DE3304468C2

DE3304468C2 -

Info

Publication number: DE3304468C2
Application number: DE3304468A
Authority: DE
Inventors: Shozo Shiozaki; Hideaki Yamada; Yoshiki Tani; Sakayu Kyoto Jp Shimizu
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1982-02-25
Filing date: 1983-02-09
Publication date: 1991-11-14
Also published as: AR230457A1; BR8300654A; IT1193668B; GB8303031D0; DE3304468A1; CH658868A5; IT8319490A1; GB2116172A; US4562149A; ES8403524A1; ES519652A0; IT8319490A0; GB2116172B

Description

Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 angegebenen Mikroorganismenzellen sowie das im Anspruch 4 angegebene Verfahren zur Herstellung von S-Adenosylmethionin. Die Ansprüche 2 und 3 bzw. 5 und 6 betreffen Ausgestaltungen der Ansprüche 1 bzw. 4.

S-Adenosylmethionin (welches im folgenden als SAM abgekürzt wird) ist als Substanz bekannt, die therapeutische Wirkung bei Jecur-Adipsie, Lipämie, Arteriosklerose, etc. aufweist, und es besteht seit kurzem ein Bedarf, diese Substanz in großen Mengen herzustellen.

Ein industrielles Verfahren zur Herstellung von SAM besteht darin, daß man eine Hefe des Genus Saccharomyces in einem flüssigen Kulturmedium, das Methionin enthält, züchtet, das sich in den Mikroorganismenzellen angesammelte SAM extrahiert und reinigt [vgl. z. B. J. Biol. Chem., 229, 1037 (1957)]. Bei diesem Verfahren beträgt jedoch die Menge an SAM, die sich in den Zellen akkumuliert, höchstens etwa 3%, und es ist sehr schwierig, den Extrakt aus den Mikroorganismenzellen zu reinigen, da er sehr große Mengen an Adenin-verwandten Substanzen oder Ninhydrin-reaktiven Substanzen enthält, welche schwierig von SAM abzutrennen sind. Es ist besonders schwierig, Adenin, S-Adenosylhomocystein und Methylthioadenosin abzutrennen. Bei einem Versuch, diesen Nachteil zu vermeiden, wurden Verfahren zur Reinigung von SAM vorgeschlagen (z. B. JA-AS 13 680/1971, 21 079/1974 und 20 998/1978 sowie JA-OS 1 45 299/1981). Diese Verfahren sind jedoch für die Herstellung von SAM mit hoher Reinheit auf wirtschaftliche Weise in hoher Ausbeute nicht zufriedenstellend.

Es ist weiterhin ein Verfahren bekannt, bei dem eine Hefe, die zum Genus Candida, Pichia, Hansenula, Rhodotorula, etc. gehört, gezüchtet wird, wobei sich SAM in den Zellen des Kulturmediums bilden und ansammeln kann (z. B. JA-AS 17 118/1977). Bei diesem Verfahren ist ebenfalls die Reinigung von SAM in den Mikroorganismenzellen schwierig, und die Gewinnung von SAM aus dem Kulturmedium ist besonders schwierig, da das Kulturmedium verschiedene Metaboliten oder Abbauprodukte von SAM zusätzlich zu SAM enthält.

Aus CA 204 814 s Band 83, 1975 sind Mikroorganismen bekannt, die S-Adenosylmethionin in einer Menge von 85 mg/g trockene Zellen enthalten. Die US-PS 39 62 034 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von S-Adenosylmethionin und Methylthioadenosin, wobei Hefezellen in einem Kulturmedium, das L-Methionin enthält, gezüchtet werden.

Da SAM weiterhin eine sehr instabile Substanz ist, ist es oft allgemeine Praxis, die Mikroorganismenzellen, welche SAM enthalten, an entfernte Stellen zu transportieren. In diesem Fall ist der niedrige Gehalt an SAM wirtschaftlich nachteilig.

Zur Beseitigung der zuvor erwähnten Nachteile der bekannten Verfahren hat die Anmelderin das industrielle Verfahren zur Herstellung von SAM durch Fermentation untersucht. Die Arbeiten haben schließlich zu der Erfindung geführt, daß, wenn der Gehalt an SAM in dem Zellen der Mikroorganismen über einen bestimmten Wert, der nach dem bekannten Verfahren nicht erhalten werden kann, erhöht wird, die Menge an Verunreinigungen, die in den Mikroorganismenzellen vorhanden sind und die schwierig von SAM abzutrennen sind, bezogen auf SAM, gering wird und daß solche Mikroorganismenzellen sehr leicht gereinigt werden können und daß SAM mit hoher Reinheit wirtschaftlich in hoher Ausbeute erhalten werden kann.

Gegenstand der Erfindung sind Mikroorganismenzellen, die in sich akkumuliert mindestens 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der trockenen Zellen, an SAM enthalten, wobei die Zellen erhalten werden, indem man Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, S-Adenosylmethionin zu bilden, in einem flüssigen Kulturmedium, welches Methionin enthält, züchtet und wobei die Mikroorganismenzellen Adenin-verwandte Substanzen und Ninhydrin-reaktive Substanzen in geringen Konzentrationen enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von SAM, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Mikroorganismen, die die Fähigkeit aufweisen, SAM zu bilden, in einem flüssigen Kulturmedium, welches Methionin enthält, züchtet, so daß mindestens 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der trockenen Zellen, an SAM in den Mikroorganismenzellen akkumuliert werden, und man dann die Mikroorganismenzellen von dem Kulturmedium trennt und SAM in stabiler Form aus den Mikroorganismenzellen gewinnt und wobei die Mikroorganismenzellen Adenin- verwandte Substanzen und Ninhydrin-reaktive Substanzen in geringen Konzentrationen enthalten.

Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen können irgendwelche Mikroorganismen sein, solange sie die Fähigkeit aufweisen, SAM zu erzeugen, und die Akkumulation von mindestens 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der trockenen Zellen, an SAM in den Mikroorganismenzellen in einem flüssigen Medium, das Methionin enthält, erlauben. Hefen des Genus Saccharomyces sind bevorzugt und Hefen von Saccharomyces cerevisiae sind besonders bevorzugt. Spezifische Beispiele sind Saccharomyces cerevisiae IFO 2342, Saccharomyces cerevisiae IFO 2343, Saccharomyces cerevisiae IFO 2345, Saccharomyces cerevisiae IFO 2346 und Saccharomyces cerevisiae IFO 2347.

Natürliche und künstliche Mutanten dieser Stämme, welche die obigen Eigenschaften aufweisen, können ebenfalls verwendet werden.

Die Mikroorganismenzellen gemäß der Erfindung enthalten SAM in einer Menge von mindestens 10 Gew.-%, bevorzugt mindestens 12 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der trockenen Zellen.

Die Mikroorganismenzellen gemäß der Erfindung sind hinsichtlich des Verfahrens zu ihrer Herstellung nicht irgendeiner Beschränkung unterworfen, und sie werden im allgemeinen hergestellt, indem man die Mikroorganismen bei aeroben Bedingungen in einem flüssigen Kulturmedium, welches Methionin, Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und sehr geringe Mengen organischer Nährquellen enthält, züchtet.

Methionin wird im allgemeinen in einem Verhältnis von mindestens 0,2 g/dl zu dem Kulturmedium zugesetzt. Methionin kann auf einmal oder nacheinander in Teilportionen zugegeben werden. Wenn jedoch das erstere Verfahren angewendet wird und wenn die Menge an zugegebenem Methionin groß ist, kann die Menge an SAM, die sich in den Mikroorganismenzellen akkumuliert, sinken. In einem solchen Fall ist es besser, das letztere Verfahren zu verwenden.

Beispiele von Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Glucose, Saccharose und Fructose, Alkohole, wie Ethanol und Glycerin, Stärkehydrolysate, Melassen, Sojabohnen, Sojabohnenmehl, Molke, Abfallflüssigkeiten von Fruchtsäften, Abfallflüssigkeiten der Fischverarbeitung, Fermentationsabfallflüssigkeiten und Flüssigkeiten von verbrauchter Pulpe. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Harnstoff, Trimethylendiamin, Tetramethylendiamin, Spermin, Spermidin und 3-Amino-1,2,4-triazol.

Übliche organische Salze können je nach Erfordernis verwendet werden. Beispiele sind Phosphate, wie Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Calciumphosphat und Lithiumphosphat; Kaliumsalze, wie Kaliumchlorid; Natriumsalze, wie Natriumchlorid und Natriumcarbonat; Magnesiumsalze, wie Magnesiumsulfat und Magnesiumchlorid; Mangansalze, wie Mangansulfat und Manganchlorid; Eisensalze, wie Eisensulfat und Eisenchlorid; Zinksalze; Kupfersalze und Kobaltsalze.

Beispiele organischer Nährquellen, die erforderlichenfalls verwendet werden können, sind Vitamine, Aminosäuren, Hefeextrakt, Malzextrakt, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Casaminosäure, Sojabohnenmehl, Sojabohnenhydrolysat, Pepton, Trypton und ein Abbauprodukt von Casein.

Die Züchtung erfolgt vorzugsweise unter aeroben Bedingungen. Im allgemeinen erfolgt die Züchtung bei einer Temperatur von 15 bis 45°C, bevorzugt 20 bis 35°C, während 2 bis 10 Tagen, während der pH-Wert des Kulturmediums auf 3 bis 8, vorzugsweise 3,5 bis 7, eingestellt wird, und wobei sich SAM in den Mikroorganismenzellen bildet und dort akkumuliert.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Mikroorganismenzellen von dem Kulturmedium nach der Züchtung abgetrennt, und dann wird SAM aus den Mikroorganismenzellen extrahiert und gereinigt. Bei diesen Stufen können an sich bekannte Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann man eine Zentrifugentrennung oder Filtration zum Trennen der Mikroorganismenzellen aus dem Kulturmedium verwenden. Bei der Erzeugung von SAM aus den Mikroorganismenzellen ist es möglich, SAM aus den Zellen zu extrahieren, indem man ein Extraktionsmittel, wie Perchlorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Formiatester, Acetatester oder Ethanol, verwendet und SAM in dem Extrakt auf übliche Weise reinigt. Hinsichtlich des Reinigungsverfahrens von SAM gibt es keine besonderen Beschränkungen. Beispielsweise kann man ein chromatographisches Verfahren, bei dem Aktivkohle, stark saure Kationenaustauschharze, schwach saure Kationenaustauschharze oder Chelatharze verwendet werden; ein Verfahren, bei dem SAM mit Reineckesalz, Picrinsäure, Phosphowolframsäure, Picrolonsäure, etc. präzipitiert wird; und ein Verfahren, bei dem SAM unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, wie Aceton oder Ethanol, präzipitiert wird, verwenden. Diese Verfahren können allein oder in Kombination angewandt werden. Zur Herstellung von SAM in stabilisierter Form ist es allgemeine Praxis, eine Säure, wie Schwefelsäure, p-Toluolsulfonsäure oder Sulfosalicylsäure, zuzugeben und SAM als Salz oder Doppelsalz zu isolieren.

Die erfindungsgemäßen Mikroorganismenzellen sind für den Transport der instabilen SAM geeignet, da sie SAM in hohen Konzentrationen enthalten. Da diese Mikroorganismenzellen nur geringe Konzentrationen an Verunreinigungen enthalten, die schwierig von SAM abzutrennen sind, ist es leicht, SAM zu reinigen, und daher kann SAM in hoher Reinheit mit guter Ausbeute hergestellt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Es wurde eine Öse voll der jeweiligen in der folgenden Tabelle 1 angegebenen Mikroorganismenstämme verwendet. Diese waren während 2 Tagen auf einem Agarschrägkulturmedium (pH 6,0) gezüchtet worden, wobei das Medium 5 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Polypepton, 0,4 g/dl KH₂PO₄, 0,4 g/dl K₂HPO₄, 0,02 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O, 0,2 g/dl Hefeextrakt und 2 g/dl Agar enthielt. Es wurden 10 ml eines in der Wärme sterilisierten Kulturmediums, dessen pH auf 6,0 eingestellt war und welches 10 g/dl Saccharose, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,4 g/dl KH₂PO₄, 0,01 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O, 1,0 g/dl L-Methionin, 0,25 mg/dl ZnSO₄ · 7 H₂O und 1,25 mg/dl MnSO₄ · 4-6 H₂O enthielt, inokuliert, und dann wurde unter Schütteln 4 Tage bei 28°C gezüchtet.

Die Mikroorganismenzellen wurden durch Zentrifugentrennung gesammelt, mit physiologischer Salzlösung gewaschen, in 1,5 N Perchlorsäure suspendiert und 1 h bei Zimmertemperatur zur Extraktion von SAM geschüttelt. Der Extrakt wurde der Papierchromatographie und der Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie zur Bestimmung von SAM, Adenin (kurz Ad), S-Adenosylhomocystein (kurz SAH) und Methylthioadenosin (kurz MTA) unterworfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Die Ergebnisse der Tabelle 1 zeigen, daß, wenn der Gehalt an SAM, bezogen auf die trockenen Zellen, über 12% liegt, der Gehalt an Verunreinigungen, die schwierig von SAM abzutrennen sind, sehr gering ist.

Beispiel 2

Mikroorganismenzellen mit unterschiedlichen Gehalten an SAM, bezogen auf das Gewicht der trockenen Zellen, werden hergestellt, indem man Saccharomyces cerevisiae IFO 2346 in dem gleichen Kulturmedium wie in Beispiel 1 züchtet, mit der Ausnahme, daß die Züchtungszeit, der pH des Kulturmediums und die Züchtungstemperatur geändert werden. Die resultierenden Mikroorganismenzellen werden nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren extrahiert und analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Beispiel 3

10 ml von in der Hitze sterilisiertem Kulturmedium, dessen pH auf 6,0 eingestellt ist und welches 5 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Polypepton, 0,4 g/dl KH₂PO₄, 0,4 g/dl K₂HPO₄, 0,02 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O und 0,2 g/dl Hefeextrakt enthält, werden mit je einer Öse voll der in Tabelle 3 aufgeführten Stämme von Mikroorganismen inokuliert und dann wird 24 h unter Schütteln bei 28°C gezüchtet.

1 l Kulturmedium, dessen pH auf 6,0 eingestellt ist und welches 10 g/dl Saccharose, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,4 g/dl KH₂PO₄, 0,01 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O, 1,5 g/dl Harnstoff (getrennt sterilisiert), 0,75 g/dl L-Methionin, 0,02 g/dl CaCl₂ · 2 H₂O, 0,25 mg/dl ZnSO₄ · 7 H₂O, 0,25 mg FeSO₄ · 7 H₂O, 125 mg/dl MnSO₄ · 6 H₂O, 2 µg/dl CuSO₄ · 5 H₂O, 2 µg/dl H₃BO₃, 0,2 µg/dl CoCl₂ · 6 H₂O und 1 µg/dl KJ enthält, wird in ein 2 l Fermentationsgefäß gegeben und sterilisiert. Dann werden 5 ml Impfkulturbrühe, hergestellt wie oben beschrieben, zum Inokulieren des Kulturmediums verwendet, und dann wird 72 h bei 28°C unter Belüftung und Bewegung gezüchtet.

Nach der Züchtung werden die Mikrobenzellen durch Zentrifugentrennung gesammelt, einmal mit physiologischer Salzlösung gewaschen, in 100 ml 1,5 N Perchlorsäure suspendiert und 1 h bei Zimmertemperatur geschüttelt. Die Suspension wird dann zur Entfernung der Mikroorganismenzellen zentrifugiert und der pH der entstehenden Flüssigkeit durch Zugabe von Kaliumhydrogencarbonat auf 4,5 eingestellt. Der entstehende Niederschlag aus Kaliumperchlorat wird dann durch Zentrifugieren entfernt, und man erhält einen Extrakt, der SAM enthält. Die Menge an SAM in dem Extrakt wird bestimmt und die Menge an SAM, bezogen auf die trockenen Zellen, ist in Tabelle 3 angegeben.

Der Extrakt wird in einer Menge von 0,2 g als SAM durch eine mit 50 ml Amberlite IRC-50 (H⁺-Form), einem schwach sauren Kationenaustauscherharz, gefüllte Säule zur Adsorption von SAM geleitet. 0,005 N Essigsäure wird dann zum Auswaschen durch die Säule geleitet, bis die Absorption bei 260 nm des Eluats unter 0,1 liegt. Auf diese Weise werden die Verunreinigungen entfernt. Die Menge an 0,005 N Essigsäure, die dafür erforderlich ist, wird in Tabelle 3 angegeben. Dann wird 0,1 N Schwefelsäure durch die Säule geleitet, und SAM wird eluiert, bis die Absorption bei 260 nm des Eluats unter 0,05 liegt. Das Eluat wird dann mit Amberlite IRA 900-Harz (OH^--Form) behandelt, um seinen pH auf 3,0 einzustellen, dann wird es lyophilisiert, wobei man SAM-sulfat erhält. Das Wiedergewinnungsverhältnis von SAM ist in Tabelle 3 aufgeführt. Die Reinheit von SAM wird durch Cellulose-Dünnschichtchromatographie, Papierchromatographie und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bestimmt und ist in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

(1) Reinheit von SAM: Nach der Entwicklung bei der zweidimensionalen Papierchromatographie wird ein Fleck, der SAM zugeordnet wird, nachgewiesen. Dann wird ein Teil, der dem SAM-Fleck entspricht, abgeschnitten und SAM mit 0,1 N Chlorwasserstoffsäure aus dem abgeschnittenen Teil extrahiert. Die Reinheit von SAM wird aus dem Molekular-Extinktionskoeffizienten (15 400) von SAM bei 260 nm bestimmt.

(2) Ninhydrin-Reaktion der Substanzen, ausgenommen SAM: Nach der Entwicklung mittels der zweidimensionalen Cellulose-Dünnschichtchromatographie wird die Anwesenheit von Flecken, die Substanzen mit Ausnahme von SAM zuzuordnen sind, durch die Farbreaktion mit Ninhydrin festgestellt.

Aus Tabelle 3 ist erkennbar, daß bei der vorliegenden Erfindung die Menge an Eluat, die zur Entfernung der Verunreinigungen erforderlich ist, sehr gering ist und daß das Gewinnungsverhältnis von SAM und die Reinheit von SAM sehr gut sind.

Claims

1. Mikroorganismenzellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 10 Gew.-%, bezogen auf die trockenen Zellen, an S-Adenosylmethionin enthalten, wobei die Zellen erhalten werden, indem man Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, S-Adenosylmethionin zu bilden, in einem flüssigen Kulturmedium, welches Methionin enthält, züchtet und wobei die Mikroorganismenzellen Adenin-verwandte Substanzen und Ninhydrin-reaktive Substanzen in geringen Konzentrationen enthalten.

2. Mikroorganismenzellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Zellen einer Hefe des Genus Saccharomyces sind.

3. Mikroorganismenzellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Zellen einer Hefe sind, die zu Saccharomyces cerevisiae gehören.

4. Verfahren zur Herstellung von S-Adenosylmethionin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der die Fähigkeit aufweist, S-Adenosylmethionin zu bilden, in flüssigem Kulturmedium, welches Methionin enthält, züchtet, um mindestens 10 Gew.-% an S-Adenosylmethionin in den Mikroorganismenzellen, bezogen auf das Trockengewicht der Mikroorganismenzellen, zu akkumulieren, die Mikroorganismenzellen von dem Kulturmedium abtrennt und anschließend das S-Adenosylmethionin in stabiler Form aus den Mikroorganismenzellen gewinnt und wobei die Mikroorganismenzellen Adenin-verwandte Substanzen und Ninhydrin-reaktive Substanzen in geringen Konzentrationen enthalten.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine Hefe des Genus Saccharomyces ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine Hefe ist, die zu Saccharomyces cerevisiae gehört.