KR20230171239A

KR20230171239A - 부티레이트를 생산하는 박테로이데스 테타이오타오미크론 균주 및 이를 이용한 부티레이트 생산 방법

Info

Publication number: KR20230171239A
Application number: KR1020220071565A
Authority: KR
Inventors: 조병관; 김강산; 강민정
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2022-06-13
Filing date: 2022-06-13
Publication date: 2023-12-20

Abstract

본 발명은 부티레이트(butyrate)를 생산하는 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 균주 및 이를 이용한 부티레이트 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 균주는 글루코스 제한 조건에서 부티레이트를 생산하지 않는 외래 부티레이트 생합성 경로가 도입된 B. thetaiotaomicron 균주 대비 현저한 부티레이트 생산능을 나타내는바, 부티레이트 생산뿐만 아니라 미생물 치료제로 적용할 수 있다.

Description

부티레이트를 생산하는 박테로이데스 테타이오타오미크론 균주 및 이를 이용한 부티레이트 생산 방법{Bacteroid thetaiotaomicron strain producing butyrate and method for producing butyrate using the same}

본 발명은 부티레이트(butyrate)를 생산하는 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 균주 및 이를 이용한 부티레이트 생산 방법에 관한 것이다.

미생물 치료제(Therapeutic microbes)는 인간 질병의 증상을 예방하거나 완화하기 위해 용도가 변경된 유전자 조작 박테리아를 의미한다. 1917년 대장균(Escherichia coli) Nissle의 장 염증 완화 효능을 확인한 이후, 새로운 합성 생물학 도구와 게놈 정보의 가용성이 증가하면서 치료용 페이로드(payload) 전달, 염증의 약화, 대사에서의 고유한 결함 보완 등을 포함하여 유전자 조작을 통해 인간 건강에 유익한 기능을 갖춘 미생물을 제작하고자 하는 연구가 다수 있어왔다.

표적화된 치료 기능을 발현하도록 미생물을 조작하기 위해서는 자체적으로 생존하고 증식하며 기능성 치료제를 생산할 수 있는 능력을 보유한 강력한 미생물을 선택할 필요가 있으며, 인간의 내장에 효과적으로 서식하도록 진화한 인간의 내장 공생체는 이러한 기준에 적합한 유망한 후보이다. 주요한 인간 장 공생생물로 알려진 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)은 다양한 인간 집단에 널리 퍼져 있고 장 내 서식을 위한 탁월한 능력을 갖는 것으로 알려져 있다(Human Microbiome Project, Nature 486, 207-214., 2012).

한편, 부티레이트(butyrate)는 면역 기능의 조절에서 결장 상피세포의 에너지원으로 쓰이는 등 인간 장에서 다기능 역할을 하는 단쇄 지방산(short chain fatty acid, SCFA)이다. 부티레이트는 피르미쿠테스(Firmicutes) 종에서 확인되는 5-6단계 생합성 반응을 통해 아세틸-CoA에서 합성될 수 있다(Baek et al., Biotechnol. Bioeng. 110, 2790-2794., 2013). 그러나, B. thetaiotaomicron에서는 부티레이트가 생산되지 않는 것으로 알려져 있다(Adamberg et al., Front. Nutr. 1, 21., 2014).

이에, 외래 부티레이트 생합성 경로를 야생형 B. thetaiotaomicron에 직접 통합하여 부티레이트를 생산하고자 하는 시도가 있었으나, 외래 부티레이트 생합성 경로가 도입된 야생형 B. thetaiotaomicron는 글루코스 제한 조건에서 부티레이트를 생성하지 않는 문제점이 있었다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 글루코스 제한 조건에서도 부티레이트를 생산하는, 외래 부티레이트 생합성 경로가 도입된 B. thetaiotaomicron 균주를 개발하고 이를 부티레이트 생산뿐만 아니라 미생물 치료제로 적용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 부티레이트(butyrate)를 생산하는 박테로이데스 속(Bacteroides sp.) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 a) 상기 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 b) 상기 배양된 배지 및 균주로부터 부티레이트를 회수하는 단계;를 포함하는, 부티레이트 생산 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 부티레이트(butyrate)를 생산하는 박테로이데스 속(Bacteroides sp.) 균주를 제공한다.

구체적으로, 상기 균주는 i) 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제(acetyl-CoA acetyltransferase), 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-coA dehydratase), 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase), 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타(electron transfer flavoprotein subunit beta), 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파(electron transfer flavoprotein subunit alpha), 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase), 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제(phosphate butyryltransferase), 부티레이트 키나제(butyrate kinase) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,

ii) 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase), 락테이트 탈수소효소(lactate dehydrogenase) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 약화 또는 결실된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 박테로이데스 속(Bacteroides sp.) 균주는 일예로, 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron), 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus) 등일 수 있고, 구체적으로 B. thetaiotaomicron일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)"는 주요한 인간 장 공생생물로 알려진 균주로서, 항염증 특성, 점막 장벽 강화 및 숙주 면역 기능 자극과 같은 위장 질환 완화 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, i) 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제, 부티레이트 키나제 중 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드는 미생물 유래의 폴리펩티드일 수 있고, 일예로, 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 균주 유래 폴리펩티드일 수 있으며, 구체적으로 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 유래 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명의 균주는 상기 폴리펩티드 중 선택되는 어느 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개의 폴리펩티드를 포함하거나, 이들을 코딩하는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8개의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 균주는 상기 8개의 폴리펩티드를 모두 포함하거나, 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제 및 부티레이트 키나제는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 유래의 아세틸-CoA(acetyl-CoA)를 전구체로 하는 외래 부티레이트 생합성 경로의 폴리펩티드일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제는 thl와, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소는 crt와, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 bcd와, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타는 etfB와, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파는 etfA와, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 hbd와, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제는 ptb와, 부티레이트 키나제는 buk와 혼용될 수 있다.

상기 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제 및 부티레이트 키나제 폴리펩티드의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank, UniProtKB 등에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제는 P45359(UniProtKB), 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소는 P52046(UniProtKB), 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 P52042(UniProtKB), 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타는 P52040(UniProtKB), 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파는 P52039(UniProtKB), 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 P52041(UniProtKB), 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제는 P58255(UniProtKB) 및 부티레이트 키나제는 Q45829(UniProtKB)에서 그 서열을 얻을 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제 또는 부티레이트 키나제는 각각 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 1의 아미노산 서열, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소는 서열번호 3의 아미노산 서열, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 서열번호 5의 아미노산 서열, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타는 서열번호 7의 아미노산 서열, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파는 서열번호 9의 아미노산 서열, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소는 서열번호 11의 아미노산 서열, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제는 서열번호 13의 아미노산 서열, 부티레이트 키나제는 서열번호 15의 아미노산 서열을 각각 가지거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, ii) 포스포트랜스아세틸라제 및 락테이트 탈수소효소는 미생물 유래의 폴리펩티드일 수 있고, 일예로, 본 발명의 박테로이데스 속 균주의 내재 폴리펩티드일 수 있으며, 구체적으로 B. thetaiotaomicron의 내재 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명의 균주는 상기 폴리펩티드 중 선택되는 어느 하나 또는 2개의 폴리펩티드를 포함하거나, 이들을 코딩하는 어느 하나 또는 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 균주는 포스포트랜스아세틸라제 및 락테이트 탈수소효소의 활성이 모두 약화되거나, 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 모두 결실된 것일 수 있다.

본 발명의 포스포트랜스아세틸라제는 아세테이트 생합성 경로의 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 본 발명의 락테이트 탈수소효소는 락테이드 생합성 경로의 폴리펩티드일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 포스포트랜스아세틸라제는 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(phosphate acetyltransferase) 또는 pta(BT3692)와, 락테이트 탈수소효소는 ldhD(BT1575)와 혼용될 수 있다.

상기 포스포트랜스아세틸라제 및 락테이트 탈수소효소의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank, UniProtKB 등에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로, 포스포트랜스아세틸라제는 Q8A1G8(UniProtKB) 및 락테이트 탈수소효소는 Q8A7E9(UniProtKB)에서 그 서열을 얻을 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 포스포트랜스아세틸라제 또는 락테이트 탈수소효소는 각각 서열번호 17 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 포스포트랜스아세틸라제는 서열번호 17의 아미노산 서열, 락테이트 탈수소효소는 서열번호 19의 아미노산 서열을 각각 가지거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다.

본 출원에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17 또는 서열번호 19의 아미노산 서열은 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17 또는 서열번호 19로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ET AL/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 발명의 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제 및 부티레이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13 또는 서열번호 15로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 예로, 상기 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제 및 부티레이트 키나제를 코딩하는 각 유전자, 즉, thl, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, ptb 및 buk 유전자는 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14 또는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 thl를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열, crt를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열, bcd를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열, etfB를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열, etfA를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열, hbd를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열, ptb를 코딩하는 유전자는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열, buk를 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 각각 포함하거나, 가지거나, 이루어지거나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 포스포트랜스아세틸라제 및 락테이트 탈수소효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17 또는 서열번호 19로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 예로, 상기 포스포트랜스아세틸라제 및 락테이트 탈수소효소를 코딩하는 각 유전자, 즉, pta 및 ldhD 유전자는 각각 서열번호 18 또는 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 pta를 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열, ldhD를 코딩하는 유전자는 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 각각 포함하거나, 가지거나, 이루어지거나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 발명의 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 발명의 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 99% 이상인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 99% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 21 내지 24의 염기서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 염기서열로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).

본 발명의 균주가 포함하는 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제, 부티레이트 키나제 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드는 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제 및/또는 부티레이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 즉, thl, crt, bcd, etfB, etfA, hbd, ptb 및/또는 buk 유전자를 포함하는 벡터를 통해 도입된 것일 수 있다.

본 발명의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 RSF계, P15A계, pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pMM710, pFD340, pNBU2, pLGB13, pDZ, pDC, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제, 부티레이트 키나제 중 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명에서 용어, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.

본 발명의 균주는 i) 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제, 부티레이트 키나제 및 이들의 조합 중 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하고, ii) 포스포트랜스아세틸라제, 락테이트 탈수소효소 및 이들의 조합 중 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 약화 또는 결실된 균주로서, i) 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제, 부티레이트 키나제 및 이들의 조합 중 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하거나, 상기 폴리펩티드 활성을 가지고, ii) 포스포트랜스아세틸라제, 락테이트 탈수소효소 및 이들의 조합 중 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 약화 또는 결실되도록 변형된 균주 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 균주는 부티레이트 생산능을 갖는 균주일 수 있다.

일예로, 본 발명의 균주는 천연의 야생형 미생물, 자연적으로 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제 또는 부티레이트 키나제를 가지고 있거나, 포스포트랜스아세틸라제 또는 락테이트 탈수소효소를 가지고 있지 않거나, 부티레이트 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제 또는 부티레이트 키나제를 가지고 있지 않거나, 포스포트랜스아세틸라제 또는 락테이트 탈수소효소를 가지고 있거나, 부티레이트 생산능이 없는 모균주에 본 발명의 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되고 포스포트랜스아세틸라제, 락테이트 탈수소효소 및 이들의 조합 중 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 약화 또는 결실되어, 부티레이트 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 부티레이트 생산능이 부여된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물(즉, i) 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제, 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타, 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파, 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소, 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제, 부티레이트 키나제 및 이들의 조합 중 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하지 않고, 및/또는 ii) 포스포트랜스아세틸라제, 락테이트 탈수소효소 및 이들의 조합 중 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 약화 또는 결실되지 않은 미생물)에 비하여 부티레이트 생산능이 향상된 균주일 수 있다.

본 발명에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 변이 균주를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 단백질이 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.

본 발명의 균주에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위(engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 균주는 부티레이트를 글루코스 제한 조건(일예로, 글루코스를 최종 농도 0.5%로 첨가한 최소 배지(glucose minimum medium, MM-glc)에서 배양하는 조건)에서 부티레이트 역가 28 mg/L 이상으로 부티레이트를 생산하는 균주일 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 글루코스가 제한되지 않는 조건(일예로, BHIS(brain heart infusion-supplemented broth) 배지에서 배양하는 조건)에서 부티레이트 역가 41 mg/L 이상으로 부티레이트를 생산하는 균주일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 부티레이트 생합성 경로가 도입되고 pta 및 ldhD 유전자가 결실된 본 발명의 B. thetaiotaomicrion 균주(△pta△ldhD_but 균주)는 MM-glc 배지에서 약 28 ± 1 mg/L의 최대 부티레이트 역가를 나타내었으며(도 4c, 표 3), 영양이 풍부한 장을 모방한 BHIS 배지에서 부티레이트의 최대 역가와 생산성은 각각 3.4배 및 4.9배 증가하여(도 4d, 표 3), 41 ± 1 mg/L의 최대 부티레이트 역가를 나타내었다.

반면, 부티레이트 생합성 경로만 도입된 야생형 B. thetaiotaomicrion 균주는 MM-glc 조건에서 부티레이트를 생성하지 못하여, 야생형 B. thetaiotaomicrion에 부티레이트 생합성 경로를 도입하더라도, 글루코스 제한 조건에서는 부티레이트를 생산하지 않음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 종래 야생형 B. thetaiotaomicrion에 부티레이트 생합성 경로만을 도입하는 경우 글루코스 제한 조건에서 부티레이트가 생산되지 않는 문제점을 개선하기 위해, 야생형 B. thetaiotaomicrion에 부티레이트 생합성 경로를 도입하고 추가로 pta 및 ldhD 유전자를 결실시켜 글루코스 제한 조건에서 부티레이트 생산능을 현저히 증가시킬 수 있음을 최초로 확인한 것에 의의가 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 i) 본 발명의 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 ii) 상기 배양된 배지 및 균주로부터 부티레이트를 회수하는 단계;를 포함하는, 부티레이트 생산 방법을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서, 용어 "배양"은 본 발명의 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "배지"는 본 발명의 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 발명의 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 균주의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 배양에서 배양온도는 20 내지 40℃, 구체적으로는 25 내지 37℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 배양에 의하여 생산된 부티레이트는 배지 중으로 분비되거나, 세포 내에 잔류할 수 있다.

본 발명의 부티레이트 생산 방법은, 본 발명의 균주를 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법은, 상기 배양된 배지 또는 균주로부터 부티레이트를 회수할 수 있다.

상기 회수는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 IMP를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 부티레이트를 회수할 수 있다.

또한, 본 발명의 부티레이트 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 발명의 부티레이트 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 균주 및 이의 배양액을 포함하는, 부티레이트 생산용 조성물을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

상기 조성물은 본 발명의 균주 및 이의 배양액을 포함할 수 있으며, 추가로 상기 균주의 부티레이트 생산을 증대시킬 수 있을 구성을 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 균주는 글루코스 제한 조건에서 부티레이트를 생산하지 않는 외래 부티레이트 생합성 경로가 도입된 B. thetaiotaomicron 균주 대비 현저한 부티레이트 생산능을 나타내는바, 부티레이트 생산뿐만 아니라 미생물 치료제로 적용할 수 있다.

도 1은 (a) 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)에 도입된 부티레이트 생합성 경로를 나타낸 도이다. 약어 Ac-AcoA: 아세틸-CoA(Acetyl-CoA), AAc-CoA: 아세토아세틸-CoA(acetoacetyl-CoA), 3-HB_CoA: 3-하이드록시부타노일-CoA(3-hydroxybutanoyl-CoA), Crt-CoA: 크로토닐-CoA(crotonyl-CoA), But-CoA: 부티릴-CoA(butyryl-CoA), butyryl-P: 부티릴 포스페이트(butyryl phosphate), But: 부티레이트(butyrate). (b) 야생형 B. thetaiotaomicron에 부티레이트 생합성 경로를 도입하여 발현하기 위한 유전자와 프로모터를 포함하는 벡터의 모식도 및 이를 포함하는 B. thetaiotaomicrion(WT_but)의 게놈 모식도이다. 합성 프로모터(p_BfP1E6)가 부티레이트 생합성 경로 발현에 사용되었다. (c-d) BHIS(brain heart infusion-supplemented broth) 배지 (c) 및 0.5%(w/v) 포도당이 보충된 최소 배지(MM-glc 배지) (d)에서의 부티레이트 생산 프로파일을 나타낸 도이다.
도 2는 후속 PCR 스크리닝을 통해 B. thetaiotaomicron 게놈에서 pta의 프레임 내 결실을 확인한 결과이다.
도 3은 MM-glc 배양 조건에서 야생형 B. thetaiotaomicrion, △ldhD, △pta 및 △pta△ldhD 균주의 성장 프로파일 및 특정 성장률을 나타낸 도이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내었다. ^****: P ≤ 0.0001, ^***: P ≤ 0.001, ns: 유의하지 않음.
도 4는 (a) MMglc 배양 조건에서 야생형 B. thetaiotaomicrion, △ldhD, △pta 및 △pta△ldhD 균주의 대사산물 프로파일을 나타낸 도이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내었다. (b) △pta△ldhD 균주에 부티레이트 생합성 경로를 도입하여 발현하기 위한 유전자와 프로모터를 포함하는 벡터의 모식도 및 이를 포함하는 B. thetaiotaomicrion(△pta△ldhD_but)의 게놈 모식도이다. (c-d) (c) MM-glc 배지 및 (d) BHIS 배지에서 WT_but 및 △pta△ldhD_but의 성장 및 부티레이트 생산 프로파일을 나타낸 도이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내었다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 외래 부티레이트 생합성 경로 도입 균주 및 이의 부티레이트 생산능 분석

인간 장 공생생물인 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)에 부티레이트 생산능을 부여하기 위해, 아세틸-CoA(acetyl-CoA)를 전구체로 하는 외래 부티레이트 생합성 경로를 도입하여 이종 발현시키고자 하였다.

먼저, 야생형 B. thetaiotaomicron에 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824 유래의 thl(아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제(acetyl-CoA acetyltransferase)), crt(3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-coA dehydratase)), bcd(3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase)), etfB(전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타 (electron transfer flavoprotein subunit beta)), etfA(전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파(electron transfer flavoprotein subunit alpha)), hbd(3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase)), ptb(포스페이트 부티릴트랜스퍼라제(phosphate butyryltransferase)) 및 buk(부티레이트 키나제(butyrate kinase))로 구성된 아세틸-CoA를 전구체로 사용하는 6단계 부티레이트 생합성 경로(도 1a)를 도입하기 위해, 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 각 유전자 단편은 코돈 최적화(서열번호 21 내지 24) 후 pMM710 및 pFD340 백본에 클로닝되었으며, 야생형 프로모터 pBT1311(Mimee et al., Cell Syst. 1, 62-71., 2015)과 합성 프로모터 P_BfP1E6(Whitaker et al., Cell 169, 538-546., 2017)의 제어 하에 위치하였다. 각 유전자와 프로모터를 포함하는 벡터의 모식도 및 이를 포함하는 B. thetaiotaomicrion 게놈 모식도는 도 1b에 도시된 바와 같다.

여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

서열번호	서열명	서열
25	Seg 1 Fwd Primer	GCAtctagatgatctggaagaagcaatgaaag
26	Seg 1 Rev Primer	ataGCGGCCGCttaGGGCCCagtcCTCGAGtgaGTCGACACCTACCGATTCTTAAAACCTTCT
27	Seg 2 Fwd Primer	GAATCGGTAGGTCGACGAAATAAAGAC
28	Seg 2 Rev Primer	ataGCGGCCGCTTCTCGAGTTAAATATAATGC
29	Seg 3 Fwd Primer	TTAACTCGAGAAAAGGATCTATTA
30	Seg 3 Rev Primer	ttacgatcagtcGGGCCcTTATTTGGAATAATC
31	Seg 4 Fwd Primer	TATTCCAAATAAgGGCCCgactgatcgtaatc
32	Seg 4 Rev Primer	tGCGGCCGCggaccaaaacgaaaaaggcc
33	CAB1_BB_Infu_F	tctttatttcGtgaGTCGACACCTACCGATTCT
34	CAB1_BB_Infu_R	TTATATTTAAaCTCGAGgactGGGCCCtaa
35	CAB2_Infu_frag_F	gtcgactcacGAAATAAAGACATATAAAAGAAAA
36	CAB2_Infu_frag_R	gtcCTCGAGtTTAAATATAATGCTCCTCCTTCAG
37	NBU2_Backbone_F	GCAtctagatacttgtgcctgttctatttccg
38	NBU2_Backbone_R	ataGCGGCCGCggtggaggggaattcccat

제작된 벡터를 야생형 B. thetaiotaomicrion VPI-5482(ATCC 29148)에 형질전환한 후 배양하여 부티레이트 생산능을 분석하였다. 형질전환된 균주를 섬유소 제거된 양 혈액 5%(MBcell)가 보충된 BHIS(brain heart infusion-supplemented broth) 배지(리터당 37g의 BHI 분말(BD Bacto, Detroit, MI), 5g의 효모 추출물(BD Bacto), dH₂O에 용해된 0.5g/L L-시스테인 염산염 일수화물(L-cysteine hydrochloride monohydrate) (TCI, Tokyo, Japan), 0.2mM L-히스티딘, 1N NaOH(pH 8)에 용해된 1.9μM 헤민(hemin) 용액 및 무수 에탄올에 용해된 1㎍/mL 메나디온(menadione) 포함, L-시스테인 염산염 일수화물, L-히스티딘-헤민 용액 및 메나디온을 Minisart® 0.2μm 주사기 필터(Sartorius, G¨ottingen, Germany)를 사용하여 여과 멸균하고 접종 직전에 고압멸균 배지에 첨가하여 제조) 또는 글루코스를 최종 농도 0.5%로 첨가한 최소 배지(glucose minimum medium, MM-glc) (리터당 100mM의 KH₂PO₄, 15mM의 NaCl, 8.5mM의 (NH₄)2SO₄, 0.5g/L L-시스테인 염산염 일수화물, 0.2mM L-히스티딘, 1.9μM 헤민, 50μM CaCl₂, 100μM MgCl₂, 1.4μL FeSO₄·7H₂O, 1μg/mL 메나디온 및 5ng/mL 비타민 B12 포함, 글루코스를 최종 농도 0.5%로 첨가) (Martens et al., Cell Host Microbe 4, 447-457., 2008)에서 배양하였으며, 구체적으로 배양은 80kPa의 게이지 압력에서 N₂/CO₂(90:10) 가스로 퍼징된(purged) 배양 배지 100mL를 포함하는 150mL 혈청 병에서 수행되었다.

균주 성장 프로파일링은 48웰 플레이트에서 24시간 동안 진탕(206rpm 이중 궤도)하면서 37℃에서 플레이트 판독기(BioTek, Winooski, VT)를 사용하여 수행하였으며, OD600nm에서의 흡광도는 10분 간격으로 측정되었다.

균주에서 생산된 부티레이트를 정량하기 위해, 배양된 균주를 1-2시간 간격으로 샘플링하고 최대 1mL의 샘플을 Minisart® 0.2μm 주사기 필터(Sartorius)를 통해 여과하여 무세포 상청액을 얻었다. 배양 상청액의 각 대사 산물은 RI 검출기(Waters, Milford, MA)와 MetaCarb 87H Organic Acids Column(Agilent, Waldbronn, Germany)이 장착된 고압 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 컬럼은 6.57mM H₂SO₄로 0.6mL/min의 유속으로 37℃에서 용출되었다.

그 결과, 부티레이트 생합성 경로가 도입된 야생형 균주는 BHIS 배지에서는 최종 농도 12 mg/L로 부티레이트를 생성하나, 글루코스 제한 조건(MM-glc 배지)에서는 부티레이트를 생산하지 않았다(도 1c-d).

이에 따라, 야생형 B. thetaiotaomicrion에 부티레이트 생합성 경로를 도입하더라도, 글루코스 제한 조건에서는 부티레이트를 생산하지 않음을 확인하였다.

실시예 2. 내재 유전자 결실 및 외래 부티레이트 생합성 경로 도입 균주 제작

균주에서 목적하는 산물 생산을 최대화하기 위해 일부 비필수적인 내재 경로를 비활성화하는 것은 가장 일반적인 접근 방식 중 하나이다. 이에, B. thetaiotaomicron의 이종 부티레이트 생산을 부티레이트 합성에 필요한 세포 전구체 또는 산화환원 보조인자를 공유하는 유기산(아세테이트, 락테이트 및 숙시네이트 등) 발효 경로 등의 녹아웃을 통해 향상시키고자 하였다.

먼저, 세포 성장 방해를 최소화하면서 목적 산물 생산을 최대화하기 위한 결실 표적으로서 아세틸-CoA의 아세테이트로의 첫 번째 전환을 촉매하는 pta(포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase), BT3692)와 D-락테이트(D-lactate)의 생산을 촉매하는 ldhD(락테이트 탈수소효소(lactate dehydrogenase), BT1575)의 두 가지 유전자를 선정하고, 에리트로마이신 선택 마커 ermG가 포함된 pNBU2를 이용한 NBU2 인테그라제(integrase)에 의해 매개되는 부위 특이적 이중 교차를 활용하여 상기 유전자를 녹아웃시켜(Garcia-Bayona and Comstock, 2019), △ldhD, △pta 및 △pta△ldhD 균주를 각각 제조하였다.

구체적으로, pta 및 ldhD의 1.1 및 1.2kbp 위쪽 및 아래쪽에 인접하는 B. thetaiotaomicrion 게놈 영역을 PCR 증폭하고 pLGB13에 개별적으로 클로닝하였다. 유전자 녹아웃을 위해 pLGB13 백본 내로 표적 유전자의 양 말단에 인접하는 상동성 암(arm)을 도입하였다. 또한 pLGB30의 박테로이데스 오바투스(Bacteroides ovatus) 유래 테트라사이클린 내성 tetQ 유전자(Garcia-Bayona and Comstock, mBio 10., 2019)를 pta의 상동성 암 사이에 배치하여 테트라사이클린 내성 선별에 사용하였다.

여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.

서열번호	서열명	서열
39	Lac_1_HA_F	tcccgggcagcagcagcatccggaaat
40	Lac_1_HA_R	agtcaggtaaaggttacgtaaaaacagggtggtttgttt
41	Lac_2_HA_F	accctgtttttacgtaacctttacctgacttcccttgt
42	Lac_2_HA_R	GTCGACAACTTTCGCGGCAGTACCTT
43	Lac_con_F	CCAGCCAGGTATTCGTGTGT
44	Lac_con_R	AGGAAGCGATCGTGTAACCG
45	Ace_1_HA_F	ACCCGGGTGTCCATGGCAGTGGAAGTG
46	Ace_1_HA_R	gccattcggcaaagtatttgtaatttgcgctgcaaaagta
47	Ace_2_HA_F	gcgcaaattacaaatactttgccgaatggcgaaaa
48	Ace_2_HA_R	AGTCGACcgacttcatgataagccgcc
49	pAceKO_F	agcaaaaatgtgccgaatggcgaaaagaaag
50	pAceKO_R	ggagcggtcatttggctgtttggctttggg
51	pLGB30_tetQ_F2	aacagccaaatgaccgctccattattttg
52	pLGB30_tetQ_R2	ccattcggcacatttttgctcaacaattgct
53	Ace_con_F	tcggcggtcacttttcatgg
54	Ace_con_R	CCGATCTGCCACTTCCTTACA

제작된 벡터를 야생형 B. thetaiotaomicrion VPI-5482(ATCC 29148)에 형질전환한 후 TYG(Tryptone Yeast Extract Agar) 한천 플레이트에서 선별된 B. thetaiotaomicron 콜로니를 25 μg/mL 에리트로마이신이 포함된 액체 BHIS 배지로 옮기고 37℃에서 혐기성 배양하였다. 에리트로마이신 양성 배양물을 비선택적 BHIS 액체 배지에서 100cfu/mL로 연속 희석하고 37℃에서 12시간 동안 정적으로 배양하였다. 균주를 TYG 한천과 100ng/mL aTC 유도제에서 배양하여 이중 교차 분해제(double-crossover resolvents)를 스크리닝하였다. 후속 PCR 스크리닝을 통해 B. thetaiotaomicron 게놈에서 pta의 프레임 내 결실을 확인하였다(도 2).

각 유전자 녹아웃이 균주 성장에 미치는 영향을 평가하기 위해 상기 실시예 1과 동일한 균주 성장 프로파일링 방법으로 MM-glc 배지에서 야생형 및 각 녹아웃 변이 균주의 성장 여부를 확인하였다.

그 결과, 균주 △ldhD의 성장률의 변화는 야생형 대비 미미한 것으로 나타난 반면, △pta 및 △pta△ldhD는 균주 성장이 상당히 감소하였다(도 3).

다음으로, MM-glc 조건에서 성장한 녹아웃 변이 균주의 배양 배지에서 대사물 프로파일을 분석하여 발효 경로가 기능적으로 불활성화되었는지를 검증하기 위해 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 균주에서 생산된 아세테이트(acetate), 숙시네이트(succinate), D-락테이트(D-lactate)를 정량하되, 컬럼 온도 50℃에서 용출하여 정량하였다.

그 결과, ldhD의 결실에 의한 최종 D-락테이트 역가는 야생형과 비교하여 2배 감소하였다(야생형에서 0.04 ± 0.00 g/L 및 △ldhD에서 0.02 ± 0.00 g/L) (도 4a).

pta의 결실에 의한 최종 아세테이트 역가는 야생형과 비교하여 거의 3배까지 감소하였으며(야생형에서 1.30 ± 0.05 g/L 및 △pta에서 0.45 ± 0.02 g/L), 이중 녹아웃 균주에서 약간 더 감소하였다(△pta△ldhD에서 0.39 ± 0.01 g/L).

또한, 숙시네이트의 최종 농도는 균주 △pta 및 △pta△ldhD에서 상당히 증가하였으나, △ldhD에서는 야생형과 유사한 수준으로 유지되었다.

이에 따라, 상기 균주들은 pta 및 ldhD 발효 경로가 기능적으로 불활성화되어 △ldhD, △pta 및 △pta△ldhD 균주가 제작되었음을 확인하였다.

실시예 3. 내재 유전자 결실 및 외래 부티레이트 생합성 경로 도입 균주의 부티레이트 생산능 분석

상기 실시예 1에서 제작한 부티레이트 생합성 경로를 포함하는 벡터를 상기 실시예 2에서 제작한 이중 녹아웃 변이 균주 △pta△ldhD에 도입하여 △pta△ldhD_but 균주를 제작하였다. 각 유전자와 프로모터를 포함하는 벡터의 모식도 및 이를 포함하는 B. thetaiotaomicrion 게놈 모식도는 도 4b에 도시된 바와 같다.

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 균주 성장 프로파일링 및 균주에서 생산된 부티레이트 정량을 분석하였다.

그 결과, 부티레이트 생합성 경로가 도입된 야생형 균주는 MM-glc 조건에서 부티레이트를 생성하지 못한 반면, △pta△ldhD_but 균주는 약 28 ± 1 mg/L의 최대 부티레이트 역가를 나타내었다(도 4c, 표 3).

영양이 풍부한 장을 모방한 BHIS 배지에서 부티레이트의 최대 역가와 생산성은 각각 3.4배 및 4.9배 증가하여(도 4d, 표 3), 41 ± 1 mg/L의 최대 부티레이트 역가를 나타내었다.

Media	Strain	Titer (mg/L)	Productivity (mg/L/h)	Calculated Flux (mmol/gDW/hr)
MM_Glc	WT	0	0	0
MM_Glc	Double KO(△pta△ldhD_but)	28 ± 1	2.8 ± 1.0	0.03 ± 0.01
BHIS	WT	12 ± 0	1.4 ± 0	0.02 ± 0.00
BHIS	Double KO(△pta△ldhD_but)	41 ± 1	6.8 ± 0.2	0.11 ± 0.02

상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에 따른 외래 부티레이트 생합성 경로가 도입된, 이중 녹아웃 변이 균주(△pta△ldhD) B. thetaiotaomicron 균주는 글루코스 제한 조건에서 부티레이트를 생산하지 않는 외래 부티레이트 생합성 경로가 도입된 B. thetaiotaomicron 균주 대비 현저한 부티레이트 생산능을 나타내었으며, 영양이 풍부한 배지에서는 최대 부티레이트 역가 41 ± 1 mg/L로 부티레이트를 생산하는바, 부티레이트 생산뿐만 아니라 미생물 치료제로 적용할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Bacteroid thetaiotaomicron strain producing butyrate and method for producing butyrate using the same <130> KPA211725-KR <160> 54 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 392 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> thl AA <400> 1 Met Lys Glu Val Val Ile Ala Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asp Val Pro Ala Val Asp Leu Gly Ala Thr 20 25 30 Ala Ile Lys Glu Ala Val Lys Lys Ala Gly Ile Lys Pro Glu Asp Val 35 40 45 Asn Glu Val Ile Leu Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn 50 55 60 Pro Ala Arg Gln Ala Ser Phe Lys Ala Gly Leu Pro Val Glu Ile Pro 65 70 75 80 Ala Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Arg Thr Val Ser 85 90 95 Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Val Ile Ile Ala 100 105 110 Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ala Pro Tyr Leu Ala Asn Asn Ala 115 120 125 Arg Trp Gly Tyr Arg Met Gly Asn Ala Lys Phe Val Asp Glu Met Ile 130 135 140 Thr Asp Gly Leu Trp Asp Ala Phe Asn Asp Tyr His Met Gly Ile Thr 145 150 155 160 Ala Glu Asn Ile Ala Glu Arg Trp Asn Ile Ser Arg Glu Glu Gln Asp 165 170 175 Glu Phe Ala Leu Ala Ser Gln Lys Lys Ala Glu Glu Ala Ile Lys Ser 180 185 190 Gly Gln Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Val Val Ile Lys Gly Arg Lys 195 200 205 Gly Glu Thr Val Val Asp Thr Asp Glu His Pro Arg Phe Gly Ser Thr 210 215 220 Ile Glu Gly Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala Phe Lys Lys Asp Gly Thr 225 230 235 240 Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Cys Ala Ala Val Leu 245 250 255 Val Ile Met Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Leu Gly Val Lys Pro Leu 260 265 270 Ala Lys Ile Val Ser Tyr Gly Ser Ala Gly Val Asp Pro Ala Ile Met 275 280 285 Gly Tyr Gly Pro Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Gly 290 295 300 Trp Thr Val Asp Glu Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asn Glu Ala Phe Ala 305 310 315 320 Ala Gln Ser Leu Ala Val Ala Lys Asp Leu Lys Phe Asp Met Asn Lys 325 330 335 Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala 340 345 350 Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Val His Ala Met Gln Lys Arg 355 360 365 Asp Ala Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly 370 375 380 Thr Ala Ile Leu Leu Glu Lys Cys 385 390 <210> 2 <211> 1179 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> thl NT <400> 2 atgaaagagg ttgtaatagc ttcagcggta cgtactgcca tcggtagcta tggtaaaagc 60 ctgaaggacg tccctgccgt tgacttggga gctaccgcga ttaaggaagc tgtaaagaag 120 gccggcatta agcctgaaga cgtgaatgaa gtaatcttag ggaacgtgtt gcaagcaggg 180 ctggggcaaa atcctgcgcg gcaggcatca ttcaaggcag gtctgccagt tgaaattcct 240 gccatgacta tcaacaaagt gtgcggtagc ggacttcgca ccgtatcact tgccgcccag 300 atcattaagg ctggagatgc agatgtcatt atcgcggggg gcatggaaaa catgtcaaga 360 gcgccttact tagcaaataa tgcacgttgg ggttatcgta tgggtaatgc taaattcgtt 420 gacgagatga taacagatgg tctttgggac gcattcaacg attaccatat gggaatcaca 480 gcggagaata tagcagaacg ttggaacatc agccgtgagg aacaagacga attcgcattg 540 gcctctcaaa aaaaagcaga agaagcgata aagagcggcc aattcaaaga tgaaatcgta 600 cctgtcgtca taaaaggacg taaaggtgaa acagtagtgg acacagatga acatcctaga 660 ttcggtagca ccattgaagg actggctaaa ttaaaaccgg ccttcaaaaa agacgggacg 720 gtaacagctg gtaacgcatc tgggctgaat gactgcgcag cggtattagt gattatgagc 780 gctgaaaagg ccaaggaact gggtgtgaag cccttggcaa aaatcgtatc atatgggtct 840 gcaggcgtag accccgcaat catgggttat ggtccgttct acgccacaaa agccgctatt 900 gagaaagcag ggtggacagt ggatgagctg gatcttattg agtctaatga agcctttgca 960 gctcagagtc tggccgtagc caaagatctg aaattcgata tgaataaggt aaacgtaaat 1020 ggcggggcga tcgccctggg tcatcccatt ggcgcatctg gtgctcgcat acttgtgacg 1080 ctggtgcatg ccatgcaaaa acgtgatgcg aaaaaaggtc tggccacctt atgcatcgga 1140 ggtggtcaag gcacggccat cttactggaa aagtgttag 1179 <210> 3 <211> 261 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> crt AA <400> 3 Met Glu Leu Asn Asn Val Ile Leu Glu Lys Glu Gly Lys Val Ala Val 1 5 10 15 Val Thr Ile Asn Arg Pro Lys Ala Leu Asn Ala Leu Asn Ser Asp Thr 20 25 30 Leu Lys Glu Met Asp Tyr Val Ile Gly Glu Ile Glu Asn Asp Ser Glu 35 40 45 Val Leu Ala Val Ile Leu Thr Gly Ala Gly Glu Lys Ser Phe Val Ala 50 55 60 Gly Ala Asp Ile Ser Glu Met Lys Glu Met Asn Thr Ile Glu Gly Arg 65 70 75 80 Lys Phe Gly Ile Leu Gly Asn Lys Val Phe Arg Arg Leu Glu Leu Leu 85 90 95 Glu Lys Pro Val Ile Ala Ala Val Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Cys Glu Ile Ala Met Ser Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ser Ser Asn Ala 115 120 125 Arg Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly 130 135 140 Gly Thr Gln Arg Leu Ser Arg Leu Val Gly Met Gly Met Ala Lys Gln 145 150 155 160 Leu Ile Phe Thr Ala Gln Asn Ile Lys Ala Asp Glu Ala Leu Arg Ile 165 170 175 Gly Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Met Asn Thr Ala 180 185 190 Lys Glu Ile Ala Asn Lys Ile Val Ser Asn Ala Pro Val Ala Val Lys 195 200 205 Leu Ser Lys Gln Ala Ile Asn Arg Gly Met Gln Cys Asp Ile Asp Thr 210 215 220 Ala Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ala Phe Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu 225 230 235 240 Asp Gln Lys Asp Ala Met Thr Ala Phe Ile Glu Lys Arg Lys Ile Glu 245 250 255 Gly Phe Lys Asn Arg 260 <210> 4 <211> 786 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> crt NT <400> 4 atggaattga ataatgttat 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gcagcaatcc ggggtcccag gtcacggcca atgaatgttg cccctataaa cagaatctcc 1800 ggtttacgtt cattcaccaa gtcacagatc actttcgcat acccgtcggt tgagaaatgc 1860 gccagaagtt cattgtctgc agccagtact ttgtctgcac catgagacaa caaatccttg 1920 gacatctttt ctgtattatg tcccaataat acagcagtca gctccacccc taatttttcc 1980 gccatttctt tgcccttacc cagcagttcc agactaactt tttgcaattc accatcacgt 2040 tgttctgcga atacccatac gcccttataa tctgccttat tcatggtgag tgcctcctta 2100 taatagatcc ttttc 2115 <210> 24 <211> 2124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seg 4(buk, pbt, RBS7 and RBS6) <400> 24 ggaccaaaac gaaaaaggcc cccctttcgg gaggcctctt ttctggaatt tggtaccgag 60 ttatttgttc ccagctacta atgcggccaa agcaatagaa ttcattttcg tttcgtgact 120 atcagcacgt gatgttaata cgacaggggc agaagtacct accaaaattc cgccgttctt 180 gctatcggtg gtatacgtca atgtcttata cattacatta cctgtctcta tattaggcat 240 caaaaagata tctgccttac cggccacttc tccggtcaca cctttgtgat gagcagcctc 300 ctcagacaaa gcgatatcta aggctaacgg gccatccacc acacaaccct taatttgacc 360 gcgatcactc attttactta 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tttggcaacc tggaatgtga atgcttcata 1260 aattaatgcg cattttttat caccttccaa tgccttatca actacggctt taaaatcgat 1320 agtattaagg tagctcacta ctccaccctt gccattgatc tttttcatta cttcttcata 1380 ggtatattta ttagaaaagc acagtctgac aaggtcacca ataggtacac caccgctacg 1440 ctcaggtgag aacggccctt ctccgtccag tgtattgtta acttctataa cacgtccgtc 1500 cttatgggtt cctacgctag tacctccccc catatgcaca acaataagat ttaagtcttc 1560 atatttcttt ccaacctctt ttgcataacg tctggcaacc gccttctgat taagagcatg 1620 aaaaatactc tttctaggta tgtcagccat gccactaatt ctggatactt cgtccagttc 1680 gtccactact accgggtcta caatataagc aggtacattt atctcttttg caatctcgtt 1740 agcgatgatg cctcccagat tagatgcgtg ttggccctgt acgccgacct tcaagtcttc 1800 cagcattttc tggtttacgg catatgtgcc tgatacaatg ggcttcaaca aacctcctct 1860 tcctactacg gcgttcaagc tcgacacctc tatattcgct tctttcaagg cgtccaaaat 1920 tacgttctta cgaaactgga actggtcgaa aatagtattg tacttttcaa tttcttcagc 1980 cgagtgccgc agagtttttt cgaagatttc tttttcgtcg tcgtatatcc cgatttttgt 2040 cgaggtactc ccagggttta taattaacag tctatacatc attattttta ttttttttaa 2100 agattacgat cagtcgggcc ctta 2124 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seg 1 Fwd Primer <400> 25 gcatctagat gatctggaag aagcaatgaa ag 32 <210> 26 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seg 1 Rev Primer <400> 26 atagcggccg cttagggccc agtcctcgag tgagtcgaca cctaccgatt cttaaaacct 60 tct 63 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seg 2 Fwd Primer <400> 27 gaatcggtag gtcgacgaaa taaagac 27 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seg 2 Rev Primer <400> 28 atagcggccg cttctcgagt taaatataat gc 32 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seg 3 Fwd Primer <400> 29 ttaactcgag aaaaggatct atta 24 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seg 3 Rev Primer <400> 30 ttacgatcag tcgggccctt atttggaata atc 33 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seg 4 Fwd Primer <400> 31 tattccaaat aagggcccga 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<400> 39 tcccgggcag cagcagcatc cggaaat 27 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac_1_HA_R <400> 40 agtcaggtaa aggttacgta aaaacagggt ggtttgttt 39 <210> 41 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac_2_HA_F <400> 41 accctgtttt tacgtaacct ttacctgact tcccttgt 38 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac_2_HA_R <400> 42 gtcgacaact ttcgcggcag tacctt 26 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac_con_F <400> 43 ccagccaggt attcgtgtgt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac_con_R <400> 44 aggaagcgat cgtgtaaccg 20 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ace_1_HA_F <400> 45 acccgggtgt ccatggcagt ggaagtg 27 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ace_1_HA_R <400> 46 gccattcggc aaagtatttg taatttgcgc tgcaaaagta 40 <210> 47 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ace_2_HA_F <400> 47 gcgcaaatta caaatacttt gccgaatggc gaaaa 35 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ace_2_HA_R <400> 48 agtcgaccga cttcatgata agccgcc 27 <210> 49 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAceKO_F <400> 49 agcaaaaatg tgccgaatgg cgaaaagaaa g 31 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAceKO_R <400> 50 ggagcggtca tttggctgtt tggctttggg 30 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLGB30_tetQ_F2 <400> 51 aacagccaaa tgaccgctcc attattttg 29 <210> 52 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLGB30_tetQ_R2 <400> 52 ccattcggca catttttgct caacaattgc t 31 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ace_con_F <400> 53 tcggcggtca cttttcatgg 20 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ace_con_R <400> 54 ccgatctgcc acttccttac a 21

Claims

i) 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제(acetyl-CoA acetyltransferase), 3-하이드록시부티릴-coA 탈수효소(3-hydroxybutyryl-coA dehydratase), 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase), 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 베타(electron transfer flavoprotein subunit beta), 전자전달 플라보단백질 서브유닛 알파(electron transfer flavoprotein subunit alpha), 3-하이드록시부티릴-CoA 탈수소효소(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase), 포스페이트 부티릴트랜스퍼라제(phosphate butyryltransferase), 부티레이트 키나제(butyrate kinase) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
ii) 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase), 락테이트 탈수소효소(lactate dehydrogenase) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 약화 또는 결실된, 부티레이트(butyrate)를 생산하는 박테로이데스 속(Bacteroides sp.) 균주.
제1항에 있어서, 상기 i)의 폴리펩티드는 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 균주 유래인 것인, 균주.
제2항에 있어서, 상기 클로스트리디움 속 균주는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)인 것인, 균주.
제1항에 있어서, 상기 ii)의 폴리펩티드는 박테로이데스 속 균주의 내재 폴리펩티드인 것인, 균주.
제1항에 있어서, 상기 박테로이데스 속 균주는 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)인 것인, 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 부티레이트를 28 mg/L 이상 생산하는 것인 것인, 균주.
a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 배양된 배지 및 균주로부터 부티레이트를 회수하는 단계;를 포함하는, 부티레이트 생산 방법.