DE1919854B2

DE1919854B2 - Gewinnung einer sauren Carboxy peptidase mikrobillen Ursprungs

Info

Publication number: DE1919854B2
Application number: DE1919854A
Authority: DE
Inventors: Eiji Ichishima; Fumihiko Yoshida
Original assignee: Kikkoman Shoyu KK
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1968-12-09
Filing date: 1969-04-18
Publication date: 1973-09-27
Also published as: NO129578B; GB1261363A; CH518362A; FR2025621A1; DK124337B; SE364287B; DE1919854C3; BE731756A; DE1919854A1; AT295449B; US3645850A

Description

sich dieser ζ. Β. von einer aromatischen Aminosäure ableitet, wie Tyrosin oder Phenylalanin, besitzt die hydrolytische Aktivität des vorgenannten Enzyms einen Maximalwert.

Leitet sich der Rest X von einer sauren Aminosäure ab, wie von Glutaminsäure, so ist die Aktivität immer noch hoch; ist X hingegen eine Leucin-Gruppe, dann sinkt die Aktivität ein wenig ab. Andere Aminosäurereste, wie Glycin-, Valin-, oder Prolingruppen können ebenfalls verwendet werden, die Aktivität jedoch wird merklich verringert.

Tabelle I zeigt eine Zusammenstellung der hydrolytischen Aktivität der erfindungsgemäß erhaltenen sauren Carboxypeptidase gegenüber Peptiden und Amiden, wobei der Einfluß verschiedener Aminosäurereste des Substrats auf die Wirkung des Enzyms ersichtlich ist. Als Maß für die enzymatische Aktivität wird die Anzahl an Mikromolen Aminosäure angegeben, die bei 30° C und einem pH Wert von 3,5 aus verschiedenen Substraten R — X — Y in 1 Minute freigesetzt werden. Die Enzymkonzentration wurde dabei, wenn nicht anders angegeben, so gewählt, daß die Extinktion bei 280 παμ 2,0 betrug.

Tabelle I

Vergleich der hydrolytischen Aktivität gereinigter saurer Carboxypeptidase gegenüber Peptiden und

Amiden*)

Substrat (R-X-Y)

Mikromole freigesetzte Aminosäure

iV-Aminopeptide:
1.X = Rest einer aromatischen Aminosäure
Benzoxycarbonyl-L-tyrosyl-

L-leucin

Benzoxycarbonyl-L-phenylalanyl-

L-leucin**)

Benzoxycarbonyl-L-phenylalanyl-

L-tyrosin**)

Acetyl-L-phenylalanyl-L-dijod-

tyrosin**)

2.X = saurer Aminosäure-Rest Benzoxycarbonyl- L-glutamy 1-

L-phenylalanin**)

Benzoxycarbonyl-L-glutamyl-

L-tyrosin

3.X = Leucylgruppe

Benzoxycarbonyl-L-prolyl-

L-leucyl-glycin

4.X = Glycylgruppe

Benzoxycarbonyl-glycyl-L-leucin.. Benzoxycarbonyl-glycyl-L-phenyl-

alanin

Benzoxycarbonyl-glycyl-

L-tryptophan

Benzoxycarbonyl-glycyl-L-prolin Benzoxycarbonyl-glycyl-i.-propyl-

L-leucyl-glycyl-L-prolin

Benzoyl-glycyl-i.-lysin

5. X = Valylgruppe

Benzoxycarbonyl-i-valy I-

i--glutaminsäurc

6.X= Prolylgruppc

Benzoxycarbonyl-glycyl-i.-prolyl-L-leucin

67 874

51866

24 864

16 732 9 110

2 742 350 224

40 Spur Amide:

Benzoxycarbonyl-L-tyrosyl-L-leucyl-

amid**)

Benzoxycarbonyl-L-tryptophanyl-

phenylalanyl-amid**)

Benzoxycarbonyl-glycyl-L-phenyl-

alanyl-amid**)

Benzoxycarbonyl-glycyl-L-leucylamid**)

Mikromole freigesetzte Aminosäure

Benzoxycarbonyl-L-alanyl-L-phenyl-

'5 alanyl-amid**)

Tripeptide:

Glycyl-glycyl-glycin

L-Alanyl-glycyl-glycin

L-Leucyl-glycyl-glycin

Glycyl-glycyl-L-Ieucin

Dipeptide:

L-Tyrosyl-L-leucin

G Iy cy !-glycin

Glycyl-L-leucin

^a5 Glycyl-L-asparaginsäure

L-Leucyl-glycin

Peptide, die einen Rest einer D-Aminosäure enthalten
Benzoxycarbonyl-L-tyrosyl-

n-leucin

Glycyl-D-asparaginsäure

*) Die Substratkonzentration ist jeweils 5 · 10-⁴molar, mit folgenden Ausnahmen: 10~⁴molar für den Fall des Benzoyl-glycyl-L-lysins und 5 - 10-⁶molar im Fall der Dipeptide und Tripeptide.

♦♦) Ein Teil des Substrats wird bei einem pH-Wert von 3,0 unlöslich.

Aus Tabelle I geht hervor, daß die Carboxylgruppe

des Substrats frei sein muß, um die Umsetzung mit der sauren Carboxypeptidase zu ermöglichen. Das Enzym kann als eine Carboxypeptidase bezeichnet werden, weil es keine Umsetzung mit Substraten ergibt, deren Carboxylgruppen, z. B. durch eine Aminogruppe,

blockiert sind, wie Benzoxycarbonyl-L-tyrosyl-L-leucylamid, Benzoxycarbonyl- L-tryptophanyl- L-phenylalanyl-amid^enzoxycarbonyl-glycyl-L-phenylalanyl-amid, Benzoxycarbonyl-glycyl-L-leucyl-amid oder Benzoxycarbonyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-amid. Dennoch ist

aus den vorgenannten bzw. nachstehenden Eigenschaften des Enzyms der Erfindung ersichtlich, daß es sich von den bekannten Carboxypeptidasen A und B immer noch unterscheidet.
Das Enzym der Erfindung unterscheidet sich in

seiner Wirkungsweise gänzlich von Exopeptidasen, wie Dipeptidase oder Tripeptidase. Bei der Hydrolyse durch das Enzym der Erfindung ist es wichtig, daß die Aminogruppe in α-Stellung des Aminosäurerests X, d. h. die benachbart zur C-Endgruppe Y stehende Gruppe, durch Acylreste oder Peptide blockiert ist. Dies bedeutet, daß das Enzym der Erfindung sich nicht mit Dipeptiden, wie L-Tyrosyl-L-leucin, Glycylglycin, Glycyl-1.-leucin, Glycyl-L-asparaginsäure, oder L-Leucyl-glycin und Tripeptiden, wie Glycylglycyl-glycin, i.-Alanyl-glycyl-glycin, L-Leucyl-glycylglycin, oder Glycyl-glycyl-L-leucin umsetzt.

Ferner ist aus Tabelle I ersichtlich, daß die durch das Enzym der Erfindung bewirkte Hydrolyse durch

5 6

Aminosäurereste in X-Stellung sehr stark beeinflußt Die saure Carboxypeptidase der Erfindung wird

wird; die Aminosäurereste in Y-Stellung und in dessen bei 60°C und darüber inaktiviert bzw. bei einem

Nachbarschaft können jedoch ebenfalls von Einfluß pH-Wert von 7,0 und darüber inaktiv,

sein. Das Molekulargewicht des Enzyms der Erfindung

Die Geschwindigkeit der durch das Enzym der 5 wird auf Grund der Gelfiltration an Sephadex auf Erfindung bewirkten Hydrolyse wird wahrscheinlich etwa 100 000 geschätzt. Nach der Methode von bei Substitution der a-Aminogruppe des Aminosäure- Yphantis ergibt sich ein Molekulargewicht des Enzyms rcstes X durch eine Benzoxycarbonylgruppe in der Erfindung von 122 000. Die Sedimentationsstärkerem Maße erhöht als bei Substitution durch konstante des Enzyms der Erfindung bei der Konzeneine Acetylgruppe. Da die Substrat-Spezifität des io tration gegen 0 wird auf 7,3 S geschätzt. Im Vergleich Enzyms der Erfindung durch den Aminosäurerest X, dazu beträgt das Molekulargewicht der aus Asperder der C-Endgruppe Y benachbart ist, stark beein- gillus saitoi hergestellten sauren Protease 35 550 und flußt wird, zeigt das Enzym der Erfindung bei Sub- jenes der Carboxypeptidasen A bzw. B 34 000 bzw. straten, deren C-Endgruppe sich von einer basischen 34 300. Auch hier besteht also ein Unterschied des Aminosäure ableitet, wie Benzoyl-glycyl-L-lysin, nur 15 Enzyms der Erfindung gegenüber den anderen Eneine geringe Wirkung. Diese ist bei Substraten noch zymen.

geringer, die in der C-Endgruppe Prolin besitzen, wie Die vorgenannten Versuchsergebnisse lassen den

Benzoxycarbonyl-L-prolyl-L-leucyl-glycyl-L-prolin. Schluß zu, daß die saure Carboxypeptidase der Er-

Eine weitere Anforderung an ein Substrat für das findung ein neues Enzym ist.

Enzym der Erfindung besteht darin, daß der Amino- 20 Die Aktivität der sauren Carboxypeptidase der säurerest des Substrats sich von einer l-Aminosäure Erfindung wird nach den folgenden Verfahren beableiten muß. Deshalb ist eine Verbindung, wie stimmt.

Benzoxycarbonyl-i.-tyrosyl-n-leucin, die von D-Ami- 1 ml eines Gemisches aus einer bestimmten Menge

nosäuren abgeleitete Reste enthält, kein geeignetes der sauren Carboxypeptidase der Erfindung in einer Substrat für das Enzym der Erfindung. 25 5 · 10 ''molaren Lösung von Benzoxycarbonyl-L-tyro-

Wie erläutert, unterscheidet sich das Enzym der syl-L-leucin in 0,05molarem Acetatpuffer mit einem

Erfindung bezüglich seiner Substrat-Spezifität ganz- pH-Wert von 3,5 oder in einer 5 · lO^molaren Lösung

lieh von den beiden Carboxypeptidasen A und B. von Benzoxycarbonyl-L-glutamyl-L-tyrosin in einer

Darüber hinaus weist es die nachstehenden unter- Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3,1 wird 20 Mischeidenden Merkmale auf. Die Aktivität der sauren 30 nuten bei 30^cC inkubiert und nach erfolgter Um-

Carboxypeplidase der Erfindung wird durch Metall- Setzung nach Zugabe von 200 μΐ 0,3 m Natronlauge

Chelatbildner, wie Äthylendiamintetraessigsäure zur Inaktivierung des übriggebliebenen Enzyms 30 Mi-

(0,05 m) oder o-Phenanthrolin, nicht gehemmt, durch nuten auf 3O⁰C erwärmt. Das alkalische Gemisch wird

die an den Proteinrest eines Enzyms koordinativ anschließend mit 200 μΐ 2,5°/_oiger Essigsäure neugebundene Metalle entfernt werden. Daraus kann 35 tralisiert und zuletzt nach Zugabe von 2,0 ml 0,5mo-

man schließen, daß das Enzym der Erfindung kein für laren Citronensäure-Puffers mit einem pH-Wert von

die katalytischc Wirksamkeit erforderliches Metall 5,0 und 1 ml von nach der Yemm-Cocking Methode

enthält. Es unterscheidet sich darin grundlegend von (E. C ο c k i η g und E. W. Ye m m: Biochem. J. 58,

den anderen Carboxypeptidasen, die an der Kataly- XlI [1954]) hergestelltem Ninhydrin-Gemisch in siedensatorwirkung beteiligte Metalle enthalten. Die be- 4° dem Wasser erhitzt. Nach 15 Minuten Erhitzen wird

kannten Ausnahmen sind Carboxypeptidase C, die aus das Gemisch unter Eiskühlung kräftig gerührt und

Citrusfrüchten extrahiert wird, und Penicillium- durch Zugabe einer Mischung von 1 Volumteil

Peptidase B, die von Mikroorganismen der Gattung Äthanol und 2 Volumteilen Wasser auf ein Volumen

Penicillium gewonnen wird; die Aktivitäten dieser von 5 ml gebracht. Schließlich wird die durch das beiden Enzyme werden durch Zusatz von Metall- 45 Ninhydrin-Reagens erzielte Farbir.tcnsität bestimmt,

Chelatbildner nicht beeinflußt. Dennoch gibt es noch indem die Absorption bei 570 mu., die die Menge der

einen Unterschied, der darin besteht, daß das pH- Aminosäure angibt, gemessen wird.

Optimum des Enzyms der Erfindung merklich niedriger Eine Enzymeinheit ist als diejenige Enzymmenge

ist als das der vorgenannten beiden Enzyme. Ferner definiert, die bei 30" C und einem pH-Wert von 3,5

geht aus der Literatur hervor, daß die allgemeinen 50 in 1 Minute aus Benzoxycarbonyl-L-tyrosyl-L-kucin

Eigenschaften der Penicillium-Peptidase B jenen der als Substrat 1 aMol L-Leucin freisetzt. Bei Verwendung

Dipeptidasen eher ähneln als jenen der Carboxy- anderer Substrate wird auf vorgenanntes Substrat

peptidasen. als Bezugsgröße umgerechnet. Leucin oder andere bei

Andererseits ist die saure Carboxypeptidase der der Umsetzung in Freiheit gesetzte Aminosäurer

Erfindung im Gegensatz zu den bekannten Endo- 55 können durch Dünnschicht-Chromatographie ar

peptidasen nicht in der Lage, Peptidbindungen von Kieselgel G als Adsorbens mit Ninhydrin-Reagen«

Proteinen oder Peptiden aufzuspalten. Wenn man oder aber mit Hilfe eines automatischen Aminosäuren

z. B. ein Gemisch des Enzyms der Erfindung mit einem Analysator bestimmt werden.

Protein zur Ausfällung der hochmolekularen Protein- Die Züchtung der Stämme von Aspergillus usami Fraktion mit Trichloressigsäure behandelt, so enthält 60 ATCC-14 331, Aspergillus saitoi ATCC-14 332, Asper

die in Trichloressigsäure lösliche Fraktion im über- gillus niger NRRL 330, Aspergillus inuii ATCC-14 333

stehenden Filtrat lediglich freie Aminosäuren als Aspergillus aureus ATCC-14 334 und Aspergillu

Zersetzungsprodukte, jedoch keine Peptide. Dement- awamori ATCC-14 335 kann entweder in festen ode

sprechend kann man das Enzym der Erfindung ein- flüssigen Nährböden durchgeführt werden. Die Züch

deutig von sauren Proteinasen oder anderen ähnlichen 65 tung dieser Stämme ist bekannt

Endopeptidasen unterscheiden, die mit Hilfe von Bei der Züchtung in festen Nährböden werden al AspergiHi' hergestellt sind und deren pH-Optimum Medium geeignete Stoffe, wie Weizenkleie oder ent

bei 2,5 b^ 3,0 liegt. fettete Sojabohnen, gegebenenfalls mit geeignete:

Nährstoffen, wie Ammoniumchlorid, und mit Wasser gemischt. Das Gemisch wird unter Dampfdruck sterilisiert und gekühlt. Nach dem Kühlen wird eingeimpft und gut gemischt. Schließlich wird die Inkubation 50 bis 90 Stunden bei einer Temperatur von 25 bis 4O⁰C durchgeführt.

Nach dem Inkubieren wird mit dem 5- bis 20fachen Volumen Extraktionsflüssigkeit versetzt, das Gemisch 60 bis 70 Minuten stehengelassenen und anschließend das Enzym-Rohpräparat unter Druck extrahiert. Die extrahierte Flüssigkeit wird filtriert, wodurch aufgeschlämmte Festkörper, Sporen und andere Fremdstoffe entfernt werden. Das Filtrat wird auf 1 bis 5 "C abgekühlt und mit dem 2,5- bis 3,0fachen Volumen 95^Ü/_Oigen, zuvor auf 1 bis 5°C abgekühlten Äthanols versetzt. Das Gemisch wird gründlich gerührt und mindestens 10 Stunden absetzen gelassen. Man gefriertrocknet die Fällung bei einem Druck von 0,1 Torr und erhält das Enzym-Rohpräparat der sauren Carboxypeptidase. Zur Fällung kann man an Stelle von Äthanol auch Aceton, Methanol oder lsopropanol als Lösungsmittel verwenden.

Bei der Durchführung der Züchtung nach dem Submers-Verfahren stellt man einen flüssigen Nährboden her, der geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und andere für das Wachstum des Mikroorganismus nötige Nährstoffe enthält, und impft an. Zum Beispiel beimpft man das flüssige Medium mit einer wäßrigen Suspension des Mikroorganismus. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Weizenkleie, Stärke und Glucose. Beispiele für Stickstoffquellen sind organische Stoffe, wie Sojabohnen, Casein oder Fleischextrakt, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumchlorid. Außerdem können Phosphate oder andere anorganische Salze als Zusätze verwendet werden. Die Verfahrensbedingungen werden bei der Submerskultur in flüssiger Phase durch die Wahl der verwendeten Stämme und anderer Faktoren so eingestellt, daß die Aktivität der sauren Carboxypeptidase einen Maximalwert erreicht. Bei Verwendung von Aspergillus usamii ATCC-14 331 muß man z. B. den pH-Wert des Mediums auf 3,0 bis 6,0 und die Temperatur auf etwa 30 C einstellen und die Inkubation während 50 bis 100 Stunden durchführen.

Die Züchtung in Submerskultur kann bei stationären Bedingungen, unter Schütteln, Rühren oder Belüften durchgeführt werden. In großem Maßstab wird die Züchtung mit besserer Wirkung unter gleichzeitigem Belüften und Rühren durchgeführt.

Nach dem Züchten wird die Gärmaische filtriert, das Filirat gegebenenfalls konzentriert und auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt. Nach nochmaligem Filtrieren wird das Filtrat wie bei der Züchtung in fester Phase mit Alkohol versetzt und die Fällung zur Gewinnung des Rohpräparats der sauren Carboxypeptidase gefriergetrocknet.

Das erhaltene Enzym-Rohpräparat wird nach sorgfältig ausgewählten, gegebenenfalls kombinierten Verfahren gereinigt. Beispiele für derartige per se bekannte Verfahren sind das Aussalzen, das Adsorptions-Eluierverfahren mit Hilfe verschiedener Ionenaustauscher, wie Phosphocellulose oder Diäthylaminoäthylcellulose, und die Gelfiltration zur Fraktionierung nach Maßgabe des Molekulargewichts.

Tabelle Il zeigt ein Beispiel der Analyse des er haltenen Produkts in festem Nährboden, bei der die Aktivität der sauren Carboxypeptidase gemessen wird, die durch Züchtung der angegebenen Stämme der Gattung Aspergillus auf Weizenkleie in fester Phase erhalten wird.

Tabelle II	5	*„ Stamm	10	Aspergillus usamii ATCC-14 331	Enzym
		Aspergillus saitoi ATCC-14 332	einheiten/g
Aspergillus niger NRRL 330	fester Nährboden
¹S Aspergillus inuii ATCC-14 333	nach der
Aspergillus aureus ATCC-14 334	Züchtung
Aspergillus awamori ATCC-14 335 ...	18 800
	14 400
9 500
6 300
5 000
10 000

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

840 kg Weizenkleie werden mit 5001 Wasser benetzt und 40 Minuten mit Dampf bei einem Druck

as von 1,1 kg/cm² sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden 3 kg einer Impfkultur von Aspergillus saitoi ATCC-14 332, die getrennt als Reinkultur gezüchtet wurde, eingeimpft, und es wird gründlich durchgemischt. Das Gemisch wird anschließend auf 1600 Koji-Böden überführt und 50 Stunden bei 30 bis 45" C inkubiert. Die Koji-Böden werden einmal in 2 Tagen beim Ansteigen der Temperatur der Kultur umgestellt.

Nach Beendigung des Züchtens wird das Material

in einen Extraktionsapparat übergeführt und nach Zugabe von 30001 Wasser 60 bis 70 Minuten darin gelassen. Anschließend wird die Extraktion bei einem Druck von 60 kg/cm² durchgeführt. Es werden 2400 1 Flüssigkeit, d. h. 80 °/o des zugesetzten Wassers, erhalten, die anschließend zur Entfernung, z. B. aufgeschlämmter Festkörper und Sporen, filtriert werden. Das erhaltene Filtrat wird in einem Fällbottich gesammelt, darin mit Kältesole auf 1 bis 5°C abgekühlt und mit dem 2¹I₂- bis 3,0fachen Volumen 95°/„igen Alkohols, der vorher auf 1 bis 5°C abgekühlt wurde, versetzt. Das erhaltene Alkohol-Gemisch wird gründlich gerührt und über 10 Stunden bis zur vollständigen Ausfällung stehengelassen. Die Fällung wird durch kontinuierliche Filtration abgetrennt und sofort danach bei einem Druck von 0,1 Torr gefriergetrocknet. Das getrocknete Produkt wird zerkleinert. Es werden 16 kg des Rohpräparats der sauren Carboxypeptidase gewonnen. Die Enzym-Aktivität des vorgenannten Rohpräparats beträgt 3,14 · 10^e Enzym-Einheiten pro 1 g, die Ausbeute beträgt 60%.

Beispiel 2

Ein Gemisch aus 90 kg Weizenkleie, 160 kg ent fetteten Sojabohnen und 40 kg Ammoniumchloric wird nach Zugabe von Wasser 1 Stunde bei einen Druck von 3 kg/cm² sterilisiert und in einen 20 000 fassenden Fermenter eingespeist, der mit der zu Erzielung eines Gesamtvolumens von 10 0001 nötige] Menge Wasser aufgefüllt wird. Der Ausgangs-pH Wert wird auf 5,5 und die Temperatur des Medium auf 35°C eingestellt; dann wird eine Sporensuspensio eingeimpft, die getrennt als Reinkultur durch grüne liches Vermischen von 100 g Impfkultur von Aspei

309539/41

gillus saitoi ATCC-14 332 mit 500 ml sterilen Wassers gezüchtet wurde. Anschließend wird das Brüten bei 35°C unter Belüften und Rühren durchgeführt.

Nach 4 Tagen Brüten wird die Gärmaische unter Verwendung einer Filterhilfe filtriert. Das Filtrat wird bei 35°C/35Torr konzentriert. Man erhält 1500 1 Flüssigkeit, die mit einer anorganischen Säure, wie Salzsäure, auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und wiederum filtriert wird. Dann werden gemäß Beispiel 1 die Fällung mit Äthanol und die Gefriertrocknung durchgeführt. 20 kg Roh-Enzympulver werden erhalten. Die Aktivität der erhaltenen sauren Carboxypeptidase beträgt 7,8 · 10° Einheiten pro 1 g, die Ausbeute beträgt 60%.

Bei Anwendung der Aussalzmethode durch Ammoniumsulfat an Stelle des gemäß Beispiel 1 bzw. 2 durchgeführten Fällens mit Alkohol ergibt die Ausfällung mit 70% Ammoniumsulfat die höchste Ausbeute an saurer Carboxypeptidase, d.h. 60%.

Beispiel 3

Ein schwach saures Kationen-Austauscherharz, das vorher mit einer O.OOlmolaren Acetat-Pufferlösung gepuffert wurde, wird in eine Chromatographiersäule mit einem Durchmesser von 2 cm bis zu einer Höhe von 40 cm eingefüllt. 20 ml einer Rohenzym-Lösung mit einem Gehalt von 500 mg des gemäß Beispiel 2 erhaltenen Enzym-Rohpräparats werden mit Hilfe dieser Säule chromatographiert. Das Chromatographierverfahren wird unter Verwendung einer 300 ml fassenden, mit einem Rührer ausgerüsteten Mischkammer durchgeführt, die an der Verbindungsstelle zwischen dem Lösungsvorrat und der Chromatographiersäule angebracht ist und einen kontinuierlichen Verlauf des Verfahrens bis zu jenem Punkt gestattet, bei dem der pH-Wert des Eluats (ler'ilbe wie jener des Acetat-Puffers der 0,15molaren Vorratslösung ist, d. h. 5,2 beträgt. Danach werden Fraktionen von jeweils 5 ml gesammelt.

F i g. 2 zeigt das Ergebnis der vorgenannten chromatographischen Analyse der sauren Carboxypeptidase. Während die durch den Stamm Aspergillus satoi ATCC-14 332 erzeugte Fraktion der sauren Proteinase bzw. Aspergillopeptidase A nahezu vollständig am Austauscherharz adsorbiert wird und daher nur langsam eluiert wird, wird das Enzym der Erfindung am Austauscherharz nur schwach adsorbiert und von diesem leicht eluiert. Die Fraktion der vorgenannten sauren Carboxypeptidase, die leicht eluiert wurde, enthält fast keine saure Proteinase. Die Ausbeute des Enzyms der Erfindung beträgt etwa 50 ± 15 %, wobei sich bei jedem Chromatographier-Arbeitsgang eine kleine Abweichung ergibt. Die erhaltene Enzym-Fraktion wird anschließend in einem Kollodiumbeutel konzentriert oder nach Dialyse gegen eine 0,005molare Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 4,0 der zweiten Reinigungsstufe unterworfen.

Die zweite Stufe beim Chromatographierverfahren besteht darin, daß man die saure Carboxypeptidase der Erfindung durch Phosphocellulose, einer Kationen-Austauschercellulose, trennt. Zuvor mit 0,005molarem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,0 abgepufferte Phosphocellulose wird in eine Chromatographiersäule mit einem Durchmesser von 2 cm bis zu einer Höhe von 50 cm eingefüllt. In der Säule werden 100 ml der nach dem ersten Chromatographierverfahren fraktionierten sauren Carboxypeptidase adsorbiert, und das Chromatographierverfahren wird mit einer 0,05molaren Lösung von Natriumchlorid in einer 0,005molaren Acetatpuffer-Lösung mit einem pH-Wert von 4,0 in einer 500 ml fassenden Mischkammer kontinuierlich durchgeführt. Es werden Fraktionen von jeweils 5 ml aufgefangen.

F i g. 3 zeigt das Ergebnis des vorgenannten Chromatographierverfahrens mit Phosphocellulose. Die

ίο Ausbeute des Enzyms beträgt etwa 60%. Die Enzym-Fraktionen werden gesammelt und gegen einen 0,005molaren Acclatpuffer mit einem pH-Wert von 5,0 dialysiert und anschließend entweder der nächsten Reinigungsstufe unterworfen oder zur Aufbewahrung konzentriert.

Die dritte Stufe des Chromatographierverfahrens wird unter Verwendung des Anionen-Austauscherharzes Diäthylaminoäthylcellulose durchgeführt. Die mit einem 0,005molaren Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,0 abgepufferte Diäthylaminoäthylcellulose wird in eine Chromatographiersäule mit einem Durchmesser von 2 cm bis zu einer Höhe von 50 cm eingefüllt. In dieser Säule werden 194 ml der nach dem vorausgehenden Chromatographierverfahren erhaltenen sauren Carboxypeptidase adsorbiert, und das Chromatographierverfahren wird durchgeführt, indem man in einem 0,005molarcn Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 3,0 gelöstes Natriumchlorid kontinuierlich durch eine 500 ml fassende Mischkammer einspeist. Fraktionen von jeweils 5 ml werden aufgefangen.

F i g. 4 zeigt das Ergebnis des vorgenannten Chromatographierverfahrens mit Diäthylaminoäthylcellulose. Die Ausbeute der Carboxypeptidase der Erfindung beträgt etwa 60%. Die erhaltene Fraktion wird nochmals wie vorher chromatographiert. Die Ausbeute beträgt nachher etwa 80%· Anschließend wird die gesammelte aktive Fraktion dialysiert und zur Aufbewahrung konzentriert.

Als vierte Reinigungsstufe dient die Gelfiltration Die Abmessungen der Säule betragen 2 cm im Durchmesser und 65 cm in der Höhe. Das Gelfiltermaterial wird vor dem Einfüllen in die Säule mit einem 0,01-molaren Acetatpuffer abgepuffert. Das vorstehend erhaltene, gefriergetrocknete Enzympräparat wird in 5 ml einer Essigsäurelösung gelöst und ins obere Ende der Säule eingespeist, wo die Gelfiltration mit derselben Essigsäurelösung durchgeführt wird. Fraktionen von jeweils 5 ml werden aufgefangen.

F i g. 5 zeigt das an Hand der Gelfiltration erhaltene Diagramm. Die Ausbeute beträgt 76%. Aus den vorstehenden Versuchen geht hervor, daß die saure Carboxypeptidase der Erfindung viel schneller als die saure Proteinase (Aspergillopeptidase A) mit einem Molekulargewicht von 35 000 eluiert wird, was bedeutet, daß sie ein Enzym mit einem höheren Molekulargewicht ist.

Das vorstehend erhaltene Enzympräparat wird entweder sofort oder nach dem Aussalzen zur Gewinnung eines Reinpräparates von saurer Carboxypeptidase gefriergetrocknet.

Bei der Durchführung der Disc-Elektrophorese (diskontinuierliche Elektrophorese) am zuletzt erhaltenen Enzympräparat bei einem pH-Wert von 8,(

(D. E. Williams, R. A. Reisfeld: Ann New York Acad. Sei., 121 [1964], S. 373) zeigt sich daß das Enzym der Erfindung elektrophoretiscl homogen ist. Das gereinigte Enzympräparat der Er

findung erscheint beim Zentrifugieren in der Ultrazenfuge homogen, und seine Sedimentationskonstante bei einer Konzentration gegen 0 wird mit 7,3 S berechnet.

Beispiel 4

Vergleichsversuche der erfindungsgemäß erhaltenen sauren Carboxypeptidase (a) mit Carboxypeptidase C aus Citrusfrüchten gemäß Nature, Bd. 201 (4919), S. 613 (1964), (b) und der Carboxypeptidase (Pro-

tease III) der F i g. 1 von Sci.-Papers Inst. Phys. Chem. Res. (Tokyo), Bd. 59 (1965), Nr. 1, S. 44 bis 48, (c). Die Wirkung auf das Substrat Benzocarboxycarbonyl-glycyl-L-leucin, das pH-Optimum und die Wärmestabilität des Enzyms wird mit der der obengenannten bekannten Carboxypeptidasen verglichen. Die Ergebnisse sind aus den F i g. 6 und 7 ersichtlich. Aus diesen Figuren geht hervor, daß die charakteristischen Werte für die saure Carboxypeptidase der ίο Erfindung sich von denen der bekannten Carboxypepiidase deutlich unterscheiden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

1 2

Carboxypeptidase G beschrieben, deren pH-Optimum Patentanspruch: nicht angegeben ist, die aber ein absolutes Bedürfnis

nach Zn⁺⁺-Ionen besitzt.

Verwendung der durch Züchten von Aspergillus Die Erfindung betrifft nun die Verwendung der

usamii ATCC-14 331, Aspergillus saitoi ATCC- 5 durch Züchten von Aspergillus usamii ATCC-14 331, 14 332, Aspergillus niger NRRL 330, Aspergillus Aspergillus saitoi ATCC-14 332, Aspergillus niger inuii ATCC-14 333, Aspergillus aureus ATCC- NRRL 330, Aspergillus inuii ATCC-14 333, Asper-14 334 oder Aspergillus awamori ATCC-14 335 gilius aureus ATCC-14 334 oder Aspergillus awamori gewonnenen festen oder flüssigen Nährböden zur ATCC-14 335 gewonnenen festen oder flüssigen Nähr-Gewinnung einer sauren Carboxypeptidase, die io boden zur Gewinnung einer sauren Carboxypeptidase, die endständige, eine freie Carboxylgruppe auf- die die endständige., eine freie Carboxylgruppe aufweisende Aminosäure von Protein oder Peptiden weisende Aminosäure von Proteinen oder Peptiden bei einem pH-Wert von etwa 1,5 bis 5,5 hydro- bei einem pH-Wert von etwa 1,5 bis 5,5 hydrolytisch lytisch abspaltet, metallfrei ist, ein Molekular- spaltet, metallfrei ist, ein Molekulargewicht von etwa gewicht von etwa 122 000 besitzt, bei einer Tempe- 15 122 000 besitzt, bei einer Temperatur von 6O⁰C oder ratui von 6O⁰C oder darüber inaktiviert wird, bei darüber inaktiviert wird, bei einem pH-Wert von 7 einem pH-Wert von 7 oder darüber inaktiv ist oder darüber inaktiv ist und die, jeweils bei einer und die, jeweils bei einer Temperatur von 3O⁰C, Temperatur von 3O⁰C, gegen Benzoxycarbonylgegen Benzoxycarbonyl-L-tyrosyl-L-leucin ein pH- L-tyrosyl-L-leucin ein pH-Optimum von 3,5, gegen Optimum von 3,5, gegen Benzoxycarbonyl-L-glut- 20 Benzoxycarbonyl-L-glutamyl-L-tyrosin ein pH-Optiamyl-L-tyrosin ein pH-Optimum von 3,1 und mum von 3,1 und gegen Benzoxycarbonyl-glycylgegen Benzoxycarbonyl-glycyl-L-prolyl-L-leucyl- L-prolyl-L-leucyl-glycin ein pH-Optimum von 3,2 glycin ein pH-Optimum von 3,2 besitzt. besitzt.

Die Bezeichnung »saure Carboxypeptidase« wurde

25 für das Enzym, das eine völlig andersartige Substrat-

Spezifität als die bekannten Arten besitzt, gemäß der im »Report of the Commission on Enzymes of the

Unter dem Enzym Carboxypeptidase versteht man International Union of Biochemistry« (veröffentlicht bekanntlich die aus der Bauchspeicheldrüse von 1961) aufgestellten Nomenklatur für Enzyme gewählt. Tieren extrahierten Carboxypeptidasen A und B 30 Das pH-Optimum der sauren Carboxypeptidase sowie die aus Früchten gewonnene Carboxypeptidase der Erfindung liegt weiter im sauren Bereich als jenes C. Die Carboxypeptidasen A bzw. B setzen bekannt- der anderen bekannten Carboxypeptidasen. Die lieh von der freien, endständigen Carboxylgruppe her pH-Optima des vorgenannten Enzyms betragen bei stufenweise Aminosäuren aus Proteinen oder Peptiden der Einwirkung auf Benzoxycarbonyl-L-tyrosyl-L-leuin Freiheit. Das pH-Optimum der Carboxypepti- 35 ein, Benzoxycarbonyl-L-glutamyl-L-tyrosin bzw. Benzdasen A und B liegt bei etwa 7,5. Das pH-Optimum oxysarbonyl-glycyl-L-prolyl-L-leucyl-glycin als Subder Carboxypeptidase C liegt bei etwa 5,3; vgl. strate 3,5, 3,1 bzw. 3,2. Die Kurve A in Fi g. 1 zeigt niederländische Offenlegungsschrift 6 407 591, referiert die Abhängigkeit der Enzym-Aktivität vom pH-Wert in Chemical Abstracts Vol.63 (1965), 676 a. Aus bei Umsetzung eines Gemisches, das 0,025 % Benzoxy- »Shionogi Kenkyusho Nempo«, Bd. 13 (1963), S. 91 40 carbonyl-L-tyrosyl-L-leucin als Substrat, 0,0025 °/₀ bis 98, referiert in Chemical Abstracts Vol. 60 (1964), Enzym-Rohpräparat und einen 0,005-molaren Natri-1981 g, ist eine Carboxypeptidase aus Streptomyces umacetat-Salzsäure-Puffer enthält, bei einer Tempesioyaensis bekannt, deren pH-Optimum bei etwa 8 ratur von 30⁰C. Die Kurve B gibt die entsprechende liegt. Abhängigkeit bei Verwendung von 0,025 °/o Benzoxy-

In Nature, Bd. 201 (4919), 613 (1964), referiert in 45 carbonyl-L-glutamyl-L-tyrosin als Substrat und 0,025 °/₀ Chemical Abstracts Vol.60 (1964), 10 978 f, ist eine Enzym-Rohpräparat wieder.

Carboxypeptidase C aus Citrusfrüchten beschrieben, Nachstehend wird die Substrat-Spezifität der er-

die bei pH-Werten von 6 bis 10 und unter 4 rasch findungsgemäß erhaltenen sauren Carboxypeptidase zerstört wird. beschrieben. Die allgemeine Formel I

Aus Sci.-Papers Inst. Phys. Chem. Res. (Tokyo), 50 r _ χ _ γ m

Bd. 59 (1965), Nr. 1, S. 44 bis 48, insbesondere S. 48,

referiert in Chemical Abstracts, Bd. 63 (1965), in der der Rest R sich von gegebenenfalls durch andere 15 173 d, ist eine Carboxypeptidase — dort auch als Acylreste substituierten Aminosäuren oder Peptiden Protease III bezeichnet — bekannt, deren pH-Opti- und die Reste X bzw. Y sich von L-Aminosäuren mum im alkalischen pH-Bereich liegt. 55 ableiten, kennzeichnet eine Carboxyl-Endgruppe einer

In Arch. Biochem. Biophys., Bd. 121 (1967), S. 555 Peptidkette eines Substrats, die nachstehend als bis 562, referiert in Chemical Abstracts, Bd. 67 (1967), C-Endgruppe bezeichnet wird. Die Carboxypeptidase A 87 852j, ist eine Carboxypeptidase, deren maximale bewirkt eine hydrolytische Spaltung der Peptidbindung Aktivität im pH-Bereich von 6 bis 8 liegt und deren zwischen X und Y, wenn die Aminosäurereste in Aktivität durch Chelierungsmittel reduziert wird, 60 Y-Stellung der C-Endgruppe des Substrats, die eine beschrieben. In Arch. Biochem. Biophys., Bd. 128 freie Carboxylgruppe besitzen, entweder neutral oder (1968), S. 88 bis 94, referiert in Chemical Abstracts, sauer sind, mit Ausnahme von Prolin; die Carboxy-Bd. 69 (1968), 93 095x, ist eine weitere physikalisch- peptidase B des Standes der Technik zeigt nur dann chemische Charakterisierung dieser Carboxypeptidase eine ähnliche starke Aktivität, wenn die Aminosäureangegeben. 65 reste in Y-Stellung sich von basischen Aminosäuren Schließlich ist in Proc. Nat. Acad. Sei. U. S., Bd. 58 ableiten. Demgegenüber wird die Aktivität der sauren (1967), S. 1299 bis 1306, insbesondere S. 1300, referiert Carboxypeptidase der Erfindung am stärksten durch in Chemical Abstracts, Bd. 67 (1967), 113 939q, eine den Aminosäurerest in X-Stellung beeinflußt. Wenn