DE1617868A1

DE1617868A1 - Verfahren zur Herstellung einer anticanceroes wirksamen Substanz

Info

Publication number: DE1617868A1
Application number: DE19661617868
Authority: DE
Inventors: Dr Bogdanov Ivan Georgiev
Original assignee: TEXIM DARSCHAWNO STOPANSKO PRE
Current assignee: TEXIM DARSCHAWNO STOPANSKO PRE
Priority date: 1965-06-01
Filing date: 1966-06-01
Publication date: 1971-04-15
Also published as: CH459469A; PL71341B1; AT267058B; BE681876A; FI45764B; DE1617868C3; IL25759A; ES327373A1; FI45764C; NO134752B; SU390699A3; NO134752C; NL6607345A; LU51226A1; BR6679943D0; GB1146626A; NL153939B; US3762998A; DK120610B; DE1617868B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer anticancerös wirksamen Substanz, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Laotobaclllus kultiviert, wobei der Mikroorganismus die anticanceröse Substanz in seinen Kulturen bildet und in den Bakterienzellen ansammelt, und daß man die antisanceröse Substanz extrahiert und reinigt, ■

Die beigefügten Zeichnungen stellen dar:

Figur 1 das Ultraviolett-Spektrum der Ribonukleinsäure,

Figur 2 das Infrarot-Spektrum der Ribonukleinsäure.

Die Tabelle zeigt eine Zusammenfassung der verschiedenen Ergebniese»

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Bis jetzt sind als anticanceröse Mittel einige synthetische Produktes, Extrakte von fieren und Pflanzen und von Mikroben stammende Produkte beschrieben worden. Jedoch sind diese nicht zufriedenstellend, da sie nicht allein gegenüber den cancerösen Zellen wirksam ßindp sondern auch normale Gewebe beschädigen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche antieanceröse Substanz ist durch ihre biologische Wirkung und ihre chemische Hatur von allen bis jetzt bekannten antioancerösen Substanzen völlig verschieden und s5.e wirkt auf selektive Weise nur auf die cancerösen Zellen-

Die neue anticanceröse Substanz besitzt bei Tumoren eine inhibierende Wirkung und gleichzeitig eine starke nekrotisierende Wirkung. Eine intravenöse Injektion eier Substanz kann zu einer totalen Zerstörung selbst großer Tuiuore und iiu völliger Heilung fast aer Hälfte der behandelten Tiere führen, während die bis jetzt bekannten anticancerösen Substanzen nur eine inhibierende Wirkung bei einem Tumor haben, wenn sie unmittelbar nach der Implantation des Tumors angewendet werden.

Die neue anticanceröse Substanz stimuliert gleichzeitig die Abwehrkräfte des Organismus_e

BAD ORIGINAL

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In cancercsen Geweben werden Änderungen schon 8 Stunden nach der intravenösen Injektionen der anticancerösen Substanz beobachtet. Nikorskopische Untersuchungen geigen, daß die Substanz in selektiver Weise auf die canoeröeen Zellen und nicht auf die Blutgefäße und andere normale Gewebe wirkt. Die Substanz stimuliert das Knochenmark und se Ils Hämatopoesej, wäh» rend das die anderen anticanceröeen Stoffe verhindern·

Diese Tatsachen zeigen, daß die anticanceröse Substanz von den bie jetzt bekannten anticancerösen Stoffen wesentlich verschieden ist und ihre chemische liatur bestätigt das«

Zu Beginn der Untersuchungen wurden die anticancerösen Eigenschaften verschiedener Mikroorganismen studiert. Die Kulturen und die Extrakte dieser Mikroorganismen wurden auf intravenösem Wege Mäusen, injiziert, die Träger von gut entwickelten, auf intraderml schein Weg implantierten Sarcomen 180 (Krocker-Sarcom) waren. Es wurde eine anticanceröse Wirkung bei den Substanzen festgestellt, die aus Kulturen von Bazillen der Gattung Lactobacillus erhalten worden sind. So wurde eine bedeutende Wirkung mit Lactobacillus bu7.garicus, Stamm 51, isoliert aus Dickmilch (Joghurt) beobachtet. 24 Ms 48 Stunden nach der Injektion der Kulturen dieses Stammes wurde bei fast allen Tumoren «ine gut ausgeprägte Necrose beobachtet und einige Stunden später sind fast ein Drittel der behandelten Tiere

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völlig geheiltο

Eine ähnliche, wenn auch weniger starke Aktivität vrurde bei der UnterBuchung bestimmter Stämme der Gattungen Lactobacillus bulgarioua, lactobacillus easel, Lactobacillus helveticus und Lactobacillus acidophilus festgestellt»

Lactobacillus bulgaricus LB-51 besteht aus gram-prositiven Bazillen, deren Größe zwischen 5 und 7 Mikron liegt, die gemäß

dem Nährmedium paarweise oder in Ketten verschiedener Lärige angeordnet sindo

In den flüssigen Kulturen gibt er einen weichen Bodensatz, während er in den Medien, die Agar enthalten, kleine fasrige Kolonien bildet.

Die anderen biochemischen Eigenschaften sind in der ia"i:r?lle

im Vergleich mit den Eigenschaften anderer antieancerös aktiver Stämme der Gattung Lactobacillus angegebene

Die morphologische und physiologische Charakterisierung aller dieser anticancerös aktiven Stämme entspricht der Beschreibung in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" von Robert So Breed, 7« Auflage, jedoch besitzen sie gleichseitig eine charakteristische Besonderheit, weshalb sie als "varietas tumoronecroticans" bezeichnet werden« Die morphologischen und

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biologischen Oharakteristika bestimmter antieaneerös wirksamer Stämme sind in der Tabelle . angegeben. Bs ist klar, daß die vorliegende Erfindung nicht nur auf die oben zitierten Stämme beschränkt ist,, die nur eine Veranschaulichung der Erfindung darstellen» sondern daß sie sich auf alle '"Jhuiioronecroticans"-Stämme im allgemeinen bezieht.

Die Kultur und die Anhäufung der anticancerösen Substanz der "Varietas tumoronecroticans" der Bazillen der Gattung Laoto* Bacillus hängt ab vom Nährmedium. Man kann Währmedien verwenden, die verschiedene Nahrungsmittelfaktoren enthalten. Als Stickstoffquelle kann man Peptone, Extrakte von Fleisch, Maie, Soja, Hefe und dgl. verwenden, während man als Kohlenstoffquelle Glukose» Maltose, Lactose, Saccharose, Melasse und dgl. verwenden kann. AIb Phosphorquellen kann man Hefehydrolysate, Phosphate und dgl. anwenden. Als Nährstoffe kann man wenigstens einen Vertreter der Gruppen der Stickstoff- .und Kohlenstoff quelle*-verwenden«, Man hat festgestellt, daß sich die anticanceröse Aktivität verstärkt, wenn man geringe Mengen anorganischer Salze wie Natrium- und Kaliuiaphosphate, Magnesiumsulfat und andere zugibt.

Die Kultur kann unter Anaerobiosebedingungen ohne Belüftung bei einer iemperatur zwischen 45 und 35⁰O, die sich als optimal erwiesen hat, 18 bis 24 Stunden lang durchgeführt werden«,

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Im Verlauf der Fermentation sinkt der pH der Kultur auf 3.8«, Während dieser Zeit ist es nicht notwendig, den pH au kontrollieren.

Während der Peroentatlonsdauer sammelt eich die anticanoeröse Substanz besondere in den Bakterienzellen·

Wenn sich eine Autolyse der. Bakterienzellen ereignet, wird die anticänceröse Aktivität gleichermaßen in der Flüssigkeit der Kulturen festgestellt. Die anticanceröse Substanz kann mit Wasser nach der Zerstörung der Membranen der Bakterienzellen extrahiert werden· Sie hat nichts mit Milchsäure zu tun, der 7· Canainati eine antioanceröee Wirkung zugeschrieben hat (BoIl. Jnet. Sieroterap. Milanese YZ ι 205-220, 1933).

Die antioaneeröee Subetans besitzt keine antiiaikrobiellen Eigenschaften und let von den antimikrobiellen Stoffen völlig verschieden, die durch die Basillen des Stammes Lactobacillus gebildet werden und beschrieben £ind von Bogdanov (Wieeenteoheftliche Werke dea I8DL, dee Instituts für Spezia

lisierung und V«rv

»llkoamnung der Medizin, 2». 1952-,-iyi-tf9kt₃.

Waeater, Hfrach, Hatti :k (Nature 1952· Bd. 168, 659) uad Vincent Co (J.Bacteriology, 78, 477-84, 1959).

W«nn die Fermentierung beendet ist, kann die in den Bakterierisellen enthalttne anticanoeröse Substanz extrahiert und auf

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verschiedene Weise gereinigt werden.

Die Reinigung kann mindestens eine Extraktionsoperation und eine Fällungsoperation umfassen, die sowohl allein als auch mehrere Male in verschiedenen Kombinationen angewendet werden können^ wie durch das folgende Schema angezeigt:

S .. Extraktion E-P ^

.2 = "fällung E - P - E

E ~ P - Ji - P

E -P-E - P - E - P usw.

1 ο Extraktionsverfahren

Die Extraktion der anticancerösen Substanis kann mit Hilfe von mindestens einem der Lösungsmittel Wasser und Phenol durchgeführt werden« Man verwendet einen Ausgangsstoff in fester form für die wässrige Extraktion, während man für die Phenolextraktion die wässrigen Lösungen der anticancerösen Substanz oder der Stoffe« die diese enthalten, verwenden kann_a"

Als feste Stoffe, die die anticanceröise Substanz enthalten,

^natiyen)
keimen die ursprunglicheB; 3akterienaelle2i_f die entfetteten^ trooicenen. Bakterienzellen, die vorher zur Eliminierung von Ballaststoffen extrahierten Bakterienzeüen und die trockenen Stoffe erwähnt werden, die als Produkte der Extraktionen und

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f .8 -

Fällungen erhalten werden, die weiter unten beschrieben sind.

Die Wasserextraktion kann durch Mischung des Wassers und des die anticanceröse Substanz enthaltenden Stoffes durchgeführt werden. Wenn dieser Stoff aus den Bakterienz.ellen besteht, ist dB notwendig, diese mit Hilfe eines Homogenisators, einer Kolloidmühle, Ultraschall oder Enzymen wie Lysozym, Pepsin oder anderen zu zerstören» Die Mischung kann zur Entfernung der unlöslichen Stoffe filtriert oder zentrifugiert werden. Dann ist der größte Teil der anticancerösen Aktivität in den wässrigen Extrakt übergegangen· Die Wasserextraktion wird bei einer Temperatur durchgeführt, die von 0 bis 18⁰C variiert. Es ist bevorzugt, daß der pH des Wassers «wlochen 4 und 9 liegt. Ein niedrigerer pH führt eine Peilung herbei, während ein höherer pH die anticanceröse Substanz inaktiv macht. Die Zugabe eines Phosphatpuffere und von 0,01 Mol Magnesiumsulfat verbessert die Eigenschaften der wässrigen Extraktion»

Das Phenolextrektionsverfahren kann sowohl durch Extraktion der festen Stoffe mit Phenol Bit 96 £ eis auch durch Zugabe eines gleichen Volumens Phenol mit 96 $> zu wässrigen Lösungen oder Suspensionen, die die antioanceröse Substanz ent- · halten, durchgeführt werden.

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In beiden Fällen kann man nach starkem Rühren der Mischungen diese zentrifugieren, um die Phenolschicht_v die unlöslichen Rückstände und die Wasserschicht zu trennen. Die anticanceröse Substanz geht in das Phenol und scheidet sich ab, wenn man die unten beschriebenen Verfahren anwendet· Die Phenolextraktion kann bei einer Temperatur zwischen 4 und 70°0 durchgeführt werden. .

II. Die Fällungsverfahren«

Die Fällung der anticancerösen Substanz kann mit Hilfe einer Zugabe verschiedener Salze, organischer wasserlöslicher Lösungsmittel und/oder Säuren durchgeführt werden. Die Fällungeverfahren können auf die wässrigen und auf die phenolischen Extrakte angewendet werden.

Wenn die Fällung durch die Zugabe verschiedener Salze erreicht wird, bevorzugt man Amnioniumsulfat, Amraoniumchlorid, Natriumsulfat, Kalziumchlorid oder Magnesiumsulfat. Wenn man Ammoniums ulf at verwendet, hängt die Menge von der Sättigung ab, die man erreichen will, sie kann »wischen 0,1 und 0,8 liegen. Die anticanceröse Substanz geht in den Niederschlag. Der Heat der Salze des Niederschlags kann durch ein Verfahren wie die Dialyse, die Filtration auf "Sephadex" oder durch Auflösung und anschließendes Wiederholen der Fällung mit Säure entfernt weraeno

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- ίο -

Wenn die Fällung durch organische wasserlösliche Lösungsmittel durchgeführt wird, kann man Methanol, Äthanol, Aceton und dgl· verwenden. Es ist bevorzug ι Die 3 Volumina lösungsmittel auf 1 Volumen Ausgangslöa jag zu verwenden.

Im falle der fällung mit Hilfe von Säuren ist es bevorzugt, daß der pH zwischen 1,5 und 4 liegt. In diesem Sinn kann man anorganische Säuren wie Chlorwasserstoffsäure. Schwefelsäure, Phosphorsäure, und organische Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure und dgl. verwenden.

Man kann daß Eiweiß.und die Enzyme für die Zerstörung der Bakterienzellen und für die Extraktion der anticancerÖsen Substanz verwenden, ohne daß die Enzyme eine chemische Beaktion mit der aktiven Substanz eingehen· Sie tragen lediglich zu einer Beseitigung der Ballaststoffe bei, die keine Beziehung zu der anticancerösen Wirkung haben.

Das Verfahren ist mit der Verwendung von Eiweiß oder dem enthaltenen Lysozym, dem Pepsin und Trypsin, verbunden. Die Enzyme können nacheinander in verschiedenen Kombinationen je nach dem zu erreichenden Ziel verwendet werden, was die Beispiele 13 bis 19 zeigen.

Als Auegangsstoff kann man die ursprünglichen Bakterie:.^eI-len des Mikroorganismuserzeugers, lyophilisierte Bakterien-

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ORIGINAL

zellen,, trockene entfettete Bakterienzellen, vorher zur Entfernung bestimmter Ballaststoffe behandelte Bakterienzellen und die Präparate der anticancerösen Substanz verwenden, die als Ergebnis einer entmischen Reinigung erhalten worden sind.

Die wie oben beschrieben erhaltene anticanceröse Substanz zeichnet sich durch folgende Eigenschaften aus:

U Die anti.canceröse Substanz ist in alkalischem und neutra-

unter lern Wasser löslich, wird jedoch bei einem pH von/4 gefällt.

2o Die anticanceröse Substanz kann praktisch nicht in organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen, Aceton, EssigsaureäthyleBter_s Äther, Benzol, Chloroform und Petroläther gelöst werden,

3ο Die anticanceröse Substanz ist in Wasser gegen eine Membrane aus regenerierter Zellulose (Zellophan) nicht dialysierbar.

4- ο Die anticanceröse Substanz verliert ihre anticanceröse Aktivität, wenn sie in neutraler wässriger Lösung 10 Minuten auf eine Temperatur von 120⁰C erwärmt wird,- Sie verliert ihre Aktivität bei Umgebungstemperatur in alkalischer Lösung,

5» Die am meisten charakteristische Eigenschaft der anticancerösen Substanz ist ihre biologische anticanoeröse Aktivität.

109816/1935 sad original

Wenn man eine pasβende Dosis intravenös Mäusen injiziert, die Träger von intradermischen, gut entwickelten Krocker-Sarcomen (Sarcom 180) oder intradermischen Erlih-Karzi.nomen sind, ergibt sich bei fast allen Tumoren eine sehr bedeutende Necrose des Tumors und einige Stunden später sind fast die Hälfte der Tiere vollständig geheilte

Biese Eigenschaften erlauben den Schluß, daß die anticancerö-= se Substanz eine komplizierte molekulare Konstitution aufweist ο Sie unterscheidet sich durch ihre Eigenschaften von allen bisher bekannten anticancerösen Mitteln.

Die zahlreichen chemischen Analysen der anticancerösen Substanz zeigen, daß sie eine komplizierte chemische Zusammensetzung aufweist und daß sie auch,eine Ribonukleinsäure enthält, deren chemische und phyeikalische Eigenschaften die Charakterisierung der anticancerösen Substanz erlauben können,

Die einen Teil de^ anticancerösen Substanz darstellende Ribonukleinsäure besitzt als Hatriumsalz folgende, charakteristische Eigenschaften:

Q *= 33,35 f>

H = 4,43 i°

N » 13,70 i°

P « 9,80 i*

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... 13 ~

Sie Ribonukleinsäure zeigt ein Absorptionsmaximum bei 258 mu. Ihr Ultraviolett-Spektrum zeigt Figur 1 , ihr Infrarot-Spektrum Figur " 2<>

Nach, der Hydrolyse zeigt eine Chromatographie der Koalehydra-» te mittels einem lösungsmittelsystein ButanoliPropanolsWaeser = lsi si einen Fleck mit R» = Ot35, was Ribose entspricht.

Beispiel 1 >

Lactobacillus bulgaricus var. tumoronecroticans IiB-51 wird in ein Nährmedium von 200 ml inokuliert, das 3 °ß> So ja extrakt, 0_c5 ^cß> Pepton, 0_P5 ^fleischextrakt, 0,5 f° Hefeextrakt, 0,5 f» Saccharose und 0,1 ^ Magnesiumsulfat enthält» Sie Kultur wird bei einer,Temperatur von 37⁰O 24 Stunden lang durchgeführte Der pH der Kultur wird auf 6_F5 eingestellt und anschließend wird die Kultur mit 5000 g 30 Minuten zentrifugiert»

Die überstehende Flüssigkeit (1) wird Sn einer Mengi. von O₅5 ml intravenös Mäusen injiziert, die Träger eines gut entwickelten Sarcoma 180 sind, das auf subkutanem Wege implantiert worden ist, Man erhält bei allen 20 behandelten Mäusen keine iTeorose? Das Sediment aus fiakterienzellen (2) wird mit Quarzsand in einem Mörser vermählen und mit Hilfe von 100 ml destilliertem Wasser extrahiert« Die Mischung wird mit. 500P g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit (3)

BAD ORSGiNAL

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wird auf intravenösem Wege in einer Dosis von 0,5 ml Mäusen injialert, die Träger von Saroom 180 sind. NaQh 24 Stunden beobachtet man eine Neorose des Tumors bei 17 von 20 behandelten Hausen und 10 Tage später sind 8 Mauere vollständig geheilt.

Unter den gleichen VerSuchebedingungen rufen Extrakte der Bakterienzellen (3), die von Lactobacillus casei, var. tumoronecroticane Nr. 17 stammen» Necrosen bei 14 von 20 behandelten Mäusen hervor, wovon 4 vollständig geheilt sind.

Die Extrakte von Lactobacillus helvetious, var. tumoronecroticans Nr. 31» rufen bei 15 von 20 behandelten Hausen Neorosen hervorι wovon 5 vollständig geheilt sind. Die Extrakte von Lactobacillus acidophilus, var_o tumoroneoroticans Nr. 43» rufen entsprechend 12 Necroeen und 3 vollständige Heilerfolge hervor,»

Beispiel 2

Lactobacillus bulgaricus, var. tumoronecroticans LB~51 wird in ein Nährmedium von 1200 1 mit folgender Zusammensetzung inokuliert: Sojaextrakt 3 $*% Fleischextrakt 0,5 #» Pei>3on 0,5 ^, Melasse 2 # (bezogen, auf Zucker)· Magnesiumsulfat 0,1 # und 1200 1 Leitungswasser. Die Kultur wird bei 37⁰C 24 Stunden lang durchgeführt· Der pH der Kultur wird auf 6,5 eingestellt, wonach aentrifugierir T*ird, Das Sediment wird mit 50 Volumina physiologischer Lösung gewaschen und erneut

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„ 15 zentrifugiert. Man erhält 14,2 g feuohter nativer Bakterien

5 g der Bakterienzellen werden in 15 1 Waeser verdünnt und in einem Homogenisator zerstört. Das homogenisierte Produkt wird bei 5*000 g zentrifugiert und die tiberstehende Flüssigkeit (?) abgetrennt. 10 ml der Flüssigkeit werden mit destilliertem Wasser bis auf eine Konzentration von 8 rag Trockensubstanz pro ml verdünnt und auf intravenösem Wege in einer Dosis von 0,5 ml Mäusen injiziert, die träger von entwickelten Krocker-Sarcomen sind. Bei 19 von 20 behandelten Mäusen wird eine bedeutende Necrose dee Tumors sichtbar, wovon 12 nachfolgend vollständig geheilt wurden«

100 ml der überstehenden Flüssigkeit (1) werden lyophilisiert und die chemische Analyse der lyophilisierten Substanz zeigt folgende Zusammensetzung: Nukleinsäure 9t5 $6 und Proteine

70 ^

Beispiel 5

5000 ml der überstehenden Flüssigkeit (1) aus Beispiel 2 werden zu 6000 ml 96/&igem Äthanol gegeben. Sie Mischung wird 2 Stunden bei 4°0 gehalten und darauf zentrifugiert«

Die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und der Nieder*

schlag (3) in 600 ml Wasser gelöst und darauf zur Entfernung

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unlöslicher !teste zentrifugiert. Die reine Lösung (4) wird in drei gleiche Teile für die spätere Bearbeitung aufgeteilt.

200 ml der lösung (4) werden mit Chlorwasserstoffsäure bis zu einem pH von 2 angesäuerte Der Niederschlag (5) wird durch Znetrifugieren abgetrennt. Die Überstehende Flüssigkeit (6) wird gleichermaßen abgetrennt· Der Niederschlag wird mit Äthanol und Aceton gewaschen und dann getrocknet. Man erhält 9»4 g Trockensubstanz· 30 mg dieser Substanz werden mit 15 ml Wasser gelöst und darauf in einer Dosis von 0,5 ml auf intravenösem Wege Hausen mit Sarcomen 180 injiziert» Bei 17 von 16 behandelten Mäusen werden Neorosen des Tumors sichtbar, wobei 10 Mäuse im folgenden vollständig geheilt wurden?

Die Ergebniete der Analyse zeigen das Vorliegen von 13,7 i> Nukleinsäure und 74 ^cfi Proteinen.

Beispiel 4

200 ml der Lösung (4) von Beispiel 3 werden mit Ammoniumsulfat bis zur Sättigung 0,4 gemischt und 2 Stunden bei einer Temperatur von 4°0 gekühlte Die Mischung wird zentrifugiert_r Die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und der Nieder·» schlag wird in 50 ml Wasser bei einem pH von 2 gelöst und dann erneut zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt und das Sediment wird in Wasoer unter Zugabe von Na-

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tronlauge bis zu einem pH von 7. gelöst«, Die Lösung wird einer Dialyse gegenüber Zellophan in fließendem Wasser 18 Stunden lang ausgesetzte Die dialysierte Lösung wird zur Abtrennung eines geringen nichtgelösten Beste zentrifugiert und darauf lyophilisierto Man erhält. 7»4 g Trockensubstanz«

Die Prüfung der antioancerösen V/irkung, auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt, führt zu einer Neorose

des Tumors bei allen/behandelten Tieren, wovon 12 im folgen*

den völlig geheilt wurden_e ·

Beispiel 5

Zu 200 ml der Lösung (4) aus Beispiel.3 werden 2 ml einer 20$igen Kalziuachloridlösung gegeben. Der Niederschlag (1) . wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit (2) wird durch Chlorwasserstoffeäure bis zu einem pH von 2 angesäuert-. Der neue Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit (4) wird beseitigt. Der Niederschlag (3) wird in Wasser unter Zugabe von Natronlauge bis zu einem pH von 7 gelöst und anschließend einer Lyophiliaierung unterworfen. Man erhält 5,2 g Trockensubstanz, Eine Dosis von einem mg pro Maus führt zu einer vollständigen Necrose des Tumors bei allen behandelten Mäusen, die einen Tumor tragen» Die Analysenergebnisse zeigen die Anwesenheit von 14,3 # Nukleinsäure und von 69 # Proteinen*

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Der Niederschlag (1) wird in 50 ml Wasser verdünnt und es werden 3 g Amberlitezugegebene Die Mischung wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit lyophilißiert. Man erhält 7,4 g Trockensubstanz., Eine Dosis von einem mg dicuer

Substanz pro Maus ruft durchgreifende Neorosen des Tumors 20

bei allen/behandelten Tieren hervor, wovon 11 vollständig geheilt wurden.

Die Analysenergebnisse zeigen die Anwesenheit von 11,9 i> Nukleinsäure und von 70 i· Proteinen»

Beispiel 6

1000 ml der überstehenden flüssigkeit '1) aus Beispiel 2 werden durch ChI orwa s s er st off säure" bis zu einem pH von 2 sngeeäuerto Der Niederschlag wird wird durch Zentrifugieren, abgetrennt und in 100 ml Wasser unter Zugabe von Natronlauge bis zu einem pH von 7 gelöst„ Die Lösung wird mit 2 Yolumira 96$igeni Äthanol gemischt„ Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Äthanol und Aceton gewaschen und getrock net. Man erhält 7»2 g Trockensubstanz« ^Äine Dosis von einem mg pro Maus ruft die Necrose des Tumors bei 20 behandelten Tieren hervor, wovon 13 vollständig geheilt wurden. Die Analysenergebnisse dieser Substanz zeiger, das Vorliegen von 10ρ8 # Nukleinsäure und von 74 # Proteinen»

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Beispiel 7

Zu 1000 ml der überstehenden Flüssigkeit (1) aus Beispiel 2 werden Ammoniumsulfai bis zu 0,4 Sättigung gegeben» Der Niederschlag wirrd zentrifugiert und in Waeser gelöst* ^ie Lösung wi:^fd durch Chlorwaesfcrstoffsäure bis zu einem pH von 2 ange-* säuert* Der Niederschlag wird in Waeeer gelöst, neutralisiert bis zu einem pH von 7 und lyophilisierto Man erhält 8,2 g Tvookeneubstanz. üine Losis von einem mg pro Maus fül^'c zu sjner Necrose tfes Tumors zel 18 der behandelten Mäusen,, wovon 12 im folgenden vollständig geheilt wurden.

Die Analysenergebnisse zeigen 9»S $> Hukleinsäure und 77 ^c/> Proteine an.

Beispiel 8

Zu 1000 ml der überstehenden Flüssigkeit (1) aus Beispiel 2 werden 10 ml einer 20^igen Kalziumchloridlteung gegeben» Der Niederschlag wird zentrifugiert una in 100 mi. destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Suspension werden 3 k Amberlite gegeben« Nach starkem Rühren wird die Mischung zentrifugiert und der flüssige Überstand lyophilisiert. Man erhält 6,8 g Trockensubstanz. Eine Dosis von einem mg pro Maus ruft eine bedeutende Necrose des Tumors bei allen H behandelten Mäusen hervor, wovon 11 im folgenden vollständig geheilt wurden»

Die Analysenergebnisse zeigen das Vorliegen von 12 i» Xukleinsäure und von 69 i» Proteinen.

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Beispiel 9

500 ml der überstehenden Flüssigkeit (1) aus Beispiel 2 werden mit 500 nl 90#igera Phenol gemischt. Die Mischung wird 1 Stunde bei einer Temperatur von 4⁰C stark gerührt und mit 5000 g 30 Minuten zentrifugiert. Die Wasser- und Phenolphasen sind getrennt«.

Die Wasserphase wird durch Chlorwaseerstoffsäure bis zu einem pH von t angesäuert. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, dann mit Äthanol und Aceton-gewä sehen und schließlich getrocknet» Man erhält 1,8 g Trockensubstanz <, Eine !Dosis von 2 mg pro Maus ruft Necrosen des Ttönors nur bei 12 von 20 behandelten Mäusen hervor, wovon nur 5 vollständig geheilt wurden.

Der Phenolphase wird Satriumacetat bis zu einer Konzentration von 1 i» zugesetzt, anschließend werden 4 Volumina Äthanol zugegeben» Der Niederschlag wird zentrifugiert, mit Äthanol und Aceton gewaschen und dann getrocknet. Man erhält 6,4 g Trockensubstanz, Sin· Dosis von 1 ag pro Maus ruft die Necrose des Tumors bei den 20 behandelten Tieren hervor, wovon 12 im folgenden völlig geheilt wurden.

Die Analysenergebnisse der Substanz zeigen das Vorliegen von 7,9 ί Yukleinsäure und von 64 i* Proteinen.

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Beispiel 10

100 g der feuchten nativeii Bakterienzellen aus Beispiel 2 werden mit 1000 ml 90$Sigem, frisch destilliertem Phenol gemischt« Die Mischung viird 1 Stunde bei einer Tempera!·¹'":? von 1O⁰O gerührt und dann zentrifugiei^, Die Phenolschich'i; wird abgetrennte 100 ml dieser Schicht wird NatriumaeetatO ^cß>) und 4 Volumina 96$iges Äthanol zugesetzt. Der erhaltene Niederschlag wird zentrifugiert, mit Äthanol und Aceton gewuschen und dann getrocknete Man erhält 3,2 g Trockensubstanz„ Eine Dosis von 2 mg pro Maus ruft eine Necrose des Tumors bei den 20 behandelten Mäusen hervor, wovon 9 im folgenden vollständig geheilt wurden. ·

■freispiel 11 .

500 g der feuchten Bakterienseilen aus Beispiel 2 werrt^n in

1000 ml Wasser verdünnt und anschließend werden 1000 ml

9Obiges Phe.iol zugegebene Me Mischung wird 1 Stunde bei einer Temperatur von 4⁰C gerührt und dann 30 Minuten bei 5000 g zentrifugiert. Die Vaeserphase (1) und die Phenolphase (2)

werden abgetrennt.

Zui Wasserphase werden 1 i» Natriumacetat und dann 2 Volumina Äthanol gegeben« Die Mischung wird zentrifugiertο Die überst«. lende Flüssigkeit (2) wird beseitigt. Der Niederschlag (4) wird in 50 ml Wasser unter Zugabe von Natronlauge bis zum Er-

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reichen von pH 7 gelöst* Dann wird die Lösung durch Chlorwasserstoff säure bis zu einem pH von 2 angesäuert. Die Mischung wird zentrifugiert» Die überstehende Flüssigkeit (3) wird abgetrennt und der Niederschlag (6) erneut in 50 ml V/asser unter Zugabe von Natronlauge gelöst, dann wird durch Chlorwasserstoff säure bis zu einem pH von 2 angesäuert und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird beseitigt und der * Niederschlag (8) wird mit Äthanol und Aceton gewaschen und dann in 20 ml Wasser unter Zugabe von Natronlauge bis pH 7 erreicht wird, gelöst und lyophilisiert· Manerhält 0,8 g Trockensubstanz. Eine Dosis von 1 mg dieser Substanz pro Maus ruft eine vollständige Necrose des Tumors bei den 20 behandelten Mäusen hervor, wovon nur 5 im folgenden vollständig geheilt wurden.

Die Phenolphase (2) wird mit 4 Volumina Äthanol als Fällungs-» ) mittel versetzt. Der Niederschlag wird mit Äthanol und Aceton gewaschen und dann getrocknet« Eine Dosis von 1 mg dieser Substanz pro Maus ruft Necrosen des Tumors bei den 22 behandelten Mäusen hervor, wovon 10 im folgenden vollständig geheilt wurden.

Beispiel 12

10 g der lyophilisierten Bakterienzellen werden in 100 ml Wasser verdünnt η Man gibt 100 mg Lysozym zu„ Die Mischung wird kontinuierlich 3 Stunden bei einer Temperatur von 37⁰O ge-

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rührt_s wobei man eine völlige Homogenisierung err ei-/ate Die Mischung wird bei 10 000 g 1 Stund© zentrifugiert* Bie überstehende Flüssigkeit (1) wird lyophilisiert. Eine Dosis von 2 mg pro Haue ruft eine Necrose dee IEumors bei 17 von 20 behandelten Mäusen hervor. X)er Niederschlag (2) wird in mit Hilfe von OhIorwaeserstoffsäure bis zu einem pH von 2 angesäuerten Wasser gelöst und es werden 100 rag Pepsin zugegeben. Es wird 2 Stunden bei 37⁰O gehalten, dann wird die Mischung zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit (3) wird beseitigt. Der Niederschlag (4) wird in bis zu einem pH von 7 neutralisiertem Wasser gelöste Nach erneuter Zentrifugierung wird der Niederschlag (5) abgetrennt» während die ÜLumstehende Flüssigkeit (6) lyophilisiert wird.

Das Ergebnis ist bei einer Injektion einer Dosis von 1

eine völlige Necrose des Tumore bei allen behandelten Mäusen_o

Beispiel 13

4800 g nativer, feuchter Bakterienzellen von Lactobacillus bulgaricuB LB-51 werden in 2000 ml Eiweiß verdünnt, wobei man eine Salzlösung zugibt, bis das Gesamtvolumen von 14 000ml erreicht ist. Die Suspension wird auf 37⁰C gebracht und 3 Stunden kontinuierlich gerührt? wonach die Mischung 'I) durch Chlorwasserstoff säure bis zu einem pH von 2 angesäuert wird·

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Zu 1000 ml der Mischung (H) werden 1 g Pepsin gegeben, wobei man das Ganze 4 Stunden rührt und bei einer Temperatur von 37⁰C halte Darauf wird mit Hilfe von Natronlauge der pH auf 7 eingestellt· Danach wird noch 1 g Trypsin "Difoo" zugegeben. Die Behandlung mit Trypsin wird 12 Stunden lang bei einer Temperatur von 37⁰C unter kontinuierlichem Hühren und Zugabe von Chloroform vorgenommen₀

500 ml der so behandelten Mischung werden bei 8000 U/min₀ 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Niederschlag der nicht völlig digerierten Rückstände (2) wird mit Alkohol gewaschen und dann getrocknet. Es werden 5 g Trockensubstanz erhalten· Die überstehende Flüssigkeit (3) wird mit dem gleichen Volumen Alkohol gemischt« Der erhaltene Niederschlag wird mit 2700 U/min 15 Minuten zentrifugiert _f darauf wird (4) in einer geringen Menge Wasser gelöst und lyop]iilisiert₀ Man erhält 3500 mg Trockensubstanz ρ Die Analyse zeigt die Anwesenheit von 62 1° Proteinen und von 13»54 $> Nukleinsäure.

Die auf intravenösem Wege Mäusen, die Träger gut entwickelter Sarcome 180 sind, injizierten Dosen von 4 mg rufen tiefgreifende Necrosen der Tumore der 10 behandelten Tiere hervor₀

Die überstehende Flüssigkeit (5) wird mit einem gleichen Volumen Alkohol gemischt. Es ergibt sich ein neuer Niederschlag.

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Nach 15-minütigem Zentrifugieren bei 2700 U/min, wird der Niederschlag (6) in einer kleinen Menge Wasser gelöst und dann lyophilisiert. Man erhält 3300 mg Trockensubstanz^ deren Analyse 29 $> Proteine und 30,03 # Nukleinsäure ergibt·

Eine auf intravenösem Wege Mäusen» die Träger gut entwickelter Saroome 180 sind_t injizierte Dosis von 4 mg ruft grünö>

10 .

Hohe Necrosen des Tumors bei allen/behandelten Tieren hervor*

Beispiel 14

13 000 ml der Mischung (1) aus Beispiel 13 werden bei 8000 U/min·- 30 Minuten lang zentrifugiert· Die überstehende Flüssigkeit (1) wird abgetrennt«, Der Niederschlag (2) wird dreiaal einer Entfettung durch eine Misohung gleicher Volumina Alkohol und Äther unterworfen_o Nach der Verdampfung des Lösungsmittels erhält man 544 g Trockensubstanz (3)·

Beispiel.15

10 g der Substanz (3) aus Beispiel 14 werden in 100 ml einer Salzlösung verdünnt· Nach Ansäuern der Mischung mit Chlorwasserstoffsäure bis su einem pH von 2 werden 100 Bg Pepsin suge* geben. Die Hie ο hung wird 4 Stunden unter konstantem Rühren bei einer Temperatur von 37⁰C gehalten. Darauf wird alt 2700 ü/min. 15 Minuten sentrlfugiert. Die überstehende Flüssigkeit (1) wird abgetrennt. Der Niederschlag (2) wird in des

109818/193$

» 26 - .

Ausgangs volumen Salzlösung gelöst, dann "bis zu einem £.iL von 7 neutralisiert und anschließend bei 8000 U/min. 30 Minuten zentrifugiert» Der Niederschlag (3) der nicht digerierten Rückstände wird mit Alkohol gewaschen und getrocknet« Man erhält 3900 mg Trockensubstanz? Die.überstehende Flüssigkeit (4) wird lyophiliaiert. Eb ergeben sich 3100 mg Trockensubstanz, deren Analyse das Vorliegen von 88 # Proteinen und von 10,09 $> Nukleineäure anzeigte

Dosen von 2 mg, die auf intravenösem Wege Hausen injiziert worden sind, die Träger gut entwickelter Saroome 180 sind, rufen gründliche Neorosen der Tumore bei 17 von 20 behandelten Tieren hervor<> 10 Tage später sind 9 Tiere vollständig gehellt.

Beispiel 16

10 g der Substanz (3) aus Beispiel 14 werden in 100 ml Salzlösung verdünnt, der pH wird auf 7 korrigiert lind ββ werden 100 mg Trypsin ¹¹DIfCo" zugegeben. Die Mischung wird bei einer Temperatur von 37⁰O 4 Stunden stark gerührt und dann 15 Minuten mit 2700 U/min, zentrifugiert. D«r Niederschlag der nioht digerierten Rückstände (1) wird mit Alkohol gewaschen und getrocknet. Man erhält 2550 mg Trockensubstanz·

Die überstehende Flüssigkeit (2) wird mit dem gleichen VoIumen Alkohol gemischte Es ergibt sich ein reichlicher Nieder-

BAD ORIGINAL

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schlag» Die überstehende Flüssigkeit (3) wird nach dem Zentrifugieren abgetrennt und der Niederschlag (4) wird in Wasser gelöst und anschließend lyophilisiert. Man erhält 2800 mg Trockensubstanz_s deren Analyse das Vorliegen von 92 $ Proteinen und 7 $> Nukleinsäure zeigt*

Dosen von 4 mg, die auf intravenösem Weg Mäusen injiziert werden, die Träger gut entwickelter Saroome 180 sind, rufen gründliche Necrosen des Tumors bei 18 von 20 behandelten Tieren hervor. 10 Tage später waren 10 Tiere völlig geheilt.

Beispiel 17 . ·

10 g der Substanz (3) aus BeispieliH- werden in 100 ml einer Salzlösung verdünnt. Die Mischung wird bis zu einem pH von 2 durch Chlorwasserstoffsäure angesäuert und es werden 100 mg Pepsin zugegebene Nach einer 4-etündigen Behandlung bei einer Temperatur von 37⁰C wird die Mischung bis zu einem pH von 7 neutralisiert» bei dem 100 mg Trypsin^KDifoo" zugegeben werden· Die Mischung wird neuerlich 4 Stunden bei 37°C gehalten und 30 Minuten alt 8000 Tf/ain. zentrifugiert. Der Niederschlag der nicht digerierten Rückstände (1) wird mit Alkohol gewaschen und getrocknet. Man erhält 1350 mg Trockensubstanz«

Die überstehende Flüssigkeit (2) wird mit einem gleichen Volumen Alkohol gemischt und zentrifugiert. Die überstehende

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Flüssigkeit (3) wird abgetrennt, Nach Auflösen in ein wenig Wasser wird der Niederschlag lyophilAsiert» Man erhält 2200 mg Trockensubstanz, deren Analyse die Anwesenheit von 68 i> Proteinen und 8,84 $ Nufcleinsäure zeigte

Eine Dosis von 2 Eig_f die auf intravenösem Wege Mäusen injiziert worden ist, die Träger gut entwickelter Sarcome 180 sind, ruft gründliche Hecrosen des Tumors bei allen 20 behandelten Tieren hervor und 10 Tage später sind 8 Tiere geheilte

Beispiel 18

1500 mg der Fraktion (4) aus Beispiel 15 werden in 45 ml Salzlösung, zu der 15 mg"umkristalliBiertes Trypsin gegeben werden, gelöst. Die Mischung wird bei konstantem Rühren und periodischer Korrektur dea pH auf 7 bei einer Temperatur von 37⁰C gehalten. Nach einer 20~stündigen Behandlung wird die Mischung zentrifugierte Der Niederschlag (1) der nicht digerierten Stoffe wird abgetrennt. Der überstehenden Flüssigkeit (2) wird Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 12 ^c£ zugesetzt. Es ergibt sich eine Niederschlagsablagerung, die bei 2700 U/min, für 30 Minuten zentrifugiert wird, danach wird de±·

(3)

Niederschlag/in Wasser gelöst und lyophilisiert. Man erhält

400 mg Trockensubstanz, deren Analyse das Vorliegen von 11 ^ Proteinen und 0,5 $> Nukleineäure zeigt.

Selbst «ine Dosis von 8 mg dieser Substanz pro Maue ruft, injiziert auf intravenösem Wege, keine Änderung der Tumore von

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BAD ORiGINAL

20 behandelten Mäusen hervorο

Man gibt ein halbes Volumen Alkohol zur überstehenden Flüssigkeit (4) zu. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, dann in Wasser gelöst und lyophilisierto Man erhält 120 mg Trockensubstanz (5), deren Analyse das Vorliegen von 21 9δ Proteinen und 7» 3 $ Nukleinsäure zeigt»

Eine Dosis von 4 mg, die auf intravenösem We,ge Mäusen, die Träger gut entwickelter Sarcome 180 sind, injiziert worden ist, ruft gründliche Hecrosen des Tumors belie von 20 behandelten Tieren hervor· 10 Tage später sind δ Tiere völlig "geheilt.

Beispiel 19

5 g lyophilisierte Bakterienzellen von Lactobacillus bulgaricus LB-51 werden in 50 ml Salzlösung mit einem pH von 7 verdünnt. Der Mischung werden 50 mg Lyeozym zugegeben. Sie Behandlung mit dem Lysozym wird 2 Stunden unter konstantem Rühren bei einer Temperatur von 37⁰C durchgeführt_o Die Mischung wird durch Chlorwasserstoffsäure bis zu einem pH von 2 angesäuert, dann warden 50 mg Pepsin zugegebene Nach 4-etündiger Behandlung bei einer Temperatur von 37⁰C wird die. Mischung mit 2700 U/min. 30 Minuten lang zentrifugiert. Die

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- 30 überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt«

Der Niederschlag (2) wird in einer Salzlösung, deren pH 7 ist, gelöst und es werden 50 mg Trypsin "Difco" zugegeben. Nach 4-etündiger Behandlung bei 37°0 unter dauerndem Rühren '..Ird " die Mischung 30 Minuten bei 2700 U/min, zentrifugiert. Der Niederschlag der nicht digerierten Rückstände (3) wird mit Alkohol gewaschen und getrocknet· Man erhält 640 mg Trockensubstanz.

Die überstehende Flüssigkeit (4) wird mit einer gleichen Menge Alkohol gemischt-; Nach Zentrifugieren der Mischung wird der Niederschlag (5) in wenig Wasser gelöst und gegen eine Zellophanmembrane in fließendem Wasser dialysiert und anschließend lyopallieieri« Man erhält 500 mg Trockensubstanz, deren Analyse da» Vorliegen von 37 %> Proteinen und 11,36 fi NuVTeinsäure zeigt«

Die überstehende Flüssigkeit (6) wird alt einem gleichen Volumen Alkohol gemischt und zentrifugiert. Dieser in wenig Wasser gelöste Niederschlag (7) wird in fließendem Wasser 24 Stunden diarlysiert und anschließend lyophilisiert. Man erhält 80 mg Trockensubstanz, deren Analyse das Vorliegen von 29 ¥> Proteinen und von 41,24 # Nukleineäure zeigt.

Die Niederschläge (5) und (7) zeigen in einer Dosis von 4 mg

pro Maus eine starke Necrosewirkung auf den Tumor bei den 20 behandelten Mäusen·

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Tabelle

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16

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19

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Tabelle (Fortsetzung)

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Specie·

9 Physiologische
Eigenschaften
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19

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Zucker

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-

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Faktor
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α», O)

Claims

Patentansprüche

2o Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus einer der Spezies Lactobacillus bulgarlcus Lactobacillus caaei, Lactobacillus helveticue, Lactobacillus acidophilus angehört·

3ο Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus einem der Stämme Lactobacillus bulgarious, var. tuaoronecrotioans, LB-51 Hr. 93 und Nr. 100, Lactobacillus helveticua, var. tumoronecroticans Nr. 31# Lactobaoillua acidophilu·, rar* tumoroneorotioane Hr. 45 angehört.

4. Verfahren nach Anspruch 3t dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Lactobacillus bulgaricus, Tar. tumoronecroticans LB-51 ist«.

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1017868

« 35 «

5o Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß dae Nährmedium für die Kultur des Mikroorganismus mindestens einen der folgenden Stoffe enthält: Sojaextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Maisextrakt, Fleischextrakt, Glukose, Maltose, Lactose, Saccharose, Dextrin und Helasöe, organische und anorganische Phosphate und Magnesiumsulfat«

6. Verfahren nach Anspruch 3_S dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur praktisch bei Anaerobioee-Bedingungen durchführt.

7« Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur bei einer Temperatur zwischen 28 und 5O⁰C durchführt«,

8o Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion der anticancerösen Substanz aus den aus der KuItür stammenden Stoffen durchführt, indem man wenigstens einmal einen der beiden folgenden Arbeitsschritte durchführt:

1) Extraktion mittels eines Lösungsmittels aus der Gruppe Wasser und Alkohol, und

2) Fällung durch Zugabe von mindestens einem Vertreter der Gruppe, die wasserlösliche organische Lösungsmittel, Salae und Säuren umfaßt,

9« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die anticanceröse Substanz in mindestens einem der Vertreter der

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« 36 -

Gruppe: native Bakterienzellen von Bakterien der Gattung Lac-

und

tobecillus, entfettete Bakterienzellenf/während der chemischen Reinigung erhaltenen Bakterienzellen, denen die nicht aktiven Bestandteile und Ballaststoffe vorher extrahiert wor= den sind, enthalten ißt-

"»Ο- Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß mai Wasser und den die anticanceröse Substanz enthaltenden Stoff mischt und die Mischung filtriert oder zentrifugiert und den wässrigen Extrakt abtrennte

11_β Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stoffe-mit Phenol misoht, die Mischung zentrifugiert und don Phenolextrakt abtrennte

12» Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet„ daß man Wasser mit den Bakterienzellen mischt, die Bakterienzellen mit einem Homogenieator, einer Kolloidmühle, Ultraschall oder Enzymen, wie Lysozym und Pepsin zerstört, die Mischung zentrifugiert und den wässrigen Extrakt.abtrennt.

13· Verfehlen nach Anspruch 8» dadurch gekennzeichnet, daß man die anticanceröee Substanz enthaltenden Stoffe mit gleichen Tgilen Watteer und Phenol mischt, die Mischung zentrifugiert und die wässrige Schicht der Phenolschicht trennt~

BAD ORIGINAL 10 9816/1935

14. Verfahren nach Anspruch. 8, dadurch gekennzeichnet» daß man wasserlösliche organische Lösungsmittel su den Lönungen hinzugibt, um die antloanceruse Substanz zu fällen«

15° Verfahren nach Anspruch 14_f dadurch gekennzeichnet, daß daβ organische Lösungsmittel aus mindestens einem Vertreter der Gruppe besteht, die Methanol, Äthanol, Propanol und Aceton umfaßte

16. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dafl man die Substanz aus den sie enthaltenden Lösungsmitteln fällt, indes man verschiedene 88lze zugibt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Salze mindestens einen Vertreter der Gruppe umfassen, die

τ· ·

Ammoniumsulfate latriuaeulfat, Bariumchlorid, Kaliumchlorid und Magnesiumsulfat in Kombination alt Chlorwasserstoff säure umfaßt.

18» Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Lesungen!tteln Säure sueetst, bis ein pH ron etwa 2 erhalten vrird.

19« Verfahren nach Anspruch T7, dadurch gekennzeichnet, AsJ man den erlialtenen Hiederschlag τοη den Salzen duroh Dialyse gegen sine Membrane aus regenerierter Zellulose in Vbassr o4sr ittroh LOsen des Visderschlages in Wasser und fällung mit din*» ren oder Alkohoi truant, 109816/1935 . ' bad ^

20 ο Verfahren na oh Anspruch 1» dadurch gekennzeichnet, daft ■an die Bekteriensollen der Bazillen der Qattung Lactobacillus alt Hilf· Ton Eiweiß und Bneyaen serstQrt, die die antieanoeröee Substans nicht beeinfluaen, Jedoch die begleitende« nioht aktlTen Ballaststoffe entfernen.'

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennseiohnet» daß die Enzyme das Lyeaxy* und die proteolytiechen £njtyae sind.

22. Verfahren nach Anspruch 21» daduroh gekennseiohnet, daß ■an Ensyae la der Reihenfolge! liveii oder lysosys, Pepsin« Trypain, Pepsin« anwendet.

■■ΙΟΪΒΙΒ'/Ιίϊί '-