGAGGATCTGACGCC	10
	역방향	GGCGTCAGATCCTCGTCGATCGTCATTTCGAAGTCGACGGCGC	11
T274D	정방향	CGACTTCGAAATGACGATCGACGAGGATCTGACGCCGACCGCG	12
	역방향	CGCGGTCGGCGTCAGATCCTCGTCGATCGTCATTTCGAAGTCG	13
T274E	정방향	GGTTGACTTCGAAATGACCATCGACGAAGAACTGACCCCGACCGCGC	14
	역방향	GCGCGGTCGGGGTCAGTTCTTCGTCGATGGTCATTTCGAAGTCAACC	15
F298N	정방향	CTGATCGGTAAAAACGTTGACATCAACTCTATGGCGCCGCGTTTC	16
	역방향	GAAACGCGGCGCCATAGAGTTGATGTCAACGTTTTTACCGATCAG	17
S299L	정방향	GATCGGTAAAAACGTTGACATCAATTCGATGGCGCCGCGTTTCATC	18
	역방향	GATGAAACGCGGCGCCATCGAATTGATGTCAACGTTTTTACCGATC	19
F308M	정방향	CCCGCGGTTTATCGGCGAAATGCAGAAGGGGATCGACTATATCGGCG	20
	역방향	CGCCGATATAGTCGATCCCCTTCTGCATTTCGCCGATAAACCGCGGG	21
Y404T	정방향	GCATTTTGAAGAGGCGACCGCTTATACCCATGTCACGACCAATCTGAACAACATCC	22
	역방향	GGATGTTGTTCAGATTGGTCGTGACATGGGTATAAGCGGTCGCCTCTTCAAAATGC	23

PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 50초 변성, 57℃ 50초 어닐링, 72℃ 12분 신장을 16회 반복한 후, 72℃에서 10분간 연장반응을 실시하였다. PCR 반응이 종결된 후에는 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 linear한 형태의 플라스미드 크기가 증폭되었는지 확인한 후, Dpn I 제한효소를 37℃에서 1시간 처리하여 parental DNA template를 최대한 제거하였다. E. coli DH10B에 형질전환 후 2~3개의 콜로니로부터 DNA miniprep 하여 염기서열 분석을 실시하였다.

실시예 5: 변이 효소 정제 및 특성분석

실시예 4에서 얻어진 변이효소는, 실시예 2와 같은 방법으로 정제하고 정제된 효소는 BCA protein assay를 이용하여 단백질을 정량하였다.

상기 정제된 변이효소를 사용하여, 1중량% 과당, 0.01 mM NiSO₄ 또는 CoCl₂염 완충용액 (pH 8.0)에 넣어 반응온도 60℃ 에서 1시간 동안 반응하여 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 분석을 실시하였다. 액체 크로마토그래피 분석은 SUGAR SP0810 컬럼(Shodex)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 RID(Refractive Index Detector, Agilent 1260 RID)를 이용하여 수행하였다. 이동상 용매는 물, 온도는 80℃, 유속은 0.6 mL/min로 하였다. 활성이 2배 이상 증가한 다중 변이 효소는 표와 같고, 최종적으로 실시예 2의 야생형 효소 대비 D-타가토스 생성 활성이 약 5배 증가된 변이 효소 1종 선발하였다. 2이상의 아미노산 잔기가 치환된 변이 효소를 7종 선별하였다.

상기 선발된 변이 효소의 아미노산 서열은 서울 금천구 가산동 60-24에 위치한 ㈜마크로젠에 의뢰하였으며, 서열 분석 결과, 변이가 확인된 아미노산 위치 및 치환 아미노산을 하기 표 8에 아미노산을 갖는 것임을 확인하였다.

효소	123	269	270	274	298	299	308	404	R.A (%)
M1	D	I	S	T	F	S	F	Y	100
M2	D	I	F	E	F	S	F	Y	222
M3	D	M	T	T	F	S	F	Y	245
M4	D	M	T	E	F	S	F	Y	263
M5	D	I	T	D	N	S	F	Y	316
M6	D	I	T	D	F	L	F	Y	350
M7	D	M	T	D	F	S	M	T	495

<110> SAMYANG CORPORATION <120> Production for functional sweetener <130> DPP20201502KR <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 489 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild-type enzyme of Cohnella laeviribosi <400> 1 Met Lys Ala Gln Ser Ile Ile Glu Arg Leu Ala Ala Gly Gln Val His 1 5 10 15 Val Tyr Pro Arg Ser Arg His Glu Ser Glu Gly Thr Arg Val Gln Met 20 25 30 Ile Lys Ala Glu Gly Arg Lys Tyr Leu Val Ala Glu Gly Ser Gly Lys 35 40 45 Leu Tyr Asp Glu Leu Arg Gly Glu Glu Ala Asp Gly Val Lys Leu Cys 50 55 60 Glu Leu Ser His Glu Asn Arg Leu Val Leu Asn Arg His Phe Pro Phe 65 70 75 80 Thr Val Pro Gln Ala Phe Gly Lys Gln Ser Ala Thr Ile Gly Leu Gly 85 90 95 Asp Arg Leu Gly Ile Ala Gly Pro Gly His Val Gln Thr Val Arg Gly 100 105 110 Arg Ala Ile His Pro Ile Leu Ala Gln Gln Ser Ile Arg Glu Leu Ala 115 120 125 Leu Thr Gly Arg Asp Tyr Lys Gln Val Ile Asp Ala Ala Ala Tyr Ala 130 135 140 Val Phe Gln Glu Gly Tyr Thr Glu Gly Tyr Gly Ala Asp Gly Asp His 145 150 155 160 Leu Lys Lys Glu Glu Asp Ile Arg Met Ala Leu Asp Leu Gly Phe Thr 165 170 175 Met Leu Thr Leu Asp Cys Ser Glu Gln Ile Asp Asn Glu Ala Ala Gln 180 185 190 Ala Gly Glu Ser Glu Val Lys Arg Lys Tyr Glu Glu Leu Pro Glu Ser 195 200 205 Val Arg Ser His Tyr Glu Ala Lys Tyr Leu Asp Lys Thr Phe Gln Val 210 215 220 Gly Pro His Ala Ile His Phe Asp Ala Ala Thr Leu Met Arg Asp Val 225 230 235 240 Leu Val Tyr Arg Glu Ala Ile Gln Phe Met Ile Tyr Ile Tyr Glu Lys 245 250 255 Tyr Ile Gln Thr Ala Gly Arg Ala Val Asp Phe Glu Ile Ser Ile Asp 260 265 270 Glu Thr Leu Thr Pro Thr Ala Pro Gly Ser His Phe Leu Val Ala Ser 275 280 285 Glu Leu Ile Gly Lys Asn Val Asp Ile Phe Ser Met Ala Pro Arg Phe 290 295 300 Ile Gly Glu Phe Gln Lys Gly Ile Asp Tyr Ile Gly Asp Ile Ala Gln 305 310 315 320 Phe Glu Arg Glu Leu Ala Val His Ala Ala Ile Ala Asp Arg Phe Gly 325 330 335 Tyr Lys Leu Ser Ile His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser Val Phe Ala 340 345 350 Leu Val Gly Arg Tyr Thr Asn Gly Arg Phe His Val Lys Thr Ala Gly 355 360 365 Thr Asn Trp Leu Glu Ala Val Arg Ile Val Ala Lys Thr Asn Pro Gly 370 375 380 Leu Tyr Arg Arg Met His Gln Tyr Ala Leu Glu His Phe Glu Glu Ala 385 390 395 400 Thr Ala Tyr Tyr His Val Thr Thr Asn Leu Asn Asn Ile Arg Pro Leu 405 410 415 Ala Asp Val Ser Asp Glu Glu Leu Pro Ser Tyr Met Asn Glu Asn Asp 420 425 430 Ala Arg Gln Leu Leu His Ile Thr Tyr Gly Leu Leu Leu Gln Ala Lys 435 440 445 Lys Asp Asp Gly Ser Ser Leu Phe Arg Asp Glu Phe Phe Arg Thr Leu 450 455 460 Ser Glu Arg Glu Glu Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Arg Ser His Ile Gly 465 470 475 480 Lys His Leu Asp Leu Leu Gly Val Lys 485 <210> 2 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide seqence encoding wild-type enzyme <400> 2 atgaaagcgc aatccatcat cgaacggctg gccgcaggcc aggtacacgt ttatccccgt 60 tccaggcacg aatccgaagg aacccgcgtg cagatgatca aggcggaggg acgcaaatat 120 ctcgtcgcgg agggaagcgg caagctgtac gacgagctgc gcggcgaaga ggcggacggc 180 gtcaagctgt gcgagctttc gcacgagaac cggcttgtgc tcaaccgcca ttttccgttt 240 accgtaccgc aggctttcgg caagcagagc gcgaccatcg ggctcgggga tcgcctcggc 300 atcgcaggtc ccggccatgt gcaaacggtg agaggacgcg ccatccatcc cattttggct 360 cagcaatcca tacgcgaact tgcgcttacc ggacgcgact acaagcaggt gatcgacgcg 420 gcggcctatg ccgttttcca ggaagggtat accgaaggct atggggcgga cggcgaccat 480 ctgaaaaagg aagaagacat ccgcatggcc ctcgatctcg ggtttacgat gctgacgctg 540 gactgctccg agcagatcga caacgaagcc gcccaggccg gcgaatcgga agtgaagcgg 600 aaatacgaag agttgccgga atccgtgcgc agccactatg aagcgaaata tttggacaaa 660 acgttccagg tcggtccgca cgccattcat ttcgacgccg caacgctgat gcgggatgtg 720 ctcgtctatc gcgaagcgat tcagttcatg atttatattt acgaaaaata tattcaaacc 780 gcaggccgcg ccgtcgactt cgaaatttcg atcgacgaga cgctgacgcc gaccgcgccg 840 ggctcgcatt ttctggtcgc ttcggagctc atcggcaaaa acgtcgatat cttcagcatg 900 gccccgcggt ttatcggcga attccagaag gggatcgact atatcggcga tatcgcccaa 960 ttcgagcgcg aactggccgt tcacgccgcg attgcggatc gtttcggcta taagctgagc 1020 atccattcgg gcagcgacaa attcagcgtg ttcgcgcttg tcggccgcta tacgaacggg 1080 cggttccacg tcaagacggc gggcacgaac tggctggagg cggtgcggat cgtcgccaag 1140 acgaatccgg gcctgtaccg ccgcatgcat cagtatgcgc tcgagcattt tgaagaggcg 1200 accgcttatt accatgtcac gaccaatctg aacaacatcc gcccgcttgc cgacgtgtcc 1260 gacgaggagc tgccttcgta catgaacgag aacgacgcgc gccagcttct ccatatcacc 1320 tacggcctgt tgctgcaggc gaaaaaggac gacggttcga gcctgttccg cgacgagttt 1380 ttccggacgc tcagcgagcg cgaggaagat tacgaggccg cgctgcgaag ccatatcggc 1440 aagcatctgg acctgctcgg cgtgaaataa 1470 <210> 3 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide seqence encoding wild-type enzyme <400> 3 atgaaagcgc agtctatcat cgaacgtctg gcggcgggtc aggttcacgt ttacccgcgt 60 tctcgtcacg aatctgaagg tacccgtgtt cagatgatca aagcggaagg tcgtaaatac 120 ctggttgcgg aaggttctgg taaactgtac gacgaactgc gtggtgaaga agcggacggt 180 gttaaactgt gcgaactgtc tcacgaaaac cgtctggttc tgaaccgtca cttcccgttc 240 accgttccgc aggcgttcgg taaacagtct gcgaccatcg gtctgggtga ccgtctgggt 300 atcgcgggtc cgggtcacgt tcagaccgtt cgtggtcgtg cgatccaccc gatcctggcg 360 cagcagtcta tccgtgaact ggcgctgacc ggtcgtgact acaaacaggt tatcgacgcg 420 gcggcgtacg cggttttcca ggaaggttac accgaaggtt acggtgcgga cggtgaccac 480 ctgaaaaaag aagaagacat ccgtatggcg ctggacctgg gtttcaccat gctgaccctg 540 gactgctctg aacagatcga caacgaagcg gcgcaggcgg gtgaatctga agttaaacgt 600 aaatacgaag aactgccgga atctgttcgt tctcactacg aagcgaaata cctggacaaa 660 accttccagg ttggtccgca cgcgatccac ttcgacgcgg cgaccctgat gcgtgacgtt 720 ctggtttacc gtgaagcgat ccagttcatg atctacatct acgaaaaata catccagacc 780 gcgggtcgtg cggttgactt cgaaatctct atcgacgaaa ccctgacccc gaccgcgccg 840 ggttctcact tcctggttgc gtctgaactg atcggtaaaa acgttgacat cttctctatg 900 gcgccgcgtt tcatcggtga attccagaaa ggtatcgact acatcggtga catcgcgcag 960 ttcgaacgtg aactggcggt tcacgcggcg atcgcggacc gtttcggtta caaactgtct 1020 atccactctg gttctgacaa attctctgtt ttcgcgctgg ttggtcgtta caccaacggt 1080 cgtttccacg ttaaaaccgc gggtaccaac tggctggaag cggttcgtat cgttgcgaaa 1140 accaacccgg gtctgtaccg tcgtatgcac cagtacgcgc tggaacactt cgaagaagcg 1200 accgcgtact accacgttac caccaacctg aacaacatcc gtccgctggc ggacgtttct 1260 gacgaagaac tgccgtctta catgaacgaa aacgacgcgc gtcagctgct gcacatcacc 1320 tacggtctgc tgctgcaggc gaaaaaagac gacggttctt ctctgttccg tgacgaattc 1380 ttccgtaccc tgtctgaacg tgaagaagac tacgaagcgg cgctgcgttc tcacatcggt 1440 aaacacctgg acctgctggg tgttaaataa 1470 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (forward PCR primer for S123D) <400> 4 catccatccc attttggctc agcaagacat acgcgaactt gcgcttaccg 50 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (reverse PCR primer for S123D) <400> 5 cggtaagcgc aagttcgcgt atgtcttgct gagccaaaat gggatggatg 50 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (forward PCR primer for I269M) <400> 6 cgcgccgtcg acttcgaaat gacgatcgac gaggatctga cg 42 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (reverse PCR primer for I269M) <400> 7 cgtcagatcc tcgtcgatcg tcatttcgaa gtcgacggcg cg 42 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (forward primer for S270F) <400> 8 gtcgtgcggt tgacttcgaa atgttcatcg acgaagacct gacccc 46 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (reverse primer for S270F) <400> 9 ggggtcaggt cttcgtcgat gaacatttcg aagtcaaccg cacgac 46 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (forward primer for S270T) <400> 10 gcgccgtcga cttcgaaatg acgatcgacg aggatctgac gcc 43 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (reverse primer for S270T) <400> 11 ggcgtcagat cctcgtcgat cgtcatttcg aagtcgacgg cgc 43 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (forward primer for T274D) <400> 12 cgacttcgaa atgacgatcg acgaggatct gacgccgacc gcg 43 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (reverse primer for T274D) <400> 13 cgcggtcggc gtcagatcct cgtcgatcgt catttcgaag tcg 43 <210> 14 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (forward primer for T274E) <400> 14 ggttgacttc gaaatgacca tcgacgaaga actgaccccg accgcgc 47 <210> 15 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (reverse primer for T274E) <400> 15 gcgcggtcgg ggtcagttct tcgtcgatgg tcatttcgaa gtcaacc 47 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (forward primer for F298N) <400> 16 ctgatcggta aaaacgttga catcaactct atggcgccgc gtttc 45 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (reverse primer for F298N) <400> 17 gaaacgcggc gccatagagt tgatgtcaac gtttttaccg atcag 45 <210> 18 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (forward primer for S299L) <400> 18 gatcggtaaa aacgttgaca tcaattcgat ggcgccgcgt ttcatc 46 <210> 19 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (reverse primer for S299L) <400> 19 gatgaaacgc ggcgccatcg aattgatgtc aacgttttta ccgatc 46 <210> 20 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (forward primer for F308M) <400> 20 cccgcggttt atcggcgaaa tgcagaaggg gatcgactat atcggcg 47 <210> 21 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (reverse primer for F308M) <400> 21 cgccgatata gtcgatcccc ttctgcattt cgccgataaa ccgcggg 47 <210> 22 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (forward primer for Y404T) <400> 22 gcattttgaa gaggcgaccg cttataccca tgtcacgacc aatctgaaca acatcc 56 <210> 23 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer (reverse primer for Y404T) <400> 23 ggatgttgtt cagattggtc gtgacatggg tataagcggt cgcctcttca aaatgc 56

Claims (15)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 123, 269, 270, 274, 298, 299, 308 및 404번 위치의 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환되며,
   아미노산 위치 123번은 D이고, 아미노산 269번은 I 또는 M이고, 아미노산 270번은 S, F, 또는 T이고, 아미노산 274번은 T, E 또는 D이고, 아미노산 298번은 F 또는 N이고, 아미노산 299번은 S, I, L 또는 V이고, 아미노산 308번은 F 또는 M이며, 또는 아미노산 404번은 Y 또는 T이며,
   Cohnella laeviribosi 로부터 유래된 것인, D-프럭토스 4-에피머화 효소 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 활성 온도가 50 내지 90℃ 및 pH가 6 내지 9인 특성을 갖는 것인, 효소 단백질.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 3로 이루어지는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 암호화되는 것인 효소 단백질.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 효소 단백질은 코발트(Co) 이온, 니켈(Ni) 이온 및 철(Fe)이온에 의해 활성이 증가되는 것인 효소 단백질.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 핵산분자.
6. 제5항에 따른 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것인 재조합 발현벡터.
8. 제5항에 따른 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환되며, D-프럭토스 4-에피머화 효소 단백질을 발현하는 재조합 균주.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 균주는 E.coli, 바실러스속 균주, 코리네박테리움속 균주, 또는 살모넬라 속 균주, 세라티아속 균주, 슈도모나스속 균주 사카로마이세스속 균주, 아스퍼질러스속 균주 또는 피키아속 균주인 재조합 균주.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 배양물 또는 파쇄물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 과당으로부터 타가토스를 생산하는 타가토스 제조용 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 타가토스 제조용 조성물은 코발트, 니켈 및 철로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 추가로 포함하는 조성물.
12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 배양물 또는 파쇄물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을, 과당-함유 원료와 반응시키는 단계를 포함하는, 과당으로부터 타가토스를 생산하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 반응은 온도 50 내지 90℃ 및 pH 6.0 내지 9.0범위에서 수행하는 것인 방법.
14. 제 12 항에 있어서, 상기 과당-함유 원료의 과당 농도는 1 내지 60 %(w/w) 인 것인 방법.
15. 제 12 항에 있어서, 상기 반응은 코발트, 니켈 및 철로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온과 함께 수행하는 것인 방법.

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