DE1919854A1 - Saure Carboxypeptidase und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

DR. ELISABETH JUNG. DR. VOLKER VOSSIUS, DIPL-ING. GERHARD COLDEWEY

PATENTANWÄLTE

8 MDNCHEN 23 · S I EGESSTR ASSE 26 ■ TELEFON 3450 67 · TELE G RAM M-AD R ES SE: INVENT/M ONCHEN

TELEX 5 29 686

IB. APR. 1989

UoZos E 249 (Pi/Vo/kä)
POS-16994

KIKKOMAIi SHOYU COo₉
Koda.p iioda-shiy Japan

" Saure Carboxypeptid&se und Verfahren au ihrer Herstellung " Prioritäts 9° Dezember 1968,, Japan, Nr₀ 89 525/68

Unter dam Enzym Carboxypeptidase versteht man bekanntlich die aus der Bauchspeicheldrüse von fieren extrahierten Carboxypeptidasen A und B_p sowie die aus Früchten gewonnene Carboxypeptidase G₀ Die Carboxypeptidasen A bzv/_o B setzen bekanntlich von der freiens endständigen Carboxylgruppe her stufenweise Aminosäuren aus Proteinen oder Peptiden in Freiheit» Das pg-Optimum der Carboxypeptidasen A und B liegt bei etwa 7»5· Das p_H~Optimum der Carboxypeptidase C liegt bei etwa 5»3·

Die Erfindung betrifft ein neues Enzym mit der Bezeichnung "saure Carboxypeptidase", das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die endständige₈ eine freie Carboxylgruppe aufweisende Amino säure von Proteinen oder Peptiden bei einem p_H-Wert von etwa Ip5 bis 5,5 hydrolytisch abspaltet, metallfrei ist, ein Moleku largewicht von etwa 122 000 besitzt, bei einer Temperatur

0 0 9 8 2 5/ 1727 bad original

POSTSCHECKKONTO. MÖNCHEN NI7S· IANKKONTOt DEUTiOHE BANK A. Q. MÖNCHEN, LEOPOLDeTR. 71, KTO. NfI. 90/36794

60 C inäjstivi ert wired und bei --siaeia ρ^-ν,'θζΊ; von T oder dar-* ina&tiv ist* .

BIe Beseiciiaung "säure Oax-fcjEsypeptida-sa « -y&rde für das Enaym» das eine völlig andersartige Substrat~Spesifität als die bekannten Arten besitzt _s geaäes der im "Beport of-the OociBiissiozi on Ensymes of the Inte mat ioaal Union of Biochemistry" (veröffant«=· licht I96I) aufgestellten HoiuenJilB.tur für Ens^iae gewählt. Das vorgenannte Sasjnii κάιχώ. dureb S-ilohtiiag von der (rattling Aspergiilus laargertelJ.t i-jerden

1 seigt; den Einfluss d©s ^.j-Wertes auf die Aktivität der sauren Garfeoxypeptidase; Pigο- 2 biß Fig. 4 neigen die Ergebnisse άυτ chromatograpSiißchaa Analyse dor sauren Oarbozypeptidasej, die mittels sines ach.v/&ch sauren BiatiunezL^Auetauacherhar^ee (Figa 2)-₉ ^liospliocellulose (Pig. 3.) bzv/₀ PiäthylamiaoäthylcelMloae *.

(l^!ig_o 4) durchgeführt v/urdeo 5?ig_e 5 schlieselich zeigt das Er^ 5 gebnis der Gelfiltration der eauren GarboJQ/peptidase an Sephadex

Das pjT-Optioium der sauren Carboxypeptidase. der JErfindimg liegt weiter im säuren Bereich als jenes der anderen bekannten Carboxypeptidase-Arteno Die p^-Optima ä«a vorgenannten Enzyms betragen ZoBo bei der Einwirkung auf Benzoxycarbonyl-Ii-tyrosyl'-Ir» leucin, Benaozycarbonyl-L-glutamyl^L-tyrosin bzwo BenzosEycarbonyl-glycyl-L-prolyl-L-leuoyl-glycin als Substrate 3»5» 3»1 bzw_e 3,2ο Die Kurve A in SJLg. 1 zeigt die Abhängigkeit äer Enzym-Aktivität vom pjj-Wert bei Umsetzung eines Gemisches, das 0,025 i> Benaoxycarbonyl-Ip-tyrosyl-I-Xeuoin ale Substrat» 0,0025 i» Enzym-Rolipräparat und einen 0,005 molaren Hatriumacetat-

009825/1727 «

enthält,, bei eiaör Senxperatur von 30⁰C₀ Die Kur ve B gibt die entsprechende Abhängigkeit "bei Terwendung von 0_BG25 ^ Bensoxycarl3onyl-L«glai;ainyl~L-tyros:in als Substrat und CL 025 5» Bnäyßi-2.oapräparat wieder.

laehetehead wird öle Substrat^Spesifität der sauren Carboxypeptida.se. beschriebene DiQ allgemeine, formel I

(I)

Am ö.ex dex* Rest E sich von gegebenenfalls durch andere Acylreste substituierten .Aminosäuren oder Peptiden imd die Reste X bsw«, Y sich von L~Aminosäuren ableiten_r kennzeichnet eine Carboxyl-Jäadgruppe einer Peptißicette eines Substrats, die nachstehend als G-Endgruppe beseichnet viirdo Die Carboxypeptidase A bewirkt eine hydrolytische Spaltung der Peptidbindung «wischen X und J₉ v;enn die Aiainosäurereste in ϊ-Stellung der C-Eüdgruppe des Substrats, die eine freie üarboxylgruppe besitzen_c entweder neutral oder sauer sind, mit Ausnahme von Prolin; die Carboxypeptidase B zeigt nur dann eine ähnlich starke Aktivität _t vrenn die Aminosäurereste in Y~Stellung sich von basischen Aminosäuren ableiten Demgegenüber wird die Aktivität der sauren Oarboxypeptidase der Erfindung am stärksten durch den Aminosäurerest in X-Stellung beeinflusst· Wenn sich dieser zum Beispiel von einer aromatischen Aminosäure ableitet, wie !Tyrosin oder Phenylalanin, besitat die hydrolytische Aktivität des vorgenannten Enzyms einen Maximal"' wert.»

Leitet sich der Rest X von einer sauren Aminosäure ab, wie von Glutaminsäure, so ist die Aktivität immer noch hoch; ist X hingegen eine Leucin-Gruppe"_t dann sinkt die Aktivität ein wenig abc

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Andere Aminosäureresteρ t?ie Glycin-, Talin-», oder Prolingruppen,, können ebenfalls verwendet werden _t die "Aktivität jedoch wird, merklich verringerte . .;

Tabelle I zeigt eine Xtisammensteilung der hydrolytischen Aktivität der sauren Carboxypeptidaae gegenüber Peptiden und Amiden, wobei der Einfluss verschiedener Aminosäurereste des Substrats auf die Wirkung des Enzyms ersichtlich ist« Als Mass für die enzymatisch© Aktivität wird die Ansah! an Mikromolen Aminosäure

^bei ο
angegeben, die/30 C und einem Pg-Wert von 3j5 -aus-'verschiedenen Substraten R - X - Y in 1 Minute freigesetzt v/erden» Die Enzymkonaentration wurde dabei ₉ wenn nicht anders angegeben, so gevfählts dass die Extinktion bei 280 mu 2,0 betrug =

Tabelle I Vergleich der hydrolytischen Aktivität gereinigter saurer Carboxypeptidase gegenüber Peptiden und Amiden *

£,„,,„, _t t-a ύ v\ Mikromole freige-

Substrat (R-X^Y) eetzte Aminosäure

0{-Arainopeptide:

(1) X s Rest einer aromatischen Aminosäure

Benzoxycarbonyl-Ir-tyrosyl-L-leuoin 67 874

Benzoxycarbonyl-L-phenylalanyl-I-leucin** 51 666

Benzoxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-tyrpsin** 24 864

Acetyl—Ir-phenylalanyl-L-di j odtyrosin** 16

(2) X = saurer Aminosäure-Rest ·

Benzoxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylai.anin*» 16 732 ■ Benzoxycarbonyl-L-g^tamyl-Ir-tyrosin 9 110

(3) X β Leueylgruppe
Benzoxycarbonyl-L-prolyl-L-leucyl-glyciii 2 742

00 9 825/1 7 27,

Mikroaole frei»

Substrat (R-X-Y) gesetafce Amino*

aäure

(4) X= Glyeylgruppe

Bens O2cycarbonyl-glycy 1-L-I eucin 550

Bensojiycarbonyl^glycyl-Ir-phenylalanin 224-

Beasc3:ycarbonyl-»glycyi~l> tryptophan . 20

Bsnzo3i3rcarbonyl-glyeyl=Ii~proliii 0

Benzoxycarbonyl-glycyl-Ii-propyl-L-leucyl- 24 lli

lysiii 86

(5) X = falylgruppe
BQilaoxycarbonyl-Ir-valyl-ls-glutaminsäure 40

(6) Z ~ Prolylgruppe
Benso^^carbonyl-glycyl-L-prolyl-L-leucin Spur

Imide: " .

Benaos^carbonyl-L-tyrosyl-L-leucyl-aiuidi** 0

Besiao^ycarbonyl-L-tryptopiianyl-phenylalaiiyl- 0"

Bensoxycarbonyl-glycyl-X-'phenylalanyl-amid'»* 0

BenzojEycarbonyl-glycyl-L-leucyi-aniid** 0

BenzoxycarbonyX'-L-alaJiyl-L-'piienylalanyl-aaid«* 0

Xripeptide

Glycyl-glycyl-glycia 0

LAlXllli 0

ygyygy

L-Leucyl~glycyl~glycin 0

Glycyl-glycyl-L-leuoiji 0

Dipeptide s

Ir-Iyroeyl-Ii-leucin 0

Glycyl-glyein 0

Grlycyl-Ii-leucin 0

Glycyl-L-asparagineaure 0

Ir-Leucyl-glycin 0

Peptide, die einen Heat einer D-Aminoeäure enthalten

Benzoxyoarbonyl-L-'tyrosyl-D-leuoin 0

Glycyl-3>-asparagin8äure 0

* Die SubBtratkonzentration ist 5x10"*^" molar, mit folgenden Ausnahmen» 10 molar für den Fall des Benzoyl-glyoyl-L-lysine und 5x10 molar im Fall der Dipeptide und Tripeptide.

** Ein Teil des Substrate wird bei einem p_H*-Wert von 3,0 unlöslich.

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Aus tabelle Ϊ geht hervor, daßa die Carboxylgruppe des Substrate frei sein muss 5, um die umsetzung, siit der sauren Carboxypsptidase" 2ü ermögliohen.0 Das Enzym kanu al» öine Qai^jlioxypeptidase bezeichnet werden9 weil es keine Üraaetaung mit Substraten ergibtj deren Carboxy !gruppen, SoB₀ durch eine Mxnogruppe, blockiert elndj •wie Benzoxyoarfconyl^^tyrosjl^L-louOylaiHidj, BensöKyearbonyl-L-

njlaiaiap Benz oxy oar bony l~glycy i-L-Bec.ao3Q^Tc&rbor2j»-l™glycyl—t-leucylamid oder aIan.yl--Ir»p.b>.t;i?.vlaIaji;7rLamid_o Dsnzioch ist aus den Yorgejianntsn bsw_e naclis^aiiendo.i aa^iirlichen Eigenschaften des Ensyms der ix'findimg srsichtlxch, dass es sich von dso. bekannten Carbqxypeptidaeen «. und B immer nosh-unterscheidet«"

Das Enaym der Brfindung imterscheidet sich in seiner Wirkungsweise gänslich voa'Exopeptidaseiip- v;ie Dipeptidase oder Sripeptida.se, Bei der Hydrolyse durch das I'äiaym der Erfindung ist es■-Witihtig _f dass die Aminogrupp© in qf-Stellung des Aminosäurerests'X^ doh. die benachbart sur C-Endgruppe Y stehende Gruppe, durch Acylreste oder Peptide blockiert ist. Dies bedeutet, dass das Enzym dex\ Erfindung sich nicht mit JJipeptiden, wie l-iyrosyl-L'-ieuein, Glycyl-ßlycin, Glycyl-L-leucin, Glyoyl-l-asparaginsäure, oder L-Leucyl-glycin und TripQptiden_p wie ^lyoyl-glycyl-glyoin, Ii-Alanyl-glycyl-glycin, L-Leucyl~glyoyiL-glycin, oder Glycylglycyl-L-leucin umsetat.

Ferner ist aus Tabelle 1 ersichtlichp dass die durch das Enzym der Erfindung bewirkte Hydrolyse durch Amihösäurereste in Χει ellung sehr stark beeinflusst wird; die Aminosäurereste in Y-Stellung und in dessen Nachbarschaft können jedoch ebenfalls von Einfluss sein. 00 9825/1727

Die 'Geschwindigkeit der durch das Enzym der Erfindung bewirkten Hydrolyse wisrd wahrscheinlich, "bei Substitution der Of-'Aminogruppa des Aminoeäurerestes X durch eine Benzoxycarbonylgruppe in stärkerem Masse erhöht als bei Substitution duroll eine Acetyl« gruppe ο Da die Substrat<=Spezi£ität des Enzyms der Erfindung durch den Aminosäurerest X_t der der C~Endgruppe Y-benachbart ist, stark beeinflusst wird* zeigt, das Enisyia der Erfindung bei Substraten, deren C-Endgruppe sich von einer· basischen Aminosäure ableitet, wie Benzoyl-glycyl-L-lysin, nur eine gerinne Wirkung. Diese ist bei Substraten noch geringer, die in der C-Endgruppe Prolin besitzen, wie Bensoxycarbonyl-Ir-prolyl-L-leucyl-glycyl-L-prolino Eine weitere Anforderung an ein Substrat für das Enzym der Erfindung besteht darin, dass der Amino saureres' t des Substrats sich von einer L-Amino säure ableiten muss« Deshalb ist eine Verbindung, wie Benzoxycarbony1-1-tyrosyl-B-leucin, die von D-Aminosäuren abgeleitete Reste enthält, kein geeignetes Substrat für das Enzym der Erfindung·

Wie erläutert, unterscheidet sich das Enzym der Erfindung bezüglich seiner Substrat-Spezifität gänzlich von den beiden Carboxypeptidasen A und B. Darüberhinaus weist es die nach-" stehenden unterscheidenden Merkmale auf₀ Die Aktivität der sauren Carboxypeptidase der Erfindung wird durch Metall™Chelatbildner, wie Äthylendiamintetraessigsäure (0,05 m) oder o-Phenanthrolin, Dtoht geAßinmt, durch die an den Proteinrest eines Enzyms koordinativ gebundene Metalle entfernt werden« Daraus kann man schliesBen, dass das Enzym der Erfindung kein für die katalytische Wirksamkeit erforderliches Metall enthält. Es unterscheidet eich darin grundlegend von den anderen Carboxypeptidasen, die an

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«. ö —

der Katalysatorwirkuag beteiligte Metalle enth Altem«, J)ie. bekannten Ausnahmen sind Carboxypeptidase C, die aus öi tr us feucht en extrahiert wird.,, und Penieilliutn~Pept.id.ase Β_Γ die von Mikroorganismen der Gattung Penicilliutn gewonnen wird; dio Aktivitäten dieser beiden Enzyme werden durch Zusatz vo» Metall-Chelatbildner nicht beeinflusst. Dennoch gibt es noch einen Unterschied, der darin besteht, dass das prj-Optitauia ö.es Enzyms der Erfindung merklich niederer ißt als das der vorgenannten beiden Enzyme₀ Ferner geht aus der Literatur hervor, dass die allgemeinen Eigenschaften der Penieillium-Peptidase B jenen uer Dipeptidaeen eher ähneln als der Carboxypeptidasen·

Andererseite ist die saure Carbcxypeptidase der Erfindung im Gegensatz' zu den bekannten Enctopeptidasen nicht in der Lage, 3?eptidblndun^en von Proteinen oder Peptiden aufzuspalten<> V/enn man z.B. ein Gemisch des Enzyme der Erfindung mit einem Protein zur Ausfällung der hochmolekularen Protein-Fraktion mit Iriehloree-Bigsäure behandelt, so enthält die in Trichloreaßigeäure lösliche Fraktion im Überstehenden FiItrat lediglich freie Aminosäuren als Zersetzungsprodukte» jedoch keine Peptideο Dementsprechend kann man das Enzym der Erfindung eindeutig von sauren Proteinasen oder anderen ähnlichen Endopeptidasen unterscheiden, die mit Hilfe von Aspergillus hergestellt sind und deren pu-Optlmum to*i 2,5 bis 3,0 liegt. . .

Die saure Carboxypeptidase der Erfindung wird bei 6O⁰C und darüber inaktiviert bzw. bei* einem p_H-Wert von 7,0 und darübe» inaktiv·

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Das Molekulargewicht des Enzyme aar Erfindung wird aufgrund der Gelfiltration an Sephadex auf etwa 100 000 geschätzt«, Nach der Methode von Yphantis ergibt sich ein Molekulargewicht dee Enzyms der Erfindung von 122 OCO„ Die Sedimentationekonetante dee Enzyms der Erfindung bei der Konzentration 0 wird auf 7₉3 S geschätzt« Im Vergleich dazu beträgt das Molekulargewicht der aus Aspergillus saitoi hergestellten sauren Protease 35 550 und JeneB der Carboxypeptidasen A baw₀ B 34 000 bzw, 34 30O₀ Auch hier besteht also ein Unterschied des Enzyme der Erfindung gegenüber den anderen Enzymen»

Die vorgenannten Versuchsergebnisse lassen den Schluss zu,, dass die saure Carboxypeptidase der Erfindung ein neues Enzym ist»

Die Aktivität der sauren Carboxypeptidase der Erfindung wird nach folgenden Verfahren bestimmt.

1 ml eine8 Gemisches aus einer bestimmten Menge der sauren oxypeptidase der Erfindung in einer 5x10™*^ molaren lösung von Benzoxycarbonyl-L-tyrosyl-L-leucin in 0,05 molarem Acetatpuffer

—4 mit einem p„-Wert von 3,5 oder in einer 5xlQ molaren Lösung von Benzoxycarbonyl-L-glutamyl-L-tyrosin in einer Pufferlösung mit einem Pg-Wert von 3*1 wird 20 Minuten bei .30⁰C inkubiert und nach erfolgter-Umsetzung naoh Zugabe von 200^uI 0,3 m Natronlauge zur Inaktivierung des übriggebliebenen Enzyms 30 Minuten auf 30⁰C erwärmt. Das alkalische Gemisch wird ansohltessend mit 200 jul 2,5 #-iger Essigsäure neutralisiert und zuletzt nach Zugabe von 2,0 ml 0,5 molaren Citronensäure-Puffers mit einem p_H-Wert von 5,Ό und 1 nl von naoh der Yemm-Cocklng Methode (E. Cooking und E.W. Yemmι Biοehem. J. 53, XIl (1954)) hergestelltem Ninhydrin-

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BAD CWlGfNAL

Gemisch in siedendem Wasser erMta'io lach 15 Minuten Erhitsen_ · wird das üemiseh unter Bislcuhlun^ kräftig gerühxfc und durch be einer Mischung ?oal· Yöl«,~t©il- Äthanol -met 2 fol.-teilen ser auf ein Volumen von 5 ml gebracht„ Sciiliesslich wird die "' durch aas Hinhydrin-Reagens erzielte iTarbintensität beetinunt, iü~ dem die Absorption "bei 570 ιπμ* die- die Menge .der Aminosäure'an- ^ gibtρ gemessen wirdo

Eine Enzymeinheit ist als diejenige Ensymmenge definiert,, die bö_ti 30 G und einem p^-Wert von 3_P5 in 1 Minute aus Bens oxy carbony I=Lr tyrosyl-L-leucin als Substrat 1 uMol L-Ieucin freisetato. Bei Ye_:r.?- wendung anderer Substrate wird auf vorgenanntes Substrat als Se~- zugsgrösse umgerechnete Leucin oö.er andere bei der Umsetzung in Freiheit gesetste Aminosäuren können durch DUnnschicht-Chroina— " tographie an Kieselgel G als Adsorbens mit Ninliydriri-Heagens oder aber mit Hilfe eines automatischen Amino säur en-Analy sat or s .-be- .. stimmt werden.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der sauren Carboxypeptidase₉ das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Schimmelpilzkultüren der Gattung Aspergillus in festen oder flüssigen Nährböden züchtet und das Enzym aus dem Nährboden oder aus von diesen hergestellten Präparaten gewinnt_β

Beispiele für im Verfahren der Erfindung rerwendbare Soblflunelpilzarten der Gattung Aspergillus sind Aspergillus uöamii, Aspergillus saitoi, Aspergillus niger, Aspergillus inuil, Aepergillus aureus, Aspergillus awamori, Aspergillus nakazawaii_e ABpergillus oryzae und Aspergillus

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e für einzelne Stämme dieser Schiramelpilssarten sind ü^porgillua uearaii ft-0655 (ASOD 14351)» Aepergilliis sal toi Ε~5β13 (A¹I¹CC 14-552), Aopergillus nige? KRHX₁ 550, Aopergillue insii R-5631 (Al¹OO 14335), Aspergillus aureus R-4522, Aspergillus attreus R-6&2 (ASFCC-14554)*- Aepergillue awamori R-5523» Aspergilluö aweiaori IAH 2590 (15GG 14535)» Aspergillus nakaaawaii E-6S22T, lepergillus oryso.ß var_o raagnasporuo A - 1 - 5 und

so^aa KSc Biese Stamms_? baw« deren Varietäten oder n sctoliessen ^edocii die YerewendU3% anderer Stämme gemäsß übt Erfindung nicht aus? es können nämlich alle Stämme von Seiiimmelpilisen,, die zur Sattung Aspergillus- gehören und die eich sur Herstellung von saurer Carbosiypeptidase eignen_s gemäsa der Erfindung verv/endet v/erden.

Die Züchtung der vorgenannten Stämme gemäßs der Erfindung kann entweder in festen oder flüssigen Nährböden durchgeführt werden«,

Bei der Züchtung in festen Nährböden (Koji-Verfahren) werden ale Medium geeignete Stoffe, wie V/eizenkleie oder entfettete Sojabohnen, gegebenenfalls mit geeigneten Nährstoffen, wie Ammoniumchlorid, und mit Wasser gemischte Das Gemisch wird unter Dampfdruck sterilisiert und gekühlte Nach dem Kühlen wird eingeimpft und gut gemischt. Schliesslioh wird die Inkubation 50 bis 90 Stunden bei einer Temperatur von 25 bis 4O⁰C durchgeführte

Nach dem Inkubieren wird mit dem 5 bis 20-fachen Volumen versetzt, das Gemisch 60 bis 70 Minuten stehengelassen und anschlieesend das Enzym-Rohpräparat unter Druck extrahierte Die extrahierte . Flüssigkeit wird-filtriert, wodurch aufgeschlämmte Festkörper, Sporen und andere Premdatoffe entfernt werden«, Das

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QflJGlNAL

Piitrat- wird auf 1/bis 5⁰C abgekühlt und mit dom. 2,"$- bis 3_P0-'^;~ fachen Volumen 95 #—igen,, atwor au." 1 biß 3⁰C abgekühlter. Äthanole versetzt ο Das Gemisch v;ircl gründlich gerührt und mindestens 10 Stunden, absetzen gelassen. Man g&friexitrocknet die fällung bei einem Druck von 0_pl Torr und erhält das Ensym-Rohpräparat der sauren Carboxypeptl&ase. Zur: Fällung kann aian anstelle,von Ithanol auch Aceton, Methanol oder leopropanol als Lösungsmittel verwenden ο _T._T.

Bei der Durchführung der Züchtung nach dem Submers-Verfahren stellt man einen flüssigen Hährboden her, der geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und andere für das Wacheturn des Mikroorganismus nötige Nährstoffe enthält und impft an, ZoBe beimpft man das.flüssige Medium mit einer wässrigen Suspension des Mikroorganismusο Beispiele für Kohlenstoffquellen sind V/eiaenkleie_s Stärke und Glucose_o Beispiele für Stickstoffquellen sind organische Stoffe, wie Sojabohnen, Casein oder Fleischextrakt; oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumchlorido Aueserdem können Phosphate oder andere anorganische Salze als Zusätze verwendet werden_o Die Verfahrensbedingungen werden bei der Submerskultur in flüssiger Phase durch die Wahl der verwendeten Stämme und anderer Faktoren so eingestellt, dass die Aktivität der sauren Carboxypeptidase einen Maximalwert erreicht. Bei Verwendung von Aspergillus usamii muss man 2oB« den p„-Wert des Mediums auf 3,0 bis 6,0 und die temperatur auf etwa 30⁰C einstellen und die Inkubation während 50 bis 100 Stunden durchführen.

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" O ORIGINAL

Die güehtung in Submersloiltur kann bei stationären Bedingungen, unter Schütteln; Rühren oder Belüften durchgeführt werdeiu In grosöem Maßstab wird die Züchtung mit besserer Wirkung unter gleichseitigem BeIiIften und Rühren duröfcgeführt.

!fach dem Züchten wird die Gärmaieche filtriert _f das ffiltrat gegebenenfalls konzentriert und auf einen p^-Wert vo» 4»O eingestellt,, Nach nochmal igem Filtrieren vird das Filtrat wie !bei der Züchtung in fester Phase mit Alkohol versetzt und die Fällung zur Gewinnung des Rohpräparats der sauren Carboxypeptidaea gefriergetrocknet»

Das erhaltene Enzym-Üohpräparat wird nach sorgfältig ausgewählt ten, gegebenenfalls kombinierten Verfahren gereinigt<,' Beispiele für derartige Verfahren sind das Aussalzen, das Adsorptions-Eluierverfahren mit Hilfe verschiedener Ionenaustauschers wie Duolite GS - 101, Phosphocellulose oder ÜiäthylarainoäthylGellulose, und die Gelfiltration sur Fraktionierung hinsichtlich des Molekulargewichteο

Tabelle II zeigt ein Beispiel der Analyse des erhaltenen Pro·* dukts, bei der die Aktivität der sauren Carboxypeptidase gemessen wird, die durch Züchtung verschiedener Schimmelpilzarten der Gattung Aspergillus auf Weizenkleie In fester Phase erhalten wird·

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. - 14- «-
Säbelle ϊϊ

Stemm

	1918854
fester (Ko-Ii)	■üiheiteÄ/g nach der ΪΙ&.
18	800
14	400
9	500
6	300
6	900
VJ!	000
15	000
10	OCO
3	300
15	700
4	900

Aspergilius usaäii R-0635 (ATCC-14331) Aspergilius saitoi R-3813 (ATCC~14532) Aspergilius niger ilRRL 330

Aspergilius inuii 1-3631 (AICC-14333)-Aepergillue aureus R-4523

Aspez*gilius aureus R-651H (ASCCWL4334) Aspergilius av/amori R-35.23

AspergillUB av/amori Ι.ΛΜ .2390 <.5.200-14335) Aspergilius nakaaawai E-6822X

Aspergilius öryaäe yar, magnasporus A-l-5 Aspergilius sojae KS

Die Beispiele erläutern die Erfindung,

Beispiel 1

840 kg Weizenkleie werden mit 500 Liter Wasser benetat und 40 Minuten mit Dampf bei einem Druck von 1,1 kg/cm sterilisierte Naeh dem Abkühlen werden 3 kg einer Impfkultür von Aspergilius saitoi R-3813i die getrennt als Reinkultur gezüchtet wurde, eingeimpft, und es wird gründlich durchgemischte Das Greniisch wird anschliessend auf 1600 Koji-Böden Übergeführt und 50 Stunden bei 30 bis 45°C inkubiert. Die Koji-Böden werden einmal in zwei Tagen beim Ansteigen der Temperatur der Kultur umgestellt.

Nach der Beendigung des Züchtens wird das Material in einen Extraktionsapparat übergeführt und nach Zugabe von 3000 Liter

Wasser 60 bis 70 Minuten darin gelassene Anschliessend wird die Extraktion bei einem Druck von 60 kg/cm² durchgeführt. Eb werden 2400 Liter Flüssigkeit! d_oh, 80 $ des zugeaetssteu Wassers erhalten, die ansohiiessend zur Entfernung,a.B. aufgesohlämmter Pest-

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körper und Sporen₉ filtriert werden* Das erhaltene Plltrat wird in einem Fällbottieh. gesammelt, darin mit Kalteaöle auf 1 bis 5⁰C

und mit dem 2 1/2 bis 3?0-fachen Volumen 95 #~igen 11-der vorher auf 1 bis 5°G abgekühlt wurde, versetzte Daß erhaltene Alköhol-Gemißelx wird gi'ündlich gerührt und über 10 Stunden bis zur vollständigen Ausfällung stehengelassene Die Fällung "wird durch kontinuierliche Filtration abgetrennt und sofort danach "bei einem Druck von 0_rl Torr gefriergetrocknet.. Das getrocknete Produkt wird, iaerkleinert* Es werden 16 kg des Rohprä parats der sauren Garboxypeptidcss gewonnene Die Enzym-Aktivität des vorgenannten Rohpräparats betr
pro 1 g_r die Ausbeute beträgt 60 ^

des vorgenannten Rohpräparats beträgt 3»14x10 Enaym-Einheiten

Ein Gemisch aus 90 kg Weizenkleie, 160 kg entfetteten Sojabohnen und 40 kg Ammoniumchlorid wird nach Zugabe von Wasser 1 Stunde bei einem Druck von 3 kg/cm sterilisiert und in einen 20 000 Liter fassenden Fermenter eingespeist, der mit der zur Erzielung eines Gesamtvolumens von 10 000 Liter nötigen Menge Wasser aufgefüllt wird. Der Ausgangs-p_H-Wert wird auf 5»5 und die Temperatur des Mediums auf 35°C eingestellt; dann wird.eine Sporensuspension eingeimpft, die getrennt als Reinkultur durch gründliches Vermischen von 100 g Impfkultür von Aspergillus eaitoi R-3813 mit 500 ml sterilen Wassers gezüchtet wurde.. An-

o
echliessend wird das Brüten bei 35 C unter Belüften und Rühren durchgeführt.

Nach 4 lagen Brüten wird die Gärmaische unter Verwendung einer PiIt erhilf e filtriert» Das Pil trat viird bei 35°O/35 Torr konzentrierte Man erhält 1500 Liter Flüssigkeit, die mit einer anorga-

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BAD

mischen Säure _g wie Salzsäure_s auf einen p„-Wert von 4,0 eingestellt und wiederum filtriert wird. Dann werden gemäss Beispiel 1 die Fällung mit Äthanol und die Gefriertrocknung durchgeführt.. 20 kg Roh-Enzympulver werden erhalten. Die Aktivität der erhaltenen sauren Carboxypeptidase beträgt 7,8 χ 10 Einheiten pro Ig, die Ausbeute beträgt 60 ^₀

Bei Anwendung der Aussalzmethode durch Ammoniumsulfat anstelle des gemäsß Beispiel 1 bzw. 2 durchgeführten Fällen© mit Alkohol ergibt die Ausfällung mit. 70 i> Ammoniumsulfat die höchste Ausbeu- \ te an saurer Carboxypeptidase, doh. 60 ^₀ ^

Beispiel 3 .,

Ein schwach saures Kationen-Austauscherharz (Duolite CS - 101), das vorher mit einer 0,001 molaren Acetat-Pufferlösung gepuffert wurde i wird in eine Ghromatographiersäule mit einem Durohmesser von 2 cm bis zu einer Höhe von 40 cm eingefüllte 20 ml einer Rohenzym-Lösung mit einem Gehalt von 500 mg des gemäße Beispiel 2

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erhaltenen Enzym-Rohpräparats werden mit Hilfe dieser Säule chromatographierto Das Chromatographierverfahren wird unter Ver-Wendung einer 300 ml fassenden, mit einem Rührer ausgerüsteten Mischkammer durchgeführt, die an der Verbindungsstelle zwischen dem Lösungsvorrat und der Chromatographiersäule angebracht ist und einen kontinuierlichen Verlauf des Verfahrene bie zu jenem Punkt gestattet, bei dem der p^-Wert des Eluats derselbe wie ijener des Acetat-Puffers der 0,15 molaren Vorratslösung ist, doh· 5,2 beträgt· Danach werden Fraktionen von jeweils 5 ml gesammelt.

Figo 2 zeigt das Ergebnis der vorgenannten chromatographiechen '. Analyse der sauren Carboxypeptidase. Während die durch den Stamm

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:-iw^·':· *** · BAD ORIGINAL ·

der Gattung Aspsrgillus erzeugte Fraktion der sauren Proteinase bzw· Aspergillopeptidase A nahezu vollständig am Auetauscherharz . adsorbiert wird und daher nur langsam eluiert wird» wird das Enzym der Erfindung am Austauseherharz nur schwach adsorbiert und von diesem leicht eluiert₀ Die fraktion der vorgenannten sauren Carboxypeptidase, die leicht eluiert wurde, enthält fast keine saure Proteinase„ Die Ausbeute des Enzyms der. Erfindung beträgt etwa 50 + 15 #, wobei sich bei jedem Chromatographier-Arbeitegang eine kleine Abweichung ergibt» Die erhaltene Enzym-Fraktion wird anschliessend in einem Kollodiumbeutel konzentriert oder nach Dialyse gegen eine 0,005 molare Acetatpufferlösung mit einem p„-Wert von 4»0 der zweiten Reinigungsstufe unterworfene Anstelle von Duolite CS - 101 kann man auch Amberlite CG - 50 verwenden.

Die zweite Stufe beim Chromatographierverfahren besteht darin, das8 man die saure Carboxypeptidase der Erfindung durch Phosphooelluloee, einer Kationen-Austauschercellulöse, trennt. Zuvor mit 0,005 molarem Acetatpuffer mit einem p^-Wert von 4,0 abgepufferte Phosphocellulose wird in eine Chromatographlersäule mit einem Durchmesser von 2 cm bis zu einer Höhe von 50 cm eingefüllt. In der Säule werden 100 ml der nach dem ersten Chromatographierverfahren fraktionierten sauren Carboxypeptidase adsorbiert, und das Chromatograph!erverfahren wird mit einer 0,05 molaren lösung von Natriumchlorid in einer 0,005 molaren Acetatpufferlösung mit einem p_H-Wert von 4,0 in einer 500 ml faseenden Mischkammer kontinuierlich durchgeführt· Ee werden Traktionen von jeweils 5 ml aufgefangen.

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Figo 3 zeigt das Ergebnis des vorgenannten Chromatograpiiierverfahrens mit Phosphocellulose. Die Ausbeute des Enzyms beträgt etwa 60 #e Die Enzym-Fraktionen werden gesammelt und gegen einen 0,005 molaren Acctatpuffer mit einem p„-Wert von 5_P0 dialysiert und anschliessend entweder der nächsten Reinigungsstufe unterworfen oder zur Aufbewahrung konzentrierte

Die dritte Stufe des Chromatographierverfahrens wird unter Verwendung des Anionen«Austauscherharzes Diäthylawinoäthylcellulose durchgeführt» Die mit einem O₉005 molaren Acetatpuffer mit einem powert voii 5»0 abgepufferte Diäthylaminoäthylcellulose wird in eine Chromatograph!ersäule mit einem Durchmesser von 2 cm bis asu einer Höhe von 50 cm eingefüllte In dieser Säule werden 194 ml der nach dem vorausgehenden Chromatographierverfahren erhaltenen sauren Carboxypeptidaee adsorbiert, und das Chromatographierver-= fahren wird durchgeführt, indem man in einem 0,005 molaren Acetatpuffer mit einem p_H~Y/ert von 3,0 gelöstes Natriumchlorid kontinuierlich durch eine 500 ml fassende Mischkammer einspeiste Fraktionen von jeweils 5 ml werden aufgefangen,

Figo 4- zeigt das Ergebnis des vorgenannten Chromatographierverfahrens mit Diäthylaminoäthylcellulose. Die Ausbeute der Carfcoxypeptidase der Erfindung beträgt etwa 60 ^₀ Die erhaltene Fraktion wird nochmals wie vorher chromatographiert· Die Ausbeute beträgt nachher etwa 80 fi, Anschliessend wird die gesammelte aktive Fraktion dialysiert und zur Aufbewahrung konzentrierte

Ale vierte Reinigungsstufe dient die Gelfiltration an Sephadex 6 - 75· Die Abmessungen der Säule betragend oai im Durohmesser und 65 om in der Höhe. Das Gelfiltermaterial wird Tor dem Ein-

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in die Säule mti; einem O_föl molarer* Aeetatpuffer abgepuf-Daä-vorßtehend erhaltene._f gefriergetrocknete Enzympräparat in 5 mi <■ Iner EeaigEauralufcnmg gelöst und lpe obere Ende der Säule *ing&$\tiei,_t wo die Gelfiltration mit dernaliC-n ßesigeäur·- Xifeung -duröhgofütrct wird, i^ralctionen von ;jev/eil^ ^ ml werden aufgefangen.

Fig» 5'Beigt-i.lri·. c-aUand der Ge?..!titration erhti' ijve .Diagramme. Sie Ausbeute bet;.n,,«t 76 ?>o Λ,αε Oer. ve j?e teilendes ' "ir,· uc hen geht äervor_f daee dl·; κ-sure Garboxype itidaee der Iäri'i. ^l:.-i.g· viel geiineller alu ri* sc.ure Protein:··?.b (Aepergillov^x^T;it\ace A) mit ainein Molekulai-gov/icht von 55 0OC aluiert wird_f ex bedeutet, daee sie ein Ifna;nn mit einem höh-· : mi Molekular^¹\.icht ist.

Das vorstehend es.haltene Enaympräparat wird entvcdöi sofort oder nach dem Aussalücu üur Gewinnung einee Keinpräpairc.tE' von eaurer Carboxypeptidase gtifriergetroclcnet·

Bei der Durchführung der Diec-Elektrophoreae (diekontinuierliohe Elektrophorese) am vorgenannten Enzympräparat bei einem p^-Wert von 6,0 (D. E. Williame, R.A. Reisfeldj Ann. New York Acad. Solo 121 (1964)»373)aeigt »ich, dass dae Enzym der Erfindung elektrophoretisch homogen ist. Das gereinigte Enzympräparat der Erfindung erscheint beim Zentrifugieren in der ultrazentrifuge homogen, und seine Sedimentationekonetante bei einer Konzentration 0 wird mit 7,3 S berechnet·

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Claims (1)

1. lc Pa» Εχΐ'Λνηι "saure C£irliOKypeptidaee"_r das dadurch g e k e π ;a ζ w :?. α b. η e t lß+,ς 6.&.B& «?s die endständigen eine freie Carboxylgruppe aufweisende Asiposäure tob. Proteinen oder Peptides bei eines p„->We:;?t von etwa. 1_ε5 biß 5,-5 hydrolytisch abspaltet j. BäotalXi'rtfi "Ist. ein Mols^ul^rgevielat von eti^a 132-000 ^:' Defiatat, bei oiner 7MFfpe.ri?-tx3r vbei: bO G iri;ai.tiv^-a.ert^;wirß und bei einem p^Wert τοπ 7 cC.ex e.r,räber inaktit ist.

   2ο TiB-is Ensym Bach Anepvucli 1_? v/cuei das vorgenannte Peptid ge-g e k s Ii η s e i e h η ρ; t iüt durch die allgemeine .Formel I

   XL "■ A. ·"·■ .'- \1 )

   ±n der R ein ge^etoenenfallc lurch einen Aoylrest substituierter Aminoßäure— od&r i-eptidrest :lst_t A. und Y an der Carboscjrl-iaadgrup= pe ö.ea Peptide befindliche, !»Aminoeäurereete sind und die Amino— gruppe des "Aminoeäurereßta X. in (V-Stellung durch Acylreste oder · Peptide gebunden ist, mit der Maesgabe_f dass die Enzymalctivität einen Maximalwert erreicht, wenn X der Hest einer aromatischen Aminosäure ist_f dass die Aktivität einen mittleren Wert erreicht, wenn X ein sauer reagierender Aminoßäurerest ist und dass die Aktivität gering ist, wenn X ein neutral oder basisch reagierender Aminosäurerest ißt,

   3ο Daa Enzym saure Garboxypeptidase nach Anspruch Ij, dadurch gekennzeichnet daee das p„-0ptimum gegenüber Benzoxycarbonyl«L-1;yrosyl~L--leucin als Substrat 3_r5 beträgt C

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   -21- 1319854

   4c Yerfahren 2sur Herstellung des Eaayias nach Anspruch, l, dadurch g e k e ü η 3 θ i c h η e t, dass man Schimmelpilz-Kulturen der Gattung Aspergillus in festen oder flüssigen Nährböden Küehtet und das Ensym aus dem fährboden oder aus von diesen hargesteilten Präparaten gewinnt«

   5 c Verfahren nach Anspruch 4_f dadurch g e Ic e η η zeichnet_D dass man als Organismen Aspergillus usamii R-0635 (ATCC-14331), Aepergillus saitoi R-3013 (Aa?CG~14332), Aspergillus niger SJIiBIi 33O₈ Aspergillue inuii R=>3631 (AiCC-14333)_f Aspergillus aureus H-4523» Aspergillus aureus R-6512 (ATCO-14334)i Aspergillus avemori R-352'3_P Aspergillus awaraori IAM 2390 (ATCC-14335)» Aspergillus nakazawai E-6822Yj Aspergillus oryzae var₀ magnasporus A-l-5 oder Aspergillus sojae KS verwendet«

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