JP2005073638A5 - - Google Patents
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上記のようにして変異が導入されたγ−グルタミルシステイン合成酵素（弱化型グルタチオン合成酵素）は、微弱な酵素活性を保持している。次に、国際公開WO2001/090310号パンフレットに記載のプラスミドpYES2dash（プラスミドpYES2（Invitrogen社）から2μoriを除去したプラスミド）、及び前記GSH1Mdash/pGEMを、いずれも制限酵素SacI及びSphIで切断し、pYES2dashからはURA3遺伝子を含む断片を、GSH1Mdash/pGEMからはγ−グルタミルシステイン合成酵素の部分遺伝子配列を含む領域を切り出し、これらを連結した。このようにしてプラスミドGSH1Mdash/pYES2dashを作製した。GSH1Mdash/pYES2dashを制限酵素BbeIで切断し、遺伝子置換カセットを得た(図１)。
（２）GSH1遺伝子置換カセットのサッカロマイセス・セレビシエへの導入
上記のようにして作製した遺伝子置換カセットを用いて、Nα1株のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った。Nα1株を前培養した後に、培養物を50mlのYPD培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、遺伝子置換カセットを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSDプレートで培養し、生育する株を選択した。遺伝子置換カセットが染色体上の目的の位置に組み込まれたことをPCRによって確認し、得られた株をNα4中間体とした。次に、変異型γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のみを染色体上に残す為、以下の操作を行った。Nα4中間体を1mMのグルタチオンを添加したYPD培地で培養し、培養産物を1mMのグルタチオンを含むSDFOAプレートに蒔いた。プレート上に生育してきた株のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の配列を決定し、目的の部位の配列が正しく置換されていることを確認し、Nα4株を得た（図２）。
（２）GSH1遺伝子置換カセットのサッカロマイセス・セレビシエへの導入
上記のようにして作製した遺伝子置換カセットを用いて、Nα1株のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った。Nα1株を前培養した後に、培養物を50mlのYPD培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、遺伝子置換カセットを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSDプレートで培養し、生育する株を選択した。遺伝子置換カセットが染色体上の目的の位置に組み込まれたことをPCRによって確認し、得られた株をNα4中間体とした。次に、変異型γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のみを染色体上に残す為、以下の操作を行った。Nα4中間体を1mMのグルタチオンを添加したYPD培地で培養し、培養産物を1mMのグルタチオンを含むSDFOAプレートに蒔いた。プレート上に生育してきた株のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の配列を決定し、目的の部位の配列が正しく置換されていることを確認し、Nα4株を得た（図２）。
CURA3ΔCGSH2/pGEMT-Easyベクターを制限酵素NotIで切断したものを鋳型とし、配列番号４９及び５０に示すプライマーを用いてPCRにより増幅した。こうして、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットを作製した（図５，６）。
［参考例２］ウラシル要求性キャンディダ・ユティリス ATCC15239ura-株の取得
常法（Luisらの手法、FEMS Microbiology Letters 165(1998)335-340）に従い、ATCC15239由来のウラシル要求性株ATCC15239ura-株を取得した。ATCC15239ura-株は、後述するようにURA3遺伝子によって相補されたことから、ura3変異株であると推定される。
［参考例３］キャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン産生酵母（ATCC15239Δgsh2株）の取得
まず、ATCC15239ura-株をYPD試験管培地で一晩30℃で培養した。培養産物をYPDフラスコ培地（坂口フラスコ500ml容、50ml張り込み）に植菌し、30℃で振とう培養した。対数増殖期に集菌し、４℃に冷やした1Mソルビトール溶液で、菌体を３回洗浄した。洗浄菌体を冷やした1Mソルビトール溶液に懸濁した。懸濁液に、50μl（2μg）の上記グルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットを加え、0.2cmキュベット中でよく混合し、エレクトロポレーション（Gene Pulser system（BioRad社）を使用、インピーダンス200Ω、キャパシタンス125μF、設定電圧1.5kVに設定）を行なった。キュベットに、1mlの冷やした1Mソルビトールを注ぎ、キュベットを10分間氷上で冷却した。菌体懸濁液をSDプレートにスプレッドし、30℃で静地培養した。
［参考例２］ウラシル要求性キャンディダ・ユティリス ATCC15239ura-株の取得
常法（Luisらの手法、FEMS Microbiology Letters 165(1998)335-340）に従い、ATCC15239由来のウラシル要求性株ATCC15239ura-株を取得した。ATCC15239ura-株は、後述するようにURA3遺伝子によって相補されたことから、ura3変異株であると推定される。
［参考例３］キャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン産生酵母（ATCC15239Δgsh2株）の取得
まず、ATCC15239ura-株をYPD試験管培地で一晩30℃で培養した。培養産物をYPDフラスコ培地（坂口フラスコ500ml容、50ml張り込み）に植菌し、30℃で振とう培養した。対数増殖期に集菌し、４℃に冷やした1Mソルビトール溶液で、菌体を３回洗浄した。洗浄菌体を冷やした1Mソルビトール溶液に懸濁した。懸濁液に、50μl（2μg）の上記グルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットを加え、0.2cmキュベット中でよく混合し、エレクトロポレーション（Gene Pulser system（BioRad社）を使用、インピーダンス200Ω、キャパシタンス125μF、設定電圧1.5kVに設定）を行なった。キュベットに、1mlの冷やした1Mソルビトールを注ぎ、キュベットを10分間氷上で冷却した。菌体懸濁液をSDプレートにスプレッドし、30℃で静地培養した。
Claims (9)
- 下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードするDNA。
(A) 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B) 配列番号２に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。 - 下記(a)又は(b)に示すDNAである請求項１に記載のDNA。
（a） 配列番号１の塩基番号58〜1485の塩基配列を含むDNA。
（b） 配列番号１の塩基番号58〜1485の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項１又は２記載のDNA又はその断片を用いてグルタチオン合成酵素活性が0.003μｍｏｌＧＳＨ／ｍｇタンパク質／時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリス。
- 請求項１又は２記載のDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が上昇するように改変されたキャンディダ・ユティリス。
- 下記(c)又は(d)に示すDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が0.003μｍｏｌＧＳＨ／ｍｇタンパク質／時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリス。
(c)配列番号１の塩基番号58〜981の塩基配列を含むDNA、又は
(d)配列番号１の塩基番号58〜981の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 - さらに、配列番号3記載のDNAを用いてγ−グルタミルシステイン合成酵素活性が上昇するように改変された請求項３〜５のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリス。
- 請求項３〜６のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物、若しくはグルタチオン及び/又はγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画物、又は熱処理或は酵素処理によりガンマ位のグルタミン酸が遊離したこれ
らの培養物もしくは分画物を含む飲食品。 - 請求項３〜６のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
- 請求項３〜６のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
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