CN116615548A

CN116615548A - L-组氨酸输出蛋白和使用其生产l-组氨酸的方法

Info

Publication number: CN116615548A
Application number: CN202180078472.7A
Authority: CN
Inventors: 许兰; 徐昌一; 丁起龙; 任绣彬
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2023-08-18
Also published as: KR20230149787A; WO2022139523A1; JP2023540292A; KR20220092182A; CA3197710A1; AU2021409842A1; EP4269597A1

Abstract

本发明提供了一种具有组氨酸输出活性的新型蛋白质、经修饰以表达该蛋白质的生产L‑组氨酸的微生物和使用该微生物生产L‑组氨酸的方法。

Description

L-组氨酸输出蛋白和使用其生产L-组氨酸的方法

技术领域

涉及一种具有组氨酸输出活性的新型蛋白质、一种经修饰以表达所述蛋白质的生产L-组氨酸的微生物，以及一种使用所述微生物生产L-组氨酸的方法。

背景技术

L-组氨酸是20种标准氨基酸中的一种，从营养学的角度来说，成人不需要大量的L-组氨酸，但L-组氨酸被分类为成长中儿童的必需氨基酸。此外，L-组氨酸参与重要生理过程，例如抗氧化和免疫调节等，并且L-组氨酸用于医药工业中，例如胃溃疡治疗剂或循环系统治疗剂的原料和氨基酸输液制剂等。

由于L-组氨酸在血红蛋白中特别丰富，因此其主要通过使用血粉为原料的蛋白水解提取法来生产。然而，该方法具有例如效率低和环境污染等缺点。另一方面，可以通过微生物发酵法生产L-组氨酸，但尚未实现大规模工业化。这是因为L-组氨酸的生物合成与核苷酸合成前体磷酸核糖焦磷酸(PRPP)竞争，具有复杂的生物合成过程并且需要高能量的调节机制。

已知当具有其他种类氨基酸输出能力的蛋白质的表达和/或功能时，相应氨基酸的产量增加的实例，但是先前几乎没有关于对L-组氨酸特异性输出能力的蛋白质进行研究。

在这种背景下，需要发现具有组氨酸特异性输出能力的蛋白质并开发使用该蛋白质的组氨酸生产技术。

发明内容

技术问题

在本说明书中，提出了由于发现具有L-组氨酸输出能力的组氨酸输出蛋白并将其在具有L-组氨酸生产能力的微生物中表达，可以显著提高L-组氨酸的生产。

一种实施方式提供了一种具有L-组氨酸输出活性的蛋白质。所述蛋白质可以是具有L-组氨酸特异性输出能力的蛋白质。

另一种实施方式提供了一种生产L-组氨酸的微生物，所述微生物表达L-组氨酸输出蛋白。

其他实施方式提供了一种用于生产L-组氨酸的方法，包括在培养基中培养所述微生物。

技术方案

在本说明书中，通过发现具有L-组氨酸输出能力的组氨酸输出蛋白，并将其导入具有L-组氨酸生产能力的微生物中，提供了L-组氨酸产量显著提高的重组微生物和使用其生产L-组氨酸的技术。

在下文中，将更详细地描述本发明。

一种实施方式提供了一种具有L-组氨酸输出活性的蛋白质。所述蛋白质可以是具有L-组氨酸特异性输出能力的蛋白质。在本说明书中，所述蛋白质可以由L-组氨酸输出蛋白表示。在一种实施方式中，L-组氨酸输出蛋白可以在棒状杆菌属(Corynebacterium)和/或埃希氏菌属(Escherichia)的微生物中具有L-组氨酸输出能力，然后，L-组氨酸输出蛋白可以是来源于不属于棒状杆菌属和/或埃希氏菌属的微生物的蛋白质，例如，所述微生物为选自由皮杆菌属(Dermabacter)(例如，阴道皮杆菌(Dermabacter vaginalis)等)、创伤杆菌属(Helcobacillus)(例如，马赛创伤杆菌(Helcobacillus massiliensis)等)和分枝杆菌属(Mycobacterium)(例如，脓肿分枝杆菌脓肿亚种(Mycobacterium abscessussubsp.abscessus)等)等所组成的组中的至少一种微生物。

在一种实施方式中，L-组氨酸输出蛋白可以是与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或其组合具有至少60％序列同源性的蛋白质。例如，在一种具体实施方式中，所述L-组氨酸输出蛋白可以与SEQ ID NO：12、13或其组合具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的同源性。

在一种具体实施方式中，所述L-组氨酸输出蛋白可以是至少一种，例如，选自由包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质或由以下序列组成的蛋白质所组成的组中的一种、两种或三种：

SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13，或其组合；

SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42，或其组合；以及

SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45，或其组合。

SEQ ID NO：12表示的蛋白质可以由SEQ ID NO：64的核酸序列来编码，并且SEQ IDNO：13表示的蛋白质可以由SEQ ID NO：65的核酸序列来编码，或SEQ ID NO：12和/或SEQ IDNO：13表示的蛋白质可以由SEQ ID NO：14的核酸序列(融合在SEQ ID NO：64的3’端和SEQID NO：65的5’端的重叠区域的操纵子序列)来编码。

SEQ ID NO：41表示的蛋白质可以由SEQ ID NO：66的核酸序列来编码，SEQ ID NO：42表示的蛋白质可以由SEQ ID NO：67的核酸序列来编码，或者SEQ ID NO：41和/或SEQ IDNO：42表示的蛋白质可以由SEQ ID NO：43的核酸序列(融合在SEQ ID NO：66的3’端和SEQID NO：67的5’端的重叠区域的操纵子序列)来编码。

SEQ ID NO：44表示的蛋白质可以由SEQ ID NO：68的核酸序列来编码，并且SEQ IDNO：45表示的蛋白质可以由SEQ ID NO：69的核酸序列来编码，或由SEQ ID NO：44和/或SEQID NO：45表示的蛋白质可以由SEQ ID NO：46的核酸序列(融合在SEQ ID NO：68的3’端和SEQ ID NO：69的5’端的重叠区域的操纵子序列)来编码。

另一种实施方式提供了一种生产L-组氨酸的微生物，所述微生物被修饰为表达L-组氨酸输出蛋白。所述L-组氨酸输出蛋白如前文所述。所述L-组氨酸输出蛋白可以是源自生产L-组氨酸的微生物(例如，来自微生物的异源微生物)的外源蛋白的蛋白质。

在本说明书中，术语“生产L-组氨酸的微生物”可以用于表示：

通过修饰具有L-组氨酸生产能力的微生物来表达L-组氨酸输出蛋白，例如，通过修饰该微生物1)来进一步表达L-组氨酸输出蛋白，或2)通过替换内源性L-组氨酸输出蛋白来表达它，从而与未经修饰的微生物相比，具有提高的L-组氨酸生产能力的情况，和/或

通过修饰不具有L-组氨酸生产能力的微生物以表达L-组氨酸输出蛋白而具有L-氨基酸生产能力的情况。

在本说明书中，“微生物”包括单细胞细菌，并且可以与“细胞”互换使用。

在本说明书中，未经修饰的微生物用于区别于经修饰以表达L-组氨酸输出蛋白的“生产L-组氨酸的微生物”，因此L-组氨酸生产能力增加或L-组氨酸生产能力是给定的，并且可以指在经修饰以表达L-组氨酸输出蛋白之前的微生物或未经修饰以表达L-组氨酸输出蛋白的微生物，并且可以由宿主微生物表示。

微生物可以是选自由天然具有L-组氨酸生产能力的微生物或不具有L-组氨酸生产能力或通过将突变引入显著更少的菌株而可以具有L-组氨酸生产能力的所有革兰氏阳性菌所组成的组中的至少一种，例如棒状杆菌属微生物和埃希氏菌属微生物。棒状杆菌属的微生物可以包括谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)等，但不限于此。例如，棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。

在一种实施方式中，与未经修饰以表达L-组氨酸输出蛋白(例如，外源L-组氨酸输出蛋白)的同种未经修饰的微生物相比，经修饰以表达L-组氨酸输出蛋白的L-组氨酸生产微生物可具有增加的L-组氨酸生产能力。在一种具体实施方式中，经修饰以表达L-组氨酸输出蛋白的L-组氨酸生产微生物的L-组氨酸产量(例如，培养基中的含量)可以增加至少5％(w/v)、至少10％(w/v)、至少12.5％(w/v)、至少15％(w/v)、至少17.5％(w/v)或至少20％(w/v)(L-组氨酸产量增加率的上限可以不限于此，但可以是100％(w/v)、90％(w/v)、80％(w/v)、75％(w/v)、70％(w/v)、65％(w/v)、60％(w/v)、55％(w/v)或50％(w/v))。经修饰以表达L-组氨酸输出蛋白的L-组氨酸生产微生物与未经修饰的微生物之间的L-组氨酸产量的比较，可以基于彼此使用等量底物(例如，糖类如葡萄糖等)的情况来进行，例如可以在底物(例如糖类如葡萄糖等)单位量(1g、10g或100g等)标准培养基中比较L-组氨酸的含量。

在本说明书中，术语“经修饰以表达L-组氨酸输出蛋白”可以指在微生物中表达外源L-组氨酸输出蛋白的任何操作，例如，它可以指在微生物中导入编码外源L-组氨酸输出蛋白的基因或用编码外源L-组氨酸输出蛋白的基因转化微生物。

在本说明书中，多核苷酸(可以与“基因”互换使用)或多肽(可以与“蛋白质”互换使用)“包含特定核酸序列或氨基酸序列，由特定核酸组成序列或氨基酸序列组成，或由特定的核酸序列或氨基酸序列表示”，是可以互换用作等同含义的表述，并且可以指该多核苷酸或多肽由特定的核酸序列或氨基酸序列组成或基本上包含特定的核酸序列或氨基酸序列，并且可以解释为包含“基本上等同的序列”，其中，在保持多核苷酸或多肽(或不排除引入突变)的原有功能和/或所需功能的范围内将突变(删除、替换、修饰和/或添加)添加到特定的核酸序列或氨基酸序列中。

在一种实施方式中，本说明书中提供的核酸序列或氨基酸序列可以包含在保持原有功能或其所需功能的范围内，通过常规诱变修饰，例如，直接进化和/或定点诱变等。在一种实施方式中，多核苷酸或多肽“包含特定核酸序列或氨基酸序列”，可以指多核苷酸或多肽(i)由特定核酸序列或氨基酸序列组成或基本上包含该特定核酸序列或氨基酸序列，或(ii)由与特定核酸序列或氨基酸序列具有60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高(例如，60％～99.5％、70％～99.5％、80％～99.5％、85％～99.5％、90％～99.5％、91％～99.5％、92％～99.5％、93％～99.5％、94％～99.5％、95％～99.5％、96％～99.5％、97％～99.5％、98％～99.5％或99％～99.5％)的同源性或基本上包含该序列，并保持原始功能和/或所需功能的核酸序列或氨基酸序列组成。在本说明书中，原始功能可以是L-组氨酸输出功能(氨基酸序列的情况)或编码具有L-组氨酸输出功能的蛋白质的功能(核酸序列的情况)，所需的功能可以是指增加或赋予微生物L-组氨酸生产能力的功能。

在本说明书中描述的核酸序列中，考虑到微生物中的优选密码子通过密码子的简并性来表达蛋白质(L-组氨酸输出蛋白)，在不改变氨基酸序列和/或从该编码区表达的蛋白质功能的范围内，可以对编码区进行各种修饰。

在本申请中，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定的氨基酸序列或碱基序列的相关程度并且可以表示为百分比。术语同源性和同一性通常可以互换使用。

保守多核苷酸或保守多肽的序列同源性或同一性由标准阵列算法确定，并且可以一起使用通过所用程序建立的默认空位罚分。基本上，同源的或同一的序列通常可以在中等或高度严格条件下沿整个序列或全长的至少约50％、60％、70％、80％或90％杂交。显然，杂交还包括含有共同密码子的多核苷酸或考虑到多核苷酸中的密码子简并性的密码子。

任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以使用例如已知的计算机算法，诸如使用Pearson等人的“FASTA”程序(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85]:2444确定。此外，同源性、相似性或同一性可使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，在EMBOSS包的Needleman程序中执行(EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16：276-277)(版本5.0.0或之后的版本)(包括GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic AcidsResearch 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLECBIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]AcademicPress，圣地亚哥，1994，以及[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，可使用美国国家生物技术信息中心(National Biotechnology Information DatabaseCenter)的BLAST或ClustalW确定同源性、相似性或同一性。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过使用GAP计算机程序比较序列信息来确定，例如Needleman等人(1970),J Mol Biol.48:443，已知例如，Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482。概括地说，GAP程序可以定义为两个序列中的较短序列中符号的总数除以类似比对符号的数目(即，核苷酸或氨基酸)所获得的值。GAP程序的默认参数可包括(1)二元比较矩阵(包括相同值为1且非同值为0)和Gribsko等人，(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编,Atlas Of ProteinSequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,第353-358页(1979)(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵)中所公开；(2)每个空位的罚分为3.0并且每个空位的每个符号额外罚分0.10(或空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5)；以及(3)末端空位没有罚分。

另外，任意两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，可以通过在确定的严格条件下进行DNA(Southern)杂交实验比对序列来确定，所确定的合适的杂交条件是在相应的技术范围内，并且可以通过本领域技术人员已知的方法确定(例如，J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版,Cold SpringHarbor Laboratory press,Cold Spring Harbor，纽约，1989；FM Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,纽约)。

本领域技术人员使用常规表达载体，通过适当地选择已知的已知的转换方法，可以进行编码L-组氨酸输出蛋白的基因的导入或转化。在本说明书中，术语“转化”是指将包含编码靶蛋白(L-组氨酸输出蛋白)的多核苷酸的表达载体导入宿主微生物中，使得由多核苷酸编码的蛋白质可以在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可以在宿主微生物中表达，它就可以位于插入的宿主微生物的染色体中和/或位于染色体外。只要多核苷酸可以被导入宿主微生物中并在宿主微生物中表达，导入的形式不受限制。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式导入宿主微生物，该表达盒是包含自主表达所需的所有元件的基因结构。表达盒通常可以包含表达调节元件，例如可以操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和/或翻译终止信号等。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，可以将多核苷酸以其自身的形式导入宿主细胞并在宿主细胞中可操作地连接至表达需要的序列。在上文中，术语“可操作地连接”可以指表达调控元件(例如，启动子)和多核苷酸功能性地连接，使得表达调控元件对编码靶蛋白(L-组氨酸输出蛋白)的多核苷酸进行转录调控(例如，转录起始)。可操作的连接可以使用本领域已知的基因重组技术进行，例如，可以通过常见的位点特异性DNA切割和连接来进行，但不限于此。

将多核苷酸转化到宿主微生物中的方法可以通过任何将核酸导入细胞(微生物)的方法来进行，并且可以根据宿主微生物适当地选择和进行本领域已知的转化技术。作为已知的转化方法，电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、显微注射法、聚乙二醇(PEG)沉淀法(聚乙二醇介导的摄取)、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、脂质转染法、醋酸锂-DMSO法等可以作为示例，但不限于此。

将基因插入宿主细胞基因组(染色体)中可以通过适当地选择本领域技术人员已知的方法来进行，并且例如，可以使用例如RNA引导的核酸内切酶系统来进行(例如，选自由(a)RNA引导的核酸内切酶(例如，Cas9蛋白等)、其编码基因或包含该基因的载体；和(b)混合物(例如，RNA引导的核酸内切酶蛋白和向导RNA等的混合物)、复合物(例如，核糖核酸融合蛋白(RNP)、重组载体(例如，包含RNA引导核酸内切酶编码基因和向导RNA编码DNA的载体等)等，其包含向导RNA(例如，单向导RNA(sgRNA)等)，其编码DNA或包含该DNA的载体所组成的组中的至少一种，但不限于此。

另一种实施方式提供了编码L-组氨酸输出蛋白的核酸分子。在一种实施方式中，核酸分子可以是包含SEQ ID NO：64和/或SEQ ID NO：65，或SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：66和/或SEQ ID NO：67，或SEQ ID NO：43；或SEQ ID NO：68和/或SEQ ID NO：69，或SEQ ID NO：46的核酸序列或由该序列组成的核酸分子。

其他实施方式提供了一种包含该核酸分子的重组载体(表达载体)。

其他实施方式提供了一种包含该核酸分子或重组载体的重组细胞。

一种实施方式提供了一种用于生产L-组氨酸的组合物、一种用于增加L-组氨酸产量的组合物或一种用于制备L-组氨酸生产微生物的组合物，其包含编码L-组氨酸输出蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的重组载体或包含该核酸分子或重组载体的细胞。

其他实施方式提供了一种用于制备L-组氨酸生产微生物的方法或一种增强和/或赋予微生物L-组氨酸生产能力的方法，包括修饰微生物以表达L-组氨酸输出蛋白。修饰微生物以表达L-组氨酸输出蛋白可以通过将编码L-组氨酸输出蛋白的基因导入微生物来进行，或用编码L-组氨酸输出蛋白的基因转化微生物来进行。

L-组氨酸输出蛋白、编码L-组氨酸输出蛋白的基因和微生物如上所述。

在本说明书中，术语“载体”是指含有编码靶蛋白的多核苷酸的碱基序列的DNA制品，所述DNA制品可操作地连接至合适的调节序列，使得靶蛋白能够在合适的宿主中表达。调节重序列可以包含可启动转录的启动子、用于调节转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和/或调节转录和/或翻译终止的序列。在转化到合适的宿主微生物后，载体可以独立于宿主微生物的基因组表达或整合到宿主微生物的基因组中表达。

可用于本说明书的载体不受特别限制，只要它可以在宿主细胞中复制即可，并且可以选自所有常用的载体。常用载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒、噬菌体等。例如，作为载体，可以将pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等用作噬菌体载体或粘粒载体，并且可以将pBR基、pUC基、pBluescriptII基、pGEM基、pTZ基、pCL基和pET基载体等用作质粒载体。具体而言，可以举例pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等，但不限于此。

可用于本说明书的载体可以是已知的表达载体和/或用于将多核苷酸插入宿主细胞染色体的载体。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入宿主细胞染色体，例如，同源重组，但不限于此。载体还可以包含选择标记物，用于确认插入在染色体中。选择标记物用于选择用载体转化的细胞，即，确认多核苷酸的插入，并且它可以在赋予选择性表型例如抗药性、营养缺陷型、细胞毒剂抗性或表面蛋白表达的基因中选择和使用。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标记物的细胞存活或表现出其他表型性状，因此可以选择转化的细胞。

其他实施方式提供了一种用于生产L-组氨酸的方法，包括在培养基中培养生产L-组氨酸的微生物。该方法还可以包括培养后从培养的微生物、培养基或它们两者中回收L-组氨酸。

在所述方法中，微生物的培养没有特别限制，但可以通过已知的分批培养法、连续培养法、补料分批培养法等进行。然后，培养条件没有特别限制，但可以使用碱性化合物(例如：氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如：磷酸盐或硫酸盐)调节滴定pH(例如，pH5～9，具体地，pH 6～8，最具体地，pH 6.8),并且可以通过将氧气或含氧气体混合物引入培养物中来维持需氧条件。培养温度可保持在20℃～45℃或25℃～40℃，并且可培养约10小时～约160小时、约10小时～96小时、约10小时～48小时或约10小时～36小时，但不限于此。通过培养生产的L-组氨酸可以分泌到培养基中或保留在细胞中。

可用于培养的培养基可以单独地使用选自由糖和碳水化合物(例如：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如：大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如：棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇类(例如：甘油和乙醇)、有机酸(如：醋酸)等所组成的组中的至少一种，或混合并使用其中的至少两种作为碳源，但不限于此。作为氮源，可以单独地使用选自由含氮有机化合物(例如：蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、豆粕粉和尿素)、无机化合物(例如：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等所组成的组的至少一种，也可以混合并使用其中的至少两种，但不限于此。作为磷源，可以单独地使用选自由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、其相应的含钠盐等所组成的组中的至少一种，或混合并使用其中的至少两种，但不限于此。此外，培养基可以包含必需的生长促进物质，例如其他金属盐(例如：硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和/或维生素等。

回收L-组氨酸可以是根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养基、培养液或微生物中收集所需的氨基酸。例如，可以通过选自离心、过滤、阴离子交换层析、结晶、HPLC等中的至少一种方法进行回收。用于回收L-组氨酸的方法还可以包括在回收之前、回收的同时或回收之后进行纯化。

有益效果

与不表达L-组氨酸输出基因的亲本菌株相比，通过在具有L-组氨酸生产能力的微生物中表达本说明书中提供的L-组氨酸输出基因，可以显著提高L-组氨酸产量，因此不但L-组氨酸可以更有效地生产，而且其还可以有助于L-组氨酸的工业化大规模生产。

具体实施方式

下面通过实施例对本申请进行更详细的说明。然而，这些实施例旨在说明性地描述本申请，但本申请的范围不受这些实施例的限制。

实施例1.外源组氨酸输出基因搜索和候选物选择

L-组氨酸在氨基酸种类中主要分类为碱性氨基酸，但也分类为芳香族氨基酸或支链氨基酸。为了选择具有L-组氨酸特异性输出能力的蛋白质候选物，基于NCBI和Kegg数据库，作为使用输出蛋白质(LysE(Arch Microbiol 180：155-160)、Wex(韩国专利第10-1968317号)、BrnFE(Arch Microbiol 180：155-160))的氨基酸序列作为查询序列对每个类别的氨基酸(碱性氨基酸：L-赖氨酸，芳香族氨基酸：Trp，支链氨基酸：异亮氨酸)进行PSI-BLAST搜索的结果，选择预测为可能释放L-组氨酸的膜蛋白的候选基因和拥有这些基因的微生物。

其中，考虑到生产菌株适用的生物安全性水平和保障可能性，如下表1所示，选择基于LysE的1种蛋白质、基于Wex的3种蛋白质和基于BrnFE的2种蛋白质、编码它们的基因和包含它们微生物：

表1L-组氨酸输出候选物清单

(上表1中，生物安全性依据美国疾病控制和预防中心(Centers for DiseaseControl and Prevention)定义的微生物致病指数(1～4级)(越低越安全)

实施例2.导入外源L-组氨酸输出基因候选物的载体和导入该载体的棒状杆菌属重组菌株的构建

构建用于将实施例1中选择的6种外源L-组氨酸输出基因候选物导入棒状杆菌属菌株的6种载体。

为了导入外源L-组氨酸输出基因候选物，将编码谷氨酸棒状杆菌的转座子的基因中的NCgl2131基因用作插入位点(Journal of Biotechnology 104,5-25Jorn Kalinowski等人，2003)。此外，外源L-组氨酸输出基因候选物被设计为在棒状状杆菌属来源的gapA基因(下文中，PgapA，SEQ ID NO：15)的启动子下表达。

为了用输出蛋白(exporter)基因替换NCgl2131基因，构建了NCg12131缺失和靶基因插入的载体。为了构建该载体，使用谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032的染色体为模板，分别使用SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，以及SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19引物对，分别进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得531bp的del-N2131L(SEQ ID NO：20)和555bp的del-N2131R(SEQ ID NO：21)的DNA片段。将获得的DNA产物使用QIAGEN公司的PCR纯化试剂盒进行纯化，然后使用pDZ载体(韩国专利第10-0924065号)和TaKaRa公司的Infusion克隆试剂盒进行克隆，从而构建了NCgl2131基因缺失和靶基因插入的载体。

编码水草螺菌来源的蛋白质(下文中，Haq、SEQ ID NO：1)的基因(下文中，haq、SEQID NO：2)的碱基序列信息从美国国立卫生研究院GenBank(NIH GenBank)获得。为了扩增haq，使用水草螺菌菌株(KCTC42001)的染色体DNA为模板，使用SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了含有945bp的haq(SEQ ID NO：2)的977bp的haq片段。为了获得与haq可连接的PgapA片段，使用ATCC13032的染色体为模板，使用SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了含有409bp的PgapA(SEQ ID NO：15)的441bp的PgapA片段。

编码罗尔斯通氏菌来源的蛋白质(下文中，Cpi、SEQ ID NO：3)的基因(下文中，cpi、SEQ ID NO：4)的碱基序列信息从美国国立卫生研究院GenBank(NIH GenBank)获得。为了扩增来源于罗尔斯通氏菌的cpi，使用罗尔斯通氏菌菌株(KCTC22125)的染色体DNA为模板，使用SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含945bp的cpi(SEQ ID NO：4)的977bp的cpi片段。为了获得与cpi可连接的PgapA片段，使用ATCC13032的染色体为模板，使用SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：26的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃进行聚合5分钟。结果，获得了包含409bp的PgapA(SEQ ID NO：15)的441bp的PgapA片段。将获得的cpi片段和PgapA片段，以及用ScaI限制性酶切割的pDZΔN2131载体用Gibson组装法进行克隆，得到重组质粒，命名为pDZΔN2131-PgapA-Cpi。

编码栖冷克吕沃尔菌来源的蛋白质(下文中，Kcr、SEQ ID NO：5)的基因(下文中，kcr、SEQ ID NO：6)的碱基序列信息从美国国立卫生研究院GenBank(NIH GenBank)获得。为了扩增栖冷克吕沃尔菌来源的kcr，使用栖冷克吕沃尔菌菌株(KCTC2580)的染色体DNA为模板，使用SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含882bp的kcr(SEQ ID NO：6)的914bp的kcr片段。为了获得与kcr可连接的PgapA片段，使用ATCC13032的染色体为模板，使用SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：31的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含409bp的PgapA(SEQ ID NO：15)的441bp的PgapA片段。将获得的kcr片段和PgapA片段，以及用ScaI限制性酶切割后的pDZΔN2131载体使用Gibson组装方法来克隆，得到重组质粒，命名为pDZΔN2131-PgapA-Kcr。

编码停滞棒状杆菌来源的蛋白质(下文中，Cst、SEQ ID NO：7)的基因(下文中，cst、SEQ ID NO：8)的碱基序列信息从美国国立卫生研究院GenBank(NIH GenBank)获得。为了扩增停滞棒状杆菌来源的cst，使用停滞棒状杆菌菌株(KCTC6872)的染色体DNA为模板，使用SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含717bp的cst(SEQ ID NO：8)的749bp的cst片段。为了获得与cst可连接的PgapA片段，使用ATCC13032的染色体为模板，使用SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：34的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含409bp的PgapA(SEQ ID NO：15)的441bp的PgapA片段。将获得的cst片段和PgapA片段，以及用ScaI限制性酶切割后的pDZΔN2131载体使用Gibson组装方法来克隆，得到重组质粒，命名为pDZΔN2131-PgapA-Cst。

编码盐生银杆菌来源的蛋白质(下文中，LsaFE、SEQ ID NO：9、10)的基因(下文中，lsa、SEQ ID NO：11)的碱基序列信息从美国国立卫生研究院GenBank(NIH GenBank)获得。为了扩增盐生银杆菌来源的lsa，使用盐生银杆菌菌株(KCTC19904)的染色体DNA为模板，使用SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含1048bp的lsa(SEQ ID NO：11)的1080bp的lsa片段。为了获得与Isa可连接的PgapA片段，使用ATCC13032的染色体为模板，使用SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：37的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含409bp的PgapA(SEQ ID NO：15)的441bp的PgapA片段。将获得的lsa片段和PgapA片段，以及用ScaI限制性酶切割后的pDZΔN2131载体使用Gibson组装方法来克隆，得到重组质粒，命名为pDZΔN2131-PgapA-Lsa。

编码阴道皮杆菌来源的蛋白质(下文中，DvaFE、SEQ ID NO：12、13)的操纵子(下文中，dva、SEQ ID NO：14)的碱基序列信息从美国国立卫生研究院GenBank(NIH GenBank)获得。为了扩增阴道皮杆菌来源的dva，使用阴道皮杆菌菌株(KCTC39585)的染色体DNA为模板，使用SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含1081bp的dva(SEQ ID NO：14)的1113bp的dva片段。为了获得与dva可连接的PgapA片段，使用ATCC13032的染色体为模板，使用SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：40引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含409bp的PgapA(SEQ ID NO：15)的441bp的PgapA片段。将获得的dva片段和PgapA片段，以及用ScaI限制性酶切割后的pDZΔN2131载体使用Gibson组装方法来克隆，得到重组质粒，命名为pDZΔN2131-PgapA-Dva。

为了确认外源L-组氨酸输出基因候选物的L-组氨酸输出能力，构建了NCgl2131缺失的载体(pDZΔN2131)和导入6种外源L-组氨酸输出基因候选物的载体(pDZΔN2131-PgapA-Haq、pDZΔN2131-PgapA-Cpi、pDZΔN2131-PgapA-Kcr、pDZΔN2131-PgapA-Cst、pDZΔN2131-PgapA-Lsa、pDZΔN2131-PgapA-Dva)分别导入进谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株中。更具体地，分别将载体通过电穿孔法转化到ATCC13032菌株中，并且通过二次杂交过程，构建了7种重组菌株，其中染色体上的NCgl2131基因缺失或替换为L-组氨酸输出基因候选物，分别命名为ATCC13032ΔN2131(删除N2131基因)、ATCC13032ΔN2131::Haq(N2131基因被haq替代)、ATCC13032ΔN2131::Cpi(N2131基因被cpi替代)、ATCC13032ΔN2131::Kcr(N2131基因被kcr替代)、ATCC13032ΔN2131::Cst(N2131基因被cst替代)、ATCC13032ΔN2131::Lsa(N2131基因被lsa替代)和ATCC13032ΔN2131::Dva(N2131基因被dva替代)。

实施例3.导入外源L-组氨酸输出基因候选物的棒状杆菌属菌株的MIC测定

为确认实施例2构建的7种重组谷氨酸棒状杆菌菌株(ATCC13032ΔN2131、ATCC13032ΔN2131::Haq、ATCC13032ΔN2131::Cpi、ATCC13032ΔN2131::Kcr、ATCC13032ΔN2131::Cst、ATCC13032ΔN2131::Lsa和ATCC13032ΔN2131::Dva)具有L-组氨酸输出能力活性，进行使用L-组氨酸的最低抑制浓度(MIC)实验。7种菌株在30℃下在基本液体培养基中培养24小时后，稀释为1×10³个和1×10⁴个细胞，在添加了L-组氨酸的基本固体培养基中点样培养。使用的基本固体培养基组成如下：

基本培养基(pH7.2)

葡萄糖10g、KH₂PO₄ 1g、K₂HPO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 0.4g、尿素2g、(NH₄)₂SO₄ 5g、NaCl0.5g、烟酰胺5μg、泛酸钙0.1μg、生物素0.2μg、盐酸硫胺素3μg、微量元素溶液*1ml(基于1升蒸馏水)、20g琼脂

*微量元素溶液

Na₂B₄O₇·10H₂O 0.09g，(NH₄)₆Mo₇O₂₇·4H₂O 0.04g，ZnSO₄·7H₂O 0.01g，CuSO₄·5H₂O 0.27g，MnCl₂·4H₂O 0.01g,FeCl₃·6H₂O 1g,CaCl₂ 0.01g(基于1升蒸馏水)

对于最小抑菌浓度实验，在基本固体培养基中加入1g/L的L-组氨酸，并且在48小时后观察细胞生长情况，结果见下表2：

表2

导入外源L-组氨酸输出基因候选物的棒状杆菌属菌株在含L-组氨酸的基本培养基中的生长程度

(在表2中，+的数量表示菌株的相对生长程度，各个表示如下：

+：未形成单个菌落，但形成了浑浊(不是作为单个菌落生长而是聚集生长的类型)；

++：形成浑浊并且形成小于5个单个菌落；

+++：形成浑浊并且形成小于50个单个菌落；

++++：形成浑浊并且无法区分单个菌落)

如表2所示，除ATCC13032ΔN2131::Dva菌株外的所有菌株在不含L-组氨酸的基本培养基中生长顺利。然而，在包含1g/L的L-组氨酸的基本培养基中，其中导入了L-组氨酸输出基因候选物的大部分菌株的生长是不显著的，并且只有导入阴道皮杆菌来源的基因的ATCC13032ΔN2131::Dva菌株显示出优于ATCC13032ΔN2131的生长。这表明导入的阴道皮杆菌来源的蛋白质即使在包含高于最低抑菌浓度的L-组氨酸的培养基中，也可以具有L-组氨酸输出能力。

由此，选择阴道皮杆菌来源的蛋白质Dva作为赋予高于最低抑菌浓度的L-组氨酸抗性并且具有L-组氨酸特异性输出能力的蛋白质。

实施例4.基于棒状杆菌来源的L-组氨酸生产菌株KCCM80179导入阴道皮杆菌来源基因的菌株的构建及L-组氨酸生产能力的评价

为了确认阴道皮杆菌来源的蛋白质Dva的L-组氨酸输出能力，将阴道皮杆菌来源的基因dva导入L-组氨酸生产菌株KCCM 80179(韩国专利申请第10-2019-004693414-682号)。

为此，将实施例2中构建的载体pDZΔN2131和pDZΔN2131-PgapA-Dva通过电穿孔法转化，并且通过二次杂交方法来构建其中染色体上NCgl2131基因缺失或被L-组氨酸输出基因候选物(dva)替代的2种菌株，分别命名为KCCM 80179ΔN2131(NCgl2131基因缺失)和KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva(NCgl2131基因被dva替代)。

为了确认构建的KCCM 80179ΔN2131和KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva菌株的L-组氨酸生产能力，通过以下方法培养菌株：将KCCM 80179ΔN2131和KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva菌株在活化培养基中培养16小时，然后将每个菌株接种到含有25ml种子培养基的250ml角挡板烧瓶中，并以200rpm振荡培养。然后，将1ml的种子培养液接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，在30℃下以200rpm振荡培养48小时。用于培养的培养基组成如下：

<活化培养基>

肉汁1％(w/v)、聚蛋白胨1％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v)、酵母提取物1％(w/v)、琼脂2％(w/v)、pH 7.2

<种子培养基>

葡萄糖5％(w/v)、细菌蛋白胨1％(w/v)、氯化钠0.25％(w/v)、酵母提取物1％(w/v)、尿素0.4％(w/v)、pH 7.2

<生产培养基>

葡萄糖10％(w/v)、硫酸铵2％(w/v)、磷酸二氢钾0.1％(w/v)、七水硫酸镁0.05％(w/v)、CSL(玉米浆)2.0％(w/v)、生物素200μg/L、碳酸钙、pH 7.2

培养完成后，通过HPLC测定L-组氨酸产量(培养基中组氨酸含量)，结果见下表3：

表3

导入KCCM 80179来源的阴道皮杆菌来源基因的菌株的L-组氨酸产量

如表3所示，确认NCg12131-缺失菌株具有与亲本菌株KCCM 80179菌株同等水平的L-组氨酸生产能力，而与NCgl2131-缺失菌株和亲本菌株KCCM 80179菌株相比，其中导入阴道皮杆菌来源的基因的KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva菌株的L-组氨酸生产能力分别提高了23％和21％。通过实施例3和实施例4的结果，确定了通过导入阴道皮杆菌来源的基因，不仅提高了对浓度高于最低抑菌浓度的L-组氨酸的抵抗力，而且大大提高了L-组氨酸生产能力。该结果证明阴道皮杆菌来源的蛋白是能够特异性输出L-组氨酸的L-组氨酸输出蛋白。

实施例5.阴道皮杆菌来源的L-组氨酸输出蛋白样蛋白质的附加保护

由于阴道皮杆菌来源的蛋白质的L-组氨酸输出能力在实施例3和实施例4中得到确认，为了额外确保与该蛋白具有高氨基酸序列同源性的相似蛋白，使用DvaFE中DvaF的序列(SEQ ID NO：12)作为查询，进行BLAST搜索(见表4)。

表4

作为BLAST搜索的结果，另外选择了显示至少60％序列同源性并且不属于皮杆菌属的2种L-组氨酸输出蛋白，如下表5所示：

表5L-组氨酸输出蛋白附加候选物清单

实施例6.导入附加外源L-组氨酸输出基因候选物的载体的构建

构建了两种载体，用于将实施例5中附加地选择的2种L-组氨酸输出基因候选物导入棒状杆菌属菌株中。与实施例2相同，NCgl2131基因用作缺失位点，并且PgapA用作启动子。

编码马赛创伤杆菌来源的蛋白质(下文中，HmaFE、SEQ ID NO：41、42)的操纵子(下文中，hma，SEQ ID NO：43)的碱基序列信息从美国国立卫生研究院GenBank(NIH GenBank)获得。为了获得haq DNA，使用Bionics公司(社)的基因合成服务合成DNA。为了扩增合成的DNA，使用SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含1081bp的hma(SEQ ID NO：43)的1113bp的hma片段。为了获得与hma可连接的PgapA片段，使用ATCC13032的染色体为模板，使用SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：49的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含409bp的PgapA(SEQ ID NO：15)的441bp的PgapA片段。将获得的hma片段和PgapA片段，以及用ScaI限制性酶切割的pDZΔN2131载体用Gibson组装法进行克隆，得到重组质粒，命名为pDZΔN2131-PgapA-Hma。

编码脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的蛋白质(下文中，MabFE，SEQ ID NO：44、45)的操作子(下文中，mab，SEQ ID NO：46)的碱基序列信息从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得。为了获得mab DNA，使用Bionics公司(社)的基因合成服务合成DNA。为了扩增合成的DNA，使用SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含1081bp的mab(SEQ ID NO：46)的1113bp的mab片段。为了获得与mab可连接的PgapA片段，使用ATCC13032的染色体为模板，使用SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：52的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含409bp的PgapA(SEQ ID NO：15)的441bp的PgapA片段。将获得的mab片段和PgapA片段，以及用ScaI限制性酶切割的pDZΔN2131载体用Gibson组装法进行克隆，得到重组质粒，命名为pDZΔN2131-PgapA-Mab。

实施例7.基于生产L-组氨酸菌株KCCM 80179导入马赛创伤杆菌来源、脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的基因的菌株的构建及L-组氨酸生产能力的评价

为了确认马赛创伤杆菌来源的蛋白质Hma和脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的蛋白质Mab是否具有L-组氨酸输出能力，将hma和mab分别导入到生产L-组氨酸菌株KCCM 80179菌株中。

为此，将实施例6中构建的载体pDZΔN2131-PgapA-Hma和pDZΔN2131-PgapA-Mab通过电穿孔转化，并且通过二次杂交方法，来构建其中染色体上NCgl2131基因被L-组氨酸输出基因候选物替代的2种菌株，分别命名为KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma(NCgl2131基因被hma替代)和KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Mab(NCgl2131基因被mab替代)。

为了确认构建的KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma和KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Mab菌株的L-组氨酸生产能力，通过实施例4中进行的方法进行菌株培养，并且测量L-组氨酸产量。以实施例4中构建的KCCM 80179ΔN2131菌株和KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva菌株作为对照组，通过相同的方法进行培养和L-组氨酸产量(培养基中组氨酸含量)的测量。获得的结果在表6中显示。

表6

导入KCCM 80179来源的马赛创伤杆菌来源的基因或脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的基因的菌株的L-组氨酸产量

如表6所示，与亲本菌株KCCM 80179菌株相比，在KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma菌株和KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Mab菌株中，L-组氨酸产量分别增加了18％和15.8％。这种结果表明，马赛创伤杆菌来源的蛋白质和脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的蛋白质也可以选择作为L-组氨酸输出蛋白。

实施例8.基于L-组氨酸生产菌株CA14-737导入阴道皮杆菌来源、马赛创伤杆菌来源、脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的菌株的构建和L-组氨酸生产能力的评价

为了再次确认阴道皮杆菌来源的蛋白Dva、马赛创伤杆菌来源的蛋白Hma和脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的蛋白Mab的L-组氨酸输出能力，将它们分别导入来源于野生型谷氨酸棒状杆菌的L-组氨酸生产菌株CA14-737(韩国专利申请第10-2019-004693414-682号)，其中导入解决了L-组氨酸反馈限制的HisG多肽突变，并且增强了L-组氨酸生物合成基因。

为此，将实施例2和实施例6中构建的4种载体(pDZΔN2131、pDZΔN2131-PgapA-Dva、pDZΔN2131-PgapA-Hma、pDZΔN2131-PgapA-Mab)分别通过电穿孔转化到CA14-737菌株，并且通过二次杂交方法，来构建其中染色体上NCgl2131基因缺失或被L-组氨酸输出基因候选物替代的4种菌株，分别命名为CA14-737ΔN2131、CA14-737ΔN2131-PgapA-Dva、CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma和CA14-737ΔN2131-PgapA-Mab。

为了确认构建的CA14-737ΔN2131、CA14-737ΔN2131-PgapA-Dva、CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma、CA14-737ΔN2131-PgapA-Mab菌株的L-组氨酸生产能力，菌株通过实施例4中进行的方法进行培养，并且测定L-组氨酸产量(培养基中组氨酸含量)，结果见表7：

表7

导入CA14-737来源的阴道皮杆菌来源的基因、马赛创伤杆菌来源的基因、脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的基因的菌株的L-组氨酸产量

如表7所示，与亲本菌株CA14-737株相比，其中导入了阴道皮杆菌来源的基因的CA14-737ΔN2131-PgapA-Dva菌株的L-组氨酸产量增加了62.5％，并且其中导入了马赛创伤杆菌来源的基因的CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma菌株的L-组氨酸产量增加了47.5％，并且其中导入了脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的基因的CA14-737ΔN2131-PgapA-Mab菌株的L-组氨酸产量增加了52.5％。由此，再次确认了所有的阴道皮杆菌来源的蛋白质、马赛创伤杆菌来源的蛋白质和脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的蛋白质是能够特异性输出L-组氨酸的L-组氨酸输出蛋白。在构建的重组菌株中，CA14-737ΔN2131-PgapA-Dva菌株(谷氨酸棒状杆菌CA14-0875)在2020年9月21日国际保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，位于韩国首尔西大门区，保藏号为KCCM12793P。

实施例9.表达阴道皮杆菌来源、马赛创伤杆菌来源、脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的蛋白的大肠杆菌(E.coli)载体的构建

确认了所选择的L-组氨酸输出蛋白在各种菌株中是否表现出L-组氨酸生产能力。为此，构建了能够在大肠杆菌中分别表达阴道皮杆菌来源、马赛创伤杆菌来源、脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的蛋白质的载体。将各基因克隆到大肠杆菌表达载体pCC1BAC(下文中，pBAC、Epicenter公司)中，并且在大肠杆菌菌株MG1655(下文中，PyccA、SEQ ID NO：53)的yccA启动子下进行表达。

为了扩增阴道皮杆菌来源的dva，使用阴道皮杆菌菌株的染色体DNA为模板，使用SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含1081bp的dva(SEQ ID NO：10)的1113bp的dva片段。为了获得与dva可连接的PyccA片段，使用MG1655的染色体为模板，使用SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含100bp的PyccA(SEQ ID NO：53)的132bp的PyccA片段。将获得的dva片段和PyccA片段，以及用EcoRI限制性酶切割的pBAC载体用Gibson组装法进行克隆，来获得重组质粒，命名为pBAC-PyccA-Dva。

为了扩增马赛创伤杆菌来源的hma，使用实施例6中构建的pDZΔN2131-PgapA-Hm载体DNA为模板，使用SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含1081bp的hma(SEQ ID NO：43)的1113bp的hma片段。为了获得与hma可连接的PyccA片段，使用MG1655的染色体为模板，使用SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：60引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含100bp的PyccA(SEQ ID NO：53)的132bp的PyccA片段。将获得的hma片段和PyccA片段，以及用EcoRI限制性酶切割的pBAC载体用Gibson组装法进行克隆，来获得重组质粒，命名为pBAC-PyccA-Hma。

为了扩增脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的mab，使用实施例6中构建的pDZΔN2131-PgapA-Mab载体DNA为模板，使用SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含1081bp的mab(SEQ ID NO：43)的1113bp的mab片段。为了获得与mab可连接的PyccA片段，使用MG1655的染色体为模板，使用SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：63的引物对进行PCR。作为PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，循环28次，然后在72℃下进行聚合5分钟。结果，获得了包含100bp的PyccA(SEQ ID NO：53)的132bp的PyccA片段。将获得的mab片段和PyccA片段，以及用EcoRI限制性酶切割的pBAC载体使用Gibson组装法进行克隆，来获得重组质粒，命名为pBAC-PyccA-Mab。

实施例10.基于大肠杆菌来源的L-组氨酸生产菌株导入阴道皮杆菌来源的基因的菌株的构建和L-组氨酸生产能力的评价

为了确认基于大肠杆菌来源的L-组氨酸生产菌株的3种新组氨酸输出蛋白(Dva、Hma、Mab)的L-组氨酸输出能力，将3种构建的载体导入CA14 -9003e菌株，该菌株具有先前报道的基因型(purR缺失、hisL缺失、hisG^r；大肠杆菌MG1655的定向修饰来获得组氨酸产生突变体；Applied Biochemistry and Microbiology,2013,Vol.49,No.2,pp.130-135)(MG1655⁺hisG^r hisL'_ΔΔpurR)。为此，分别导入在实施例9中构建的3种载体(pBAC-PyccA-Dva、pBAC-PyccA-Hma、pBAC-PyccA-Mab)和pBAC载体，从而构建CA14-9003e/pBAC、CA14-9003e/pBAC-PyccA-Dva、CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma和CA14-9003e/pBAC-PyccA-Mab菌株。

为了确认构建的CA14-9003e/pBAC、CA14-9003e/pBAC-PyccA-Dva、CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma、CA14-9003e/pBAC-PyccA-Mab菌株的L-组氨酸生产能力，通过以下方法培养所述菌株。将菌株在LB固体培养基(包含25μg/ml氯霉素)中培养16小时，然后将各菌株接种于含有25ml的LB液体培养基的250ml角挡板烧瓶中，并且在37℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的种子培养液接种到含有25ml大肠杆菌生产培养基的250ml角挡板烧瓶中(Applied Biochemistry and Microbiology,2013,Vol.49,No.2,pp.130-135)，并且在37℃下以200rpm振荡培养48小时。用于培养的培养基如下：

<大肠杆菌生产培养基>

葡萄糖4％(w/v)、酵母提取物0.2％(w/v)、硫酸铵1.6％(w/v)、磷酸氢二钾三水合物0.06％(w/v)、硫酸铁七水合物0.0005％(w/v)、五水硫酸镁0.0005％(w/v)、碳酸钙、pH7.2

培养完成后，通过HPLC测量L-组氨酸产量(培养基中的组氨酸含量)，结果示于下表8中。

表8

导入CA14-9003e来源的阴道皮杆菌来源的基因、马赛创伤杆菌来源的基因、脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的基因的菌株的L-组氨酸产量

如表8所示，导入阴道皮杆菌来源的基因的CA14-9003e/pBAC-PgapA-Dva菌株的L-组氨酸产量增加了62.5％，导入马赛创伤杆菌来源的基因的CA14-9003e/pBAC-PgapA-Hma菌株的L-组氨酸产量增加了21.9％，以及导入脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的基因的CA14-9003e/pBAC-PgapA-Mab菌株的L-组氨酸产量增加了18.8％。由此，证实了所有阴道皮杆菌来源的蛋白质、马赛创伤杆菌来源的蛋白质和脓肿分枝杆菌脓肿亚种来源的蛋白质在大肠杆菌L-组氨酸生产菌株中作为对L-组氨酸特异性的输出蛋白质起作用。

通过上述结果，确定当与阴道皮杆菌来源的蛋白质具有至少60％同源性的蛋白质被导入微生物时，其作为特异性地将L-组氨酸输出到细胞外的输出蛋白起作用。

上述，在本说明书中公开的各个说明及实施方式也可以适用于彼此的说明及实施方式。本说明书中公开的各种要素的所有可能组合都在本说明书中提出的发明范围内。此外，不能认为本说明书中的发明范围受以下具体描述的限制，只要本领域技术人员能够认识到或识别出与本说明书中所描述的具体实施方式的许多等同物，这些等同物旨在包括于本说明书中提出的发明中。

[保藏号]

保藏单位名称：韩国微生物保藏中心

保藏号：KCCM12793P

保藏日期：2020年09月21日(中文译文)

国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约

国际表格

至：CJ第一制糖株式会社

韩国首尔市中区东湖路330号

CJ第一制糖中心

(邮编)100-400

上述翻译文本与原文没有相违之处

<110> CJ第一制糖株式会社(CJ CheilJedang Corporation)

<120> L-组氨酸输出蛋白和使用其生产L-组氨酸的方法

<130> OPP20215089KR

<150> KR 10-2020-0183702

<151> 2020-12-24

<160> 69

<170> koPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Haq蛋白质

<400> 1

Met Lys Ser Lys Asn Ala Thr Leu Val Gly Leu Ser Ala Val Val Leu

1 5 10 15

Trp Ser Ala Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu His Leu Gly

20 25 30

Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ile Tyr Thr Val Ala Ser Leu Ile Leu

35 40 45

Leu Val Ser Val Gly Phe Pro Arg Leu Ala Ser Phe Pro Arg Arg Tyr

50 55 60

Leu Leu Trp Gly Ser Val Leu Phe Val Ala Tyr Glu Leu Cys Leu Ser

65 70 75 80

Leu Ser Ile Gly Tyr Ala His Thr Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val Gly

85 90 95

Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Thr Phe Thr Leu Val Ala Ala Ile Leu

100 105 110

Phe Gly Gly Gln Arg Ala Thr Leu Leu Val Val Pro Gly Phe Ile Leu

115 120 125

Ser Met Leu Gly Ile Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Gln Gly Leu Asp

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Pro Ser Gly Met Leu Ala Asn Ile Arg Asp Asn Pro Leu Ser Tyr Gly

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Leu Ala Phe Ile Gly Ala Leu Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr

165 170 175

Thr Arg Ile Ala Gln Gly Gln Asn Gly Val Thr Pro Phe Phe Met Leu

180 185 190

Val Ala Leu Ala Leu Trp Val Lys Val Leu Leu Gly Gly His Val Ala

195 200 205

Glu Leu Ser Phe Ser Val Pro Ala Leu Val Tyr Leu Val Leu Ala Ala

210 215 220

Ala Ala Met Gly Leu Gly Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His

225 230 235 240

Gly Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Ala Ser Tyr Phe Ile Pro Val Phe

245 250 255

Ser Ser Ala Leu Ser Ala Leu Leu Leu Arg Ala Pro Leu Pro Thr Ser

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Phe Trp Val Gly Ala Ala Leu Val Cys Ala Gly Ser Ile Leu Cys Trp

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Arg Ala Thr Arg Ser Leu Asp Leu Ser Lys Glu Pro Ala Ala Arg Ala

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Ala Arg Pro Glu Gly Pro Pro Gln Asn Gln

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<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> haq基因

<400> 2

atgaagagca agaacgcaac cctggtcgga ttgagcgcgg tggtactgtg gagtgccatc 60

gtgggcctga tccgtggcgt gagcgagcat ctcggagcca ccggcggggc ggcggccatt 120

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ctctcgatcg gttatgccca taccggccgc caggccatcg aagtcggcat ggtcaattac 300

ctctggccga ccttcaccct ggtggcggcc atcctcttcg gaggccagcg cgccacgctg 360

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gcagcgcggg cggcacgtcc cgaaggccca cctcagaacc aatag 945

<210> 3

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cpi蛋白质

<400> 3

Met Gln Ser Thr Arg Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Ile Ala Ile Leu

1 5 10 15

Leu Trp Ser Ser Ile Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu Ser Leu

20 25 30

Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Met Met Tyr Ser Val Ala Ser Val Leu

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Leu Met Leu Thr Val Gly Phe Val Arg Leu Arg Glu Phe Pro Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Val Trp Gly Ser Ile Leu Phe Val Ser Tyr Glu Leu Cys Leu

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Ser Leu Ser Ile Gly Tyr Ser His Ser Gly Arg Gln Ala Ile Glu Val

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Gly Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ser Phe Thr Met Leu Cys Ala Ile

100 105 110

Ala Phe Asn Lys Gln Lys Ala Asn Val Leu Ile Val Pro Gly Phe Leu

115 120 125

Ile Ala Ile Leu Gly Ile Cys Leu Val Leu Gly Gly Glu Gln Gly Leu

130 135 140

Asp Val Ala Gly Met Val Ala Asn Val Arg Asp Asn Pro Leu Ser Tyr

145 150 155 160

Gly Leu Ala Leu Ala Gly Ala Leu Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val

165 170 175

Thr Asn Arg Ile Ala Gly Gly Asn Asn Gly Val Thr Leu Phe Phe Met

180 185 190

Leu Thr Ala Met Ala Leu Trp Ile Lys Tyr Phe Thr Gly Asp His Ala

195 200 205

Pro Met Ala Phe Thr Tyr His Ala Val Ile Tyr Leu Ala Leu Ala Ala

210 215 220

Ser Ala Met Gly Phe Gly Tyr Pro Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His

225 230 235 240

Gly Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Ala Ser Tyr Phe Ile Pro Val Ile

245 250 255

Ser Ala Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu His Ile Pro Leu Ser Leu Ala

260 265 270

Phe Trp Lys Gly Ala Ser Leu Val Cys Ala Gly Ser Val Leu Cys Trp

275 280 285

Leu Ala Thr Arg Ala Arg Lys Val Ala Ala Thr Pro Asp Arg Ala Pro

290 295 300

Val Arg Asp Arg Val Trp Lys Gln

305 310

<210> 4

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cpi基因

<400> 4

atgcaaagca cgcgtaaggc cacgttgatc gggctcattg cgatcctgtt gtggagttcc 60

atcgtcggcc tgatccgcgg cgtcagtgaa agcctcggcg cgaccggtgg cgccgccatg 120

atgtactcgg ttgcctccgt cctgcttatg ctgacggttg gcttcgtgcg tctgcgcgaa 180

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gttctgatcg tgccgggctt cctgattgcg atcctgggta tctgcctggt gctgggcggc 420

gagcagggtc tggatgttgc aggcatggtg gccaatgtca gggacaatcc gctcagctac 480

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gcactggcag cgtcggcgat gggcttcggc tacccggcgt ggaacgtggg catcctgcac 720

ggcaacgtaa cggtgcttgc cggcgcgtcg tatttcatcc ctgtgatttc agccgcactg 780

gctggcttgc tcttgcatat accgctttcg ctggcgttct ggaaaggcgc gtcgctggta 840

tgcgcggggt ccgtgctgtg ctggttggcg acgcgcgcgc gcaaggtggc tgcaacgccc 900

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<210> 5

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Kcr蛋白质

<400> 5

Met Asp Lys Lys Arg Ala Thr Leu Ile Gly Phe Ser Ala Ile Ile Leu

1 5 10 15

Trp Ser Thr Met Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu Gly Leu Gly

20 25 30

Pro Val Gly Gly Ala Ala Met Ile Tyr Ser Leu Ser Gly Leu Leu Leu

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Ile Phe Thr Val Gly Phe Pro Gln Leu Arg Gln Ile Pro Pro Arg Tyr

50 55 60

Leu Leu Val Gly Ser Leu Phe Phe Val Ser Tyr Glu Met Cys Leu Ala

65 70 75 80

Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Gly Thr Arg Gln Gln Ala Ile Glu Val Gly

85 90 95

Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ser Leu Thr Ile Leu Phe Ala Ile Ile

100 105 110

Phe Asn Gly Gln Lys Thr Thr Trp Leu Val Ile Pro Gly Leu Leu Leu

115 120 125

Ser Ile Val Gly Val Thr Trp Val Leu Gly Gly Glu His Gly Leu Asp

130 135 140

Leu Ala Glu Ile Arg Ser Asn Val Ile Ser Ser Pro Leu Ser Tyr Ile

145 150 155 160

Leu Ala Phe Val Gly Ala Phe Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr

165 170 175

Ala Lys Tyr Ala Lys Gly Lys Asn Gly Ile Thr Leu Phe Val Leu Phe

180 185 190

Thr Ala Leu Ala Leu Trp Val Lys Phe Leu Met Ser Glu Gln Pro Pro

195 200 205

Met Ile Phe Ser Trp Pro Val Val Ile Lys Leu Val Thr Cys Ala Leu

210 215 220

Ala Leu Gly Phe Ala Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly

225 230 235 240

Asn Val Ser Leu Leu Ala Ala Ala Ser Tyr Phe Thr Pro Val Leu Ser

245 250 255

Ser Ala Leu Ala Ala Phe Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ser Trp Ser Phe

260 265 270

Trp Gln Gly Ala Ala Met Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Cys Trp Tyr

275 280 285

Ala Thr Arg Arg Pro

290

<210> 6

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> kcr基因

<400> 6

atggataaga aaagagcgac gctcattgga tttagcgcca ttattttgtg gagtacgatg 60

gtgggtctga ttcgcggcgt aagcgaaggg ctcggcccgg tgggcggagc cgcaatgatt 120

tacagcctca gcggcctgct gctgattttt accgttggct tcccacaatt gcgccaaatt 180

ccaccgcgct atttgctggt aggtagcctg ttttttgtca gctacgaaat gtgcctcgcg 240

ctctcattag gctatgccgg cactcgccaa caggccatcg aagtcggcat ggtgaattat 300

ctctggccta gcctgacgat tttatttgcg attatcttta atggtcaaaa aaccacctgg 360

ctggttatcc c 371

<210> 7

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cst蛋白质

<400> 7

Met Ser Thr Leu Ser Ile Leu Ile Ala Gly Phe Ala Leu Gly Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ile Val Ala Ile Gly Pro Gln Asn Ala Leu Leu Ile Lys Gln Gly

20 25 30

Ile Lys Arg Glu His Val Trp Val Val Ile Ala Ile Cys Ala Val Ser

35 40 45

Asp Ile Ile Leu Ile Ser Gly Gly Thr Ala Gly Val Gly Tyr Leu Val

50 55 60

Glu Thr Phe Pro Thr Ala Leu Val Val Leu Lys Tyr Leu Gly Ala Ile

65 70 75 80

Tyr Leu Ala Tyr Phe Thr Tyr Leu Cys Phe Arg Asp Ala Leu Arg Asp

85 90 95

Lys Val Glu Thr Leu Ser Pro Ala Gln Ile Glu Pro Asn Lys Thr Gln

100 105 110

Gln Ile Asp Ala Phe Asp Gly Gly Asp Leu Gly Gly Ser Ser Val Asp

115 120 125

Thr Arg Arg Arg Thr Thr Arg Leu Arg Gln Gln Val Arg Gln Ser Thr

130 135 140

Trp Val Lys Pro Ala Leu Ala Thr Leu Ala Ile Cys Trp Leu Asn Pro

145 150 155 160

Ala Ala Tyr Val Asp Val Leu Val Met Ile Gly Gly Leu Ala Asn Gln

165 170 175

Tyr Gly Glu Thr Gly Arg Trp Phe Phe Ala Ala Gly Ala Ile Ala Ala

180 185 190

Ser Met Leu Trp Phe Pro Ser Val Gly Leu Ala Ala Ala Lys Phe Ser

195 200 205

His Val Leu Ser Arg Pro Ala Val Trp Arg Gly Ile Asn Phe Gly Ile

210 215 220

Gly Cys Ile Met Ala Leu Leu Thr Ile Lys Leu Leu Leu Thr

225 230 235

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cst基因

<400> 8

atgtcaacgc tgtctatcct catcgccggt ttcgcactag ggctctcact tatcgtagcg 60

attggcccgc aaaatgctct gctgatcaaa cagggcatta aacgcgagca cgtgtgggta 120

gtcattgcga tttgcgcggt gtccgacatt attttgatta gcggtggcac cgcgggggtg 180

ggctatctgg tggagacttt cccgaccgca ctggtggtgc tgaagtatct gggcgcgatt 240

tatctggctt actttactta tctgtgcttt cgcgatgcgt tgcgcgacaa ggttgaaact 300

ctctcccctg cgcagatcga gccgaataag acgcagcaga tcgatgcatt cgatggcggc 360

gacttgggcg gttcttctgt tgatacccgg cggcgcacca cgcgtctgcg ccagcaagta 420

cgccaatcga cctgggtgaa gccagctctt gcgaccttgg cgatttgctg gctgaacccg 480

gcagcttatg tcgatgtgct ggtaatgatt ggcggacttg ccaaccaata cggcgaaacc 540

ggccgatggt tttttgctgc cggtgccatt gcagcgagca tgctgtggtt tcccagcgtt 600

ggtcttgctg ccgcgaagtt ctcgcacgta ctttcgcgcc ctgcggtatg gcgcggcatc 660

aacttcggca ttggctgcat catggcgctg ctgaccatta agctgctgtt gacctag 717

<210> 9

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LsaF蛋白质

<400> 9

Met Ser Pro Ser His Asp Pro Leu Pro Arg Arg Ala Gly Ala Ala Ala

1 5 10 15

Gly Leu Arg Asp Ser Leu Gly Val Gly Leu Gly Ile Phe Pro Leu Gly

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Ile Ala Leu Gly Ile Leu Val Ile Gln Ala Gly Leu Pro Trp Trp Leu

35 40 45

Ala Pro Ala Leu Ser Ile Gly Ile Phe Ala Gly Ser Val Glu Leu Leu

50 55 60

Leu Val Ser Met Leu Ala Ala Ala Thr Pro Leu Val Thr Ile Ala Ala

65 70 75 80

Thr Val Phe Ala Val Asn Phe Arg His Val Phe Tyr Ala Phe Ser Phe

85 90 95

Pro Leu Ser Arg Val Arg Pro Gly Leu Pro Arg Ala Tyr Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Met Ile Asp Glu Ala Tyr Ala Thr Tyr Val Leu Met Asp Pro Asp

115 120 125

Arg Leu Ser Ser Ala Arg Met Val Thr Gly Gln Leu Ala Met Gln Leu

130 135 140

Tyr Trp Val Leu Gly Gly Phe Val Gly Ile Met Ile Ala Asn Val Leu

145 150 155 160

Pro Ala Pro Ile Glu Gly Phe Glu Phe Ala Leu Val Ala Leu Phe Val

165 170 175

Val Met Ser Met Asp Ala Ile Arg Gly Lys Arg Glu Leu Pro Ser Ala

180 185 190

Leu Leu Ala Cys Leu Ala Val Thr Val Ala Ile Leu Val Ala Gly Asp

195 200 205

Asn Ala Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Gly Leu

210 215 220

Arg Tyr Phe Leu Thr Lys Arg Thr Thr Asp Thr Ala Glu Glu Gly Glu

225 230 235 240

Arg Ala

<210> 10

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LsaE蛋白质

<400> 10

Met Arg Cys Trp Ser Arg Leu Arg Cys Thr Pro Gly Tyr Trp Gly Cys

1 5 10 15

Ala Ile Ser Ser Pro Ser Glu Pro Arg Thr Leu Arg Arg Arg Ala Ser

20 25 30

Val Pro Ser Thr Glu Tyr Leu Ile Ala Gly Val Val Val Ala Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Leu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Phe Ala Ala Leu Lys Pro Leu

50 55 60

Arg Lys Ser Lys Leu Val Gln Ala Leu Gly Arg Trp Met Pro Ala Gly

65 70 75 80

Ile Leu Val Ile Leu Ala Val Val Val Leu Arg Asp Gln Leu Ile Ser

85 90 95

Gln Gln Gly Arg Val Trp Pro Val Leu Val Ala Thr Ala Ile Thr Ala

100 105 110

Leu Ala His Leu Leu Ser Lys Arg Arg Ala Leu Val Ser Ile Ala Ala

115 120 125

Gly Thr Ala Cys Tyr Val Leu Leu Leu Asn Phe Phe

130 135 140

<210> 11

<211> 1048

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lsa基因

<400> 11

atgtctccgt cacacgatcc tttaccgcgc cgcgcgggcg ccgcggccgg ccttcgagat 60

tctctcgggg tcggcctcgg cattttcccc ttgggcattg ccctcggaat tcttgtcatt 120

caggcgggac ttccctggtg gctcgccccg gccctctcga ttggtatctt cgcgggatct 180

gtcgagctgc tcctggtcag catgctcgcc gccgcgactc cgctcgtgac gatcgccgcg 240

accgtgttcg ccgtgaactt tcggcacgta ttctacgcgt tctcgtttcc gctttcgcgg 300

gtgcgaccgg gtctaccccg ggcgtactcc atctacgcaa tgatcgacga ggcctacgcc 360

acctatgtgc tgatggatcc ggatcgcctg agctcagccc gcatggtaac cggccagctc 420

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cctgccccca ttgagggctt tgagtttgca ctcgtggcgc tcttcgtggt gatgtcgatg 540

gatgcgattc gcggcaagcg cgagctccca tcggccttgc tggcttgcct cgctgtcacg 600

gttgcaatac tggtcgctgg cgacaatgcg ctgctggtcg cgcttgcgct gtactccggg 660

ctactggggc tgcgctattt cctcaccaag cgaaccacgg acactgcgga ggagggcgag 720

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gctgcgcgca ctcccgtttg cggcgctcaa accgctgcgc aaatctaagc tcgtgcaggc 840

gctcgggcgc tggatgcccg ctggcatcct cgttatcctc gccgtcgtcg tactgcgcga 900

tcagctcata tcgcagcagg gccgggtgtg gccggtgctc gtcgcgaccg cgatcacggc 960

cctcgctcac ttgctctcaa agcgacgcgc gctcgtgagc atcgcggctg gcaccgcctg 1020

ctacgtgctg ctgctcaact ttttctag 1048

<210> 12

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DvaF蛋白质

<400> 12

Met Ser Val Glu Ala Gln Pro Gly Ala Asn Asp Arg Pro Tyr Ser Val

1 5 10 15

Arg His Glu Ile Thr Gln Gly Ala Leu Leu Ile Leu Pro Ala Gly Leu

20 25 30

Gly Met Ile Pro Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Leu Val Val Gln Ser

35 40 45

Gly Leu Pro Trp Trp Met Ala Pro Ala Leu Ser Phe Phe Ala Tyr Ala

50 55 60

Gly Ser Leu Glu Leu Leu Leu Ile Thr Leu Ile Thr Ser Leu Thr Pro

65 70 75 80

Leu Val Thr Ile Ala Ala Ala Ser Phe Phe Val Asn Phe Arg His Val

85 90 95

Phe Tyr Ala Phe Asn Phe Pro Leu Lys Val Val Thr Asn Pro Phe Leu

100 105 110

Lys Phe Tyr Ala Met Tyr Ser Leu Thr Asp Glu Ile Phe Ala Val Thr

115 120 125

Val Ala Asn Pro Lys Gly Trp Thr Gln Pro Arg Val Ile Ser Ala Gly

130 135 140

Ala Val Leu Gln Ile Cys Trp Val Gly Gly Gly Leu Met Gly Val Leu

145 150 155 160

Leu Ser Ser Phe Ile Pro Phe Gln Ile Arg Gly Leu Ser Phe Ala Leu

165 170 175

Cys Ala Leu Phe Ile Thr Leu Thr Leu Asp Ala Cys Arg Thr Lys Gln

180 185 190

Glu Ile Pro Ser Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ala Phe Gly Phe Ala Leu

195 200 205

Leu Leu Leu Pro Ser Gln Pro Ile Phe Ala Ala Met Ile Gly Phe Val

210 215 220

Ala Thr Leu Ala Ala Arg Tyr Thr Ile Ala Val Arg Leu Thr Arg Pro

225 230 235 240

Leu Pro Ala Glu Met Glu Ser Asp Asp Ala Ala

245 250

<210> 13

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DvaE蛋白质

<400> 13

Met Gln Leu Asp Ile Pro Phe Trp Tyr Leu Ala Ser Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ala Phe Ala Val Thr Phe Thr Leu Arg Ala Leu Pro Phe Ala Ile Leu

20 25 30

Glu Pro Leu Arg Lys Ser Gln Phe Val Arg Val Met Ala Val Trp Met

35 40 45

Pro Ala Gly Ile Leu Val Ile Leu Ala Leu Ala Thr Phe Lys Ser Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Glu Pro Gly Gly Leu Val His Leu Leu Ile Ala Ser Gly

65 70 75 80

Val Thr Ile Ala Val His Leu Phe Gly Gly Arg Arg Thr Leu Val Ser

85 90 95

Val Ala Ala Gly Thr Leu Ala Phe Val Leu Leu Val Asn Phe Phe

100 105 110

<210> 14

<211> 1081

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> dvaFE基因

<400> 14

atgagcgttg aggcgcagcc tggcgcaaac gaccgaccct atagcgtgcg ccacgagatc 60

acgcagggcg cactcctgat tctccccgca gggctcggaa tgattccgat cggcattgcc 120

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cttgtaacga tcgctgcggc atcgttcttc gtgaacttcc gccacgtgtt ctacgcgttt 300

aatttcccgc tcaaggtcgt cacgaacccg ttcttgaagt tctacgcgat gtactccctc 360

accgacgaga tcttcgcggt aacggttgcc aatccaaagg ggtggacgca gccgcgcgtg 420

atctcggcag gggccgtact ccagatctgc tgggtgggtg gcggcctcat gggggtactg 480

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atcacgctga ccctcgatgc gtgccgcacg aaacaggaga tcccgtcact tctcctcggt 600

gctgccgcct tcggtttcgc gctccttttg ctcccgagcc agccgatctt cgccgcgatg 660

attggcttcg tggcgaccct cgccgcgcgc tacacgatcg ccgtgcgcct cacgaggcca 720

ctcccggcag agatggagag cgacgatgca gcttgacatc cccttctggt atctcgcctc 780

ggttctcctc atcgccttcg ccgtgacctt cacgctgcgc gcgctcccgt tcgcgattct 840

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cctcgtgatc ctcgcgctcg cgacctttaa gagcaccctc gccgaggaac ccggtggtct 960

cgttcacctg ctgatcgcct caggagtcac gattgccgtg cacctcttcg gtggtcgccg 1020

caccctcgtg agcgtcgccg cgggcaccct cgccttcgtg ctgctcgtga actttttcta 1080

a 1081

<210> 15

<211> 409

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PgapA

<400> 15

tctgagactt taatttgtgg attcacgggg gtgtaatgta gttcataatt aaccccattc 60

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caagtgttgg aaatgccccc gtttggggtc aatgtccatt tttgaatgtg tctgtatgat 180

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ttgactcgac gaattatcca atgtgagtag gtttggtgcg tgagttggaa aaattcgcca 300

tactcgccct tgggttctgt cagctcaaga attcttgagt gaccgatgct ctgattgacc 360

taactgcttg acacattgca tttcctacaa tctttagagg agacacaac 409

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 16

gtacccgggg atcctctaga caaagccgaa gagaagttgg 40

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 17

gcatagagta ctcggcgccc ataaatttca 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 18

gcgccgagta ctctatgccg agaagttgaa 30

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 19

gcctgcaggt cgactctaga ctgggcatca cactattttt 40

<210> 20

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> del-N2131L

<400> 20

gtacccgggg atcctctaga caaagccgaa gagaagttgg cttgacggac ccgaaattcc 60

agctgatttt gacgatcctg atgcacccgg caggtggcct ggcgaaaagt tggggcttcc 120

tcaagaaggg gccggctctc tgtcctcagt ggctcgtcgt atcggcgggg tctgcgtgga 180

ctggggtgtt tcctgggtta ttgctattgt gctgtccaat ttcacggatg tgctgggcga 240

tgtagcgaca tccacgctca ttattttcgt gatcctgggt tggcttaccg gttggatctt 300

tgctcgcacc ccaggtcatg ccgtgtttgg catgggcctt gcgcgtgtgg atgcagagga 360

acgtgtgggc tggtggcgtg cgctggttcg cccactgctg acgatcttga ttctgcctgc 420

cgtgatggtg gatgctgacg gccgtgggct ccacgacaag gcaacgggaa ctgcagttat 480

ccgcgggtaa tttgtcttga gtgaaattta tgggcgccga gtactctatg c 531

<210> 21

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> del-N2131R

<400> 21

gcgccgagta ctctatgccg agaagttgaa cagcaatctt gcagcaactc ctcagtattc 60

acaccagccc caatggacac aaaaacatca gccccagaat cgcccctaag ggcctcaaat 120

acacgatctg gaccaactag tcatcgggaa aacccaaccc cttaaatcgc cttctgcgct 180

taaggggtca atgctagata agtaggaaca acaacgtttg ggcggccagg atctttgcga 240

tcatcgccag cggatacaca gaggtataac ccatggcagg gagctcgttg cgggaggcat 300

ctgacacata actcagcaca gcagggtggg tttgcgtacc ggcgaggatg ccagcggttt 360

caccgaaggg gattttcatc agtttgtggc caacgaacag caccgtgatg gagatgaaca 420

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gaaatcctgc gcccgctgag gtaccgatgg cagccaaaaa tagtgtgatg cccagtctag 540

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<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 22

aggagacaca acatgaagag caagaacgca 30

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 23

tcaacttctc ggcatagagt ctattggttc tgaggtgggc 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 24

gaaatttatg ggcgccgagt tctgagactt taatttgtgg 40

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 25

cttgctcttc atgttgtgtc tcctctaaag 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 26

aggagacaca acatgcaaag cacgcgtaag 30

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 27

tcaacttctc ggcatagagt tcattgcttc cagacacggt 40

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 28

cgtgctttgc atgttgtgtc tcctctaaag 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 29

aggagacaca acatggataa gaaaagagcg 30

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 30

tcaacttctc ggcatagagt ttagggacgg cgggtggcgt 40

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 31

tttcttatcc atgttgtgtc tcctctaaag 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 32

aggagacaca acatgtcaac gctgtctatc 30

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 33

tcaacttctc ggcatagagt ctaggtcaac agcagcttaa 40

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 34

cagcgttgac atgttgtgtc tcctctaaag 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 35

aggagacaca acatgtctcc gtcacacgat 30

<210> 36

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 36

tcaacttctc ggcatagagt ctagaaaaag ttgagcagca 40

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 37

tgacggagac atgttgtgtc tcctctaaag 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 38

aggagacaca acatgagcgt tgaggcgcag 30

<210> 39

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 39

tcaacttctc ggcatagagt ttagaaaaag ttcacgagca 40

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 40

ctcaacgctc atgttgtgtc tcctctaaag 30

<210> 41

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HmaF蛋白质

<400> 41

Met Ser Val Ala Ala Gln Pro Ser Ala His Glu His Pro Tyr Ser Val

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Gly Met Ile Pro Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Leu Val Val Gln Ser

35 40 45

Gly Leu Pro Trp Trp Met Ala Pro Ala Leu Ser Phe Phe Ala Tyr Ala

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Gly Ser Leu Glu Leu Leu Leu Ile Thr Leu Ile Thr Ser Leu Thr Pro

65 70 75 80

Leu Val Thr Ile Ala Ala Ala Ser Phe Phe Val Asn Phe Arg His Val

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Phe Tyr Ala Phe Asn Phe Pro Leu Lys Val Val Lys Asn Pro Phe Leu

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Lys Phe Tyr Ala Met Tyr Ser Leu Thr Asp Glu Ile Phe Ala Val Thr

115 120 125

Val Ala His Pro Lys Gly Trp Thr Gln Pro Arg Val Ile Ser Ala Gly

130 135 140

Ala Val Leu Gln Ile Cys Trp Val Gly Gly Gly Leu Met Gly Val Leu

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Leu Ser Ser Phe Ile Pro Phe Gln Ile Arg Gly Leu Ser Phe Ala Leu

165 170 175

Cys Ala Leu Phe Ile Thr Leu Thr Leu Asp Ala Cys Arg Thr Lys Gln

180 185 190

Glu Leu Pro Ser Leu Val Leu Gly Ala Ala Ala Phe Gly Leu Ala Leu

195 200 205

Leu Leu Met Pro Gly Gln Pro Ile Phe Ala Ala Met Ile Gly Phe Val

210 215 220

Ala Thr Leu Ala Ala Arg Tyr Thr Ile Ala Val Arg Leu Thr Arg Pro

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Leu Pro Ala Glu Met Glu Gly Asp Asp Ala Ala

245 250

<210> 42

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HmaE蛋白质

<400> 42

Met Gln Leu Asp Ile Pro Phe Trp Tyr Leu Ala Ser Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ala Phe Ala Val Thr Phe Thr Leu Arg Ala Leu Pro Phe Ala Ile Leu

20 25 30

Glu Pro Leu Arg Lys Ser Gln Phe Val Arg Val Met Ala Val Trp Met

35 40 45

Pro Ala Gly Ile Leu Val Ile Leu Ala Leu Ala Thr Phe Lys Ser Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Glu Pro Gly Ser Val Ile His Leu Leu Ile Ala Ser Ala

65 70 75 80

Val Thr Ile Ala Val His Leu Leu Phe Gly Arg Arg Thr Leu Val Ser

85 90 95

Val Ala Ala Gly Thr Leu Ala Phe Val Leu Leu Val Asn Phe Phe

100 105 110

<210> 43

<211> 1081

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hmaFE基因

<400> 43

atgagcgttg cggcgcagcc tagcgcacat gagcatccct attcggtgcg ccatgaaatc 60

acgcaggggg cgctcttgat tctccccgcg ggcctcggca tgatcccgat tggcatcgct 120

tttggccttc ttgttgtgca gtccggactt ccgtggtgga tggcacccgc cctctcattc 180

ttcgcgtacg cgggctcgct cgagcttttg ctcatcacac tcatcacatc gctcacgccg 240

ctcgtgacga tcgctgcggc atcgttcttc gtgaacttcc gccacgtgtt ttacgcgttc 300

aacttcccgc tcaaggtcgt gaagaacccg tttttgaagt tctacgcgat gtactcgctt 360

accgacgaga tcttcgcggt gacggtcgcg cacccgaagg ggtggacgca gccacgcgtc 420

atctccgcgg gcgccgtact ccagatctgc tgggtgggag gcggcctcat gggcgtgctc 480

ctctcgagtt tcattccctt ccagatccgc ggtttgagct tcgccctgtg cgcgcttttc 540

atcaccctga ctctcgatgc gtgccgcacg aagcaagaac ttccgtcgct agttctcggc 600

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atcggcttcg ttgcaacgct cgccgcgcgg tacacgatcg ccgtgcgcct tacgaggccg 720

ctaccggcgg aaatggaggg cgacgatgca gcttgacatc cccttctggt accttgcctc 780

ggttctcctc attgccttcg ccgtcacctt tacgctgcgc gcgctcccgt tcgcgatcct 840

cgaaccgctg cgcaaatccc agttcgtgcg cgtcatggcc gtgtggatgc ccgcgggcat 900

cctcgtcatt ctcgcgctcg cgaccttcaa aagcaccctc gctgaggaac ccggcagcgt 960

cattcatttg ctcattgcct cggccgtcac gatcgctgtg catcttctct ttgggcgccg 1020

aaccctcgtg agtgtcgccg cgggtaccct cgccttcgtg ctcctcgtga acttcttcta 1080

a 1081

<210> 44

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MabF蛋白质

<400> 44

Met Ser Val Glu Ala Gln Pro Gly Ala His Glu Arg Pro Tyr Ser Val

1 5 10 15

Arg His Glu Ile Thr Gln Gly Ala Leu Leu Ile Leu Pro Ala Gly Leu

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Gly Met Ile Pro Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Leu Val Val Gln Ser

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Gly Leu Pro Trp Trp Met Ala Pro Ala Leu Ser Phe Phe Ala Tyr Ala

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Gly Ser Leu Glu Leu Leu Leu Ile Thr Leu Ile Thr Ser Leu Thr Pro

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Leu Val Thr Ile Ala Ala Ala Ser Phe Phe Val Asn Phe Arg His Val

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Phe Tyr Ala Phe Asn Phe Pro Leu Lys Val Val Lys Asn Pro Phe Leu

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115 120 125

Val Ala Asn Pro Lys Gly Trp Thr Gln Pro Arg Val Ile Ser Ala Gly

130 135 140

Ala Val Leu Gln Ile Cys Trp Val Gly Gly Gly Leu Met Gly Val Leu

145 150 155 160

Leu Ser Ser Phe Ile Pro Phe Gln Ile Arg Gly Leu Ser Phe Ala Leu

165 170 175

Cys Ala Leu Phe Ile Thr Leu Thr Leu Asp Ala Cys Arg Thr Lys Gln

180 185 190

Glu Ile Pro Ser Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ala Phe Gly Leu Ala Leu

195 200 205

Leu Leu Leu Pro Ser Gln Pro Ile Phe Ala Ala Met Ile Gly Phe Val

210 215 220

Ala Thr Leu Ala Ala Arg Tyr Thr Ile Ala Val Arg Leu Thr Arg Pro

225 230 235 240

Leu Pro Ala Glu Met Glu Ser Asp Asp Ala Ala

245 250

<210> 45

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MabE蛋白质

<400> 45

Met Gln Leu Asp Ile Pro Phe Trp Tyr Leu Ala Ser Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ala Phe Ala Val Thr Phe Thr Leu Arg Ala Leu Pro Phe Ala Ile Leu

20 25 30

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50 55 60

Leu Ala Glu Glu Pro Gly Gly Leu Val His Leu Leu Ile Ala Ser Ala

65 70 75 80

Val Thr Ile Ala Val His Leu Phe Gly Gly Arg Arg Thr Leu Val Ser

85 90 95

Val Ala Ala Gly Thr Leu Ala Phe Val Leu Leu Val Asn Phe Phe

100 105 110

<210> 46

<211> 1081

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mabFE基因

<400> 46

atgagcgttg aggcgcagcc tggcgcacac gagcgaccct actcggtgcg ccacgaaatc 60

acgcagggcg cgctcctgat tctccccgca ggtctcggca tgatcccgat cggtatcgcc 120

ttcggcctgc ttgtggtgca gtcggggctc ccgtggtgga tggcgcccgc cctctcgttt 180

ttcgcgtacg cgggctcact cgagcttctg ctcatcacgc tcatcacgtc gcttacccca 240

ctggtgacga tcgcggcggc atcgttcttc gtgaacttcc gccacgtgtt ctacgcgttc 300

aactttccac tcaaggtcgt gaagaacccg tttttgaagt tctacgcgat gtattcgctg 360

accgacgaaa tcttcgcggt cacggtcgcg aacccaaagg ggtggaccca gccgcgcgtg 420

atctcggcag gggccgtact ccagatctgc tgggtgggtg gcggcctcat gggggtactg 480

ctctcgagct tcatcccctt ccagatccgc ggcctgagtt tcgcgctgtg cgccctgttc 540

atcacgctga ccctcgatgc gtgccgcaca aaacaggaga tcccgtcact tctcctcggc 600

gctgccgcct tcggcctcgc gcttcttttg ctcccgagcc agccgatctt cgcggcgatg 660

attggcttcg ttgcgaccct cgcggctcgc tacacgatcg ccgtacgcct cacgaggcca 720

ctcccggcag agatggagag cgacgatgca gcttgacatc cccttctggt acctcgcctc 780

ggttctcctc atcgccttcg ccgttacttt tacgctgcgc gcgctcccgt tcgcgatcct 840

cgaaccactg cgcaaatcgc aattcgtgcg cgtcatggcc gtgtggatgc ccgcgggcat 900

cctcgtcatt ctggcgctcg cgaccttcaa gagcaccctc gccgaggaac ccggtggtct 960

cgttcacctg ctgatcgcct cagccgtcac gatcgccgtg cacctcttcg gtggtcgccg 1020

aaccctcgtg agcgtcgccg cgggcaccct cgccttcgtg ctgctcgtga acttcttcta 1080

a 1081

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 47

aggagacaca acatgagcgt tgcggcgcag 30

<210> 48

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 48

tcaacttctc ggcatagagt ttagaagaag ttcacgagga 40

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 49

cgcaacgctc atgttgtgtc tcctctaaag 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 50

aggagacaca acatgagcgt tgaggcgcag 30

<210> 51

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 51

tcaacttctc ggcatagagt ttagaagaag ttcacgagca 40

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 52

ctcaacgctc atgttgtgtc tcctctaaag 30

<210> 53

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PyccA

<400> 53

ttccagatca aatgcgtaaa gatgggtaaa acttctgggt gcccttacgc attatcatta 60

tgctgcttaa ttaattacat ctgtcataga gagtgactca 100

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 54

gagagtgact caatgagcgt tgaggcgcag 30

<210> 55

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 55

cgggtaccga gctcgaattc ttagaaaaag ttcacgagca 40

<210> 56

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 56

actcactata gggcgaattc ttccagatca aatgcgtaaa 40

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 57

ctcaacgctc attgagtcac tctctatgac 30

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 58

gagagtgact caatgagcgt tgcggcgcag 30

<210> 59

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 59

cgggtaccga gctcgaattc ttagaagaag ttcacgagga 40

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 60

cgcaacgctc attgagtcac tctctatgac 30

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 61

gagagtgact caatgagcgt tgaggcgcag 30

<210> 62

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 62

cgggtaccga gctcgaattc ttagaagaag ttcacgagca 40

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 63

ctcaacgctc attgagtcac tctctatgac 30

<210> 64

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> dvaF基因

<400> 64

atgagcgttg aggcgcagcc tggcgcaaac gaccgaccct atagcgtgcg ccacgagatc 60

acgcagggcg cactcctgat tctccccgca gggctcggaa tgattccgat cggcattgcc 120

ttcggcctgc ttgtggtgca atcggggctc ccgtggtgga tggcacccgc cctttcgttc 180

ttcgcgtacg cgggctcact cgagcttctg ctcatcacgc tcatcacgtc gcttacgccg 240

cttgtaacga tcgctgcggc atcgttcttc gtgaacttcc gccacgtgtt ctacgcgttt 300

aatttcccgc tcaaggtcgt cacgaacccg ttcttgaagt tctacgcgat gtactccctc 360

accgacgaga tcttcgcggt aacggttgcc aatccaaagg ggtggacgca gccgcgcgtg 420

atctcggcag gggccgtact ccagatctgc tgggtgggtg gcggcctcat gggggtactg 480

ctctcgagct tcatcccctt ccagatccgc ggcctgagtt tcgcgctgtg cgccctgttc 540

atcacgctga ccctcgatgc gtgccgcacg aaacaggaga tcccgtcact tctcctcggt 600

gctgccgcct tcggtttcgc gctccttttg ctcccgagcc agccgatctt cgccgcgatg 660

attggcttcg tggcgaccct cgccgcgcgc tacacgatcg ccgtgcgcct cacgaggcca 720

ctcccggcag agatggagag cgacgatgca gcttga 756

<210> 65

<211> 335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> dvaE基因

<400> 65

atgcagcttg acatcccctt ctggtatctc gcctcggttc tcctcatcgc cttcgccgtg 60

accttcacgc tgcgcgcgct cccgttcgcg attctcgaac cactgcgcaa atcgcaattc 120

gtgcgcgtca tggccgtgtg gatgcccgcg ggcatcctcg tgatcctcgc gctcgcgacc 180

tttaagagca ccctcgccga ggaacccggt ggtctcgttc acctgctgat cgcctcagga 240

gtcacgattg ccgtgcacct cttcggtggt cgccgcaccc tcgtgagcgt cgccgcgggc 300

accctcgcct tcgtgctgct cgtgaacttt ttcta 335

<210> 66

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hmaF基因

<400> 66

atgagcgttg cggcgcagcc tagcgcacat gagcatccct attcggtgcg ccatgaaatc 60

acgcaggggg cgctcttgat tctccccgcg ggcctcggca tgatcccgat tggcatcgct 120

tttggccttc ttgttgtgca gtccggactt ccgtggtgga tggcacccgc cctctcattc 180

ttcgcgtacg cgggctcgct cgagcttttg ctcatcacac tcatcacatc gctcacgccg 240

ctcgtgacga tcgctgcggc atcgttcttc gtgaacttcc gccacgtgtt ttacgcgttc 300

aacttcccgc tcaaggtcgt gaagaacccg tttttgaagt tctacgcgat gtactcgctt 360

accgacgaga tcttcgcggt gacggtcgcg cacccgaagg ggtggacgca gccacgcgtc 420

atctccgcgg gcgccgtact ccagatctgc tgggtgggag gcggcctcat gggcgtgctc 480

ctctcgagtt tcattccctt ccagatccgc ggtttgagct tcgccctgtg cgcgcttttc 540

atcaccctga ctctcgatgc gtgccgcacg aagcaagaac ttccgtcgct agttctcggc 600

gccgcggcct tcggtctcgc cctgctcctc atgcccgggc agccgatctt tgccgcgatg 660

atcggcttcg ttgcaacgct cgccgcgcgg tacacgatcg ccgtgcgcct tacgaggccg 720

ctaccggcgg aaatggaggg cgacgatgca gcttga 756

<210> 67

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hmaE基因

<400> 67

atgcagcttg acatcccctt ctggtacctt gcctcggttc tcctcattgc cttcgccgtc 60

acctttacgc tgcgcgcgct cccgttcgcg atcctcgaac cgctgcgcaa atcccagttc 120

gtgcgcgtca tggccgtgtg gatgcccgcg ggcatcctcg tcattctcgc gctcgcgacc 180

ttcaaaagca ccctcgctga ggaacccggc agcgtcattc atttgctcat tgcctcggcc 240

gtcacgatcg ctgtgcatct tctctttggg cgccgaaccc tcgtgagtgt cgccgcgggt 300

accctcgcct tcgtgctcct cgtgaacttc ttctaa 336

<210> 68

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mabF基因

<400> 68

atgagcgttg aggcgcagcc tggcgcacac gagcgaccct actcggtgcg ccacgaaatc 60

acgcagggcg cgctcctgat tctccccgca ggtctcggca tgatcccgat cggtatcgcc 120

ttcggcctgc ttgtggtgca gtcggggctc ccgtggtgga tggcgcccgc cctctcgttt 180

ttcgcgtacg cgggctcact cgagcttctg ctcatcacgc tcatcacgtc gcttacccca 240

ctggtgacga tcgcggcggc atcgttcttc gtgaacttcc gccacgtgtt ctacgcgttc 300

aactttccac tcaaggtcgt gaagaacccg tttttgaagt tctacgcgat gtattcgctg 360

accgacgaaa tcttcgcggt cacggtcgcg aacccaaagg ggtggaccca gccgcgcgtg 420

atctcggcag gggccgtact ccagatctgc tgggtgggtg gcggcctcat gggggtactg 480

ctctcgagct tcatcccctt ccagatccgc ggcctgagtt tcgcgctgtg cgccctgttc 540

atcacgctga ccctcgatgc gtgccgcaca aaacaggaga tcccgtcact tctcctcggc 600

gctgccgcct tcggcctcgc gcttcttttg ctcccgagcc agccgatctt cgcggcgatg 660

attggcttcg ttgcgaccct cgcggctcgc tacacgatcg ccgtacgcct cacgaggcca 720

ctcccggcag agatggagag cgacgatgca gcttga 756

<210> 69

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mabE基因

<400> 69

atgcagcttg acatcccctt ctggtacctc gcctcggttc tcctcatcgc cttcgccgtt 60

acttttacgc tgcgcgcgct cccgttcgcg atcctcgaac cactgcgcaa atcgcaattc 120

gtgcgcgtca tggccgtgtg gatgcccgcg ggcatcctcg tcattctggc gctcgcgacc 180

ttcaagagca ccctcgccga ggaacccggt ggtctcgttc acctgctgat cgcctcagcc 240

gtcacgatcg ccgtgcacct cttcggtggt cgccgaaccc tcgtgagcgt cgccgcgggc 300

accctcgcct tcgtgctgct cgtgaacttc ttctaa 336

Claims

1.一种生产L-组氨酸的微生物，所述微生物被修饰为表达与SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13或其组合具有至少60％序列同源性的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的生产L-组氨酸的微生物，其中，所述蛋白质是外源蛋白质。

3.根据权利要求1所述的生产L-组氨酸的微生物，其中，所述修饰是通过导入编码与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或其组合具有至少60％序列同源性的氨基酸序列的基因进行的。

4.根据权利要求1所述的生产L-组氨酸的微生物，其中，所述蛋白质由SEQ ID NO：12和13、SEQ ID NO：41和42或SEQ ID NO：44和45的氨基酸序列表示。

5.根据权利要求4所述的生产L-组氨酸的微生物，其中，所述修饰是通过导入编码SEQID NO：12和13、SEQ ID NO：41和42或SEQ ID NO：44和45的氨基酸序列的基因进行的。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的生产L-组氨酸的微生物，其中，所述微生物是棒状杆菌属(Corynebacterium)或埃希氏菌属(Escherichia)微生物。

7.根据权利要求6所述的生产L-组氨酸的微生物，其中，所述微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。

8.一种用于生产L-组氨酸的组合物，包含：

与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或其组合具有至少60％序列同源性的蛋白质，

编码所述蛋白质的基因，

包含所述基因的重组载体，或

包含所述基因或所述重组载体的重组微生物。

9.根据权利要求8所述的用于生产L-组氨酸的组合物，其中，所述蛋白质由SEQ ID NO：12和13、SEQ ID NO：41和42或SEQ ID NO：44和45的氨基酸序列表示。

10.根据权利要求8或9所述的用于生产L-组氨酸的组合物，其中，所述微生物是棒状杆菌属或埃希氏菌属微生物。

11.根据权利要求10所述的用于生产L-组氨酸的组合物，其中，所述微生物是谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌。

12.一种用于生产L-组氨酸的方法，包括在培养基中培养根据权利要求1至5中任一项所述的生产L-组氨酸的微生物。

13.根据权利要求12所述的生产L-组氨酸的方法，进一步包括在培养后从培养的微生物或培养基中回收L-组氨酸。

14.根据权利要求12所述的用于生产L-组氨酸的方法，其中，所述微生物是棒状杆菌属或埃希氏菌属微生物。

15.根据权利要求14所述的生产L-组氨酸的方法，其中，所述微生物是谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌。