KR101298096B1

KR101298096B1 - 글루타치온을 고발현하는 효모 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101298096B1
Application number: KR1020110068582A
Authority: KR
Inventors: 강성종; 정철연; 이영돈
Original assignee: (주)창조바이오텍
Priority date: 2011-05-12
Filing date: 2011-07-11
Publication date: 2013-08-20
Also published as: KR20120127153A

Abstract

본 발명은 글루타치온(GSH)을 고발현하는 효모 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로 글루타치온을 고발현하는 BK-34(기탁번호 : KCTC 11635BP) 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하여 글루타치온을 고함량으로 포함하는 효모를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

글루타치온을 고발현하는 효모 균주 및 이의 용도{Yeast Strain Expressing Glutathione Highly and Use thereof}

본 발명은 글루타치온(GSH)을 고발현하는 효모 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로 글루타치온을 고발현하는 BK-34(기탁번호 : KCTC 11635BP) 균주에 관한 것이다.

글루타치온(L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH)은 1929년 Hopkins가 효모로부터 단리하였으며, 글루탐산, 시스테인, 글라이신 등의 세가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드로서 동물, 식물 및 미생물에 0.1-10 mM의 농도로 존재하며 세포의 총 비단백질성 황부분의 90%를 차지하고 있다. 글루타치온은 대부분 환원형으로 존재하며 산화형과 이황화물이 혼합된 GSS-단백질(PrSSG) 및 glutathione reductase (GR)로도 적은 양이 존재한다.

글루타치온은 어류용 사료첨가제로서 간기능 활성 및 면역력 향상을 위해 꾸준히 사용되어온 제품으로 양식산업 현장에서 많이 사용하고 있다. 그러나 현재 판매되고 있는 기존 제품은 너무 가격이 높아 필요량 정도로 충분히 공급하지 못하고 있는 실정이다.

본 발명은 고농도의 글루타치온을 포함하는 효모를 저가에 생산하는 기술 개발을 통해 양식 산업체에서 필요로 하는 글루타치온을 저가로 대량 공급을 통한 양식어류의 건강도 및 생산성 향상을 통해 양식산업 발전에 기여하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 글루타치온(GSH)을 고발현하는 효모 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로 글루타치온을 고발현하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) BK-34(기탁번호 : KCTC 11635BP) 균주에 관한 것이다.

상기 BK-34 균주는 누룩, 발효식품, 전통주 등으로부터 분리된 여러 효모 균주 중 본 발명자에 의해 가장 글루타치온(GSH)의 생산량이 우수한 효모 균주로 선발된 것으로, 본 발명자가 한국생명공학연구원에 2010년 2월 8일자로 기탁한 것이다(기탁번호 : KCTC 11635BP).

또한, 본 발명은 상기 BK-34 균주를 탄소원 및 질소원을 포함하는 영양배지를 이용하여 배양하는 글루타치온(GSH)을 고함량으로 포함하는 효모를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 탄소원은 미생물 배지에서 가장 중요한 요소로서, 일반적으로는 발효공정을 조절해야 할 경우, 포도당을 비롯한 단당류를 주로 사용하나, 상업적 용도로는 대부분을 경제적인 이유로 포도당 또는 설탕을 사용하지 않고 값싼 녹말과 당밀(molasses)을 이용하는 경우가 많다. 본 발명에서는 탄소원으로 포도당(Glucose) 또는 당밀(Molasses)이 바람직할 수 있다.

본 발명에서 상기 질소원은 단백질 합성의 소재로서 각종 아미노산 합성에 필요하다. 대규모 공정에서는 암모늄염, 요소, 암모니아 가스, CSL 등이 질소원으로 이용된다. 본 발명에서는 효모추출물(Yeast extract) 또는 옥수수 침지액(corn steep liquor, CSL)을 질소원으로 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

상기 탄소원 및 질소원은 배지 내 포함되는 농도가 특별히 제한되는 것은 아니나, 질소원 5 내지 20% 농도에 탄소원 0.5 내지 4% 농도로 포함하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 질소원 15% 농도에 탄소원 4% 농도로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 글루타치온(GSH)의 생산량을 더욱 더 증가시키기 위해, 상기 효모를 배양하는 과정 중에 아미노산을 추가로 첨가할 수 있다.

상기 아미노산은 특별히 종류가 제한되는 것은 아니나, L-시스테인(L-cysteine), 글리신(Glycine), L-글루탐산(L-glutamic acid), L-메티오닌(L-methionine) 및 타우린(Taurin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 L-시스테인(L-cysteine), 글리신(Glycine)일 수 있다.

본 발명에서 상기 아미노산은 첨가 시간이 특별히 한정되는 것은 아니나, 글루타치온의 생산량을 극대화하기 위하여 배양 후 4 ~ 18시간에 첨가하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 배양 후 12시간에 첨가할 수 있다.

또한, 상기 아미노산의 첨가량은 특별히 제한적인 것은 아니나, 바람직하게는 0.03 ~ 0.06% 농도로 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.05% 농도로 첨가할 수 있다.

본 발명의 글루타치온(GSH)을 고함량으로 포함하는 효모를 생산하는 방법은 글루타치온의 생산량을 극대화 하기 위해, 배양온도 25 ~ 35 ℃, 교반속도 100 ~ 600 rpm, 초기 pH 4.5 ~ 5.5 및 배양시간 12 내지 120 시간의 배양조건으로 배양하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 배양온도 30 ℃, 교반속도 100 rpm, 초기 pH 5 및 배양시간 72 시간의 배양조건으로 배양할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기의 배양방법으로 생산된 글루타치온을 고함량으로 포함하는 효모에 관한 것이다. 본 발명의 효모는 글루타치온을 고함량으로 함유하는 동시에, 효모 자체에 비타민 및 아미노산이 함유되어 있어, 어류의 스트레스를 감소시키며, 어류의 간기능 향상 및 면역증강 효과가 뛰어난 것이 특징이다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 글루타치온을 고함량으로 포함하는 효모를 유효성분으로 포함하는 어류용 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다. 상기 어류용 사료 첨가제 조성물은 글루타치온을 고함량으로 포함하는 효모를 단독으로 포함할 수 도 있고, 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등과 함께 포함될 수도 있다. 본 발명의 어류용 사료 첨가제의 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태로 조제될 수 있으며, 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우에는 어류에 대하여 단독으로 공급하여도 좋고, 사료에 혼합하여 공급하여도 좋다.

본 발명에 의하면, 글루타치온(GSH)을 높은 함량으로 포함하고 있어 어류의 간기능 활성 및 면역력을 현저히 향상 시킬수 있으며, 특히 지금까지 수입에 의존해 오던 고가의 글루타치온을 함유한 효모를 국내 기술에 의해 저가로 대량 공급할 수 있어, 양어가에 충분한 공급이 가능하여 양식어류의 건강도 및 생산성을 향상시킬 수 있고, 나아가 국내 양식산업 발전에도 이바지할 수 있다.

도 1은 BK-34과 Saccharomycetes sp. HZ178과 18S RNA 유전자 염기서열의 비교에 관한 것이다(도면에 표기되어 있는 BK-50은 테스트 당시의 모델이며, 기탁시에 모델명을 BK-34로 변경하였기 때문에 도 1의 BK-50과 본 발명의 BK-34는 동일한 것임).
도 2는 배양시간에 따른 BK-34의 건조중량과 글루타치온 생산량에 관한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 배양온도에 따른 BK-34의 건조중량과 글루타치온 생산량에 관한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 교반속도에 따른 BK-34의 건조중량과 글루타치온 생산량에 관한 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 초기 pH에 따른 BK-34의 건조중량과 글루타치온 생산량에 관한 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 Glucose와 당밀(molasses)의 농도에 따른 BK-34의 건조중량과 글루타치온 생산량에 관한 그래프를 나타낸 것이다.
도 7은 Yeast extract와 Corn steep liquor의 농도에 따른 BK-34의 건조중량과 글루타치온 생산량에 관한 그래프를 나타낸 것이다.
도 8은 탄소원과 질소원 최적화를 위한 glucose의 농도에 따른 BK-34의 건조중량과 글루타치온 생산량에 관한 그래프를 나타낸 것이다.
도 9는 퍼멘터 회분배양에 따른 BK-34의 건조중량 및 글루타치온 생산량에 관한 그래프를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 일 실시예의 배양시간에 따른 BK-34의 건조중량 및 글루타치온 생산량에 관한 그래프를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 실험 방법

1-1. 균주 screening

효모 균주를 분리하기 위한 분리원은 시중에 판매되는 누룩, 발효식품, 전통주 등을 구입하여 사용하였다. 누룩은 2 g의 누룩에 18 ml의 식염수를 첨가하여 mixer기로 분쇄하여 사용하였고, 발효식품과 전통주는 제품 원액을 바로 사용하였다.

효모균주의 순수분리는 spread-plate method와 streak-plate method를 이용하여 분리하였다. 식염수로 serial dilution하고 YM Agar (Yeast extract 3.0 g, Malt extract 3.0 g, Peptone 5.0 g, Glucose 10 g, Agar 20 g)에 spreading하여 30℃에서 48시간 배양하였다. colony 모양과 현미경 검경을 통해 효모로 추정된 single colony을 YM agar에 streaking 하였다. 그리고 분리한 모든 균주는 글리세롤을 30%첨가한 YM broth (Yeast extract 3.0 g, Malt extract 3.0 g, Peptone 5.0 g, Glucose 10 g)를 이용하여 -70℃에 보관하였다.

균주의 screening은 500 ml 삼각플라스크에 YM broth를 100 ml 분주하고 순수 분리된 균주를 한 루프 접종하여 72시간동안 진탕배양(30℃, 100 rpm)하여 건조중량과 GSH 생산량을 조사하였다.

1-2. 우수균주 선발

우수균주 선발은 보관 중인 효모 균주 중 GSH 생산량이 우수한 균주를 10종을 재생하여 실험을 실시하였다. 500 ml 진탕 삼각플라스크에 YM broth 100 ml씩 분주하고 재생균주를 2%로 접종하여 24시간동안 전배양(30℃, 100 rpm)을 하였다. 그리고 동일한 방법으로 제작된 진탕 삼각플라스크에 전배양액을 2% 접종하여 같은 조건으로 72시간동안 배양한 후 건조중량과 GSH 생산량을 조사하였다.

선발배양에서 GSH 생산이 가장 우수한 효모 균주는 솔젠트(주)에 의뢰하여 ITS1 염기서열을 분석하였다. 분석된 실험균주의 18S 리보좀 RNA 염기서열은 BLAST database(http://www.ncbi.nlm.nih.gob/blast/)와 EMBOSS Align(www.ebi.ac.uk/)을 사용하여 유사성을 비교하였다.

1-3. 초기배양조건

초기배양조건을 조사하기 위해 배양시간, 배양온도(25, 30, 35, 40℃), 교반속도(0, 50, 100, 150, 200 rpm), 초기 pH(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) 등에 따른 건조중량과 GSH 생산량을 조사하였다.

1-4. 배지최적화

미생물은 대부분 화학합성 종속영양미생물로서 탄소원 또는 에너지원으로 탄수화물을 이용한다. 탄소원(carbon source)은 미생물 배지에서 가장 중요한 요소이다. 일반적으로는 발효공정을 조절해야 할 경우는 포도당을 비롯한 단당류를 주로 사용한다. 그러나 상업적 용도로는 대부분을 경제적인 이유로 포도당 또는 설탕을 사용하지 않고 값싼 녹말과 당밀(molasses)을 이용하는 경우가 많다.

그리고, 대부분의 미생물은 유기 및 무기 질소원을 이용하여 생육을 한다. 질소원은 단백질 합성의 소재로서 각종 아미노산 합성에 필요하다. 대규모 공정에서는 암모늄염, 요소, 암모니아 가스, CSL을 질소원으로 이용한다. 일부 미생물은 아미노산 요구성에 있어서 한 가지 이상의 특정한 아미노산이 없이는 생육하지 않거나 생육속도가 매우 늦어지는 경우가 있다. 이 경우에는 필요로 하는 특정의 아미노산을 첨가하여 주어야 한다.

① 탄소원 선정

본 실시예에서 고농도 GSH 함유 효모의 대량 배양을 위한 탄소원으로는 포도당과 당밀을 이용하였다. 당밀은 전처리 과정으로 105℃에서 30분간 열처리를 한 후, 7000 rpm으로 15분간 원심분리하여 사용하였다. 탄소원 선정 실험은 YM broth에서 포도당을 뺀, Yeast extract 0.3%, Malt extract 0.3%, Peptone 0.5%에 포도당은 1~5%의 범위에서 1%의 간격으로, 당밀은 2~10%의 범위에서 2% 간격으로 첨가하여 실험을 진행하였다.

② 질소원 선정

본 실시예에서는 아미노산 또는 펩타이드를 함유하여 유기질소원으로 사용되는 질소원 중, 대량공정에 주로 이용되는 유기질소원인 Yeast extract와 corn steep liquor (CSL)를 사용하였다. CSL은 전처리 과정으로 7,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 사용하였다. 질소원 농도 결정은 Yeast extract는 0.5%에서 15.0%까지 2.5%간격, CSL은 1.0%에서 30.0%까지 5.0%간격으로 첨가하여 질소원 선정 실험을 진행하였다. 배지에 탄소원으로는 Glucose 1.0%를 첨가하였다.

③ 탄소원과 질소원 최적화

최대 GSH을 생산하는 탄소원과 질소원의 배합비율을 조사하기 위하여 포도당을 각각 0%, 0.1%, 1.0%, 2.0%, 4.0%, 6.0%, 8.0%, 10%의 농도로 첨가하였다. 이때 GSH 생산이 가장 높게 증가한 질소원 CSL은 15%의 농도로 고정하였다.

④ 아미노산 최적화

본 실시예에서는 GSH 효모 배양에 필요로 하는 아미노산을 조사하기 위하여 L-glutamic acid, L-cysteine, Glycine, L-methionine 그리고 Taurin을 대상으로 실험하였다. 각각의 아미노산 첨가 비율은 각각 0.05%의 농도로 첨가하여 실험을 수행하였다.

1-5. 시스테인(Cysteine) 투여시간에 따른 글루타치온(GSH) 생산량 조사

시스테인(Cysteine)의 첨가 시간에 따른 GSH의 생산량을 조사하기 위하여 각기 다른 시간(배양 4, 8, 12, 24, 48시간)에 L-Cysteine (0.1%) 투여하여 GSH의 생산량을 조사하였다. 배지는 포도당 4%, CSL 15%, Glycine과 L-Cysteine이 각각 0.05%의 농도로 첨가하여 사용하였다.

1-6. 퍼맨터(fermenter) 회분배양

배양 장치에 따른 효모(BK-34, 기탁번호:KCTC 11635BP)의 건조중량 및 GSH의 생산량을 조사하기 위해 5 L 퍼맨터(fermenter)를 이용하여 회분배양을 실시하였다. 최적배지의 부피는 2 L로 하였고, 배양조건은 초기 pH 5.0, 배양온도 30℃, 교반속도 200 rpm, 공기공급 1.5 L/min로 설정하였다. 샘플은 전배양액을 2%로 접종하여 72시간 동안하면서 8시간 간격으로 취하여 건조중량 및 GSH의 생산량을 조사하였다.

1-7. 효모의 건조중량

각각의 실험에 따른 회수율 조사는 건조중량을 측정하여 조사하였다. 72시간 동안 배양한 플라스크에서 1 ml 씩 마이크로 튜브에 샘플링 한 후, 13,000 rpm, 3분간 원심분리하고 증류수를 사용하여 3회 세척한 후, 건조오븐(60℃)에서 건조하여 정밀저울로 균의 중량을 측정하였다.

1-8. GSH 함량 분석

각각의 실험에 따른 GSH 함량 분석은 배양된 샘플을 3회 세척하여 배지성분을 제거하고 함량의 초순수 물을 첨가한 후, 95℃에서 15분간 뜨거운 물에 중탕하는 방법으로 GSH을 추출하였다. 추출된 샘플은 측정하기 전까지 -70℃에 보관하였다. GSH 분석은 Sigma 사의 Glutathione assay kit (CS0260)를 사용하여 측정하였다.

2. 실험 결과

2-1. 균주 screening

누룩, 발효식품, 전통주 등에서 1차적으로 총 213개의 효모를 분리하였다. 분리된 효모의 건조중량 및 GSH 생산량을 조사 결과, 효모의 건조중량은 1.1~6.2 g/L, GSH 생산량은 0.3~58.1 mg/L이었으며, GSH의 함량은 0.2~18.5 mg/g로 조사되었다. 선택 분리 된 균주 중 건조중량은 BK-26 균주가 6.2 g/L으로 가장 양호하였고, 생산량은 BK-05 균주가 58.1 mg/L 가장 높았다. 그리고 GSH 함량은 BK-28이 18.5 mg/g로 가장 높았다.

냉동 보관 균주는 재생하여 실험에 이용할 시, 균주의 활성 및 GSH의 생산력의 차이가 있었다. 따라서, 분리한 효모 중, GSH 함량이 높은 균주 10종을 대상으로 우수균주 선발 시험을 실시하였다.

2-2. 우수균주 선발

1차 스크리닝에서 GSH 생산량이 우수한 균주 10종을 재생하여 전배양하고, YM broth에 전배양액을 접종하여 배양한 결과 효모의 건조중량은 BK-43과 BK-34이 3.3 g/L로 가장 좋았으며, GSH의 생산량과 함량은 BK-34이 42.5 mg/L로 가장 높았다.

실험균주의 18S 리보좀 RNA 염기서열을 BLAST database와 EMBOSS Align을 사용하여 비교한 결과 Saccharomycetes sp. HZ178 18S ribosomal RNA gene [GU213443]과 97.8%의 유사성을 보였다(도 1).

본 발명자는 상기 BK-34 균주를 한국생명공학연구원에 2010년 2월 8일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 11635BP).

2-3. 초기배양조건

① 배양시간

배양시간에 따른 BK-34의 건조중량과 GSH의 생산량을 12시간 간격으로 120시간까지 조사하였다. 균체의 건조중량은 배양 12시간에 2.1 g/L로 급속히 성장하였고, 24시간 이후부터 완만히 증가하여 120시간에 4.0 g/L까지 성장하였다. GSH의 생산량은 배양 36시간에 37.0 mg/L로 생산량이 빠른 속도로 증가한 후, 48시간부터는 증가폭이 감소하여 120시간에 48.0 mg/L까지 생산하였다(도 2).

② 배양온도

BK-34의 배양온도에 따른 건조중량 및 GSH의 생산량을 조사하기 위해 YM broth에 2% 접종하여 25, 30, 35, 40℃에서 72시간 진탕 배양한 결과 균체의 건조중량과 GSH의 생산량 모두 30℃에서 건조중량은 2.9 g/L, GSH 생산량은 36.6 mg/L로 가장 높았다. 25℃와 35℃에서 건조중량과 GSH의 생산량은 각각 2.0 g/L과 27.4 mg/L, 2.0 g/L과 32.7 mg/L이었다. 따라서 BK-34의 성장과 GSH의 생산이 가장 높은 30℃를 배양온도로 설정하였다(도 3).

③ 교반속도

교반속도에 따른 BK-34의 건조중량 및 GSH 생산 변화를 조사한 결과, 0 rpm에서는 1.2 g/L (12.7 mg/L), 100 rpm 에서는 3.7 g/L (42.4 mg/L), 200 rpm 에서는 2.2 g/L (40.4 mg/L) 이었다. BK-34는 100 rpm에서 건조중량과 GSH의 생산이 가장 높아 최적 교반조건은 100 rpm으로 정하였다(도 4).

④ 초기 pH

초기 pH에 따른 BK-34의 건조중량 및 GSH의 생산량을 조사한 결과, pH 5에서 4.0 g/L (52.2 mg/L)로 가장 높았다. pH 5에서 산성 또는 알카리성으로 높아질수록 성장과 생산량이 감소하여 pH 2에서는 3.1 g/L (26.0 mg/L) 이었고, pH 8에서는 3.4 g/L (37.4 mg/L) 이었다(도 5).

2-4. 배지 최적화

① 탄소원 선정

탄소원을 선정하기 위해 Glucose와 Molasses를 농도 별로 첨가하여 실험하였다. 탄소원 농도에 따른 BK-34의 건조중량은 Glucose와 Molasses에서 각각 3.8~4.2 g/L, 3.9~6.2 g/L 이었다. 그리고 GSH의 생산은 Glucose와 Molasses에서 각각 45.3~51.6 mg/L, 40.2~54.9 mg/L 이었다. Molasses는 Glucose에 비해 BK-34의 성장이 좋았으나, GSH의 생산에 있어서는 큰 차이를 보이지 않았다. 또한, Molasses는 배지로 이용하기 위해 열처리 및 원심분리 등의 전처리 공정이 필요하여 배지최적화를 위한 탄소원으로 Glucose를 선정하였다(도 6).

② 질소원선정

질소원을 선정하기 위해 Yeast extract와 CSL를 농도 별로 첨가하여 실험하였다. 질소원 농도에 따른 BK-34의 건조중량은 Yeast extract와 CSL에서 각각 3.5~5.6 g/L, 4.8~6.4 g/L이었다. GSH의 생산은 각각 43.9~55.2 mg/L, 44.4~68.7 mg/L로, CSL 첨가구가 Yeast extract 첨가구에 비해 성장과 생산량이 높았다. CSL 첨가구 중 건조중량은 CSL 0.5% 첨가구에서 6.4 g/L로 가장 높았고 GSH의 생산량은 CSL 15% 첨가구에서 68.7 mg/L로 가장 높았다. 또한, CSL 15% 첨가구는 BK-34의 성장에 있어서도 6.1 g/L로 높은 값을 나타내어 질소원으로 CSL 15%를 선정하였다(도 7).

③ 탄소원과 질소원의 최적화

BK-34의 탄소원과 질소원의 최적화는 질소원으로 선정된 CSL 15%의 농도를 고정하고 탄소원으로 선정된 Glucose를 농도별로 첨가하여 실험하였다. Glucose 비첨가구는 건조중량이 4.4 g/L 이었고, Glucose의 첨가에 의해 건조중량이 증가하였다. 건조중량은 Glucose 0.5 첨가구에서 11.1 g/L로 가장 높게 나타났다.

BK-34의 GSH의 생산량은 Glucose 비첨가구에서 90.6 mg/L이었고 Glucose 첨가에 의해 증가하여 4% 첨가구에서 134.1 mg/L로 가장 높은 생산량을 보였다. 그러나 포도당 6% 이상 첨가구에서는 GSH 생산량이 점차 감소하였으며, Glucose 10% 첨가구에서 69.9 mg/L로 가장 낮은 생산량을 나타내었다(도 8).

2-5. 아미노산 최적화

아미노산의 첨가에 따른 BK-34의 건조중량과 GSH의 생산량을 조사하였다. 아미노산을 첨가하지 않은 대조구의 건조중량과 GSH의 생산량은 각각 8.6 g/L, 87.1 mg/L 이었다. BK-50의 성장은 아미노산 첨가에 의해 증가하여 Glycine 첨가구에서 12.4 g/L로 가장 높았다. 그리고 아미노산 첨가에 의한 GSH의 생산량은 대조구에 비해 L-cysteine와 Glycine 첨가구가 각각 91.8 mg/L, 92.2 mg/L로 생산량이 증가하였다

2-6. 아미노산 투여시간

GSH의 생산력 향상을 위해 아미노산인 L-cysteine을 배양 도중에 투여하여 실험하였다. L-cysteine 투여 시간에 따른 건조중량과 GSH의 생산량을 조사한 결과, 대조구의 건조중량 및 GSH의 생산량은 각각 7.6 g/L와 90.0 mg/L 이었다.

L-cysteine 첨가에 의한 건조중량은 배양 12시간에 첨가한 실험구에서 7.8 g/L를 나타났다. 이 실험구를 제외한 모든 실험구에서는 건조중량이 대조구에 비해 낮았으며, 배양 4시간 후에 첨가한 실험구에서 5.8 g/L로 가장 낮았다.

GSH의 생산에 있어서는 cysteine을 첨가한 모든 실험구에서 대조구보다 높은 생산량을 타나내었고, 배양 12시간 후 아미노산을 첨가한 실험구가 128.8 mg/L로 가장 높았다

2-7. 퍼맨터(fermenter) 회분배양

Scale-up을 하기위한 기초 조사를 하기위해 최적화된 조건과 배지를 이용하여 배양 장치에 따른 건조중량과 GSH 생산량을 조사하였다. 5L fermenter에 장치에서 BK-34을 회분배양한 결과, 건조중량은 배양 8시간 만에 8.7 g/L로 증가하였고, 그 후 지속적인 성장을 하여 실험 종료시점인 72시간에는 28.5 g/L 까지 성장하였다. 반면, GSH의 생산량은 배양 40시간에 76.5 mg/L까지 증가하였으나 배양 48시간에는 62.2 mg/L로 감소하여 그 값이 72시간까지 유지되었다(도 9).

실시예 1

Glucose 4%, CSL 15%, L-cysteine 0.05%, Glycine 0.05%과 같이 배지를 조제하여 pH를 5.0으로 4N HCl 또는 4N NaOH로 조정하여 배지를 제작하였다. 이 배지에 BK-34를 2%의 농도로 접종하여 24 시간동안 전배양하였다. 동일한 배지 2 L에 BK-34 전배양액을 2%의 농도로 접종하여 배양온도 30℃, DO 20%, 교반속도 200~600 rpm, 공기공급 1 vvm으로 48시간 동안 5 L fermenter를 이용하여 배양하였다. 배양 4시간에 Cysteine 2 mM 첨가한 후, 배양 12시간에는 L-glutamic acid, Glycine그리고 L-cysteine을 각각 10 mM의 농도로 첨가하였다.

상기와 같이 배양한 결과, 배양 20시간에 1.47% GSH 함유 효모를 얻었다. (DCW 42.1 g/L, GSH 624.5 mg/L)(도 10)

한국생명공학연구원

KCTC11635BP

20100208

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Claims

글루타치온을 고발현하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) BK-34(KCTC 11635BP) 균주.
제 1항의 균주를 탄소원 및 질소원을 포함하는 영양배지를 이용하여 배양하는 글루타치온을 고함량으로 포함하는 효모를 생산하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 탄소원은 포도당(Glucose) 또는 당밀(Molasses)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 질소원은 효모추출물(Yeast extract) 또는 옥수수 침지액(corn steep liquor, CSL) 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 탄소원 및 질소원은 질소원 5 내지 20% 농도에 탄소원 0.5 내지 4% 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
아미노산을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 아미노산은 L-시스테인(L-cysteine), 글리신(Glycine), L-글루탐산(L-glutamic acid), L-메티오닌(L-methionine) 및 타우린(Taurin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 아미노산은 배양 후 4 ~ 18시간에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 아미노산은 0.03 ~ 0.06% 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
배양온도 25 ~ 35 ℃, 교반속도 100 ~ 600 rpm, 초기 pH 4.5 ~ 5.5, 배양시간 12 내지 120 시간 배양조건으로 배양하는 방법.
제 2항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 의해 생산된 글루타치온을 고함량으로 포함하는 효모.
제 11항의 효모를 유효성분으로 포함하는 어류용 사료 첨가제 조성물.