KR20100095829A

KR20100095829A - 글루타치온을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애의 돌연변이체 및 이를 배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20100095829A
Application number: KR1020090014835A
Authority: KR
Inventors: 이왕식; 김현섭; 이현준; 김상범; 기광석; 김상우; 장정순; 주한승; 서유림; 지유나
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2009-02-23
Filing date: 2009-02-23
Publication date: 2010-09-01

Abstract

본 발명은 글루타치온(glutathione)을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 돌연변이체, 상기 균주를 0.3 ∼ 0.8%의 암모늄 설페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 디포타슘 포스페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 모노포타슘 포스페이트, 1.5 ∼ 2.5%의 TSB(Tryptic Soy Broth), 2.0 ∼ 3.0%의 폴리펩톤, 1.0 ∼ 2.0%의 수크로오스, 1.0 ∼ 2.0%의 글루코오스, 0.02 ∼ 0.03%의 미오-이노시톨, 0.2 ∼ 0.3mM의 ZnSO₄ 및 0.15 ∼ 0.25%의 L-시스테인을 함유하는 배지에서 30 ∼ 35℃, pH 5.5 ∼ 6.5, 교반속도 200 ∼ 300rpm으로 진탕배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법 및 상기 배양물, 균주 또는 균주로부터 분리한 글루타치온을 함유하는 가축 사료 첨가제에 관한 것으로, 글루타치온을 대량 생산하여 다양한 용도로 사용 가능하며, 가축 사료 첨가제로 사용함으로써 가축의 스트레스 저감 및 생산성 향상 효과를 얻을 수 있었다.

글루타치온, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사료 첨가제, 스트레스 저감, 생산성 향상

Description

글루타치온을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애의 돌연변이체 및 이를 배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법{The mutant of Saccharomyces cerevisiae producing glutathione to high concentrations and the mass production method of glutathione by culturing the mutant of Saccharomyces cerevisiae}

본 발명은 글루타치온을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애의 돌연변이체, 이를 배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법 및 상기 배양물, 균주 또는 균주로부터 분리한 글루타치온을 함유하는 가축 사료 첨가제에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 생막걸리로부터 글루타치온을 고농도로 생산하는 효모를 분리하고, 이 효모를 자외선 조사하여 돌연변이체를 얻고, 상기 균주를 0.3 ∼ 0.8%의 암모늄 설페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 디포타슘 포스페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 모노포타슘 포스페이트, 1.5 ∼ 2.5%의 TSB(Tryptic Soy Broth), 2.0 ∼ 3.0%의 폴리펩톤, 1.0 ∼ 2.0%의 수크로오스, 1.0 ∼ 2.0%의 글루코오스, 0.02 ∼ 0.03%의 미오-이노시톨, 0.2 ∼ 0.3mM의 ZnSO₄ 및 0.15 ∼ 0.25%의 L-시스테인을 함유하는 배지에서 30 ∼ 35℃, pH 5.5 ∼ 6.5, 교반속도 200 ∼ 300rpm으로 진탕배양하여 글루타치온을 대량 생산하며, 상기 배양물, 균주 또는 균주로부터 분리한 글루타치온을 함유하는 가축 사료 첨가제로 사용함으로써 가축의 스트레스 저감 및 생산성 향상 효과를 얻을 수 있고, 글루타치온을 대량 생산하여 다양한 용도로 사용 가능하도록 하는 글루타치온을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애의 돌연변이체, 이를 배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법 및 상기 배양물, 균주 또는 균주로부터 분리한 글루타치온을 함유하는 가축 사료 첨가제에 관한 것이다.

사람을 위시한 각종 동물은 산소를 전자 수용체로 하는 호흡과정을 통하여 에너지를 생성한다. 그러나, 이 산소는 각종 물리적, 화학적 및 환경적 요인에 의하여 다양한 활성산소로 전환될 수 있다. 사람을 비롯한 동물은 항산화 기작을 갖고 있어 산화적 손상으로부터 보호하는 자체의 방어수단을 갖고 있지만(예: superoxide dismutase 등), 호흡 등의 과정에서 광범위하게 일어나는 활성산소에 의한 피해를 완전하게 제거하기에는 충분치 않다. 생체 내 항산화 기작의 결여 혹은 과도한 활성산소의 생성에 의한 활성산소의 축적은 생체 내에서 DNA 및 RNA 손상, 세포 내 각종 단백질의 손상, 세포막 지질의 손상과 같은 산화적 스트레스를 야기하여 노화, 뇌졸증, 암, 파킨스씨 병 등과 같은 각종 질병의 한 원인으로 알려져 있다. 따라서, 자유 라디칼을 제거하거나 과산화물 생성을 억제할 수 있는 화합물, 특히 천연물은 인체 및 가축에 있어서 산화적 스트레스로부터 보호해 줄 수 있을 것으로 판단된다.

글루타치온(L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH)은 세포내 존재하는 생 리활성물질로서 글루타메이트(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine) 의 세가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드로 동물, 식물 및 미생물의 세포내에서 0.1 ~ 10mM의 농도로 존재하며, 세포의 총 비단백질성 활성성분의 90% 이상을 차지하고 있다. 이들의 다양한 기능은 농업 분야 뿐만 아니라 효소학, 수송, 약물학, 치료, 독물학, 내분비학 및 미생물학을 포함하는 많은 의학분야에서 중요한 부분을 차지하고 있다.

생체 내에서 글루타치온(glutathione)은 백혈구 생성을 통한 면역 활성 증가를 야기함으로써 중요한 항바이러스제의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, GST(glutathione S-transferase)의 기질로 작용하여 생체에 해로운 비생체물질(xenobiotics)과 같은 독성물질과 콘쥬게이션되어 해독 작용에 중요한 역할을 한다. 이러한 작용들 중 세포내에서 중요한 항산화 기능을 하는 성분으로서 환원형 글루타치온(reduced glutathione)이 널리 알려져 있다.

환원형 글루타치온은 3개의 펩타이드(γ-L-Glu-Cys_Gly; G-SH)로 구성된 비 단백질성 티올(-SH)화합물로, 세포내에서 산화형(G-S-S-G)과 환원형(G-SH)으로 존재하면서 산화에 의한 세포벽의 보호, 세포 증식, 독성물질의 해독 등 생체 내에서 중요한 생리활성을 나타내고 있어 세포내의 환원형 글루타치온의 농도와 성인 질병과의 연관성에 대한 많은 결과가 보고되고 있다. 따라서, 글루타치온은 제약 산업에서도 광범위하게 사용될 뿐만 아니라 식품첨가제, 사료첨가제 및 화장품 첨가제로도 그 응용 범위를 넓혀 가고 있다.

글루타치온은 세포 방어에서 뿐만 아니라 다양한 대사 과정에서 결정적인 역 할을 한다. 그것은 단백질과 다른 분자들과의 이황화물 결합의 환원, DNA의 옥시리보뉴클레오타이드 전구물질의 합성, 대사작용의 다양한 단계에서 형성되는 많은 활성 산소 매개체(예를 들면, 과산화물) 및 자유 라디칼(free radical)의 해로운 효과로부터 세포 보호를 수행한다. 글루타치온 대사작용에서의 효소 작용 및 수송 작용은 "Meister 'Selective Modification of Glutathione Metabolism', Science, volume 220, No.4596,472-477 (1983)"에 기재되어 있다.

글루타치온은 1888년 Baker's yeast의 효모 추출물에서 처음 발견된 이래로 동물, 식물을 포함하는 거의 모든 생물에서 발견되지만, 세포내에서 그 함량이 매우 낮고 최종 산물이 고가여서 산업적으로 적용하는 데에는 많은 문제점을 내포하고 있다. 약 70년 전에 글루타치온이 화학적으로 합성되었지만 D- 및 L-형의 광학이성질체의 혼합물로 합성되어 실제적으로 생물학적으로 활성이 있는 L-글루타치온만을 얻을 수 없어 이들 광학이성질체를 분리해야 하는 추가 공정이 필요하였다.

그러나, 최근 효모나 재조합 미생물을 이용한 생물공학적 기법에 의해 글루타치온을 대량으로 생산하는 노력이 활발하게 이루어지고 있다. 효모를 이용한 글루타치온의 생산에는 전구체들(글루타메이트(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine))과 에탄올 및 젖산 등을 배지에 첨가하는 방법, 글루타치온 생산균주를 고정화시켜 생산하는 방법, 유전공학 기술을 활용하여 재조합된 미생물에서 글루타치온 생합성 효소를 이용하여 글루타치온을 생산하는 공정이 개발되었다.

이들 방법 중에서 미생물인 효모를 이용하여 합성 전구물질인 글루타메이트, 시스테인 및 글라이신과 탄소원으로서 포도당 및 당밀 등을 배지에 첨가하여 글루 타치온을 생산하는 방법이 현재 많이 활용되고 있다.

미국 특허 제4,582,801호에는 탄소, 질소 및 무기염의 동화할 수 있는 공급원을 포함하는 배양 배지에서, GSH를 생산하는 능력 및 1,2,4-트리아졸 또는 아지드화 나트륨에 대한 내성을 갖는 사카로마이시스(Saccharomyces)속에 속하는 균주를 배양하여, 미생물 세포내에 GSH를 축적시켜서, 세포를 수거하고, 이로부터 GSH를 회수함을 포함하여, 높은 수율(건조 세포 기준으로 약 3 ∼ 4% 및 약 0.7 ∼ 0.9%g/ℓ)로 GSH를 생산하는 방법이 기재되어 있다.

프랑스 특허 제2,692,280호에는 건조중량을 기준으로 4.1 ∼ 6.6%의 GSH를 얻을 수 있는 발효과정에서 사카로마이시스 속에 속하는 아연에 내성을 가진 효모의 사용을 기술하고 있다. 더 높은 함량은 바이오매스의 생산에는 부정적인 영향을 끼치는 반면에 발효과정동안 GSH의 축적을 개선시키는 것으로 알려진 L-시스테인을 사용하여 얻을 수 있다.

유데 케이. 오. 및 아크레모이츠 비.는 문헌[참조 : 'High-gltathione containing yeast Saccharomyces cerevisiae:optimization of production', Acta Microbiologica Polonica, 1997, vol.46, No.1, 105-114]에서 GSH를 고함량으로 함유하는 효모 에스. 세레비지애 S-8H를 사용하여, 1.6g/ℓ의 GSH 평균 수율 및 건조 바이오매스 17㎎/g의 GSH함량을 수득하는 GSH 수율을 극대화하는 방법에 대해서 논의하고 있다.

치-지엔 리우 등은 문헌[참조: 'Medium optimization for glutathione production by Saccharomyces cerevisiae',Process Biology, vol.34, 1999, 17-23] 에서 효모 균주에서 글루코오스, 펩톤 및 황산 마그네슘이 세포 성장과 GSH생산에 적합하고, GSH생산은 평균 26 ∼ 28㎎/ℓ까지, 최고치는 124.93㎎/ℓ에 이른다고 보고하였다.

알파파라 씨. 등은 문헌[참조: 'Cysteine addition strategy for maximum glutathione production in fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae', Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 37, 141-146]에서 발효 기간동안, 약 0.8 g/ℓ에 이르는 총 GSH 생산을 극대화하기 위해서 반응기에서 일정한 시스테인 농도를 유지시켜야 한다고 제시하였다.

그러나, 항산화 효과를 비롯하여 다양한 생리활성을 갖는 글루타치온을 쉽고 단순한 공정을 통하여 글루타치온을 생산하는 방법이 필요한 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 글루타치온(glutathione)을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 돌연변이체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 목적의 균주를 배양하여 단순한 공정으로 글루타치온을 대량 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 목적의 방법으로 배양된 배양액 전체 또는 분리된 균주 혹은 균주로부터 얻은 글루타치온을 함유하는 사료 첨가제를 제공하는 데 있다.

상기 목적들 뿐만 아니라 용이하게 표출될 수 있는 또 다른 목적들을 용이하게 달성하기 위하여 본 발명에서는 생막걸리로부터 글루타치온을 고농도로 생산하는 효모를 분리하고, 이 효모를 자외선 조사하여 돌연변이체를 얻고, 상기 균주를 0.3 ∼ 0.8%의 암모늄 설페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 디포타슘 포스페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 모노포타슘 포스페이트, 1.5 ∼ 2.5%의 TSB(Tryptic Soy Broth), 2.0 ∼ 3.0%의 폴리펩톤, 1.0 ∼ 2.0%의 수크로오스, 1.0 ∼ 2.0%의 글루코오스, 0.02 ∼ 0.03%의 미오-이노시톨, 0.2 ∼ 0.3mM의 ZnSO₄ 및 0.15 ∼ 0.25%의 L-시스테인을 함유하는 배지에서 30 ∼ 35℃, pH 5.5 ∼ 6.5, 교반속도 200 ∼ 300rpm으로 진탕배양하여 글루타치온을 대량 생산하며, 상기 배양물, 균주 또는 균주로부터 분리한 글루타치온을 함유하는 가축 사료 첨가제로 사용함으로써 가축의 스트레스 저감 및 생산성 향상 효과를 얻을 수 있고, 글루타치온을 대량 생산하여 다양한 용도로 사용 가능하도록 하는 효과를 얻을 수 있었다.

본 발명은 간단한 공정으로 글루타치온을 대량 생산하여 다양한 용도로 사용 가능하도록 하고, 배양물, 균주 또는 균주로부터 분리한 글루타치온을 함유하는 가축 사료 첨가제로 사용함으로써 가축의 스트레스 저감 및 생산성 향상 효과를 얻을 수 있었다.

본 발명에 따른 글루타치온을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애의 돌연변이체는 생막걸리로부터 분리한 것으로서 가장 높은 글루타치온의 활성을 보이는 사카로마이세스 세레비시애 균주와 자외선 광원간의 거리를 25 ~ 35cm로 맞춘 후 50 ∼ 60초 동안 자외선을 조사한 후, 생존하는 균주로부터 가장 높은 글루타치온의 활성을 보이는 균주를 선별한 것으로 특징지워진다.

본 발명에 따른 글루타치온을 대량 생산하는 방법은 글루타치온(glutathione)을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 돌연변이체 균주를 0.3 ∼ 0.8%의 암모늄 설페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 디포타슘 포스페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 모노포타슘 포스페이트, 1.5 ∼ 2.5%의 TSB(Tryptic Soy Broth), 2.0 ∼ 3.0%의 폴리펩톤, 1.0 ∼ 2.0%의 수크로오스, 1.0 ∼ 2.0%의 글루코오스, 0.02 ∼ 0.03%의 미오-이노시톨, 0.2 ∼ 0.3mM의 ZnSO₄ 및 0.15 ∼ 0.25%의 L-시스테인을 함유하는 배지에서 30 ∼ 35℃, pH 5.5 ∼ 6.5, 교반속도 200 ∼ 300rpm으로 진탕배양하는 것으로 특징지워진다.

또한, 본 발명에 따른 사료 첨가제는 글루타치온(glutathione)을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 돌연변이체 균주를 0.3 ∼ 0.8%의 암모늄 설페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 디포타슘 포스페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 모노포타슘 포스페이트, 1.5 ∼ 2.5%의 TSB(Tryptic Soy Broth), 2.0 ∼ 3.0%의 폴리펩톤, 1.0 ∼ 2.0%의 수크로오스, 1.0 ∼ 2.0%의 글루코오스, 0.02 ∼ 0.03%의 미오-이노시톨, 0.2 ∼ 0.3mM의 ZnSO₄ 및 0.15 ∼ 0.25%의 L-시스테인을 함유하는 배지에서 30 ∼ 35℃, pH 5.5 ∼ 6.5, 교반속도 200 ∼ 300rpm으로 진탕배양한 배양물, 상기 배양물로부터 분리한 균주 또는 상기 균주로부터 분리한 글루타치온을 함유하는 것으로 특징지워진다.

본 발명자들은 전국 각지로부터 수집한 막걸리로부터 주조에 이용된 효모, 즉 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 분리한 후. 그들의 글루타치온 활성을 측정하였다. 그 결과, 경북 군위군 부계면 소재의 팔공산 주조장에서 주조된 팔공산 생막걸리로부터 분리한 사카로마이세스 세레비시애가 가장 높은 글루타치온의 활성을 보이는 것으로 확인하였다. 본 발명자들은 상기 팔공산 생막걸리에서 분리한 글루타치온을 고발현하는 사카로마이세스 세레비시애를 “yeast 54-8”이라고 명명하였고, yeast 54-8을 돌연변이시켜 돌연변이체는 생산하였으며, 이를 “yeast 54-8m”이라고 명명하였다.

상기 돌연변이는 “yeast 54-8” 균주와 자외선 광원간의 거리를 25 ~ 35cm로 맞춘 후 50 ∼ 60초 동안 30㎼/㎠ 파장의 자외선을 조사한 다음, 생존 균주 중에서 글루타치온을 가장 고농도로 생성하는 균주를 선별하는 방법으로 행하였다.

자외선 조사시 균주와 자외선 광원과의 거리 및 조사되는 자외선의 파장은 특별히 한정되는 것은 아니며, 돌연변이체를 유발하기 위한 자외선 조사시 통상적으로 사용되는 것으로서 반복실험을 통하여 적절히 조절될 수도 있다.

본 발명에서 얻어지는 사카로마이세스 세레비시애 돌연변이체 “yeast 54-8m” 균주는 반복 재현성있게 생성되므로 균주 기탁은 행하지 않았다.

글루타치온의 대량 생산을 위하여 본 발명에서는 “yeast 54-8m” 균주를 0.3 ∼ 0.8%의 암모늄 설페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 디포타슘 포스페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 모노포타슘 포스페이트, 1.5 ∼ 2.5%의 TSB(Tryptic Soy Broth), 2.0 ∼ 3.0%의 폴리펩톤, 1.0 ∼ 2.0%의 수크로오스, 1.0 ∼ 2.0%의 글루코오스, 0.02 ∼ 0.03%의 미오-이노시톨, 0.2 ∼ 0.3mM의 ZnSO₄ 및 0.15 ∼ 0.25%의 L-시스테인을 함유하는 배지에서 배양하는 것이 좋은 결과를 나타내었다.

보다 바람직하게는 0.5% 암모늄 설페이트, 0.5% 디포타슘 포스페이트, 0.5% 모노포타슘 포스페이트, 2.0% TSB(Tryptic Soy Bean), 2.5% 폴리펩톤, 1.5% 수크로오스, 1.0% 글루코오스, 0.025% 미오-이노시톨, 0.25mM ZnSO₄ 및 0.2% L-시스테인을 함유하는 배지에서 배양하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 배지 성분은 다양한 탄소원, 질소원 등의 영양성분을 투입하고 “yeast 54-8m” 균주를 배양하면서 최적의 생욱 및 최고 농도의 글루타치온 생성이 가능한 영양성분 및 농도를 선정한 것이지만, “yeast 54-8m” 균주의 생육에 지장을 초래하지 않고 글루타치온의 생성이 저하되지 않는다면 상기 성분 이외의 다른 성분들이 추가로 첨가될 수도 있다.

상기 배지의 구성성분은 미국의 Sigma사를 비롯한 여러 화합물 제조 회사로부터 용이하게 입수 가능하다.

상기 배지에서 배양할 때 온도는 30 ∼ 35℃, 바람직하게는 32℃, pH는 5.5 ∼ 6.5, 바람직하게는 6.0으로 설정하는 것이 효과적이다. 진탕 배양기를 이용할 경우에는 교반속도를 200 ∼ 300rpm으로 유지하는 것이 바람직하다.

상기 배양 온도가 30℃ 미만이거나 35℃를 초과할 경우, 또는 pH는 5.5 미만이거나 6.5를 초과할 경우에는 균주의 생육이 양호하지 못할 뿐만 아니라 글루타치온의 생성 농도도 낮은 단점이 있다.

본 발명에서 사용되는 사카로마이세스 세레비시애 돌연변이체 “yeast 54-8m” 균주는 전술된 배지와 글루타치온의 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에, 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 혹은 대규모 발효, 셰이킹 플라스크 배양 등으로 배양할 수 있다.

한편, 본 발명의 사카로마이세스 세레비시애 돌연변이체의 배양물 또는 그로부터 분리한 사카로마이세스 세레비시애 돌연변이체 자체 또는 이들로부터 분리한 글루타치온 자체를 함유시켜 사료 첨가제를 제조할 수 있다.

여기서, 사카로마이세스 세레비시애 돌연변이체의 배양물로부터 균주만을 분리하는 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 실시할 수 있다.

그러나, 글루타치온은 세포내 물질이므로 배양물 또는 균주로부터 글루타치온을 분리하기 전에 균주를 용균시키는 것이 좋다. 균주의 용균은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법 예를 들어, 용균용 완충용액, 소니케이터, 열 처리 및 후렌치 프레서 등에 의해 달성 가능하다.

사카로마이세스 세레비시애 돌연변이체의 배양물 또는 이의 균주로부터 글루타치온을 분리하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함한 전통적인 방법에 의하여 분리할 수 있다. 더 나아가, 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, SDS-PAGE를 포함하여 일반에 공지된 다양한 방법을 통해서 분리 가능하다.

또한, 본 발명의 사료 첨가제를 사료에 배합하여 첨가하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

사료에는 일반 볏짚, 야초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1 : 자외선에 의한 yeast 54-8의 돌연변이

냉동 보관 중인 yeast 54-8 균주를 하기 표 1에 기재된 성분 비율을 갖는 10㎖의 최적화 배지에 접종한 후, 32℃에서 48시간 동안 배양한다. 자외선을 조사하기 전에 빛이 들어오지 않게 주위 환경을 어둡게 한 후, yeast 54-8 균주와 자외선램프 간의 거리를 30cm로 맞춘 다음, 10초 간격으로 60초까지 30㎼/㎠ 파장의 자외선을 조사하였다. 배양액을 멸균증류수에 1000 : 1로 희석하여 자외선을 조사하기 전(대조군: yeast 54-8)과 조사된 시점으로부터 10초 간격으로 0.2㎖씩의 시료를 취하여 이스트(yeast) 평판배지에 0.15㎖씩 스프레딩(spreading)하고, 37℃ 배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다.

평판배지에 형성된(즉, 자외선 조사로부터 생존하여 증식된) 콜로니를 최적화 배지에 접종한 후, 32℃로 조절된 진탕 배양기에서 200rpm의 조건으로 배양하였다. 접종 후 24시간, 48시간 및 72시간별로 시료를 준비하고 자외선이 조사된 yeast 54-8의 GSH 활성화 에세이를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 수행하였다.

구성 성분	농도
암모늄 설페이트	0.5%
디포타슘 포스페이트	0.5%
모노포타슘 포스페이트	0.5%
TSB	2.0%
폴리펩톤	2.5%
수크로오스	1.5%
글루코오스	1.05
미오-이노시톨	0.025%
ZnSO₄	0.25mM
시스테인	0.2%

실시예 2

자외선 조사 시간대별로 콜로니(colony)를 채취 후 액상의 최적화배지에서 배양한 다음, 배양액으로부터 자외선이 조사된 yeast 54-8을 원심분리를 통하여 포집하였다. 상기 균주를 0.8% SDS 0.6㎖에 잘 풀어준 다음, 잘 혼합하여 완전히 풀어주었다. 완전히 풀어진 균주에 직경 4mm의 글래스 비드 10개를 넣고 진탕 배양기에서 2시간 동안 파쇄하였다.

이어서, 상기에서 얻은 각각의 시료 10㎕와 50mM의 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.5) 100㎕ 및 10mM의 DTNB(5,5-dithio-bis 2-nitrobenzoic acid) 10㎕를 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 412nm에서의 흡광도를 측정하여 글루타치온의 농도를 측정하고, 그 결과를 표 2에 기재하였다.

자외선에 30초 이상 노출된 균주들은 99% 이상 생존하지 못하였고, 자외선이 조사된 yeast 54-8(돌연변이형)과 자외선이 조사되지 않은 yeast 54-8(야생형)의 글루타치온 활성을 측정한 결과, 자외선이 55초간 조사된 yeast 54-8이 가장 높은 글루타치온의 함량을 보여주었다.

한편, yeast 54-8의 야생형과 돌연변이형의 글루타치온 함량을 비교한 결과, 야생형은 균주 당 글루타치온 농도가 2.11mg/g인데 반하여 돌연변이체는 4.5mg/g이상 이었다. 이러한 결과로 보아 yeast 54-8를 자외선으로 조사함으로써 야생형에 비하여 글루타치온의 생성 수율이 2배 정도 높은 “yeast 54-8m”을 얻을 수 있다.

yeast 54-8	A412	㎍	㎍/㎖*	총 mg**	세포 무게	GSH/세포	GSH %	수율%
야생형	0.321	3.16	316	0.2	0.09	2.11	0.2	100
돌연변이형	0.693	6.87	686	0.4	0.09	4.58	0.5	217

* ㎍/㎖은 ㎖당 글루타치온의 농도

**총 mg은 SDS 0.6㎖에 균주 파쇄 후, 0.6㎖에 있는 글루타치온의 농도를 mg으로 환산해 준 값

실시예 3

사슴(엘크) 14두 중 7두에 표 3에 기재된 바와 같은 글루타치온을 함유하는 가축사료 첨가물을 체중 kg 당 6mg 씩 급여하고, 7두는 글루타치온 대신 밀겨를 함유하는 사료를 급여하는 대조군으로 사육하였으며, 이에 따른 체중 증가량 및 녹용생산량을 분석하고, 그 결과를 표 4 및 표 5에 기재하였다.

성분	비율
글루타치온(glutathione 99%)	0.042
감미제	0.020
밀겨	0.938
소계	1.000

	대조구		실험구
	체중	일당 증체량	체중	일당 증체량
개시 시(4/19)	133.4±14.3		133.5±17.0
1.5 개월(6/05)	154.8±13.0	0.46	159.4±16.7	0.55
3개월(7/18)	173.3±13.0	0.43	178.3±18.0	0.44
5.5개월(10/04)	187.8±13.6	0.18	192.7±20.3	0.18

구분	대조구	시험구
녹용생산량	911±256	1066±357
비율(%)	100	117

표 4 및 표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 대조구 및 글루타치온 급여 구의 체중 증가량은 두당 각각 39.8, 44.9kg으로, 글루타치온 급여구가 대조구보다 체중증가량이 2.9% 높았으며, 녹용생산량에 있어서는 대조구와 글루타치온 급여구가 각각 911 ± 256 및 1066 ± 357g으로 글루타치온 급여구가 155g 많았으며, 글루타치온 급여에 따른 경제성을 분석한 결과, 글루타치온 급여구가 두당 약 38,450원 정도의 경제적 이익을 발생시킨다.

이는 글루타치온이 강력한 항산화제로서 기능하기 때문에 글루타치온이 급여된 가축의 경우 산화적 스트레스 저감을 통하여 생산성이 향상됨을 실험적으로 입증한 것이다.

아울러 본 발명의 주된 균주는 2009년 2월 2일 국립농업과학원 농업유전자 센터에 본 발명의 주된 균주를 기탁하여 수탁번호(KACC 93070P)를 부여받았다.

Claims

글루타치온(glutathione)을 고발현하는 것을 특징으로 하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 돌연변이체 yeast 54-8m(KACC 93070P).
제 1항에 있어서, 상기 돌연변이체는 사카로마이세스 세레비시애 yeast 54-8 균주와 자외선 광원간의 거리를 25 ~ 35cm로 맞춘 후 10초 내지 60초 동안 자외선을 조사하여 생산된 것임을 특징으로 하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 돌연변이체 yeast 54-8m(KACC 93070P).
글루타치온을 고생산하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 돌연변이체를 준비하는 단계; 상기 균주를 배양하기 위한 배양액을 제조하는 단계; 및 상기 배양액에 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 돌연변이체를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 글루타치온 고발현을 위한 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 돌연변이체를 배양하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 돌연변이체는 사카로마이세스 세레비시애 yeast 54-8 균주와 자외선 광원간의 거리를 25 ~ 35cm로 맞춘 후 10초 내지 60초 동안 자외선을 조사하여 생산된 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 돌연변이체 yeast 54-8m임을 특징으로 하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 돌연변이체를 배양하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 배양액은 0.3 ∼ 0.8%의 암모늄 설페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 디포타슘 포스페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 모노포타슘 포스페이트, 1.5 ∼ 2.5%의 TSB(Tryptic Soy Broth), 2.0 ∼ 3.0%의 폴리펩톤, 1.0 ∼ 2.0%의 수크로오스, 1.0 ∼ 2.0%의 글루코오스, 0.02 ∼ 0.03%의 미오-이노시톨, 0.2 ∼ 0.3mM의 ZnSO₄ 및 0.15 ∼ 0.25%의 L-시스테인을 함유하는 것을 특징으로 하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 돌연변이체를 배양하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 배양 단계는, 30 ∼ 35℃, pH 5.5 ∼ 6.5에서 1 ~ 2일간 배양하는 것을 특징으로 하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 돌연변이체를 배양하는 방법.
사카로마이세스 세레비시애 yeast 54-8 균주와 자외선 광원간의 거리를 25 ~ 35cm로 맞춘 후 10초 내지 60초 동안 자외선을 조사하여 생산된 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 돌연변이체 yeast 54-8m을 준비하고, 0.3 ∼ 0.8%의 암모늄 설페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 디포타슘 포스페이트, 0.3 ∼ 0.8%의 모노포타슘 포스페이트, 1.5 ∼ 2.5%의 TSB(Tryptic Soy Broth), 2.0 ∼ 3.0%의 폴리펩톤, 1.0 ∼ 2.0%의 수크로오스, 1.0 ∼ 2.0%의 글루코오스, 0.02 ∼ 0.03%의 미오-이노시톨, 0.2 ∼ 0.3mM의 ZnSO₄ 및 0.15 ∼ 0.25%의 L-시스테인을 함유하는 배양액에 접종하고 30 ∼ 35℃, pH 5.5 ∼ 6.5에서 1 ~ 2일간 배양하여 얻은 고발현된 글루타치온을 포함하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 돌연변이체 배양물.
제 7항에 따른 사카로마이세스 세레비시애 균주 돌연변이체의 배양물 또는 이로부터 분리한 균주 자체 혹은 이들로부터 분리한 글루타치온을 함유하는 가축 사료 첨가제.