CH658868A5

CH658868A5 - Verfahren zur herstellung von s-adenosyl-methionin.

Info

Publication number: CH658868A5
Application number: CH762/83A
Authority: CH
Inventors: Shozo Shiozaki; Hideaki Yamada; Yoshiki Tani; Sakayu Shimizu
Original assignee: Nippon Zeon Co
Priority date: 1982-02-25
Filing date: 1983-02-10
Publication date: 1986-12-15
Also published as: IT8319490A0; GB2116172B; GB2116172A; DE3304468C2; ES8403524A1; DE3304468A1; US4562149A; IT1193668B; GB8303031D0; AR230457A1; ES519652A0; BR8300654A; IT8319490A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von S-Adenosyl-methio-nin mittels Hefezellen der Gattung Saccharomyces. Das S-Adenosyl-methionin ist in hoher Reinheit mit gutem Wirkungsgrad und auf einfache Art erhältlich.

S-Adenosyl-methionin, das im nachstehenden kurz mit «SAM» bezeichnet wird, ist eine Substanz mit therapeutischer Wirkung auf Leberverfettung, Lipämie, Arteriosclerose und dergleichen, so dass es in letzter Zeit erwünscht ist, diese Substanz in grossen Mengen herzustellen.

Eine bisher vorgeschlagene industrielle Methode zur Herstellung von SAM umfasst Züchtung einer Hefe der Gattung Saccharomyces in einem Methionin enthaltenden, flüssigen Kulturmedium, Extraktion des in den mikrobiellen Zellen angesammelten SAM und dessen Reinigung (siehe beispielsweise «J. Biol. Chem.» 229,1037 [1957]).

Nach dieser Methode beträgt jedoch der in den Zellen angesammelte Mengenanteil SAM höchstens etwa 3 Gew.-%, und der aus den mikrobiellen Zellen erhaltene Extrakt ist sehr schwierig zu reinigen, da er grosse Mengenanteile von ade-ninverwandten oder ninhydrinreaktiven Substanzen enthält, die von SAM schwierig abzutrennen sind. Besonders schwierig ist die Abtrennung von Adenin, S-Adenosyl-homocystein und Methylthioadenosin.

In Bestrebungen, diese Nachteile zu beheben, wurden einige Methoden zur Reinigung von SAM vorgeschlagen, beispielsweise in den JP-AS 13680/1971,21079/1974 und 20998/1978, und in der JP-OS 145299/1981, die sich jedoch als ungenügend zur ökonomischen Erzielung von SAM hoher Reinheit in einem hohen Gewinnungsverhältnis erwiesen haben.

Es ist auch eine Methode bekannt, welche die Züchtung einer Hefe einer der Gattungen Candida, Pichia, Hansenula, Rhodotorula und dergleichen zur Bildung und Ansammlung von SAM in den Zellen oder dem Kulturmedium umfasst, wie 5 beispielsweise in der JP-AS 17118/1977 beschrieben. Auch in einer derartigen Methode ist jedoch die Reinigung von SAM in den mikrobiellen Zellen schwierig, und die Gewinnung von SAM aus dem Kulturmedium ist noch schwieriger, da das Kulturmedium ausser SAM zusätzlich verschiedene Metabo-io liten oder das Zersetzungsprodukt von SAM enthält.

In der US-A3 962 034 wird ebenfalls ein entsprechendes Verfahren beschrieben. Hier wird SAM simultan mit Methylthioadenosin (MTA) erhalten.

Ausserdem ist es, da SAM eine sehr unstabile Substanz 15 ist, oft üblich, für Transporte microbielle Zellen, die SAM enthalten, einzusetzen. In diesem Fall ist der geringe Gehalt an SAM ökonomisch nachteilig.

Zur Behebung der vorstehend beschriebenen Nachteile des Standes der Technik wurde intensiv nach einer industriel-20 len Methode zur Herstellung von SAM nach einer Fermentationsmethode geforscht. Es wurde dabei gefunden, dass bei Erhöhung des Gehaltes von SAM in mikrobiellen Zellen auf einen nach dem Stand der Technik nicht erzielbaren Gehalt, die Mengenanteile an in den mikrobiellen Zellen vorhande-25 nen und schwer von SAM abtrennbaren Verunreinigungen relativ zum Gehalt an SAM sehr klein werden und derartige mikrobielle Zellen sehr leicht zu reinigen sind, so dass ökonomische Herstellung von SAM hoher Reinheit in hohem Gewinnungsverhältnis ermöglicht wird.

30 Gegenstand der Erfindung ist somit das im Patentanspruch 1 definierte Verfahren.

Im erfindungsgemässen Verfahren kann jeder beliebige Hefe-Mikroorganismus der Gattung Saccharomyces verwendet werden, welcher die Fähigkeit zur Produktion von SAM 35 aufweist und ermöglicht, in einem flüssigen, Methionin enthaltenden Kulturmedium bei einem pH-Wert von 3-8 und einer Temperatur von 15-45°C und unter aeroben Bedingungen, in den Hefezellen mindestens 10 Gew.-% SAM, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, anzusammeln. 40 Bevorzugte Hefen der Gattung Saccharomyces sind solche der Gattung Saccharomyces cerevisiae. Spezifische Beispiele hierfür sind Saccharomyces cerevisiae IFO 2342,2343, 2345,2346 und 2347 sowie die Sake-Hefe Kyokai Nr. 9. Es können auch natürliche und künstliche Mutanten dieser 45 Stämme, welche die genannten Eigenschaften aufweisen, verwendet werden.

Das Kulturmedium enthält in der Regel Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und sehr geringe Mengenanteile von organischen Nährquellen.

so Der Mengenanteil Methionin im Kulturmedium beträgt üblicherweise mindestens 0,2 g/dl. Das Methionin kann entweder gleichzeitig in einem einzigen Zusatz oder portionenweise nacheinander zugesetzt werden. Im ersteren Fall neigt jedoch bei gleichzeitiger Zugabe eines grossen Mengenanteils 55 Methionin der in der mikrobiellen Zelle angesammelte Mengenanteil SAM dazu, abzunehmen. In solchen Fällen ist es zweckmässig, die letztgenannte Zugabenmethode anzuwenden.

Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Glu-60 cose, Sucrose,'Fructose; Alkohole, wie Ethanol, Glycerin; Stärke-Hydrolysate; Melassen; Sojabohnenmolke; flüssige Abfälle aus der Fruchtsaftherstellung, Fischverarbeitung, Fermentation und Pulpeherstellung. Bevorzugte Stickstoffquel-len sind Harnstoff, Tri- und Tetramethylendiamin, Spermin, 65 Spermidin, 3-Amino-l,2,4-triazol.

Je nach Bedarf können gewöhnliche anorganische Salze verwendet werden. Beispiele hierfür sind Phospahte, wie Kalium-, Natrium-, Calcium- und Lithiumphosphat; Kali

3

658 868

salze, wie Kaliumchlorid; Natriumsalze, wie Natriumchlorid und -carbonat; Magnesiumsalze, wie Magnesiumsulfat und -chlorid; Mangansalze, wie Mangansulfat und -chlorid; Eisensalze, wie Eisensulfat und -chlorid; Zinksalze; Kupfersalze; Kobaltsalze.

Beispiele von organischen Nährstoffquellen, die je nach Bedarf verwendet werden können, sind Vitamine, Aminosäuren, Hefe-, Fleisch- und Malzextrakt, Mais-Einweich- und -Brühflüssigkeit, Casaminosäuren, Sojabohnenmehl und -hydrolysate, Pepton, Trypton und Zersetzungsprodukte von Casein.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen bei 15-45°C unter Einstellung des pH-Wertes des Kulturmediums auf 3-8 ausgeführt, wobei SAM gebildet und in den mikrobiellen Zellen angesammelt wird.

Das Kulturmedium weist vorzugsweise eine Temperatur von 20-35 °C und einen pH-Wert von 3,5-7 auf. Die Züchtung wird in der Regel während 2-10 d durchgeführt.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden die Hefezellen nach der Züchtung aus dem Kulturmedium abgetrennt und danach wird SAM aus den Zellen extrahiert und gereinigt. In diesen Verfahrensschritten können allgemein bekannte Methoden zum Einsatz gelangen. Beispielsweise können die Hefezellen aus dem Kulturmedium durch Zentri-fugation oder Filtration abgetrennt werden. Zur Gewinnung von SAM aus den Hefezellen können diese mittels eines Extraktionsmittels, wie Perchlor-, Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Ameisen-, Essigsäure, Formiat- oder Acetatestern, Ethanol extrahiert und das SAM im Extrakt auf übliche Art gereinigt werden, wobei die Reinigungsmethode keiner besonderen Einschränkung unterliegt. Beispielsweise kann die Reinigung nach einer einzigen oder einer Kombination der folgenden Methoden erfolgen: Chromatographie unter Verwendung von Aktivkohle, stark- oder schwachsauren Kationenaustauscherharzen oder Chelatharzen; Ausfällung von SAM mittels Reineckesalz, Pikrin-, Phosphorwolfram-, Pikrolonsäure und dergleichen, oder Ausfällung von SAM mittels eines organischen Lösungsmittels, wie Aceton oder Ethanol. Zur

Erzielung von SAM in einer stabilisierten Form ist es allgemein üblich, eine Säure, wie Schwefel-, p-Toluolsulfon- oder Sulfosalicylsäure, zuzusetzen und SAM in Form eines Salzes oder Doppelsalzes zu gewinnen.

5 Zum Transport von unstabilem SAM können Hefezellen der Gattung Saccharomyces, worin SAM in hoher Konzentration enthalten ist, verwendet werden. Da diese Hefezellen ausserdem schwer von SAM abtrennbare Verunreinigungen nur in niedrigen Konzentrationen enthalten, ist die Reinigung io von SAM leicht und demzufolge kann SAM hoher Reinheit mit gutem Wirkungsgrad gewonnen werden.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur spezifischen Erläuterung der Erfindung.

15 Beispiel 1

Die in Tabelle 1 angeführten Mikroorganismen wurden einzeln während 2 d in einem Agar-Schrägkulturmedium mit pH-Wert 6,0, enthaltend 5 g/dl Glukose, 0,5 g/dl Polypepton, 0,4 g/dl KH2PO4, 0,4 g/dl K2HPO4, 0,02 g/dl MgSC>4.7H20, 20 0,2 g/dl Hefeextrakt und 2 g/dl Agar gezüchtet. Mit einer Drahtschlaufe voll von jedem der gezüchteten Mikroorganismen wurden jeweils 10 ml eines heisssterilisierten Kulturmediums mit pH-Wert 6,0, enthaltend 10 g/dl Sucrose, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,4 g/dl KH2PO4,0,01 g/dl MgS04.7H20, 25 1,0 g/dl L-Methionin, 0,25 mg/dl ZnS04.7Hz0 und

1,25 mg/dl MnS04.4-6Hî0 geimpft und unter Schütteln bei 28 °C während 4 d gezüchtet werden.

Dann wurden die gezüchteten mikrobiellen Zellen durch Zentrifugation abgetrennt, mit physiologischer Salzlösung 30 gewaschen, in 1,5N Perchlorsäure suspendiert und zwecks Extraktion von SAM während 1 h bei Zimmertemperatur geschüttelt. Der jeweils erhaltene Extrakt wurde Papierchromatographie und Hochleistungs-Flüssigchromatographie unterzogen zur Bestimmung von SAM, Adenin (Kurzbezeich-35 nung «Ad»), S-Adenosyl-homocystein (Kurzbezeichnung «Sah») und Methylthioadenosin (Kurzbezeichnung «MTA»). Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 1 angeführt.

Tabelle 1

Versuch Nr.

Mikroorganismus, Stamm

Gehalt SAM, Mengenanteil Mengenanteil bezogen auf Ad SAH

Zellen-Trockengew. (*) (*)

Gew.-%

Mengenanteil

MTA

+ *)

erfindungsgemäss

1-1

Saccharo

IFO 2342

14,8

2,5 x 10"3

0,06

0,03

1-2

myces

IFO 2343

12,9

3,8 x 10"3

0,13

0,08

1-3

cerevisiae

IFO 2345

13,0

6,2 x 10~3

0,09

0,04

1-4

IFO 2346

19,1

1,9 x IO"3

0,06

0,02

1-5

IFO 2347

16,7

8,3 x IO-3

0,06

0,03

1-6

Hefe von «Sake Kyokai Nr. 9»

18,5

2,7 x 10~3

0,06

0,07

Vergleich

1-7

Saccharo

IFO 0259

3,1

9,6 x 10"2

1,6

0,54

1-8

myces

IFO 1346

4,0

5,3 x 10~2

1,4

0,33

1-9

cerevisiae

IAM4175

1,8

8,8x 10~2

3,5

0,69

1-10

IAM 4274

5,3

5,9 x IO"2

1,4

0,90

1-11

IFO 2003

5,1

4,9 x 10"2

1,7

0,34

1-12

IFO 2363

2,1

7,3 x IO"2

3,1

0,47

(*) Die relativen Werte wurden unter Annahme eines Mengenanteils SAM von 100 errechnet.

Aus Tabelle 1 geht hervor, dass bei einem Gehalt an SAM von mehr als 12 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, die Mengenanteile von schwierig vom SAM abtrennbaren Verunreinigungen gering sind.

Beispiel 2

Mikrobielle Zellen mit unterschiedlichem Gehalt von SAM, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, wurden durch Züchtung von Saccharomyces cerevisiae IFO 2346 im

658 868

4

gleichen Kulturmedium und nach dem gleichen Vorgehen wie in Beispiel 1 beschrieben, mit den Ausnahmen hergestellt, dass die Züchtungsdauer, der pH-Wert des Kulturmediums und die Züchtungstemperatur verändert wurden. Die erhaltenen gezüchteten mikrobiellen Zellen wurden extrahiert und analysiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 2 angeführt.

Tabelle 2

Versuch Gehalt SAM, Mengen- Mengen- Mengen-

Nr. bezogen auf anteil Ad anteil anteil

Zellen-Trockengew. (*) SAH MTA

Gew.-% (*) (*)

erfindungsgemäss

2-1

19,9

l,8xl0-3

0,06

0,01

2-2

19,1

l,9xl0-3

0,06

0,02

2-3

16,3

3,1 x IO"3

0,08

0,04

2-4

15,1

6,2xl0-3

0,28

0,04

2-5

12,0

9,3 x IO"3

0,30

0,07

Vergleich

2-6

6,2

4,9 xlO"2

9,9

0,33

2-7

3,5

5,4 xlO"2

1,4

0,33

2-8

1,8

9,6 xlO"2

1,7

0,37

Beispiel 3

Je 10 ml eines heisssterilisierten Kulturmediums mit pH-Wert 6,0, enthaltend 5 g/dl Glukose, 0,5 g/dl Polypepton, 0,4 g/dl KH2PO4, 0,4 g/dl K2HPO4, 0,02 g/dl MgS04.7H20 und 0,2 g/dl Hefeextrakt, wurden mit einer Drahtschlaufe voll je eines der in Tabelle 3 angeführten Mikroorganismen geimpft und bei 28 °C während 24 h unter Schütteln gezüchtet.

1 Liter eines Kulturmediums mit pH-Wert 6,0, enthaltend 10 g/dl Sucrose, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,4 g/dl KH2PO4, 0,01 g/dl MgS04.7H20,1,5 g/dl separat sterilisierten Harnstoff, 0,75 g/dl L-Metionin, 0,02 g/dl CaCh.2H20, 0,25 mg/dl

ZnS04.7H20,0,25 mg/dl FeS04.7H20,125 mg/dl MnS04.4-6H20,2 ng/dl CuS04.5H20, 2 ng/dl H3BO3, 0,2 jj.g/dl C0CI2.6H2O und 1 ug/dl KI wurden in einen 2-Liter-Fermenter gefüllt und sterilisiert.

5 Der Inhalt je eines solchen Fermenters wurde dann mit 5 ml einer der wie vorstehend beschrieben hergestellten Saat-Kulturbrühen geimpft und bei 28 °C unter Belüftung und Bewegen während 22 h gezüchtet.

Nach Abschluss der Züchtung wurden die mikrobiellen 10 Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, einmal mit physiologischer Salzlösung gewaschen, in 100 ml 1,5N Perchlorsäure suspendiert und während 1 h bei Zimmertemperatur geschüttelt. Dann wurde die Suspension zur Abtrennung der mikrobiellen Zellen zentrifugiert und die erhaltene Flüssigkeit 15 durch Zusatz von Kalium-hydrogencarbonat auf den pH-Wert 4,5 gestellt. Die gebildete Ausfällung von Kaliumper-chlorat wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, wobei ein SAM enthaltender Extrakt erhalten wurde. Der Gehalt an SAM im jeweiligen Extrakt wurde bestimmt und ist in Tabelle 20 3 in Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, angegeben.

Die jeweilige, 0,2 g SAM enthaltende Menge Extrakt wurde zwecks Adsorption des SAM durch eine Säule geschickt, die mit 50 ml «Amberlite» IRC-50 in H+-Form, 25 einem schwach sauren Kationenaustauscherharz gefüllt war. Dann wurde die Säule mit 0,005N Essigsäure solange durchgespült, bis das Eluat eine Absorption bei 260 nm von weniger als 0,1 aufwies und somit Verunreinigungen entfernt waren. Das bis zum Erreichen dieses Punktes durch die Säule 30 gelaufene Volumen an 0,005N Essigsäure ist in Tabelle 3 angegeben. Dann wurde SAM eluiert, indem 0,1N Schwefelsäure solange durch die Säule geleitet wurde, bis das Eluat eine Absorption bei 260 nm von weniger als 0,05 aufwies. Das Eluat wurde mit «Amberlite» IRA 900 Harz in OH~-Form 35 behandelt, um den pH-Wert 3,0 einzustellen und danach zur Gewinnung von SAM-Sulfat lyophilisiert. Das jeweilige prozentuale Gewinnungsverhältnisvon SAM ist in Tabelle 3 angegeben. Die Reinheit von SAM wurde bestimmt durch Cellulose-Dünnschichtchromatographie, Papierchromatogra-40 phie und Hochleistungs-Flüssigchromatographie und der jeweils erhaltene prozentuale Wert ist in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Versuch

Mikroorganismus,

Gehalt SAM,

Zur Entfernung der

Gewinnungsver

Reinheit von Ninhydrinreak-

Nr.

Stamm

bezogen auf

Verunreinigungen hältnis von

SAM %

tion von anderen

Zellen-Trocken benötigtes Volumen

SAM, %

(*1)

Substanzen als

gew. Gew.-%

0,005 N Essigsäure, ml

SAM (*2)

erfindungsgemäss

3-1

Saccharo

IFO 2343

12,1

980

94

95

Spur(±)

3-2

myces

IFO 2346

18,8

770

96

Spur(±)

3-3

cerevisiae

IFO 2347

16,7

890

94

95

Spur(±)

Vergleich

3-4

Saccharo

IFO 1346

3,1

1910

86

84

+ +

3-5

myces

IAM 4274

4,0

1760

86

83

+ +

3-6

cerevisiae

IFO 2363

2,1

2440

81

86

+ +

(*1): Reinheit von SAM

Nach Entwicklung durch zweidimensionale Papierchromatographie wurde ein SAM zugeschriebener Fleck entdeckt. Dann wurde ein dem Fleck von SAM entsprechender Teil abgeschnitten und aus dem abgeschnittenen Teil SAM mit 0,1N Salzsäure extrahiert. Die Reinheit von SAM wurde aus dem molekularen Extinktionscoeffizient (15400) von SAM bei 260 nm errechnet.

(*2): Ninhydrinreaktion von anderen Substanzen als SAM Nach Entwicklung durch zweidimensionale Cellulose-Dünnschichtchromatographie wurden durch Farbreaktion von Ninhydrin gebildete Flecken festgestellt, die anderen Substanzen als SAM zugeschrieben.

Aus Tabelle 3 geht hervor, dass beim erfindungsgemässen Verfahren das zur Entfernung von Verunreinigungen benötigte Eluatvolumen klein sein kann, und das Gewinnungsverhältnis und die Reinheit von SAM sehr gut sind.

G

Claims

658 868

1. Verfahren zur Herstellung von S-Adenosyl-methionin, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Hefe-Mikroorganismus der Gattung Saccharomyces, der die Fähigkeit zur Produktion von S-Adenosyl-methionin aufweist, in einem flüssigen, Methionin enthaltenden Kulturmedium mit einem pH-Wert von 3-8 und bei einer Temperatur von 15-45 °C unter aeroben Bedingungen züchtet, um Zellen, die mindestens 10 Gew.-% S-Adenosyl-methionin, bezogen auf die trockenen Hefezellen, enthalten und im wesentlichen frei von Methylt-hioadenosin sind, zu erhalten, und dass man dann die Hefe-Zellen vom Kulturmedium abgetrennt und danach aus den Hefezellen S-Adenosyl-methionin in stabiler Form gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezellen, die mindestens 10 Gew.-% S-Adenosyl-methionin enthalten, nicht mehr als 0,08 Gewichtsteile Methylthioadenosine pro 100 Gewichtsteile S-Adenosyl-methionin aufweisen.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezellen so lange gezüchtet werden, bis sie mindestens 12 Gew.-% S-Adenosyl-methionin, auf Basis der trockenen Hefezellen, enthalten.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Hefe-Mikroorganismus eine Hefe der Gattung Saccharomyces cerevisiae ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefe der Gattung Saccharomyces cerevisiae ausgewählt ist aus der Gruppe

Saccharomyces cerevisiae IFO 2342,

Saccharomyces cerevisiae IFO 2343,

Saccharomyces cerevisiae IFO 2345,

Saccharomyces cerevisiae IFO 2346,

Saccharomyces cerevisiae IFO 2347.