KR20100040589A

KR20100040589A - 글루타치온의 대량 생산방법

Info

Publication number: KR20100040589A
Application number: KR1020080099793A
Authority: KR
Inventors: 조영수
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2008-10-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2010-04-20

Abstract

본 발명은 글루타치온 대량 생산방법에 관한 것으로, 사카로마이세스 세레비지아에 FF-8 균주를 이용하여 글루타치온 생산량을 극대화하는 생산방법을 제공하는 것으로 발효조에서 효모세포와 글루타치온 생산의 최적발효조건으로 30℃, pH 6.0, 교반속도 200 rpm, 통기량 2.0 vvm에서 72시간만에 255.8 mg/L을 생산하는 것을 개시하고 있는 뛰어난 발명인 것이다.

사카로마이세스 세레비지아에 FF-8, 글루타치온, 최적발효조건

Description

글루타치온의 대량 생산방법{A method for mass production of glutathione}

본 발명은 글루타치온의 대량 생산방법에 관한 것으로 회분식 또는 유가식 배양(Fed-batch culture)에서 상기 대사산물을 대량 생산하기 위하여 최적배양조건을 규명한 것이다.

글루타치온(Glutathione)은 L-글루타메이트, L-시스테인 및 글라이신을 포함하는 tripeptide로서 동물과 미생물체내에서 산화환원에 관여하는 화합물이다.

세포내 화합물로서의 글루타치온은 생체조직에서 산화적 손상에 막강한 방어역할을 하며 자외선 및 중금속에 대하여 생체조직을 보호한다.

따라서, 글루타치온은 간장치료제로서의 의약용도로 널리 사용되어 왔고 기능성 건강식품, 기타 화장품의 첨가제로도 사용되어 왔으며 이와 같은 상업적 수요는 급증하는 실정이다.

종래 연구결과 문헌들은 주로 글루타치온 생산조건의 적정화 또는 글루타치온 생산방법의 적정화를 위한 생산량의 증가에 목적이 있었는데 대부분이 특정물질 예컨대 탄소원이나 질소원외에 미량요소, ATP, 기타 유황같은 특수물질의 보충에 관한 것이었다.

본 발명자는 한국전통발효주로부터 분리한 글루타치온 고함유 효모를 사용하여 글루타치온의 최적대량 배양조건을 규명하였는데 이와 같은 최적배양조건은 글루타치온과 같은 세포내 물질의 생산효율을 높이는 유가식 배양(Fed-batch culture)에 활용될 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 점 등을 감안하여 연구한 결과로서 글루타치온 대량생산용 최적배양방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 글루타치온 생산 효모균주를 선택하여 최적배양조건을 실험을 통하여 규명하므로서 달성하였다.

본 발명은 글루타치온 생산용 효모균주 S. cerevisiae FF-8 에서 글루타치온 생산량을 증대시킬 수 있는 최적발효조건으로 발효조내 온도 30℃에서, 초기 pH 6.0, 교반속도 200 rpm, 통기조건 2.0 vvm으로서 100 L 발효조에서 내부압력 0.8 kgf/㎠에서 글루타치온 생산량 255.8 mg/L를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

이하, 본 발명의 기술적 구성을 구체적으로 설명한다.

공시효모균주

본 발명에서 사용한 효모공시균주는 전통막걸리에서 분리한 글루타치온 생산균주(KACC 93023) S. cerevisiae FF-8 이었다.

배양배지

상기 S. cerevisiae FF-8 (KACC 93023)균주를 3%(w/v) 글루코스, 3% 효모추출물, 0.06% KH₂PO₄, 0.06% L-cysteine으로 조성된 배양배지가 들어 있는 플라스크에서 종배양하였다.

발효조건

상기 배양배지로 플라스크에서 배양한 종균을 7 L 직립형 발효조에서 발효시켰다.

발효조내에는 양날을 가진 2개의 임펠러와 3개의 baffle이 장착된 Ko-Biotech Co.제품을 사용하였다.

100 L 발효조는 6날을 가진 2개의 임펠러와 6개의 baffle이 장착된 것(Ko- Biotech Co.)을 사용하였다.

작업 부피는 각각 5 L 와 70 L 로 하고, 배지는 121℃에서 30분 멸균한 것을 사용하고 종균사용량은 5%(v/v)를 접종시켰다.

실험결과, 7 L 발효조에서 30℃에서 72시간 글루타치온 발효시 교반속도 200 rpm(도 1d)(도 2)이 가장 바람직하고 공기공급속도는 2.0 vvm(도 3), 그리고 발효조 내부압력 0.8 kgf/㎠(도 4d),(도 5)가 각각 바람직하였다.

세포성장분석

배양된 효모세포는 7,000×g/15분간 원심분리하여 수확하고 상등액은 제거한 다음 남은 효모를 3회 정제수로 수세하였다.

수확한 효모세포는 건조세포무게(DCW)와 글루타치온 농도를 분석하였고 세포성장은 660 nm에서 UV 스펙트로포토메터(UV min-1240, Shimadzu, Kyoto, 일본)상의 흡광도(absorbance)를 측정하여 나타내었다.

배양액의 pH 는 pH 메터로 측정하였고 건조세포무게(DCW)는 wet cells을 105℃에서 건조한 후 측정하였다.

글루타치온 농도 분석

세포내 분비 글루타치온 농도는 Beutler 등(1963)의 방법을 사용하고 수확한 효모세포를 0.2M 인산완충용액(pH 7.2)에 현탁시킨 다음 sonication하여 파쇄하였다. 파쇄된 세포는 원심분리하여 제거하고 0.2 mL의 상등액을 1.8 mL의 EDTA 용 액에 혼합하였다. 이어서 여기에 3.0 mL의 침전제를 첨가하고 완전히 섞은 후에 4℃에서 5분간 정치시켰다.

상기 혼합물은 다시 3,000×g/5분간 원심분리하고 2 mL의 상등액을 4 mL의 0.3M disodium hydrogen phosphate 용액과 0.1 mL의 DTNB 시약의 혼합물에 넣어 글루타치온의 농도를 412 nm(UV min 1240, Shimadzu, Kyoto, Japan)에서 흡광도로 측정하였다.

실험결과, 글루타치온 생산량은 7 L 발효조에서, 30℃, 초기 pH 6.0 에서 교반속도 200 rpm, 공기공급속도 2.0 vvm 에서 최대 230 mg/L이고 100 L 발효조에서 동일한 발효조건에서(0.8 kgf/㎠) 255.8 mg/L 이었다(도 5).

본 발명은 글루타치온 고생산성 효모균주(KACC 93023)를 이용하여 세포내 분비 대사산물인 글루타치온을 대량 생산하는 뛰어난 효과가 있으므로 의약, 기능성 건강식품, 화장품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1a 내지 도 1d 는 본 발명 S. cdrevisiae FF-8 효모균주를 7 L 발효조에서 72시간 배양결과 교반속도가 세포성장에 미치는 효과를 보인 그래프이다.

도 2 는 7 L 발효조에서 교반속도가 글루타치온 생산과 건조세포무게(DCW)에 미치는 효과를 나탄낸 그림이다.

도 3 은 7 L 발효조내의 온도 30℃, 교반속도 200 rpm의 발효조건에서 공기공급속도(vvm)가 글루타치온 생산과 건조세포무게(DCW)에 미치는 효과를 나타낸 그림이다.

도 4a 내지 도 4d 는 100 L 발효조내의 온도 30℃, 200 rpm, 2.0 vvm의 조건하에서의 세포성장에 미치는 내부압력의 효과를 보인 그래프이다.

도 5 는 본 발명 균주가 100 L 발효조내에서 온도 30℃, 200 rpm, 2.0 vvm의 조건하에서 72시간 배양한 결과 내부압이 글루타치온 농도에 미치는 효과를 나타낸 그림이다.

Claims

글루타치온 고생산성 효모균주 S. cerevisiae FF-8 (KACC 93023)를 글루코스 3%(w/v), 효모추출물 3%, KH₂PO₄ 0.06%, L-cysteine 0.06%의 배양용 배지를 첨가한 발효조에서 배양온도 30℃, 초기 pH 6.0, 교반속도 200 rpm, 공기공급속도 2.0 vvm, 내부압력 0.8 kgf/㎠ 조건에서 글루타치온을 생산하는 방법.
제1항 또는 제2항의 방법은 7 L 이상의 발효조에서 회분식 발효 또는 유가식 발효함을 특징으로 하는 글루타치온 생산방법.