TWI789734B

TWI789734B - 新穎啟動子及使用其生產麩胱甘肽的方法

Info

Publication number: TWI789734B
Application number: TW110112128A
Authority: TW
Inventors: 河哲雄; 林榮恩; 梁殷彬; 金延修; 金亨俊
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2021-04-01
Publication date: 2023-01-11
Also published as: AU2021247977A1; TW202202621A; ZA202206645B; CA3163372A1; KR102354283B1; MX2022008294A; CN115397985A; JP7467627B2; EP4053276A1; AR121730A1; KR20210123702A; US20230056278A1; EP4053276A4; BR112022015664A2; JP2023503128A; WO2021201643A1

Abstract

本發明提供一種新穎啟動子、包括其之載體、包括其之微生物，以及使用其生產麩胱甘肽的方法。

Description

新穎啟動子及使用其生產麩胱甘肽的方法

本發明是有關於一種新穎啟動子、包括其的載體、包括其的微生物，以及使用其生產麩胱甘肽的方法。

麩胱甘肽（GSH），作為常見於大多數細胞中的有機硫化合物，為由三種胺基酸組成的三肽（tripeptide）：甘胺酸、麩胺酸，及半胱胺酸。

麩胱甘肽是以麩胱甘肽之還原形式（GSH）及麩胱甘肽的氧化形式（GSSG）存在於生物體中。在正常情形下以相對高比例存在的麩胱甘肽之還原形式（GSH）主要分散在人體的肝臟及皮膚細胞中，且具有諸如分解並移除反應性氧（reactive oxygen）的抗氧化功能、移除諸如有毒物質等外來化合物（xenobiotic compounds）的解毒功能，以及抑制黑色素等產生的美白功能的重要角色（Sipes IGet al. , 「麩胱甘肽在外來化合物之毒性的角色：藉由麩胱甘肽之1,2-二溴乙烷的代謝活化（The role of glutathione in the toxicity of xenobiotic compounds: metabolic activation of 1,2-dibromoethane by glutathione）」Adv Exp Med Biol . 1986;197:457–67）。

由於麩胱甘肽的產生隨著老化過程進行而遞減，且對於抗氧化及解毒功能扮演重要角色之麩胱甘肽之產生的減少促進反應性氧的累積，而此是導致老化的一個主要因素，因此，有需要從外在補充麩胱甘肽。

由於具有上述各種功能，麩胱甘肽已在作為諸如製藥、保健機能食品及化妝品等各種領域中的材料上吸引注意，且也用於製備嘗味成分（taste ingredients）以及食物及飼料添加劑。已知的是麩胱甘肽對於增加原料的嘗味及維持濃厚風味（rich flavors）上有良好的效果，且可藉由單獨使用或與其他物質組合而被使用作為濃厚風味（kokumi flavor）增強劑。通常，濃厚風味物質已知相較於諸如核酸(nucleic acids)、麩胺酸鈉（MSG）等現有的鮮味（umami ）物質具有更濃厚的風味（richer flavors），且能藉由熟化（ripening）期間之蛋白質分解而產生。

儘管對於可使用在各種領域中之麩胱甘肽的需求增加，由於合成酵素之過程基於高生產成本而未被商業化，且自微生物萃取麩胱甘肽之方法的產率過低，基於麩胱甘肽之工業生產需要可觀的成本，該市場仍未被活化。

［欲解決的技術問題］

本發明提供一種新穎啟動子、包括其之載體、包括其之微生物，以及使用其製造麩胱甘肽的方法。［技術手段］

本發明提供一種具有啟動子活性，且至少一個選自於由下列所組成之群組之核苷酸是以一不同核苷酸所取代的多核苷酸：SEQ ID NO: 1或2的多核苷酸序列的第92個、第94個、第102個、第103個、第249個，及第251個核苷酸。

本發明提供包括具有啟動子活性之多核苷酸的載體。

本發明提供屬於酵母屬（genusSaccharomyces sp.）的微生物，包括一或多個之：具有啟動子活性以及編碼一目標蛋白的一基因之多核苷酸；以及包括其之一載體。

本發明提供一種生產麩胱甘肽的方法，該方法包括於一培養基中培養該微生物。［有益的功效］

本發明的該新穎啟動子序列顯著地增加麩胱甘肽生產且因此可被用於在高產率下生產麩胱甘肽。

［最佳實施方式］

本發明將於以下內容中被詳細敘述。同時，揭示於本揭露內容中的各說明內容及實施例可被應用於其他說明內容及實施例。換句話說，本揭露內容中所揭示的各種組分的所有組合落於本發明的範圍內。另外，本發明的範圍並不受限於以下提供的說明內容。

所屬技術領域具有通常知識者將理解或是能夠確認在不使用多於例行實驗的情形下之本揭露內容的特定實施例之許多等效內容（equivalents）。這些等效內容應被解讀為落於後述的申請專利範圍內。

本發明的一個態樣提供具有啟動子活性的多核苷酸，其中選自於由下列所組成之群組的至少一個核苷酸是以一不同核苷酸取代：SEQ ID NO: 1或2的多核苷酸序列的第92個、第94個、第102個、第103個、第249個，及第251個核苷酸。

如此處所使用的，該用語「多核苷酸」是指作為一核苷酸的聚合物之具有相當之最小長度的一DNA股，其中核苷酸單體是彼此藉由共價鍵連結成長鏈形狀。

如此處所使用的，該用語「具有啟動子活性的多核苷酸」是指靠近一將被表現之基因，即，一目標基因之轉錄起始的位置之DNA區域，該區域包括RNA聚合酶、增強子或類似者連結以表現該目標基因之位置。

本發明之具有啟動子活性的多核苷酸可被使用作為用以增強的通用（general-use）啟動子。

舉例而言，該多核苷酸可被用作得以增強具有麩胺酸-半胱胺酸接合酶活性之多肽的表現之啟動子。再者，該多核苷酸可為用於增加麩胱甘肽之生產或輸出的多核苷酸。本發明之該多核苷酸可包括任何具有啟動子活性的多核苷酸序列。

在本發明中，SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列可為得以發揮作為該麩胺酸-半胱胺酸接合酶之啟動子的功能之序列。

然而，SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列為指出修飾之位置的一代表性多核苷酸序列，且任何對應其且具有啟動子活性的多核苷酸序列亦可被包括於允許導入修飾之序列中。舉例而言，任何能夠發揮作為該麩胺酸-半胱胺酸接合酶之啟動子的功能的多核苷酸序列或具有與其等效活性的多肽可被包括於本發明之修飾被導入至其中的序列的範圍中而不受限制。在這些序列中，當對應於SEQ ID NO: 1或2之核苷酸的第92個、第94個、第102個、第103個、第249個，及第251個核苷酸的至少一核苷酸是以不同核苷酸所取代，可提供相較於未經取代（未修飾）之啟動子序列具有較高活性的啟動子。

SEQ ID NO: 1或2之核苷酸序列可自NCBI GenBank之已知資料庫獲得。對應至SEQ NO: 1或2並作為該麩胺酸-半胱胺酸接合酶之啟動子之序列可衍生自屬於酵母屬的微生物，特別是啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae ），但不限於此，且可包括具有與該多核苷酸等效活性的任何序列而不受限制。

在本發明中，具有啟動子活性之該多核苷酸可為SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列或是具有與SEQ ID NO: 1或2之至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%，或99%之同源性（homology）或相等性（identity）的多核苷酸序列，其中在特定位置或對應至其的位置處的至少一個核苷酸是由一不同的核苷酸所取代。具有同源性或相等性的該多核苷酸序列可排除具有100%相等性的序列，或可為具有小於100%之相等性的序列。

同時，雖然「具有預定SEQ ID NO之多核苷酸序列的多核苷酸」及「包括預定SEQ ID NO之多核苷酸序列的多核苷酸」被用於本發明中，顯見的是具有包括一或多個核苷酸之刪除、修飾、取代，或添加的多核苷酸序列之任何多核苷酸亦可被用於本發明中，只要該多核苷酸具有與由預定之SEQ ID NO之多核苷酸序列所組成之多核苷酸相同或等效的活性。

舉例而言，顯見的是，只要該多核苷酸具有與本發明之該多核苷酸相同或等效的活性，包括預定SEQ ID NO之多核苷酸序列之內部或一端的無意義序列（meaningless sequence）之添加，或是預定SEQ ID NO之多核苷酸序列內部或其一端之一部分之刪除的任何多核苷酸亦可落於本發明的範圍內。

該同源性及相等性是指兩個給定的多核苷酸序列之間的相關度（degree of relevance），且可以百分比表示。

同源性及相等性之用語通常可被彼此互換使用。

保留多核苷酸（conserved polynucleotide）之序列同源性或相等性可藉由標準對位演算法（standard alignment algorithms）而決定，且可與藉由程式所確立的預設空位罰分（default gap penalty）一起使用。實質上同源或相等的序列可與該序列的全長或該序列的全長之至少約50%、60%、70%、80%或90%，在中等或高度嚴密條件下彼此雜交。在經雜交之多核苷酸中，包含簡併密碼子而不是密碼子的多核苷酸亦可被考量。

兩個給定多核苷酸序列之間的序列同源性、相似性或相等性可以藉由任何已知的電腦演算法，諸如「FASTA」程式使用預設參數而決定，例如Pearsonet al ., (1988)Proc. Natl. Acad. Sci . USA 85: 2444所導入者。或者是，於The European Molecular Biology Open Software Suite（EMBOSS）的Needleman程式組合（Riceet al ., 2000,Trends Genet . 16:276–277）（5.0.0或更新之版本）中進行的Needleman-Wunsch演算法（1970, J. Mol. Biol. 48:443–453）可被用以決定序列同源性、相似性或相等性（包括GCG program package (Devereux, J.,et al .,Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F.,et al .,J MOLEC BIOL 215: 403 (1990)；Guide to Huge Computers , Martin J. Bishop, ed.,Academic Press , San Diego, 1994，及CARILLOet al . (1988)SIAM J Applied Math 48: 1073)）。舉例而言，該同源性、相似性或相等性可使用國家生物技術資訊中心資料庫（National Center for Biotechnology Information database，NCBI）的BLAST或ClustalW來決定。

多核苷酸之間的同源性、相似性或相等性可藉由使用GAP電腦程式比對序列資訊而決定，此種程式諸如揭示於Smith and Waterman,Adv. Appl. Math (1981) 2:482中之Needlemanet al . (1970)，J Mol Biol . 48 : 443所介紹者。總而言之，該GAP程式將相似性界定為相似的經對齊之符號（亦即核苷酸或胺基酸）之數量除以兩個序列之較短者中的符號之總數所獲得之值。該GAP程式的預設參數可包括：(1)二進位比較矩陣（包含表示相同的數值1及表示不同的數值0）以及揭露於 Schwartz and Dayhoff, eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure , National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) 中的 Gribskovet al . (1986)Nucl . Acids Res . 14: 6745之加權比較矩陣（或EDNAFULL (NCBI NUC4.4之EMBOSS版本) 取代矩陣）；(2)對各空位（gap）之3.0的罰分（penalty）以及各空位中每個符號額外0.10的罰分（或是一個空位開啟10罰分，且一空位延伸0.5罰分）；以及(3)對於終端空位無罰分。因此，此處所使用的用語「同源性」及「相等性」是指序列之間的相關性（relatedness）。

另外，該多核苷酸可包括自任何已知基因序列，例如但不限於以對上述多核苷酸序列完全或部分互補之序列在嚴密條件下雜交並具有相同活性的多核苷酸序列，所製備的探針（probe）。該用語「嚴密條件」是指允許在多核苷酸之間特定雜交的條件。此等條件詳細揭露在已知文件中（例如，J. Sambrooket al .,Molecular Cloning ,A Laboratory Manual , 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, 紐約, 1989；F. M. Ausubelet al .,Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, Inc., 紐約）。舉例而言，該等嚴密條件可包括在具有高同源性或相等性，例如，40%或具體而言是70%或更高、80%或更高、85%或更高，或90%或更高，更具體而言是95%或更高，甚至更具體而言是97%或更高，最具體而言是99%或更高的同源性或相等性的基因之間進行雜交反應，而不在具有低於上述同源性或相等性的同源性或相等性之基因之間進行雜交反應，或是以南方雜交法之習知清洗條件在60°C、1× SSC，及0.1% SDS；具體而言，60°C、0.1× SSC，及0.1% SDS；及更具體而言68°C、0.1× SSC，及0.1% SDS之溫度及鹽濃度下進行一次清洗，具體而言進行兩次或三次清洗。。

雜交需要包含互補序列之兩個多核苷酸，雖然依據該雜交的嚴密性，鹼基之間的錯位是可能發生的。該用語「互補」是用於敘述可彼此雜交之核苷酸鹼基之間的關係。舉例而言，對於DNA，腺苷酸是與胸腺嘧碇互補，而胞嘧啶是與鳥糞嘌呤互補。因此，本發明可包括不只實質上相似的核酸序列，還可包括對整個序列互補的獨立核酸片段。

具體而言，具有同源性或相等性的多核苷酸可使用包括在55°C之T_m 值之雜交步驟的上述雜交條件加以偵測。再者，該T_m 值可為60°C、63°C，或65°C，但不限於此，且可被適當地由所屬技術領域具有通常知識者依據其目的而調整。

用於雜交多核苷酸的適當嚴密性可依據該多核苷酸之長度及互補性的等級而定，且其參數在所屬技術領域中為已知的（Sambrooket al .,supra , 9.50–9.51, 11.7–11.8）。

本發明所提供之具有啟動子活性的多核苷酸可藉由在上述具有啟動子活性之多核苷酸序列之特定位置處之核苷酸的取代而具有增強的啟動子活性。

於一實施例中，本發明之具有啟動子活性之多核苷酸可包括具有啟動子活性的多核苷酸，其中SEQ ID NO: 1或2之核苷酸序列的至少一個核苷酸是以不同的核苷酸所取代。具體而言，該多核苷酸可由具有啟動子活性的多核苷酸所組成，其中SEQ ID NO: 1或2之核苷酸序列的至少一個核苷酸是以不同的核苷酸所取代。具有啟動子活性的該多核苷酸在本發明中可以「突變啟動子」互換使用。該突變啟動子可為其中在一或多個位置、二或多個位置、三或多個位置、四或多個位置、五或多個位置，或所有六個位置，或與其等對應之位置的核苷酸是以不同的核苷酸所取代之啟動子。

於一實施例中，具有啟動子活性的多核苷酸可為包括SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列的多核苷酸，其中選自於下列所組成之群組的至少一個核苷酸是以不同的核苷酸取代，且具有啟動子活性：第92個、第94個、第102個、第103個、第249個，及第251個核苷酸。

該「不同的核苷酸」並未特別限定，只要在取代後該核苷酸是與取代前不同即可。舉例而言，當SEQ ID NO: 1之多核苷酸序列的第92個核苷酸包括胸腺嘧碇(T)，該表達方式「SEQ ID NO: 1的第92個核苷酸是以不同的核苷酸所取代」係指胸腺嘧碇(T)是以胸腺嘧碇(T)之外的胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)，或鳥糞嘌呤(G)所取代。在本發明中，當核苷酸是「被取代」，該核苷酸是以取代前不同之另一核苷酸所取代，除非另外指明。

同時，所屬技術領域具有通常知識者能藉由本技術領域中熟知的序列對位而在任意多核苷酸序列中決定對應於本發明之SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列的第92個、第94個、第102個、第103個、第249個及第251個核苷酸的位置之核苷酸，且顯見的是，除非在本案中另外指明，在任意多核苷酸序列中，該表達方式「在特定SEQ ID NO:之特定位置處的核苷酸」包括「對應於其之位置處的核苷酸」。因此，具有啟動子活性之多核苷酸的任何多核苷酸序列，其中選自於由下列所組成之群組的至少一核苷酸是以不同核苷酸所取代者是落於本發明的範圍中：對應於SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列的第92個、第94個、第102個、第103個、第249個及第251個核苷酸之核苷酸。

「SEQ ID NO: 1或2之第92個、第94個、第102個、第103個、第249個及第251個位置」是各自位於具有啟動子活性之多核苷酸中ATG（為一起始密碼子（initiation codon））之自A（作為參考點(0) ）起上游之409 nt、407 nt、399 nt、398 nt、252 nt，及250 nt處，該多核苷酸是衍生自啤酒酵母菌菌株CEN KSD-Yc、YJM1450、YJM1401、YJM1307及依據布達佩斯條約寄存於韓國微生物保藏中心（KCCM）具有存取碼KCCM12568P的菌株，即SEQ ID NO: 2中，且因此該等位置可根據本技術領域中常用的方法被各自記載為自ORF起上游的該−409^th 、−407^th 、−399^th 、−398^th 、−252^nd ，及−250^th 位置。

同時，對於衍生自啤酒酵母菌CEN.PK1-D的具有啟動子活性之多核苷酸，即，SEQ ID NO: 1，其中在啤酒酵母菌CEN KSD-Yc之啟動子序列自ORF起上游第74個位置（即，−74^th 位置）的核苷酸被刪除，而「 SEQ ID NO: 1或2之第92個、第94個、第102個、第103個、第249個，及第251個位置」各自對應於自ORF起−408^th 、−406^th 、−398^th 、−397^th 、−251^st ，及−249^th 位置。

於一實施例中，本發明之具有啟動子活性的多核苷酸可為其中選自於由下列所組成之群組的至少一個核苷酸是以不同核苷酸取代的多核苷酸：SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列的第92個、第94個、第102個、第103個、第249個，及第251個核苷酸。

具體而言，在本發明中，具有啟動子活性的該多核苷酸可以為其中選自於由以下所組成之群組的二或更多個核苷酸是以不同的核苷酸所取代的多核苷酸：SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列的第92個、第94個、第102個、第103個、第249個，及第251個核苷酸。

具體而言，在本發明中，具有啟動子活性的該多核苷酸可以為其中選自於由以下所組成之群組的四或更多個核苷酸是以不同的核苷酸所取代的多核苷酸：SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列的第92個、第94個、第102個、第103個、第249個，及第251個核苷酸。

具體而言，該多核苷酸可以為其中選自於由以下所組成之群組的所有六個核苷酸是以不同的核苷酸所取代的多核苷酸：EQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列的第92個、第94個、第102個、第103個、第249個，及第251個核苷酸。

於本發明的一個實施例中，具有啟動子活性之多核苷酸可為其中SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列之第249個及第251個核苷酸被以不同核苷酸所取代的多核苷酸。

於本發明的一實施例中，具有啟動子活性之多核苷酸可為其中SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列之第92個、第94個、第102個及第103個核苷酸被以不同核苷酸所取代的多核苷酸。

然而，本發明並不限制於此。

於本發明的一實施例中，具有啟動子活性之多核苷酸可包括：

在第92個位置的胸腺嘧碇(T)被以鳥糞嘌呤(G)、胞嘧啶(C)，或腺嘌呤(A)所取代；

在第94個位置的胸腺嘧碇(T)被以鳥糞嘌呤(G)、胞嘧啶(C)，或腺嘌呤(A)所取代；

在第102個位置的腺嘌呤(A)被以鳥糞嘌呤(G)、胞嘧啶(C)，或胸腺嘧碇(T)所取代；

在第103個位置的腺嘌呤(A)被以鳥糞嘌呤(G)、胞嘧啶(C)，或胸腺嘧碇(T)所取代；

在第249個位置的鳥糞嘌呤(G)被以胸腺嘧碇(T)、胞嘧啶(C)，或腺嘌呤(A)所取代；

在第251個位置的胞嘧啶(C)被以胸腺嘧碇(T)、鳥糞嘌呤(G)，或腺嘌呤(A)所取代；或SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列中的任何組合。

於一實施例中，在第92個位置的胸腺嘧碇(T)可以胞嘧啶(C)取代。此亦可被表示為92 (T→C)或−409 (T→C)，且根據參考序列，為−408 (T→C)。

於一實施例中，在第94個位置的胸腺嘧碇(T)可以胞嘧啶(C)取代。此亦可被表示為94 (T→C)或−407 (T→C)，且根據參考序列，為−406 (T→C)。

於一實施例中，在第102個位置的腺嘌呤(A)可以胞嘧啶(C)取代。此亦可被表示為102 (A→C)或−399 (A→C)，且根據參考序列，為−398 (A→C)。

於一實施例中，在第103個位置的腺嘌呤(A)可以胸腺嘧碇(T)取代。此亦可被表示為103 (A→T)或−398 (A→T)，且根據參考序列，為−397 (A→T)。

於一實施例中，在第249個位置的鳥糞嘌呤(G)可以腺嘌呤(A)取代。此亦可被表示為249 (G→A)或−252 (G→A)，且根據參考序列，為−251 (G→A)。

於一實施例中，在第251個位置的胞嘧啶(C)可以胸腺嘧碇(T)取代。此亦可被表示為251 (C→T)或−250 (C→T)，且根據參考序列，為−249 (C→T)。

於本發明的一實施例中，具有啟動子活性的該多核苷酸可包括92 (T→C)、94 (T→C) 、102 (A→C) 、103 (A→T) 、249 (G→A)，及251 (C→T)之至少一個取代。

於本發明的一實施例中，具有啟動子活性的多核苷酸可包括249 (G→A)及251 (C→T)之取代。

於本發明的一實施例中，具有啟動子活性的多核苷酸可包括92 (T→C)、94 (T→C)、102 (A→C)及103 (A→T)之取代。

於本發明的一實施例中，具有啟動子活性的多核苷酸可包括92 (T→C)、94 (T→C)、102 (A→C)、103 (A→T)、249 (G→A)及251 (C→T)之所有取代。

於本發明的一實施例中，具有啟動子活性的多核苷酸可包括選自於SEQ ID NOS:3至32之至少一個多核苷酸序列。具體而言，該多核苷酸可由選自於SEQ ID NOS: 3至32之一個多核苷酸序列所組成，但不限於此。

如上所述，雖然以下表達方式：「具有特定SEQ ID NO:之核苷酸序列的多核苷酸」或「包括特定SEQ ID NO: 之核苷酸序列的多核苷酸」是用於本發明中，顯見的是只要該多核苷酸具有與由該特定SEQ ID NO之核苷酸序列所組成的該多核苷酸相同或等效的活性，具有包括一或多個核苷酸的刪除、修飾、取代，或添加的核苷酸序列的任何多核苷酸亦可被用於本發明中。

另外，本發明並未限制於前述實施例，且該核苷酸序列可以包括不顯著影響啟動子活性之範圍內的各種修飾。

本發明之具有啟動子活性的該多核苷酸可被使用作為啟動子。

該啟動子可為位於mRNA轉錄之起始位置之5’區域。

該啟動子可具有與傳統啟動子相比係經增強之啟動子活性。意即，該啟動子可不僅增加宿主細胞中之目標基因的表現，亦增加由該目標基因編碼之蛋白質的表現及／或活性。有鑑於本發明的目的，用於增強表現的目標基因可根據欲獲得的產物而修飾，且該啟動子可被使用作為一通用啟動子以增強目標基因。

依據本發明的目的，該「目標基因」指一基因，其表現是由本發明的該啟動子序列調節。由該目標基因編碼的蛋白質可被稱為「目標蛋白質」，且編碼該「目標蛋白質」的基因可被稱為「目標基因」。

另外，編碼該目標蛋白質的多核苷酸可具有於編碼區中的各種修飾，條件在於不改變由該編碼區表現之該蛋白質的胺基酸序列，該改變是由於密碼子退化或考慮到其中多核苷酸被表現的生物體所偏好的密碼子。多核苷酸序列之敘述是如同以上所提供者。

於一實施例中，該目標蛋白可為具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的多肽。意即，該啟動子的目標基因可為編碼具有該麩胺酸-半胱胺酸連接酶之多肽的基因。

在本發明中，該「麩胺酸-半胱胺酸連接酶（glutamate–cysteine ligase）」為亦稱為「麩胺酸-半胱胺酸連接酵素（glutamate–cysteine linking enzyme）」、「γ-麩胺酸半胱胺酸合成酶（gamma -glutamyl cysteine synthetase ，GCS）」或「GSH1蛋白質」之酵素。

該麩胺酸-半胱胺酸連接酶已知催化下列反應：

左旋麩胺酸 + 左旋半胱胺酸 + ATP ↔ γ-麩胺酸半胱胺酸 + ADP + P_i

另外，由該麩胺酸-半胱胺酸連接酶催化的該反應已知作為麩胱甘肽合成的第一步驟。

構成該麩胺酸-半胱胺酸連接酶的該胺基酸序列可自NCBI GenBank的已知資料庫獲得。例如，該麩胺酸-半胱胺酸連接酶可衍生自啤酒酵母菌。舉例而言，該麩胺酸-半胱胺酸連接酶可為包括SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的蛋白質，但可包括具有與該胺基酸序列相同活性的任何序列而不受限制。

另外，本發明之該「具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的多肽」可不僅包括該麩胺酸-半胱胺酸連接酶的野生種、未修飾，或自然存在形式，亦包括具有相同或增強之麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的變異體。

在本發明中，「經修飾之多肽」具有與「變異體」相同的意義，可指在保有該蛋白質的功能或特性下藉由保留取代及／或修飾與所載之序列不同的至少一胺基酸所獲得之蛋白質。舉例而言，該經修飾的多肽可為上述麩胺酸-半胱胺酸連接酶中，其中SEQ ID NO: 33之N端的第86個胺基酸是以半胱胺酸之外不同的胺基酸殘基所取代的變異體。

該變異體是藉由取代、刪除或添加數個胺基酸而被辨識為與該序列不同。此等變異體可藉由修飾該蛋白質的上述胺基酸序列之一或更多胺基酸而獲得，並藉由評估經修飾之蛋白質的特性而辨認。意即，該變異體的能力可相對於原始蛋白質（native protein）被增強。另外，一些變異體可包括諸如N端前導序列（leader sequence）或跨膜區域（transmembrane domain）之至少一部分被移除的變異體。其他變異體可包括其中一部分自一成熟蛋白質的N及／或C端移除的變異體。

該用語「變異體」亦可與其他用語互換使用，諸如修飾、經修飾之蛋白質、經修飾之多肽、突變體（mutant）、突變蛋白（mutein）及趨異體（divergent），且用於表示變化之任何用語亦可不受限地被使用。有鑑於本發明的目的，該變異體可具有相較於野生種或未修飾之蛋白質更增強之活性，但不限於此。

如此處所使用的，該用語「保留取代」是指以具有相似結構及／或化學特性的一不同胺基酸取代一個胺基酸。該變異體可在保有至少一個生物活性之下具有至少一個保留取代。此胺基酸取代通常可基於殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性，及／或兩親性（amphipathic）本質之相似性而發生。

變異體亦可包括對於多肽的特性及二級結構有最小影響的胺基酸之刪除或添加。例如，該多肽可共軛於共轉錄（co-translationally）或後轉錄（post-translationally）地引導蛋白質的轉移（transfer）的一蛋白質之N端的一訊號（或前導）序列。該多肽亦可共軛於另一序列或連接子（linker）以辨認、純化或合成該多肽。

在本發明中，只要取代後之胺基酸是與取代前之胺基酸不同，「以一不同的胺基酸取代」並未被特別限制。意即，以半胱胺酸之外的胺基酸取代SEQ ID NO: 33之該胺基酸序列的N端起算第86個胺基酸（半胱胺酸）亦可被表示為「以不同胺基酸取代該第86個胺基酸」。同時，在本發明中，顯見的是除非使用「以一不同胺基酸所取代」之表示，「一預定胺基酸被取代」之表達方式表示取代後之胺基酸是與取代前之胺基酸不同。

本發明之該「麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體」亦可被稱為「具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的（經修飾之）多肽」或「GSH1變異體」，其相較於修飾前的蛋白質、野生種多肽或未經修飾的多肽可增加麩胱甘肽的生產，但不限於此。

於該變異體中，SEQ ID NO: 33之該胺基酸序列的至少一胺基酸可以不同的胺基酸所取代。具體而言，該變異體可包括以不同的胺基酸取代對應於SEQ ID NO: 33之該胺基酸序列的第86個位置之胺基酸。該不同的胺基酸可選自於甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、離胺酸、精胺酸，及組胺酸。

於一實施例中，對應於SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第86個位置的胺基酸可以精胺酸取代，但不限於此。

於本發明中，顯見的是「SEQ ID NO: 33之胺基酸序列自N端起第86個胺基酸被以不同胺基酸取代的變異體」包括其中對應於SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第86個位置的胺基酸是以不同的胺基酸所取代的變異體，雖然由於在SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的N或C端或中央的胺基酸之刪除／添加／添加等而使該胺基酸並非在第86個位置。再者，雖然其中SEQ ID NO: 33之該胺基酸序列從N端起算第86個胺基酸以一不同胺基酸取代的變異體是作為本發明中的該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體的一個實例而揭示，顯見的是，本發明的該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體並非限制於SEQ ID NO: 33之該胺基酸序列的變異體，且在具有該麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的任何胺基酸序列中，其中對應於SEQ ID NO:33之胺基酸序列的第86個位置的胺基酸以不同胺基酸取代的變異體亦落於本發明之該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體的範圍內。在任何胺基酸序列中，該「對應於SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第86個位置的胺基酸」可藉由各種本領域中已知的序列對準（sequence alignment）方法而辨認。

本發明之其中對應於SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的N端起算之第86個位置的胺基酸是以不同胺基酸取代的該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體，可為包括SEQ ID NO: 33之該胺基酸序列或是具有與其之至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%，或99%同源性或相等性之胺基酸序列的蛋白質。再者，顯見的是，只要該蛋白質保有上述同源性或相等性以及與該變異體等效的效果，具有在第86個位置之外之位置的一或多個胺基酸之刪除、修飾、取代，或添加的胺基酸序列的任何蛋白質是落於本發明的範圍內。同源性及相等性是如上所述。

編碼本發明之具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的該多肽之基因可稱為「GSH1基因」。

該基因可衍生自酵母。具體而言，該基因可衍生自屬於酵母屬，更具體而言啤酒酵母菌的微生物。具體而言，該基因可為編碼SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之基因，但不限於此。

在本發明中，該「GSH1基因」，即，編碼具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性之該多肽的該多核苷酸可具有各種在編碼區中所做的修飾，條件在於不改變自該編碼區所表現之該多肽的胺基酸序列，該改變是由於密碼子退化（codon degeneracy）或考量多核苷酸將於其中表現之生物體所偏好的密碼子。

由於本發明之具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的該多肽亦包括變異體之序列，編碼其中本發明之SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第86個位置的胺基酸是以不同的胺基酸所取代的蛋白質變異體之任何多核苷酸序列亦可被包括而不受限制。

另外，該多核苷酸可包括在嚴密條件下以使用已知基因序列，例如對該多核苷酸序列完全或部分互補的多核苷酸序列建構的探針進行雜交以編碼該蛋白質變異體的多核苷酸序列，該蛋白質變異體中對應於SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的第86個位置的胺基酸是以一不同胺基酸所取代，但不受限於此。

本發明的另一個態樣提供用於表現包括本發明之具有啟動子活性之該多核苷酸的一基因的組成物。

用於表現一基因的該組成物是指能夠使用本發明之具有啟動子活性的該多核苷酸表現該基因的組成物。

舉例而言，用於表現基因的該組成物包括本發明之具有啟動子活性的該多核苷酸，且可進一步包括任何能夠將該多核苷酸做為啟動子操作的其他組分。

於本發明之用於表現基因的該組成物中，該多核苷酸可為被包括於載體內的形式，該載體能夠於宿主細胞中表現可操作地連結於其的基因。

本發明的另一態樣提供包括具有啟動子活性的該多核苷酸或是該多核苷酸及編碼目標蛋白之基因的載體。

於一實施例中，該目標蛋白可為具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的多肽。

如此處所使用的，該用語「載體」是指包括編碼一目標蛋白之多核苷酸序列的DNA建構體，其是可操作性地連結至一適當的調節序列（regulatory sequence）以在合適的宿主細胞中表現該目標蛋白。

有鑑於本發明的目的，該調節序列可包括本發明之具有啟動子活性的該多核苷酸。

同時，該調節序列可包括用於起始轉錄的啟動子、用於調節轉錄的運算子序列，及編碼合適的mRNA核醣體結合位置的序列，以及調節轉錄及轉譯之終止之序列。在該載體被導入合適之宿主細胞後，其可相對於該宿主基因組獨立複製或發揮功能，且可被整合至基因組本身。

用於本發明之該載體不特別限制，且任何本領域中已知的載體可被使用。作為由酵母表現的載體，整合酵母質體（integrative yeast plasmids，YIp）及染色體外質體載體皆可被使用。

該染色體外質體載體可包括附加型酵母質體（episomal yeast plasmids，YEp）、複製型酵母質體（replicative yeast plasmids，YRp），及酵母著絲點質體（yeast centromer plasmids，YCp）。

再者，人工酵母染色體（YACs）亦可被用作本發明的載體。

作為具體實例，可用的載體可包括pESCHIS、pESC-LEU、pESC-TRP、pESC-URA、閘道（Gateway） pYES-DEST52、pAO815、pGAPZ A、pGAPZ B、pGAPZ C、pGAPα A、pGAPα B、pGAPα C、pPIC3.5K、pPIC6 A、pPIC6 B、pPIC6 C、pPIC6α A、pPIC6α B、pPIC6α C、pPIC9K、pYC2/CT、pYD1酵母顯示載體（Yeast Display Vector）、pYES2、pYES2/CT、pYES2/NT A、pYES2/NT B、pYES2/NT C、pYES2/CT、pYES2.1、pYES-DEST52、pTEF1/Zeo、pFLD1、PichiaPinkTM、p427-TEF、p417-CYC、pGAL-MF、p427-TEF、p417-CYC、PTEF-MF、pBY011、pSGP47、pSGP46、pSGP36、pSGP40、ZM552、pAG303GAL-ccdB、pAG414GAL-ccdB、pAS404、pBridge、pGAD-GH、pGAD T7、pGBK T7、pHIS-2、pOBD2、pRS408、pRS410、pRS418、pRS420、pRS428、酵母微米A型（yeast micron A form）、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pYJ403、pYJ404、pYJ405，以及pYJ406，但不限於此。

將該多核苷酸插入該染色體可藉由本技術領域中任何已知的方法，例如同源重組（homologous recombination）而進行，但不限於此。可進一步包括一選擇標記（selection marker）以確認染色體的插入。該選擇標記是用以選擇以該載體轉化的細胞，即，確認所欲之核酸分子的插入，且選擇標記的實例可包括提供可選擇之表現型（selectable phenotypes），諸如抗藥性、營養需求（nutrient requirement）、對細胞毒性劑（cytotoxic 　agent）之抗性，或變異多肽之表面表現的標記。在以選擇性試劑處理的環境下，只有表現該選擇標記的細胞可以存活或顯現其他的表現型，且因此該等被轉化的細胞可被選擇。舉例而言，一野生種多核苷酸可藉由使用一載體以於細胞中進行染色體插入而以一突變多核苷酸取代。

如此處所使用的，該用語「轉化作用（transformation）」係指將包括編碼一目標蛋白的多核苷酸之載體插入一宿主細胞，使得能夠於該宿主細胞中表現該目標蛋白之程序。

只要該蛋白質被表現於該宿主細胞中，該經轉化的多核苷酸可以是呈插入宿主細胞之染色體中或位於染色體外部的形式。另外，編碼該目標蛋白的該多核苷酸可包括編碼該目標蛋白的DNA及RNA。只要該多核苷酸被導入至該宿主細胞且該蛋白質於其中被表現，編碼該目標蛋白的該多核苷酸可以任何形式被導入宿主細胞。舉例而言，編碼該目標蛋白的該多核苷酸可以表現匣（expression cassette）的形式被導入至宿主細胞中，該表現匣是包括對於其自我複製（self-replication）為必須的所有必要元素的基因建構（gene construct）。

該表現匣一般可包括可操作地連結至編碼該目標蛋白的該多核苷酸的啟動子、轉錄終止訊號（transcription terminator signal）、核醣體結合位置，及轉譯終止訊號（translation terminator signal）。該表現匣可呈自我複製表現載體的形式。再者，編碼該目標蛋白的該多核苷酸可以其原始形式被導入至宿主細胞並可操作地連結至對於宿主細胞中之表現所需的序列，但不限於此。

另外，此處所使用的用語「可操作地連結（operably linked）」意指本發明之編碼該目標蛋白的多核苷酸序列是功能性地連結（functionally linked）至一啟動子序列，且該啟動子序列起始及調解（mediates）該多核苷酸序列的轉錄。

有鑑於本發明的目的，該啟動子可為本發明之具有啟動子活性的多核苷酸。

根據本發明之轉化方法包括能夠將載體導入宿主細胞中的任何方法，且可藉由依據該宿主細胞選擇本領域中所熟知的合適標準技術進行。例如，可使用電穿孔法（electroporation）、磷酸鈣（CaPO₄ ）沉澱法、氯化鈣（CaCl₂ ）沉澱法、顯微注射法（microinjection）、聚乙二醇（PEG）法、DEAE-聚葡萄糖法（DEAE-dextran method）、陽離子型脂質體方法，以及醋酸鋰-DMSO方法，但本發明不限於此。

本發明之另一態樣提供包括本發明之具有啟動子活性之多核苷酸的微生物、包括該上述多核苷酸的多核苷酸及編碼一目標蛋白的基因，或包括其之載體。

該目標蛋白可為具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的多肽。本發明之具有啟動子活性的多核苷酸、該目標蛋白、具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性之該多肽，及該載體是如上所述。

該微生物可為酵母，具體而言，屬於酵母屬的微生物，且更具體而言，為啤酒酵母菌。

該微生物可為表現麩胺酸-半胱胺酸連接酶的微生物、表現具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性之多肽的微生物，或其中具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的多肽被導入的微生物，但不限於此。

於一實施例中，該微生物可為具有生產麩胱甘肽之能力的微生物、藉由增強本質具有低麩胱甘肽生產能力之母株的生產麩胱甘肽之能力而製備的微生物，或藉由將生產麩胱甘肽的能力提供給無法生產麩胱甘肽的母株而製備的微生物。在一實施例中，該微生物可為表現該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體的的微生物，該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體包括SEQ ID NO: 33的胺基酸序列中之至少一個胺基酸變異，且該胺基酸變異可包括SEQ ID NO: 33之N端的第86個胺基酸以不同的胺基酸進行取代。然而，本發明並未限制於此。該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體是如上所述。

如此處所使用之用語，蛋白質「將被表現／被表現（to be expressed/being expressed）」係指其中目標蛋白質，例如，麩胺酸-半胱胺酸連接酶或其變異體被導入至一微生物中，或被修飾以於微生物中表現的狀態。在該蛋白質存在於該微生物的情形中，相較於其內升蛋白質的活性，或修飾前之活性，該蛋白質的活性被增強。

具體而言，該用語「導入蛋白質」是指將一特定蛋白質之活性提供給不具有該蛋白質的一微生物，或是相較於該蛋白質的內在活性（intrinsic activity）或修飾前之活性，增強該蛋白質的活性。舉例而言，導入蛋白質可指將編碼特定蛋白質的多核苷酸導入染色體中，或將包括編碼該特定蛋白質的該多核苷酸的載體導入微生物中，藉此表現該蛋白質的活性。

另外，「增強活性」可指當相較於內在活性或修飾前的活性，微生物的特定蛋白質之活性被增強。該用語「內在活性」是指當微生物藉由自然或人工基因變化而轉化時，在轉化之前的母株所具有的特定蛋白質之活性。

有鑑於本發明的目的，活性的增強可藉由將本發明之具有啟動子活性的該多核苷酸序列作為該目標蛋白的表現調節序列而達成。該目標蛋白可為如上所述之野生種或變異體，該表現調節序列可為編碼一蛋白質變異體的基因之表現調節序列，或編碼一野生種蛋白質之染色體基因的表現調節序列。

另外，用於增強活性的任何其他方法或組合的方法可被使用。舉例而言，除了使用本發明之具有啟動子活性之該多核苷酸序列作為該目標蛋白的表現調節序列的方法，選自於由下列所組成之群組的至少一個方法可被使用而不受限制：增加細胞中編碼該目標蛋白之基因的複製數（copy number）的方法、以編碼一蛋白質變異體的基因取代編碼一野生種蛋白質的染色體基因的方法、將突變額外導入編碼該蛋白質之基因以增強該蛋白質變異體之活性的方法，以及將該蛋白質變異體導入微生物中的方法。

該目標蛋白的活性可藉由使用本發明之具有啟動子活性的該多核苷酸作為微生物中之該目標蛋白的表現調節序列而增強。

舉例而言，相較於野生種或未經修飾的微生物菌株的活性或濃度，該蛋白質之活性或濃度通常可增加1%、10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%，或500%之最小值，至1000%或2000%的最大值，但不限於此。

如此處所使用的，該用語「未經修飾的微生物」不排除具有可能自然地發生於微生物中之突變的菌株，且可為野生種菌株、不包括本發明之具有啟動子活性之該多核苷酸的微生物，或未以包括本發明之具有啟動子活性之該多核苷酸的載體轉化的微生物。

本發明之該微生物可為生產麩胱甘肽的微生物。

如此處所使用的，該用語「麩胱甘肽」可與「GSH」互換使用且是指由三個胺基酸所組成的三肽化合物：麩胺酸、半胱胺酸及甘胺酸。麩胱甘肽可被用作藥品、健康機能食品、嚐味成分、食物及飼料添加劑、化妝品及類似者的原料，但不限於此。

如此處所使用的，該用語「生產麩胱甘肽之微生物」包括其中天然或人工基因修飾發生的微生物，且可指具有經由導入外源基因或是通過基因修飾而增強或去活化內源基因而被削弱或增強以生產麩胱甘肽之特定機制的微生物。有鑑於本發明的目的，該生產麩胱甘肽的微生物可指包括本發明之具有啟動子活性之該多核苷酸且相較於野生種或未經修飾之微生物能夠大量生產目標麩胱甘肽之微生物。

該「生產麩胱甘肽之微生物」可與「生產麩胱甘肽的微生物」、「具有生產麩胱甘肽之能力的微生物」、「生產麩胱甘肽之菌株」、「具有生產麩胱甘肽之能力的菌株」或類似者互換使用。

該生產麩胱甘肽之微生物可為重組微生物。該重組微生物是如上所述。該微生物可包括用於增強生物合成途徑以增加麩胱甘肽生產能力、釋放回饋抑制（feedback inhibition），或將減弱該分解途徑或生物合成途徑的基因去活化的突變，且此突變可起因於人工方法，例如UV照射，且不排除自然發生的突變。

本發明的另一態樣提供一種生產麩胱甘肽之方法，該方法包括於培養基中培養該微生物。該微生物及麩胱甘肽如上所述。麩胱甘肽可藉由菌株培養而累積於該微生物中。

針對用於培養本發明之菌株的培養基或其他培養條件，任何常用於培養屬於酵母屬的微生物的培養基可被使用而不限於此，且具體而言，本發明之該菌株可於包含適當碳源、氮源、磷源、無機化合物、胺基酸，及／或維他命的一般培養基中，在好氧或厭氧條件下，於調整溫度、pH值及類似者下被培養。

在本發明中，作為碳源，碳水化合物，諸如葡萄糖、果糖、蔗糖及麥芽糖；糖醇諸如甘露醇及山梨醇；有機酸諸如丙酮酸、乳酸及檸檬酸；及胺基酸諸如麩胺酸、甲硫胺酸及離胺酸可被使用，但不限制於此。另外，諸如澱粉水解物、糖蜜（molasses）、廢糖蜜（blackstrap molasses）、米糠（rice bran）、木薯（cassava）、甘蔗糖蜜（sugar cane molasses）及玉米浸液的天然有機營養物可被使用，且諸如葡萄糖及滅菌預處理之糖蜜（即被轉化成還原糖的糖蜜）等的碳水化合物可被使用，且合適量的任何其他碳源亦可不受限地被使用。這些碳源可被單獨使用或以其至少兩種的組合而使用。

作為氮源，諸如氨（ammonia）、硫酸銨、氯化銨、醋酸銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸銨等無機氮源；以及諸如胺基酸、蛋白腖（peptone）、NZ-胺（NZ-amine）、肉品萃取物、酵母萃取物、麥芽精萃取物、玉米浸液、酪蛋白水解物（casein hydrolysate）、魚或其等的分解產物、以及脫脂大豆餅或其等的分解產物等有機氮源可被使用。這些氮源可被單獨使用或其等之至少二者相互組合而使用。

作為磷源，磷酸二氫鉀（monopotassium phosphate）、磷酸氫二鉀（dipotassium phosphate）、或對應其等的含鈉之鹽類等可被使用。作為該等無機化合物，氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、碳酸鈣及類似物可被使用。

該培養基可進一步包括胺基酸、維生素，及/或合適的前驅物。具體而言，左旋胺基酸或類似物可被添加至該培養基供該菌株使用。具體而言，甘胺酸、麩胺酸鹽，及／或半胱胺酸可被添加至該培養基，且若有需要，諸如離胺酸的左旋胺基酸可被進一步添加，但本發明不限制於此。

該培養基或前驅物可被以批次（in a batch）或連續模式添加至該培養物，但不限制於此。

在本發明中，於該菌株的培養過程期間，諸如氫氧化銨（ammonium hydroxide）、氫氧化鉀、氨水、磷酸及硫酸等化合物可被適當添加至該等培養物以調整該等培養物的pH值。再者，諸如脂肪酸聚乙二醇酯（fatty acid polyglycol ester）的抗發泡劑（defoaming agent）可被添加以抑制培養期間泡沫的生成。另外，氧氣或含氧氣體可被注入該培養物以維持該培養物的好氧狀態（aerobic state），而氮氣、氫氣或二氧化碳氣體可被注入該等培養物，或是不注入任何氣體至該等培養物，以維持該等培養物的厭氧（anaerobic）或微好氧（microaerobic）狀態。

該等培養物的溫度可被維持於25°C至40°C，且更具體而言，28°C至37°C，但並不限制於此。培養可持續進行直到所欲之量的產物被獲得，具體而言，繼續進行1至100小時，但並不限於此。

用於生產麩胱甘肽的方法可進一步包括在培養步驟之後的一額外程序。該額外程序可根據麩胱甘肽的使用目的而被適當地選擇。

具體而言，生產麩胱甘肽的方法可進一步包括在培養步驟後，自選自於該經培養的微生物、該微生物的一乾燥產物、該微生物的一萃取物、該微生物的一培養物以及該微生物的至少一者回收麩胱甘肽之步驟。

該方法可進一步包括在回收步驟之前或與回收步驟同步溶解該微生物（菌株）的步驟。該菌株之溶解可藉由本發明所屬技術領域中任何已經常使用的方法進行，例如，藉由熱處理或藉由使用用以水解的緩衝溶液、一超音波振盪器（sonicator）及法式壓碎機（French press）。再者，該溶解步驟可包括酵素反應，該酵素反應是藉由細胞壁溶解酵素（cell wall lytic enzyme）、核酸酶（nuclease）、核苷酸基轉移酶（transnucleotidase）、蛋白酶或類似物進行，但並不限制於此。

有鑑於本發明的目的，各自具有高麩胱甘肽含量的乾燥酵母、酵母萃取物、酵母萃取物混合粉末，及純麩胱甘肽可藉由生產麩胱甘肽的方法被製備。然而，本發明並不限制於此，且這些產物可根據所欲的產物而被適當製備。

在本發明中，乾燥酵母可與「該微生物之乾燥產物」、「該菌株之乾燥產物」或類似者互換使用。該乾燥酵母可藉由將其中累積有麩胱甘肽的酵母菌株乾燥而製備，且具體而言，其可被包括於一飼料組成物、一食物組成物及類似物中，但不限制於此。

在本發明中，該酵母萃取物可與諸如「該微生物之萃取物」、「菌株之萃取物」或類似者之用語互換使用。該菌株之萃取物可指在將細胞壁自該等菌株分離後剩餘的物質。具體而言，該菌株的萃取物可指藉由細胞之溶解所獲得之組分除去細胞壁的剩餘組分。該菌株之萃取物包括麩胱甘肽及麩胱甘肽之外的選自於下列之一或更多其他組分：蛋白質、碳水化合物、核苷酸，及纖維，但不限於此。

該回收步驟可使用本技術領域中任何已知的適合方法而進行，且麩胱甘肽可做為目標物質而被回收。

該回收步驟可包括一純化過程。該純化過程可藉由自該菌株僅分離麩胱甘肽而進行。經由該純化過程，純麩胱甘肽可被製備。

若有需要，製備麩胱甘肽的方法可進一步包括將賦形劑與選自於下列之一者混合：該菌株、該菌株的乾燥產物、該菌株的萃取物、該菌株的培養物，及該菌株的溶解產物，以及自其等回收的麩胱甘肽。藉由混合步驟，酵母萃取物混合粉末可被製備。

該賦形劑可根據其目標用途或其形式而被適當地選擇及使用，且可為，例如，選自於澱粉、葡萄糖、纖維素、乳糖、肝醣、右旋甘露醇（D-mannitol）、山梨醇、乳糖醇、麥芽糊精、碳酸鈣、合成矽酸鋁、正磷酸氫鈣（calcium monohydrogen phosphate）、硫酸鈣、氯化鈉、碳酸氫鈉、純化羊毛酯（lanolin）、糊精、海藻酸鈉、甲基纖維素、膠體二氧化矽膠（colloidal silica gel）、羥丙澱粉（hydroxypropyl starch）、羥丙基甲基纖維素、丙二醇、酪蛋白（casein）、乳酸鈣、羧甲基澱粉鈉（primogel）及阿拉伯膠，且具體而言，其可包括選自於澱粉、葡萄糖、纖維素、乳糖、糊精、肝醣、右旋甘露醇及麥芽糊精的至少一組分，但不限於此。

該賦形劑可包括，例如一防腐劑（preservative）、一濕潤劑（humectant）、一分散劑、一懸浮劑、一緩衝劑、一穩定劑，或一等滲劑（isotonic agent），但不限於此。

本發明的另一態樣提供一多核苷酸作為啟動子的用途，該多核苷酸中至少一個選自於下列的核苷酸是以不同的核苷酸所取代：SEQ ID NO: 1或2之多核苷酸序列的第92個、第94個、第102個、第103個、第249個，及第251個核苷酸。

該多核苷酸如上所述。 [發明模式]

此後，本發明將參照下列實例及實驗例而被更詳細地敘述。然而，該等實例及實驗例僅用於例示本發明的目的，而本發明的範圍為並未限制於此。

實例 1 ：獲得具有麩胱甘肽生產能力的 CJ-5 菌株

菌株由包含各種菌株的酵母塊（yeast block）獲得，且其等的特徵被改良以選擇具有麩胱甘肽生產能力的菌株。

具體而言，諸如米、大麥、綠豆、燕麥等的穀物樣品係收集自韓國京畿道（Gyeonggi Province）之諸如華城（Hwaseong）、平澤（Pyeongtaek）、龍仁（Yongin）及類似處等20個區域，接著經過粉化、研磨、包裝於布中、緊壓以成形、以稻草包裹以進行發酵10天，並緩慢乾燥以製備酵母塊。

下列實驗被進行以將各種菌株自經製備的酵母塊分離。45毫升（mL）的鹽水水溶液被添加至5克（g）酵母塊並使用混合器粉化。為了純分離（purely isolate）酵母菌株，產物藉由系列的稀釋而被稀釋，分布於YPD洋菜（每1升蒸餾水10克/升酵母萃取，20克/升細菌用蛋白腖（bacto peptone），及20克/升葡萄糖）上，並於30°C下培養48小時。接著，根據菌落的型態及微觀驗證（microscopic verification），酵母的菌落於YPD洋菜上呈紋路狀（streaked）。25毫升之YPD培養液被播種於250毫升錐形瓶中，且該純分離菌株被接種於其上並於一搖晃培養器中在30°C及200 rpm下培養48小時。菌株藉由辨識麩胱甘肽的生產而篩選。

為了增強主要分離的菌株，隨機突變被導入該等分離的菌株中。具體而言，被確認具有麩胱甘肽生產能力的一菌株自該酵母塊分離，並命名為CJ-37菌株。該CJ-37菌株於固態培養基中培養並接種至培養液中以獲得其培養溶液，且該培養溶液被使用UV燈而被暴露於UV光下。在暴露於UV射線的該培養溶液被放置於盤狀培養基上後，只有已形成菌落的突變菌株被分離，且其麩胱甘肽生產被辨認。

結果，在該等突變菌株中，展現最大的麩胱甘肽生產的菌株被選擇作為生產麩胱甘肽之菌株，命名為CJ-5菌株，依照布達佩斯條約於2019年7月31日寄存於韓國微生物保藏中心（Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM），並具有KCCM12568P之寄存編號。

實例 2 ：藉由用於 CJ-5菌株 之額外增強的實驗對 GSH1 之修飾序列的開發

實例 2-1 ：突變誘發及修飾序列的辨認

以下列方式誘發突變以進一步改良該CJ-5菌株的麩胱甘肽生產能力。

該CJ-5菌株是在固態培養基中培養並接種至一培養液以獲得一培養溶液，且該培養溶液使用UV燈被暴露於UV光。在暴露於UV射線的該培養溶液被放置於盤狀培養基上後，只有已形成菌落的突變菌株被分離。展現最大麩胱甘肽生產的菌株被分離且命名為CC02-2490菌株，依照布達佩斯條約於2020年1月17日寄存於韓國微生物保藏中心（KCCM）且被指定為KCCM12659P之寄存編號。針對該菌株之麩胱甘肽生產能力的增強分析麩胱甘肽生物合成基因GSH1之鹼基序列的結果，確認由該GSH1基因編碼之該GSH1蛋白質的第86個胺基酸之半胱胺酸是以精胺酸所取代。

實例 2-2 ： GSH1 蛋白質之 C86 殘基的 取代實驗

基於實例2-1之結果，考量該GSH1蛋白質的第86個位置處的胺基酸對於麩胱甘肽生產為重要的，啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae )）CEN.PK2-1D之突變菌株及啤酒酵母菌（S. cerevisiae ）CJ-5菌株被製備，使得其中該GSH1蛋白質之第86個位置的半胱胺酸以不同胺基酸取代的蛋白質變異體被表現，且麩胱甘肽生產的增加被辨識。

為了製備啤酒酵母菌之GSH1蛋白的第86個位置處的半胱胺酸被以精胺酸取代的菌株，參考Lee THet al. 的論文（J. Microbiol. Biotechnol . (2006), 16(6), 979–982）使用pWAL100及pWBR100質體。具體而言，聚合酶鏈反應（PCR）使用該CJ-5菌株之基因體DNA作為模板而如下所示般進行。包括N端BamHI毗鄰序列（flanking sequence）、GSH1 ORF初始密碼子，及C86R編碼突變序列（mutation-encoding sequence）的該GSH1蛋白質的N端的部分序列藉由使用SEQ ID NOS: 34及35之引子進行PCR而獲得，且包括C端Xhol毗鄰序列、GSH1 ORF終止密碼子，及一C86R編碼突變序列的該GSH1蛋白質的C端的部分序列藉由使用SEQ ID NOS: 36及37之引子進行PCR而獲得。隨後，作為使用以SEQ ID NOS: 34及37之引子作為模板的兩個序列而進行重疊PCR的結果，包括其中第86個位置的半胱胺酸以精胺酸取代之編碼GSH1變異體的序列以及N端BamHI及C端Xhol限制酶序列之一GSH1 ORF區段被獲得。該ORF區段被以BamHI及Xhol處理且接著複製至以相同酵素處理之pWAL100載體中以製備一pWAL100-GSH1(C86R)載體。

再者，包括N端Spel及C端Ncol限制酶序列的GSH1 ORF終止密碼子下游500bp藉由使用CJ-5菌株之基因體DNA作為模板及SEQ ID NOS: 38及39之引子進行PCR並以Spel及Ncol限制酵素處理而獲得。隨後，該產物被複製於以相同酵素處理的pWBR100中以製備pWBR100-GSH1載體。

於製備被導入至該酵母的最終DNA區段之前，包括編碼精胺酸突變及KIURA3之一部分的序列的PCR產物使用如上述方式製備之pWAL100-GSH1(C86R)載體作為模板及SEQ ID NOS: 34及40之引子而獲得，且包括KIURA3的一部份及該GSH1終止密碼子下游500 bp的PCR產物使用該pWBR100-GSH1載體做為模板及SEQ ID NOS: 41及39之引子而獲得。啤酒酵母菌CEN.PK2-1D及啤酒酵母菌CJ-5以PCR產物在相同莫耳比轉化。PCR經由95°C，5分鐘的變性作用，53°C，1分鐘的退火，以及72°C，每公斤1分鐘的聚合作用而進行，且該酵母的轉化根據從揭露於Geitz之論文（Nucleic Acid Research , 20(6), 1425）的方法修飾而來的醋酸鋰方法而進行。具體而言，具有0.7至1.2之OD的酵母細胞以醋酸鋰/TE緩衝液清洗兩次並與該等PCR產物及單股DNA（Sigma D-7656）混合。混合物在靜態培養條件下，於醋酸鋰/TE/40% PEG緩衝液，在30°C下培養30分鐘及在42°C下培養15分鐘。接著，該等細胞於不包括尿嘧啶的SC（2%葡萄糖）洋菜盤中培養，直到菌落為可見地以獲得該GSH1 C86R編碼突變序列及該KIURA3基因被導入其中的菌株。隨後，為了移除KIURA3，該等菌株於2毫升之YPD隔夜培養，以1/100的比例稀釋，設置於包括0.1% 5-FOA之SC（2%葡萄糖）洋菜盤上以製備啤酒酵母菌CEN.PK2-1D GSH1 C86R突變菌株及啤酒酵母菌CJ-5 GSH1 C86R突變菌株，其中一尿嘧啶標記被移除。得以表現其中半胱胺酸以精胺酸之外的18種胺基酸取代的GSH1變異體的菌株亦以相同方式被製備，除了SEQ ID NOS: 35及36之引子對中編碼第86個精胺酸的序列以編碼一不同胺基酸的序列所取代。

表1

引子	5′ → 3′ 序列
F_BamHI_GSH1 (SEQ ID NO: 34)	GGTAGGATCCATGGGACTCTTAGCTTTGGGCAC
R_GSH1_C86R (SEQ ID NO: 35)	TTAGCCTCCCT AAGGGACGAATCCT
F_GSH1_C86R (SEQ ID NO: 36)	CGTCCCTTAGG GAGGCTAACGATGT
R_XhoI_GSH1 (SEQ ID NO: 37)	ATGACTCGAGTTAACATTTGCTTTCTATTGAAGGC
F_SpeI_GSH1_DW (SEQ ID NO: 38)	TAGAACTAGTACTCCTTTTATTTCGGTTGTGAA
R_NcoI_GSH1_DW (SEQ ID NO: 39)	GCTGCCATGGGAATAGTGTGAACCGATAACTGTGT
R_AL killer (SEQ ID NO: 40)	GAGCAATGAACCCAATAACGAAATCTT
F_BR killer (SEQ ID NO: 41)	CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAG

在培養以上述方式製備之菌株26小時後，所生產之麩胱甘肽（GSH）的濃度被量測且列於表2及3中。

表2

表3

基於實驗結果，已確認的是相較於該野生種GSH1蛋白質所獲得之麩胱甘肽生產能力，藉由以不同胺基酸取代該GSH1蛋白質之第86個位置的半胱胺酸所獲得的麩胱甘肽生產能力增加高達27%。

實例 2-3 ：誘發額外突變以增強麩胱甘肽生產能力及辨識修飾序列

以下列方式誘發突變以進一步增強該CC02-2490菌株的麩胱甘肽生產能力。

該CC02-2490菌株於固態培養基中培養並接種至一培養液以獲得一培養溶液，且該培養溶液使用UV燈泡被暴露於UV光。在暴露於UV光的該培養溶液被放置於盤狀培養基上後，只有已形成菌落的突變菌株被分離，且該GSH1編碼區之序列及其上游區域於具有最增強之麩胱甘肽生產能力的菌株中被分析。

結果，經確認的是，在自該GSH1 ORF序列的上游−250 (C→T)、−252 (G→A) 、−398 (A→T) 、−399 (A→C) 、−407 (T→C)，及−409 (T→C)位置處發生變異。該菌株被命名為CC02-2544菌株且依照布達佩斯條約於2020年2月20日寄存於韓國微生物保藏中心（KCCM）且被指定為KCCM12674P之寄存編號。

實例 2-4 ：根據 GSH1 啟動子中之突變辨識麩胱甘肽生產能力

為了比較在該啟動子中突變存在與否下之麩胱甘肽生產能力，於實例2-1中製備之該CC02-2490菌株及於實例2-3中製備之該CC02-2544菌株的麩胱甘肽生產能力被量測。該野生種CEN.PK1-D菌株及該CJ-5菌株之麩胱甘肽生產能力被量測作為控制組且顯示於下表4中。

表4

菌株	#	10 hr	26 hr	32 hr
OD₆₀₀	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)
CEN.PK1-D	1	37.2	51.4	84.4	0.8	50.6	96.1	0.9
2	36.2	51.6	82.2	0.8	52.0	92.6	0.9
ave	36.7	51.5	83.3	0.8	51.3	94.4	0.9
CJ-5	1	30.2	47.8	266.4	2.7	56.8	267.1	2.3
2	30.0	53.4	256.1	2.3	55.6	266.0	2.3
ave	30.1	50.6	261.2	2.5	56.2	266.5	2.3
CC02-2490	1	36.4	63.4	375.4	2.9	63.2	368.6	2.8
2	37.4	64.8	379.8	2.8	61.6	379.2	3.0
ave	36.9	64.1	377.6	2.9	62.4	373.9	2.9
CC02-2544	1	37.8	66.2	477.7	3.5	64.4	482.0	3.6
2	38.8	64.4	484.2	3.7	60.6	477.0	3.8
ave	38.3	65.3	481.0	3.6	66.6	479.5	3.7

作為該實驗的結果，已確認的是相較於該野生種CEN.PK1-D菌株，由CC02-2544菌株獲得之麩胱甘肽生產顯著地增加了508%。

另外，相較於該母株CC02-2490，由CC02-2544獲得之麩胱甘肽生產增加了128%或更多。

結果，經確認的是該GSH1基因之啟動子序列的突變可導致麩胱甘肽生產的增加。

實例 3 ：將突變導入菌株之 GSH1 啟動子的實驗

為了辨認菌株上啟動子中突變的效果，實例2-3中確認的啟動子突變被導入該野生種菌株、該CJ-5菌株，及實例2-1中所製備之該CC02-2490菌株中，且其等之麩胱甘肽生產能力被評估。

首先，進行用以突變導入之序列對準及辨識該CJ-5菌株之該GSH1 ORF上游序列（SEQ ID NO: 2）之結果，被確認的是該CJ-5菌株具有與啤酒酵母菌CEN KSD-Yc、YJM1450、YJM1401及YJM1307相同的GSH1啟動子序列。然而，當與該野生種菌株（啤酒酵母菌CEN.PK1-D）之該GSH1 ORF上游序列（SEQ ID NO: 1）相比，被確認的是腺嘌呤被插入至該CJ-5菌株的啟動子之第−74個位置。

基於此，在啤酒酵母菌CEN.PK1-D之該GSH1 ORF上游序列中，對應於該CJ-5菌株之該GSH1 ORF上游序列的第−250、−252、−398、−399、−407及−409個位置的位置藉由序列對準被決定為第−249、−251、−397、−398、−406及−408個位置。

隨後，上述六種突變被導入至各啤酒酵母菌株CEN.PK1-D、CJ-5及CC02-2490的該GSH1 ORF上游區域。

具體而言，為了製備其中上述六種類型的突變被導入至該GSH1 ORF上游區域的菌株，參考Lee TH,et al . （J. Microbiol. Biotechnol . (2006), 16(6), 979–982）之公開文獻使用pWAL100及pWBR100質體。

在合成包括六種類型之突變的該GSH1 ORF上游區域及該GSH1 ORF區域的基因片段後，使用SEQ ID NOS: 34及37之引子進行PCR以藉此獲得包括該N端BamHI限制酵素序列、C端Xhol限制酵素序列，及六種類型之突變的該GSH1 ORF上游區域的片段。隨後，pWAL100及該片段被以BamHI及Xhol處理，接著進行連接（ligation）以製備質體。

再者，包括N端Spel及C端Ncol限制酵素序列之GSH1 ORF終止密碼子的下游500 bp藉由使用該CJ-5菌株之該基因組DNA作為模板及SEQ ID NOS: 38及39之引子進行PCR，並以Spel及Ncol限制酵素處理而獲得。隨後，所得產物（resultant）被連接至以相同酵素處理之pWBR100以製備一質體。

在製備將被導入該酵母中的最終DNA片段之前，包括具有該包括六種突變之GSH1 ORF上游區域、該GSH1 ORF區域，及KIURA3之一部分的序列之PCR產物使用如上所述所製備的pWAL質體做為模板及SEQ ID NOS: 34及40之引子被獲得，且包括KIURA3之一部分及GSH1 ORF終止密碼子下游500 bp的PCR產物使用該pWBR質體做為模板及SEQ ID NOS: 41及39之引子而獲得。啤酒酵母菌CEN.PK2-1D及啤酒酵母菌CJ-5及CC02-02490菌株使用PCR產物以相同莫耳比被轉化。PCR經由95°C，5分鐘的變性作用，53°C，1分鐘的退火，以及72°C，每公斤1分鐘的聚合作用而進行，且該酵母的轉化根據從揭露於Geitz之論文（Nucleic Acid Research , 20(6), 1425）的方法修飾而來的醋酸鋰方法而進行。具體而言，具有0.7至1.2之OD的酵母細胞以醋酸鋰/TE緩衝液清洗兩次。該DNA及單股DNA（Sigma D-7656）混合，且該混合物在靜態培養條件下，於醋酸鋰/TE/40% PEG緩衝液，在30°C下培養30分鐘及在42°C下培養15分鐘。接著，該等細胞於不包括尿嘧啶的SC（2%葡萄糖）洋菜盤中培養，直到菌落為可見地以獲得其中該六種突變及該KIURA3基因被導入該GSH1 ORF上游區域的菌株。隨後，為了移除KIURA3，該等菌株於2毫升之YPD隔夜培養，以1/100的比例稀釋，設置於包括0.1% 5-FOA之SC（2%葡萄糖）洋菜盤上以製備在該GSH1 ORF上游區域中具有六種突變的衍生自啤酒酵母菌CEN.PK2-1D之突變菌株，及在該GSH1 ORF上游區域具有六種突變的衍生自啤酒酵母菌CJ-5及CC02-2490的突變菌株。

該等菌株之GSH生產顯示於下表5中。

表5

宿主	突變	#	10 hr	26 hr	32 hr
OD₆₀₀	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)
CEN.PK1-D	控制組	1	37.2	51.4	84.4	0.8	50.6	96.1	0.9
2	36.2	51.6	82.2	0.8	52.0	92.6	0.9
ave	36.7	51.5	83.3	0.8	51.3	94.4	0.9
GSH1 啟動子， 6 處突變	1	36.6	49.2	110.3	1.1	51.8	131.0	1.2
2	36.4	52.0	114.6	1.1	52.8	135.6	1.2
ave	36.5	50.6	112.4	1.1	52.3	133.3	1.2
CJ-5	控制組	1	30.2	47.8	266.4	2.7	56.8	267.1	2.3
2	30.0	53.4	256.1	2.3	55.6	266.0	2.3
ave	30.1	50.6	261.2	2.5	56.2	266.5	2.3
GSH1 啟動子，6 處突變	1	30.2	53.0	332.8	3.0	54.2	325.5	2.9
2	29.2	54.2	360.9	3.2	58.8	354.6	2.9
ave	29.7	53.6	346.9	3.1	56.5	340.1	2.9
CC02-2490	控制組	1	36.4	63.4	375.4	2.9	63.2	368.6	2.8
2	37.4	64.8	379.8	2.8	61.6	379.2	3.0
ave	36.9	64.1	377.6	2.9	62.4	373.9	2.9
GSH1 啟動子，6 處突變	1	36.5	65.8	468.9	3.4	63.1	472.6	3.6
2	37.6	66.2	475.0	3.4	63.6	471.8	3.5
ave	37.1	66.0	472.0	3.4	63.35	472.2	3.6

基於實驗的結果，已確認的是根據該啟動子的突變，麩胱甘肽生產於相同菌株中增加高達141%。

結果，已確認的是該GSH1基因之啟動子序列的突變可導致麩胱甘肽生產的增加。

實例 4 ：用於導入突變於 GSH1 啟動子之實驗（ 1 ）

基於上述實例中所證實的結果，進行實驗以辨識該麩胱甘肽生產能力是否藉由僅將突變導入一些位置而增強。

具體而言，突變被分別導入由GSH1 ORF之上游−250^th 及−252^nd 位置兩處（−250 (C→T)及−252 (G→A)），以及CEN.PK1-D、CJ-5，及CC02-2490菌株中−398^th 、−399^th 、−407^th ，及−409^th 位置(−398 (A→T) 、−399 (A→C) 、−407 (T→C) ，及−409 (T→C))四處。（在CEN.PK1-D的情形中，突變被導入於對應其之−249^th 、−251^s 、−397^th 、−398^th 、−406^th ，及−408^th 位置，其將被應用於下列敘述中）。菌株以與實例3之相同方式製備，除了含有包括在兩處或四處之突變的GSH1 ORF上游區域及該GSH1 ORF區域的基因片段被合成，且接著PCR使用SEQ ID NOS: 34及37之引子進行，藉此獲得包括該N端BamHI限制酵素序列、該C端Xhol限制酵素序列，及在兩處或四處的突變的該GSH1 ORF上游區域的片段。

實驗結果顯示於表6至8。

表6

宿主	突變	#	10 hr	26 hr	32 hr
OD₆₀₀	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)
CEN.PK1-D	控制組	1	37.2	51.4	84.4	0.8	50.6	96.1	0.9
2	36.2	51.6	82.2	0.8	52.0	92.6	0.9
ave	36.7	51.5	83.3	0.8	51.3	94.4	0.9
GSH1 啟動子，兩處突變	1	37.2	50.6	109.8	1.1	53.6	132.0	1.2
2	38.8	48.0	106.9	1.1	54.8	122.0	1.1
ave	38.0	49.3	108.3	1.1	54.2	127.0	1.1
GSH1 啟動子，四處突變	1	37.2	51.4	100.6	0.9	54.2	105.3	0.9
2	37.0	50.8	102.1	1.0	53.2	105.4	1.0
ave	37.1	51.1	101.3	1.0	53.7	105.3	1.0
GSH1 啟動子，六處突變	1	36.6	49.2	110.3	1.1	51.8	131.0	1.2
2	36.4	52.0	114.6	1.1	52.8	135.6	1.2
ave	36.5	50.6	112.4	1.1	52.3	133.3	1.2

表7

宿主	突變	#	10 hr	26 hr	32 hr
OD₆₀₀	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)
CJ-5	控制組	1	30.2	47.8	266.4	2.7	56.8	267.1	2.3
2	30.0	53.4	256.1	2.3	55.6	266.0	2.3
ave	30.1	50.6	261.2	2.5	56.2	266.5	2.3
GSH1 啟動子，兩處突變	1	30.2	53.8	297.6	2.7	54.4	298.8	2.7
2	30.4	57.6	299.0	2.5	53.0	292.4	2.7
ave	30.3	55.7	298.3	2.6	53.7	295.6	2.7
GSH1 啟動子，四處突變	1	31.2	52.4	328.8	3.0	57.2	326.6	2.8
2	40.6	57.8	345.8	2.9	66.0	344.9	2.5
ave	35.9	55.1	337.3	3.0	61.6	335.7	2.7
GSH1 啟動子，六處突變	1	30.2	53.0	332.8	3.0	54.2	325.5	2.9
2	29.2	54.2	360.9	3.2	58.8	354.6	2.9
ave	29.7	53.6	346.9	3.1	56.5	340.1	2.9

表8

宿主	突變	#	10 hr	26 hr	32 hr
OD₆₀₀	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)
CC02-2490	控制組	1	36.4	63.4	375.4	2.9	63.2	368.6	2.8
2	37.4	64.8	379.8	2.8	61.6	379.2	3.0
ave	36.9	64.1	377.6	2.9	62.4	373.9	2.9
GSH1 啟動子，兩處突變	1	37.0	64.8	415.0	3.1	66.6	419.5	3.1
2	37.6	65.4	452.4	3.4	64.6	445.7	3.3
ave	37.3	65.1	433.7	3.2	65.6	432.6	3.2
GSH1 啟動子，四處突變	1	37.8	65.4	455.4	3.4	59.6	452.1	3.7
2	37.6	65.8	459.8	3.4	63.4	455.1	3.5
ave	37.7	65.6	457.6	3.4	66.6	453.6	3.6
GSH1 啟動子，六處突變	1	36.5	65.8	468.9	3.4	63.1	472.6	3.6
2	37.6	66.2	475.0	3.4	63.6	471.8	3.5
ave	37.1	66.0	472.0	3.4	63.35	472.2	3.6

基於實驗結果，已確認的是相較於在該啟動子區域無突變的菌株，麩胱甘肽生產能力藉由在兩處(−250 (C→T)及−252 (G→A))或在四處(−398 (A→T)、−399 (A→C)、−407 (T→C)及−409 (T→C))導入突變而增強，且該麩胱甘肽生產增加高達135%。

基於此，可確認的是藉由僅將突變導入至本發明所開發之啟動子的一些位置，以及最初確認之所有六個位置，該麩胱甘肽生產能力被顯著增強。

實例 5 ：將突變導入 GSH1 啟動子的實驗 (2)

基於上述實例中所確認的結果，進行實驗以辨識麩胱甘肽生產能力是否藉由僅將突變導入一些位置而增強。具體而言，突變被導入至CEN.PK1-D及CJ-5菌株之−250^th 位置(C→T)（在一處的突變(1)）或在−252^nd 位置(G→A)（在一處的突變(2)）一處以及以上兩處，其等的麩胱甘肽生產能力被量測並顯示於表9及10中。

為此，菌株以與實例3之相同方式製備，除了含有包括在兩處或四處之突變的GSH1 ORF上游區域及該GSH1 ORF區域的基因片段被合成，且接著PCR使用SEQ ID NOS: 34及37之引子進行，藉此獲得包括該N端BamHI限制酵素序列、該C端Xhol限制酵素序列，及在一處或兩處的突變的該GSH1 ORF上游區域的片段。

表9

宿主	突變	#	10 hr	26 hr	32 hr
OD₆₀₀	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)
CJ-5	控制組	1	30.2	47.8	266.4	2.7	56.8	267.1	2.3
2	30.0	53.4	256.1	2.3	55.6	266.0	2.3
ave	30.1	50.6	261.2	2.5	56.2	266.5	2.3
GSH1 啟動子，一處突變 (1)	1	30.8	53.2	253.9	2.3	53.2	268.9	2.5
2	30.8	53.0	257.0	2.4	53.6	269.6	2.4
ave	30.8	53.1	255.4	2.3	53.4	269.3	2.4
GSH1 啟動子，一處突變 (2)	1	28.8	52.2	253.9	2.4	53.2	268.9	2.5
2	29.8	51.0	257.0	2.4	53.6	269.6	2.4
ave	29.3	51.6	255.4	2.4	53.4	269.3	2.4
GSH1 啟動子，兩處突變	1	30.2	53.8	297.6	2.7	54.4	298.8	2.7
2	30.4	57.6	299.0	2.5	53.0	292.4	2.7
ave	30.3	55.7	298.3	2.6	53.7	295.6	2.7

表10

宿主	突變	#	10 hr	26 hr	32 hr
OD₆₀₀	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)	OD₆₀₀	GSH (mg/L)	GSH 含量 (%)
CEN.PK1-D	控制組	1	37.2	51.4	84.4	0.8	50.6	96.1	0.9
2	36.2	51.6	82.2	0.8	52.0	92.6	0.9
ave	36.7	51.5	83.3	0.8	51.3	94.4	0.9
GSH1 啟動子，一處突變 (1)	1	37.5	53.8	85.0	0.8	52.2	99.2	0.9
2	36.8	53.7	94.5	0.9	54.1	95.5	0.9
ave	37.2	53.8	89.7	0.8	53.2	97.3	0.9
GSH1 啟動子，一處突變 (2)	1	37.8	58.8	95.0	0.8	53.2	91.0	0.8
2	37.2	57.2	90.5	0.8	50.8	105.5	1.0
ave	37.5	58.0	92.7	0.8	52.0	98.2	0.9
GSH1 啟動子，兩處突變	1	37.2	50.6	109.8	1.1	53.6	132.0	1.2
2	38.8	48.0	106.9	1.1	54.8	122.0	1.1
ave	38.0	49.3	108.3	1.1	54.2	127.0	1.1

基於實驗結果，已確認的是藉由將突變僅導入一些位置，麩胱甘肽生產能力被增強。

基於此，可確認的是藉由僅將突變導入至本發明所開發之啟動子的一些位置以及最初確認之所有六個位置，該麩胱甘肽生產被顯著增強。

實例 6 ：用以將突變導入 GSH1 啟動子的實驗 (3)

基於上述實例中確認的結果，進行實驗以辨識麩胱甘肽生產能力是否藉由僅將突變導入一些位置而增強。

具體而言，突變被獨立地或相互組合地導入至−398^th , −399^th , −407^th , and −409^th 位置（−398 (A→T)、−399 (A→C)、−407 (T→C)，及−409 (T→C)）四處。

突變是如下所述。

1)一處突變(1)：GSH1 −398 (A→T)

2)一處突變(2)：GSH1 −399 (A→C)

3)一處突變(3)：GSH1 −407 (T→C)

4)一處突變(4)：GSH1 −409 (T→C)

5)兩處突變(1)：GSH1 −398 (A→T)及−399 (A→C)

6)兩處突變(2)：GSH1 −398 (A→T)及−407 (T→C)

7)兩處突變(3)：GSH1 −398 (A→T)及−409 (T→C)

8)兩處突變(4)：GSH1 −399 (A→C)及−407 (T→C)

9)兩處突變(5)：GSH1 −399 (A→C)及−409 (T→C)

10)兩處突變(6)：GSH1 −407 (T→C)及−409 (T→C)

11)四處突變：GSH1 −398 (A→T)、−399 (A→C)、−407 (T→C)，及−409 (T→C)

為此，菌株以與實例3之相同方式製備，除了含有包括在一處、兩處或四處之突變的GSH1 ORF上游區域及該GSH1 ORF區域的基因片段被合成，且接著PCR使用SEQ ID NOS: 34及37之引子進行，藉此獲得包括該N端BamHI限制酵素序列、該C端Xhol限制酵素序列，及在一處、兩處或四處的突變的該GSH1 ORF上游區域的片段。

該等菌株的麩胱甘肽生產能力被辨識，且結果顯示於下表11及12中。

表11

表12

依據實驗結果，已確認的是相較於未於啟動子區域中導入突變的菌株以及突變被導入至所有四處的情形，藉由將突變僅導入至四處中的一些位置，麩胱甘肽生產能力被增強。特別是在5)兩處突變(1)：GSH1 −398 (A→T)及−399 (A→C)及 10)兩處突變(6)：GSH1 −407 (T→C)及−409 (T→C)的情形中，當與該啟動子區域中無突變的菌株相比，麩胱甘肽生產能力被顯著地增強。

基於此，可確認的是藉由將突變僅導入至本發明中開發的啟動子的一些位置以及原先確認之六個位置，麩胱甘肽生產能力被顯著地增強。

本發明之以上說明是被提供用於解説的目的，且對所屬技術領域中具有通常知識者而言可以理解的是，各種改變及修飾可在不改變本發明之技術概念及必要特徵下被進行。因此，能被清楚了解的是上述實施例在所有態樣中為說明性地且不限制本發明。此處所揭露的各種實施例並非意欲為限制性地，而本發明的真正範圍及精神是以下列申請專利範圍所表示。本發明僅由所附之申請專利範圍的內容，以及這些申請專利範圍所具備之完整等效範圍所限制。

寄存機構：韓國微生物保藏中心(KCCM) 寄存編號：KCCM12568P 寄存日期：2019年7月31日寄存機構：韓國微生物保藏中心(KCCM) 寄存編號：KCCM12659P 寄存日期：2020年1月17日寄存機構：韓國微生物保藏中心(KCCM) 寄存編號：KCCM12674P 寄存日期：2020年2月20日

<110> CJ第一製糖股份有限公司(CJ CheilJedang Corporation)

<120> 新穎啟動子及使用其生產麩胱甘肽的方法

<130> OPA21012

<140> 110112128

<141> 2021-04-01

<150> KR 10-2020-0041184

<151> 2020-04-03

<160> 41

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 499

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D

<400> 1

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5

<400> 2

<210> 3

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-92 94 102 103 249 251

<400> 3

<210> 4

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-92 94 102 103

<400> 4

<210> 5

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-249 251

<400> 5

<210> 6

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-102 103

<400> 6

<210> 7

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-92 102

<400> 7

<210> 8

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-92 103

<400> 8

<210> 9

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-94 102

<400> 9

<210> 10

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-94 103

<400> 10

<210> 11

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-92 94

<400> 11

<210> 12

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-249

<400> 12

<210> 13

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-251

<400> 13

<210> 14

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-92

<400> 14

<210> 15

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-94

<400> 15

<210> 16

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-102

<400> 16

<210> 17

<211> 499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CEN.PK-1D啟動子-突變-103

<400> 17

<210> 18

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-92 94 102 103 249 251

<400> 18

<210> 19

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-92 94 102 103

<400> 19

<210> 20

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-249 251

<400> 20

<210> 21

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-102 103

<400> 21

<210> 22

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-92 102

<400> 22

<210> 23

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-92 103

<400> 23

<210> 24

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-94 102

<400> 24

<210> 25

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-94 103

<400> 25

<210> 26

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-92 94

<400> 26

<210> 27

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-249

<400> 27

<210> 28

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-251

<400> 28

<210> 29

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-92

<400> 29

<210> 30

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-94

<400> 30

<210> 31

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-102

<400> 31

<210> 32

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啤酒酵母菌CJ-5啟動子-突變-103

<400> 32

<210> 33

<211> 678

<212> PRT

<213> 啤酒酵母菌

<400> 33

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F_BamHI_GSH1

<400> 34

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R_GSH1_C86R

<400> 35

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F_GSH1_C86R

<400> 36

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R_XhoI_GSH1

<400> 37

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F_SpeI_GSH1_DW

<400> 38

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R_NcoI_GSH1_DW

<400> 39

<210> 40

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R_AL killer

<400> 40

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F_BR killer

<400> 41

（無）

Claims

一種具有啟動子活性的多核苷酸，其中選自於由以下所組成之群組的至少一核苷酸是以一不同核苷酸所取代：SEQ ID NO：1或2之多核苷酸序列的第92、第94、第102、第103、第249及第251核苷酸；其中，該第92核苷酸的取代是被取代成胞嘧啶(C)；該第94核苷酸的取代是被取代成胞嘧啶(C)；該第102核苷酸的取代是被取代成胞嘧啶(C)；該第103核苷酸的取代是被取代成胸腺嘧碇(T)；該第249核苷酸的取代是被取代成腺嘌呤(A)；且該第251核苷酸的取代是被取代成胸腺嘧碇(T)。
如請求項1所述的多核苷酸，其中該具有啟動子活性的多核苷酸的第249及第251核苷酸是以不同核苷酸所取代。
如請求項1所述的多核苷酸，其中該具有啟動子活性的多核苷酸的第92、第94、第102及第103核苷酸是以不同核苷酸所取代。
如請求項1所述的多核苷酸，其中該具有啟動子活性的多核苷酸的第92、第94、第102、第103、第249及第251核苷酸是以不同核苷酸所取代。
如請求項1所述的多核苷酸，其中該具有啟動子活性的該多核苷酸包含選自於SEQ ID NOS：3至32的一個多核苷酸序列。
一種用於表現一基因的組成物，其包含請求項1至5之任一項所述的該多核苷酸。
一種載體，其包含請求項1至5之任一項所述的該多核苷酸及編碼一目標蛋白的一基因。
如請求項7所述之載體，其中該目標蛋白具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性。
一種屬於酵母屬(genus Saccharomyces sp.)的微生物，其包含如請求項1至5之任一項所述的該多核苷酸、包含該多核苷酸及編碼一目標蛋白的一基因的一多核苷酸，或包含其的一載體。
如請求項9所述的微生物，其中該目標蛋白為具有麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的一多肽。
一種用於生產麩胱甘肽的方法，包含於一培養基中培養請求項9所述的該微生物。
如請求項11所述的方法，進一步包含自選自於經培養的該微生物、該微生物的一乾燥產物、該微生物的一萃取物、該微生物的一培養產物，及該微生物的一溶解產物的至少一者回收麩胱甘肽。
一種多核苷酸序列作為啟動子的用途，其中選自於由以下所組成之群組的至少一核苷酸是以一不同核苷酸所取代：SEQ ID NO：1或2之該多核苷酸序列的第92、第94、第102、第103、第249及第251核苷酸；其中，該第92核苷酸的取代是被取代成胞嘧啶(C)；該第94核苷酸的取代是被取代成胞嘧啶(C)；該第102核苷酸的取代是被取代成胞嘧啶(C)；該第103核苷酸的取代是被取代成胸腺嘧碇(T)；該第249核苷酸的取代是被取代成腺嘌呤(A)；且該第251核苷酸的取代是被取代成胸腺嘧碇(T)。