DE3231569C2

DE3231569C2 -

Info

Publication number: DE3231569C2
Application number: DE19823231569
Authority: DE
Inventors: Shozo Shiozaki; Hideaki Yamada; Yoshiki Tani; Sakayu Kyoto Jp Shimizu
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1982-08-25
Filing date: 1982-08-25
Publication date: 1990-11-08
Also published as: DE3231569A1

Description

Die Erfindung betrifft das durch den Anspruch 1 definierte Verfahren zur Herstellung von S-Adenosylmethionin. Die Ansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

S-Adenosylmethionin (welches im folgenden als SAM abgekürzt wird) ist eine wichtige biologisch aktive Substanz, die an dem Metabolismus von Fetten, Proteinen, Zuckern etc. in vivo teilnimmt. Es wurde kürzlich gefunden, daß SAM eine therapeutische Wirkung bei Jecur-Adipsie, Lipemia, Arterio sklerose, Depression, Schlaflosigkeit etc. besitzt, und es besteht ein Bedarf daran, es in großen Mengen herzustellen.

Verfahren zur Herstellung von SAM wurden in der Literatur beschrieben, und sie bestehen darin, daß man eine Hefe, die zum Genus Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Rhodo torula etc. gehört, oder einen Pilz, der zum Genus Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, etc. gehört, in einem Kulturmedium, welches Methionin enthält, züchtet, wobei SAM in den Mikrobenzellen oder in der Kulturbrühe gebildet wird und sich dort ansammelt [vgl. beispielsweise "Amino Acids", Nr. 4, Seite 95 (1961), japanische Patentveröffentlichungen 37 038/1972 und 17 118/1977 und "Journal of Bacteriology", Band 121, Seite 267 (1975)].

Die Menge an SAM, die sich bei diesen Verfahren ansammelt, reicht im allgemeinen nicht aus, und da eine beachtliche Menge der gebildeten SAM in das Kulturmedium fließt, ist der SAM-Gehalt der Mikrobenzellen niedrig. Als Folge muß bei der Reinigungsstufe eine große Menge des Kulturmediums behandelt werden. Da weiterhin das SAM, das sich im Kultur medium ansammelt, gegenüber Wärme instabil ist, ist seine Reinigung schwierig.

Die Anmelderin hat Versuche unternommen, um die Menge an SAM, die sich bei dem Fermentationsverfahren bildet, zu erhöhen, und es wurde gefunden, daß es wirksam ist, ein Kultur medium zu verwenden, welches eine bestimmte Verbindung zusätzlich zu Methionin, einer Vorstufe von SAM, enthält.

Gegenstand der Erfindung ist somit das im Anspruch 1 angegebene Verfahren.

Der bei der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus kann irgendein Stamm sein, der zu Saccharomyces cerevisiae gehört und die Fähigkeit hat, SAM in dem Kulturmedium, das Methionin enthält, zu bilden und zu bewirken, daß es sich ansammelt. Spezifische Beispiele sind Stämme, die unter IFO 2342, IFO 2343, IFO 2345, IFO 2346, IFO 2347 und IFO 2376 hinterlegt wurden. Natürliche und künstliche Mutanten dieser Stämme können ebenfalls verwendet werden, so lange sie die Fähigkeit haben, SAM zu bilden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es wesentlich, min destens eine Verbindung, ausgewählt unter (a) und (b), wie oben erwähnt, zu dem Kulturmedium zuzugeben. Die Ver bindung (a) ist ein niedriges Peptid, welches Glycin, Alanin oder sowohl Glycin als auch Alanin enthält, beispiels weise Dipeptide, Tripeptide und Tetrapeptide. Spezifische Beispiele sind Glycylglycin, Glycylglycylglycin, Glycylgly cylglycylglycin, DL-Alanyl-DL-Alanin, L-Alanyl-L-Alanyl-L- Alanin, L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanin und L-Alanyl- glycin. Diese niedrigen Peptide werden zu dem Kulturmedium normalerweise in einer Konzentration von mindestens 0,02 g/dl, bevorzugt 0,04 bis 4 g/dl, zugegeben.

Die Verbindung (b) ist ein Ammoniumsalz einer organischen Säure mit nicht mehr als 10 Kohlenstoffatomen. Spezifische Beispiele sind Ammoniumsalze von Mono-, Di- oder Tricarbonsäuren, wie Ammoniumsuccinat, Ammonium tartrat, Ammoniumlactat, Diammoniumcitrat, Triammonium citrat, Ammoniumoxalat und Ammoniumadipat. Die geeignete Konzentration des Ammoniumsalzes (b) in dem Kulturmedium beträgt mindestens 0,1 g/dl, bevorzugt 0,2 bis 2 g/dl.

Die Anwesenheit dieser Verbindungen in dem Kulturmedium gemäß der Erfindung aktiviert und begünstigt das Wachstum des Mikroorganismus. Insbesondere bewirkt die Anwesenheit der Verbindung (b) die Akkumulation von SAM in hohen Konzentrationen in den Zellen.

Ein Verfahren zur Herstellung von SAM durch Züchten von Saccharomyces cervisiae in einem Kulturmedium, welches Methionin enthält, ist bekannt. Bei dem bekannten Verfahren werden anorganische Salze, wie Ammoniumsulfat und Ammonium chlorid, als Stickstoffquellen verwendet. Bei dem bekannten Verfahren ist jedoch das Wachstum der Mikroorganismen nicht immer ausreichend, selbst wenn das Wachstum aktiviert wird, ist die Menge an SAM, die sich in den Zellen ansammelt, sehr gering.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Kultur medium wird in an sich bekannter Weise hergestellt, ausge nommen, daß die zuvor erwähnten spezifischen Verbindungen zugegeben werden. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Glucose, Saccharose und Fructose, Alkohole, wie Ethanol und Glycerin, und Stärkehydrolysate, Melassen, Sojabohnenmolke, Abfallflüssigkeiten von Frucht säften, Abfallflüssigkeiten von der Fischverarbeitung, Ab fallflüssigkeit von der Fermentation und verbrauchte Pulpen flüssigkeit, die Zucker oder Alkohole enthalten. Je nach Bedarf können anorganische Salze und geringe Mengen an organischen Nährstoffen zugegeben werden.

Bevorzugt erfolgt die erfindungsgemäße Züchtung unter aeroben Bedingungen. Im allgemeinen wird eine große Menge an SAM in den Mikrobenzellen gebildet und akkumuliert, wenn man den Mikroorganismus bei einer Temperatur von 15 bis 45°C, bevorzugt 20 bis 35°C, während 2 bis 10 Tagen züchtet, während der pH-Wert des Kulturmediums auf 3 bis 8, bevorzugt 4 bis 7, eingestellt wird.

Das akkumulierte SAM kann in an sich bekannter Weise gewonnen werden. Beispielsweise kann SAM durch Extraktion von SAM enthaltenden Zellen aus der Kulturbrühe unter Ver wendung von Perchlorsäure, Neutralisation des Extrakts mit Kaliumbicarbonat unter Kühlen mit Eis, Behandlung mit einem Kationenaustauschharz, welches stark sauer ist, um SAM zu adsorbieren, Eluierung des Harzes mit Schwefelsäure und Zu gabe von Phosphorwolframsäure zu dem Eluat zur Präzipitation von SAM isoliert werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die quan titative Bestimmung von SAM und die Messung des Gewichts der trockenen Zellen erfolgen wie folgt:

(1) Quantitative Bestimmung von SAM
Nach dem Züchten werden die Mikrobenzellen von der Kultur brühe durch Zentrifugieren und Extraktion mit etwa dem 5fachen ihrer Menge von 1,5N Perchlorsäure abgetrennt. Der entstehende Extraktionsüberstand wird durch Papierchroma tographie getrennt (Entwicklungslösungsmittel: Ethanol/1- Butanol/Wasser/Essigsäure/1% wäßrige Natriumpyrophosphat lösung in einem Verhältnis von 35/30/30/1/1). Ein Fleck, der SAM entspricht, wird mit einem Ultraviolettdetektor nachgewiesen und mit 0,1N Chlorwasserstoffsäure extrahiert. Aus seiner Absorption bei 260 nm wird die Menge an SAM in der Probe berechnet.
(2) Bestimmung des Gewichts der trockenen Zellen
Nach der Züchtung wird die Trübung der Kulturbrühe bei einer Wellenlänge von 610 nm mittels eines photoelektrischen Colorimeters bestimmt. Das Gewicht der trockenen Zellen in der Kulturbrühe wird aus einer Eichkurve bestimmt, in der die Beziehung zwischen der Trübung und dem Gewicht der trockenen Zellen aufgeführt ist.

Beispiel 1

Saccharomyces cerevisiae (IFO 2346) wird bei 28°C während zwei Tagen in einem Agarschräg-Kulturmedium (pH 6,0), welches 5 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Polypepton, 0,4 g/dl KH₂PO₄, 0,4 g/dl K₂HPO₄, 0,02 g/dl MgSO₄ · 7H₂O, 0,2 g/dl Hefeextrakt und 2 g/dl Agar enthält, gezüchtet. 5 ml eines in der Hitze sterilisierten Kulturmediums, dessen pH-Wert auf 6,0 eingestellt wurde und welches 10 g/dl Saccharose, 1 g/dl Casaminosäure, 1 g/dl Trypton (Bactotrypton), 0,4 g/dl KH₂PO₄, 1 g/dl K₂HPO₄, 0,04 g/dl MgSO₄ · 7H₂O, 0,75 g/dl L- Methionin und je 0,5 g/dl der in Tabelle I angegebenen Zu satzstoffe enthält, werden mit einer Öse voll Saccharomyces cerevisiae inokuliert, und dann wird bei 28°C während 5 Tagen unter Schütteln gezüchtet. Die Menge an SAM, die sich akkumuliert hat, und das Gewicht der trockenen Zellen werden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Die Ergebnisse aus Tabelle I zeigen, daß die Zugabe des organischen Ammoniumsalzes zu dem Kulturmedium zu einer erhöhten Menge an SAM, welches sich in den Zellen akkumuliert, und einer erhöhten Menge an gewachsenen Zellen führt.

Beispiel 2

Saccharomyces cerevisiae (IFO 2346) wird bei 28°C während 2 Tagen in einem Agarschräg-Kulturmedium (pH 6,0), welches 5 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Polypepton, 0,4 g/dl KH₂PO₄, 0,4 g/dl K₂HPO₄, 0,02 g/dl MgSO₄ · 7H₂O, 0,2 g/dl Hefeextrakt und 2 g/dl Agar enthält, gezüchtet. 5 ml eines in der Hitze sterilisierten Kulturmediums, dessen pH-Wert auf 6,0 eingestellt ist und welches 10 g/dl Saccharose, 1 g/dl Hefe extrakt, 0,4 g/dl KH₂PO₄, 0,01 g/dl MgSO₄ · 7H₂O, 1,0 g/dl L-Methionin, 0,25 mg/dl ZnSO₄ · 7H₂O, 125 mg/dl MnSO₄ · 4-6 H₂O enthält, werden mit einer Öse voll Saccharomyces cerevisiae inokuliert, und dann wird bei 28°C während 5 Tagen unter Schütteln gezüchtet. Die Menge an akkumuliertem SAM und das Gewicht der trockenen Zellen werden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II

Beispiel 3

Saccharomyces cerevisiae (IFO 2346) wird während 2 Tagen bei 28°C in einem Agarschräg-Kulturmedium (pH 6,0), welches 5 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Polypepton, 0,4 g/dl KH₂PO₄, 0,4 g/dl K₂HPO₄, 0,02 g/dl MgSO₄ · 7H₂O, 0,2 g/dl Hefeextrakt und 2 g/dl Agar enthält, gezüchtet. 5 ml eines in der Hitze sterilisierten Kulturmediums, dessen pH-Wert auf 6,0 eingestellt ist und welches 10 g/dl Saccharose, 1 g/dl Hefe extrakt, 0,4 g/dl KH₂PO₄, 0,01 g/dl MgSO₄ · 7H₂O, 1,5 g/dl Harnstoff (getrennt sterilisiert), 0,75 g/dl L-Methionin, 0,02 g/dl CaCl₂ · 2H₂O, 0,25 mg/dl ZnSO₄ · 7H₂O, 0,25 mg/dl FeSO₄ · 7H₂O, 1,25 mg/dl MnSO₄ · 4-6 H₂O, 2 µg/dl CuSO₄ · 5H₂O, 2 µg/dl H₃BO₃, 0,2 µg/dl CoCl₂ · 6H₂O, 1 µg/dl KJ und Glycyl glycin, jeweils in den in Tabelle III angegebenen Mengen, wird mit einer Öse voll Saccharomyces cerevisiae inokuliert, und dann wird bei 28°C während 5 Tagen unter Schütteln gezüchtet. Die Menge an SAM, die sich akkumuliert, wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben.

Tabelle III

Aus den Ergebnissen ist erkennbar, daß durch die Zugabe von Glycylglycin außer Harnstoff die Menge an gebildetem SAM weiter erhöht wird.

Beispiel 4

Beispiel 3 wird wiederholt, ausgenommen, daß 0,1 g/dl der jeweiligen niedrigen Peptide, die in Tabelle IV angegeben sind, anstelle von Glycylglycin zugegeben werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von S-Adenosylmethionin durch Züchten von Saccharomyces cerevisiae in einem flüssigen Kulturmedium, welches Methionin enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man Saccharomyces cerevisiae in einem flüssigen Kulturmedium züchtet, welches Methionin enthält, wobei das Kulturmedium zusätzlich mindestens eine Verbindung aus der Gruppe

(a) niedriges Peptid, welches Glycin und/oder Alanin enthält, und
(b) Ammoniumsalz einer organischen Säure mit nicht mehr als 10 Kohlenstoffatomen

enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium das niedrige Peptid (a) in einer Konzentration von mindestens 0,02 g/dl enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium das Ammoniumsalz (b) einer organischen Säure mit nicht mehr als 10 Kohlenstoffatomen in einer Konzentration von mindestens 0,1 g/dl enthält.