DD222895A5

DD222895A5 - Verfahren zur herstellung eines hypotriglyceridemisch aktiven polysaccharids

Info

Publication number: DD222895A5
Application number: DD84265684A
Authority: DD
Inventors: Yasuo Kawai; Kazunaga Yazawa
Original assignee: Advance Kaihatsu Kenkyusho
Priority date: 1983-07-27
Filing date: 1984-07-26
Publication date: 1985-05-29
Also published as: ES8505722A1; HUT34773A; EP0132981B1; DE3480217D1; US4687764A; EP0132981A2; EP0132981A3; JPH0365362B2; JPS6028401A; PL147734B1; HU191697B; AU563995B2; ES534629A0; SU1732815A3; PL248970A1; AU3048884A; MX7693E; CA1239364A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein hypotriglyceridemisch aktives Polysaccharid mit den folgenden Merkmalen:a) Spezifischer Drehwert (a29 D 190,1 (1,8 Masse-/Vol.-% Loesung)b) Molmasse durch Gelfiltration: 14 000 3 000c) Zuckerzusammensetzung (Masse-% durch Gaschromatografie): Glukose 70,3; Rhamnose 13,7; Uronsaeure 16,0d) Saeure-Base-Charakteristika: neutrale Polysaccharidee) Physiologische Charakteristika: ist in der Lage, das Bluttriglycerid bei Saeugetieren zu reduzieren.Dieses hypotriglyceridemisch aktive Polysaccharid kann durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der zur Art Streptococcus gehoert, in einem entsprechenden Kulturmedium dafuer hergestellt werden und anschliessendes Sammeln des hypotriglyceridemisch aktiven Polysaccharids aus den kultivierten Zellen des Mikroorganismus und/oder dem Ueberstehenden der Kulturbruehe. Das vorliegende hypotriglyceridemisch aktive Polysaccharid kann als wirksamer Bestandteil einer hypotriglyceridemischen oder antiatherosklerotischen pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Traegerstoff eingesetzt werden, um eine hypotriglyceridemisch oder antiarteriosklerotische pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden, die fuer die orale Verabreichung bei Saeugetieren geeignet ist. DD#AP

Description

Berlin, den 18* 12_# 84 AP C 08 B/265 684 2

Verfahren zur Herstellung von hypotriglyceridemiach aktiven Polysaccariden "'..'·· '. ' ' . - ~ ' ,;.· '/',.. ·: /j-·λ·^; - :

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung neuer hypqtriglyceridemisch aktiver Polysaccharide (z_# B. Triglycerid-reduziertes Polysaccarid, "TRS"), die inform von pharmazeutischen Zusammensetzungen in der Medizin zur Reduzierung von BIuttriglycerid eingesetzt werden können*

Bekannte technische Lösungen , ·; :'.·'. _:, '": ' ^ ;·,', ; ; ,:';.; ' ;; -λ:^;i._;..';'!.v :^,-_: ( -)'.V-

Wie aus dem Stand der Technik bekannt, sind bereite verschiedene pharmazeutische Zusammensetzungen, wie Clofibrat und dessen Zubereitungen als Therapeutika for Arterioekler rose oder Hyperlipämie vorgeschlagen worden« die als typi^. sehe Erkrankungen mittlerer Altersstufen oder als geriatrische Erkrankungen anzusehen sind; Allerdings wurde der gewünschte Zweck durch diese bekannten Medikamente nicht zufriedenstellend erreicht hinsichtlich beispielsweise der pharmakologischen Wirkungen und der Nebenwirkungen.

Vorteilhaft ist der Einsatz mikrobiologischer Verfahren bei der Gewinnung bestimmter Arzneistoffe_e Für die vorliegende Erfindung wurde daher auch spezielles mikrobiologisches Schrifttum herangezogen· So befassen sich Autoren in Microbiol. Immunol. Bd, 25(3), 257 - 269 (1981)_v mIt dem ökologischen Status von Streptokokken in menschlichem Stuhl. Es wird über die Verteilung fäkaier Streptokokken als *öll der

· tv'ν

Darmflora beim Menschen berichtet. Beobachtet wurden altersbezogene Differenzen bei der Verteilung der Spezies·

In Microbiol, Immunol« Bd. 26(5), 363- 373, 1982« und in The American Oöurnal of Clinical Nutrition 33» Nov_# 1980, S. 2458-2461, wird über die Kolonieierung von Milchsäurebakterien berichtet. Dabei wurden verschiedene Kolonieie« rungebilder bei verschiedenen Genera beobachtet, auch unter den isolierten Bakterien verschiedener Wirte sowie die Tatsache, daß wenigstens in einigen Fällen vorhandene heimische Streptokokken eine spezifische Adhäsion für die Wirtszellen zeigen, /-. _f ,. ..;.";' ;^: ._: ; : ; \V.' " · . :' "' -'''[

Die Beziehungen zwischen Verschiedenen Enzymaktivitäten und vorhandenen Darmmikroorganismen in Ratten wurde von mehreren Autoren untersucht. Mit der Wirkung der Darmmikroflora auf Enzymwirkungsspiegel in verschiedenen Teilen des Gastrointestinaltrakts beschäftigen sich die Autoren in Infection and Immunity, Bd, 19, Nr, 3, März 1978, S. 771 - 778_# Die Versuchsergebnisse zeigen, daß die Aktivitäten verschiedener Enzyme signifikant durch die Darmmikroflora im Verdauungstrakt von Ratten reguliert werden* Aus The American ppurnai of Clinical Nutrition 32, Oan, 1979, S#187-188 ist als Ergebnis zu entnehmen, daß beim Vergleich keimfreier, üblicher gnotobiotischer Ratten die Enzymaktivität durch lebensfähige Darmmikroben wie beispielsweise Lactobazillus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacteroides, Escherichia coli und spindeiförmige Bakterien unterdrückt wird«

. ' :'' . .' ' -:· ' Ί.. . . . ' ... -¹^ -. " · " .,·' " '

In Mechanism of Ageing and Development, 16 (1981), 149 -

-· 3:-

wird der Einfluß von Darmflora und Alter auf den Lipidatoffwechsel und die Aktivität von entsprechenden Enzymen wie Lipoproteinlipase und hormonempfindlicher Lipaee untersucht,, Veränderungen des Serumtriglyceride« des Serumcholesterols und der Enzymaktivitaten mit dem Alter wurden erforscht;und ο die Wirkung der Darmmikroflora auf diese altersbezogenen Veränderungen, In der gleichen ZeI tschrift 17 (i981) < 173-182 wird darüber berichtet! daß die Veränderung der Darmflora mit dem Alter und spezifische Effekte einiger Bakterien auf die Enzymaktivitäten nicht ganz klar sind«

In keiner dieser genannten Veröffentlichungen wird allerdings auf hypocholesterolämisch aktive Proteine zur Blutcholeaterolsenkung eingegangen» λ

Es ist Ziel der Erfindung, sichere und wirksame Medikamente für Arterioskleroee oder Hyperlipämie zu entwickeln·:

Wesen der ν Erfindung '·. '.'.' ,.·':. ' , ' : ;;; .': .· · :' .· :; . . ·:../ ·^;';

Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es* ein Verfahren zur Herstellung eines neuen triglyceridemiech wirkenden Polysaccharids zu entwickeln« wobei diese Verbindung in der Lage ist, das Bluttriglycerid bei Säugetieren: effektiv zu reduzieren·

Erfindungsgemäß hergestellt wird ein hypotriglyceridemisch aktives Polysaccharid mit den folgenden Charakteristikat

"'' ' ^; ' ' · ' ' · j— ~r 29 ^! " '

a) Spezifische Drehung: £0< ^_-/ ^-β +190,1 (1,8 _Λ . Lösung) ^: . './ ^: ' -'.' - ' . ;'.,. : ^ '• ;/·' '', ' . / ;. '' '._

b) Molmasse durch Gelfiltration: 14 000 ,+ 3 000

.1,

c) Zuckerzusammensetzung (Masse-% durch Gaschromatografie)

Uronsäure 16,0 ·;.·'' . ' . '· : ^ . r -. .;' · ^;._:'· ; ' ... · · .,:.· · .

d) Säure-Base-Charakteristik: neutrale Polysaccharide

e) Physiologische Charakteristika: fähig, das Bluttriglycerid bei Säugetieren zu reduzieren·

Dieses hypotriglyceridemisch aktive Polysaccharld kann her·*· gestellt; werden durch Kultivieren eines Mikroorganismus der Art Streptococcus in einem dafür geeigneten kulturmedium und Sammeln des hypotriglyceridemisch aktiven /Polysaccharide'. aus den kultivierten Zellen des Mikroorganismus und/oder dem Überstehenden der Kulturbrühe· Das vorliegende hypotriglyceridemisch aktive Polysaccharid kann als wirksamer Bestandteil einer hypotriglyceridemischen oder antiarterioskleroti» sehen pharmazeutischen Zusammensetzung gemeinsam mit dem dafür geeigneten pharmazeutischen Trägerstoff eingesetzt werden, um eine für die orale Verabreichung bei Säugetieren geeignete hypotriglyceridemische oder antiarteriosklerotische pharmazeutische Zusammensetzung zu erhalten*-

Es wurde gefunden, daß die neuen Polysaccharide· die man aus

. .. . .. :.·. -./4a/- . ··. .· - >, -. . ;': V- , '. ->; > ·.;;.

den zur Art Streptococcus gehörenden Mikroorganismen und/ oder dem Oberstehenden der Kulturbrühe erhält, wirksam das Bluttriglycerid verringern können und daß dieser Bestandteil, wenn er aus den sogenannten gastrointestinalen Bakterien extrahiert worden ist und aus dem Oberstehenden der Kulturbrühe, bei oraler Verabreichung im wesentlichen nicht toxisch ist.. ' . . .;."' ,"... " '

In der zur Erfindung gehörenden Zeichnung stellen dar:

Fig. 1: Profil eines Infrarot-Absorptionssektrums des TRS-Polysaccharids der vorliegenden Erfindung,

Fig. 2 Eluierungsbilder der Gelfiltration von Bei-' bis' 4:· spiel 1. - . .' ;.: '^: ' v; · '";' :" / ' ..'" .. '' · - '.

Der in der Produktzubereitung verwendete Mikroorganismus« die Herstellungsverfahren, die physiko-chemlschen Gharakteristika und die pharmakologischen Wirkungen des TRS-PoIysaccharids der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend im Detail beschrieben·:" ^; ; '" . ' ' ' . ' "' ' '' >. . ";..-' >' ' > ·/ .:' -':' -^; "'. ,

Mikroorganismen '' , '<.' ' ' . ·.'.'..·.."'"._ :-.'^;. ·' '..' ::' '/:_:\ -V··/ } ;:/;.

"!•'Spezies. .' ..' '. ;. ;. . ' ., ·'; ^...-^;i·''; / .. ' ' .:' : . ",-.. Die für die vorliegende Erfindung einsetzbaren Mikroorganiemen gehören zur Art Streptococcus: Streptococcus faecium, Streptococcus faecialis. Streptococcus bovis. Streptococcus avium, Streptococcus durans. Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis,Streptococcus equinus und andere sind bevorzugt. . . " '^: / ^: . ; : :' ''." ' ' ' ' . ' ' · ' ' ^%"'.:/¹^

' " . " / ' :·"" -4^:· . - ;: ' 4b - ; ^; '' '-.'-^-C^: I -'AH'V-'"'.

Typische Beispiele für diese Mikroorganismen wurden beim Fermentation Research Institute (FRI) / das eine internationale Hinterlegungsstelle nach dem Budapester Vertrag darstellt« in Japan hinterlegt sowie beim ZIMET in Clena/DDR. Die Hinterlegungsnummern sind in der folgenden Tabelle % aufgeführte

Stämme

Hinterlegüngsnummer FRI /.' ' '''. ': ; . > ''/.ZIMET'

FERM	BP -	296	10	976
FERM	BP-	297	10	977
FERM	BP -	298	10	978
FERM	BP -	299	10	979
FERM	BP-	300	10	980
FERM	BP-	30t	10	981
FERM	BP -	302	10	982

Streptococcus faecium Streptococcus faecalis Streptococcus avium Streptococcus salivarius Streptococcus durans Streptococcus mitis Streptococcus equinus

2. Mikrobiologische Charakteristika der Mikroorganismen - Allgemeine mikrobiologische Charakterietikä

Die mikrobiologischen Charakteristika der Mikroorganisraen der vorliegenden Erfindung sind die gleichen wie jene der bekannten Mikroorganismen, die zur gleichen Art gehören* Dab©r entsprechen die allgemeinen mikrobiologischen Gharakteristi·* ka, KuItivlerungsverfahren und andere Eigenschaften jenen_s die in den folgenden Artikeln beschrieben sind:

1) Bergey* s Manual of Determinative BaCter-iö-logy/ 8· Aufl.,; ..,,..: 490;- 509 (1974) ' . ,; _: ' ,' ; ' : " ' : , :; .'.".' '. ' : .\/ : ' ;']' .' ,'

2) Int. 0* Syst. Bact» 16/ 114 (1966)

3) Microbiol. Immunol. 25 (3),257 - 269 (1981)

64 222 12

- 5 - - ' V .:^v-·- " '...

4) J. Clin. Pathol. £3, 53-57 (1980)

5) J. General Microbiol. 128, 713-720 (1982)

6) Applied Microbiol. 2£ (6), 1131-1139 (1972).

Die typischen mikrobiologischen Eigenschaften der oben genannten Stämme der vorliegenden Erfindung sind in der Tabelle 2 zusammengefaßt*

.-. ν .' ' ' .' ' ^{: ;} Tabelle... 2 : _v . ; :'[ ' ' · \^;.'-;-'..V Charakteristika Stämme

-296 -297 298 299 300 301 302

Form der Zelle —-

Gramfärbung . + + + + + + ₊

Hämolyse * »^- »c ve te pc öl

Wachstum bei 10⁰C + + ± -" +

Wachstum bei 45°C + + + + + + ' +

Wachstum bei 50⁰G + - - - + - -

Therm. Resistenz bei 6O°f.3O + + + _ ₊ ^ ^.

^v/achstum im Kult.med. pH 9,6 + + + - + - -

Fähigk. d. Methylenblaureduz. + + - - + -

Verflüss. von Gelatine - - - - _ „ « vVachstum im Kult.med. ,enthalt.

IMgGi (6,5%) .; ' . .+ ;;.·..+ · ,. ·. .; > '· .·+ /:- ;-,

Wachstum im KuIt,m»d.,enth.

Galle (40^) + + + - + -- +

Produktivität von Ammoniak + + , ND^X2 -

Hydrolyse von Hippursäure - + - -.

Wachstum im Kult.med., enth.

Tellurit - > - ND

Wachstum im Kult.med.,enth.

+	WD-
	ubi·-

öäureproduktion aus einer Kohlenstoffquelle

64 222 12

δ —

'Ports*· Tabelle 2 \ ·' ' ' . _# ; ' Υ://"-'- ' · ,, '^'\.··'

Charakteristika 296 297 298 299 300 301

Säureprod. aus einer

Kohlenstoffquelle ~ :. .';, . :

Glukose .·"' + + + + + + +

iSskulin ± + + + + HD +

Laktose + + + + + ± ~

' .-.' Glycerol " ·..' .·. ' - .' ; - _;;...-+_r; -..+ , '.... - . - -·' '.-.'

Melezitose : _ + +^ KD - ND '-

Antigengruppeii ;". ' " ; . ./.,/ D' : ;,.; !) .--^(D)₁.-¹K,-'. D - D

'!.: ^,^,S^Triphenyltetrazoliumchlorid-, ;

..' ^X2 : nicht durchgeführt "- / :';.' . '' '^v^-v' -, ^;' '· ' '/'· "': :" .·.:'

3. Kultivierungsverfahren

Die Mikroorganismen können in konventioneller Weise kultiviert werden. Beispielsweise können die bakteriellen Zellen durch stationäre Kultivierung in einem,Rogosa Kulturmedium gesammelt werden, wobei das Medium die folgende Zusammensetzung unter aeroben Bedingungen hat. Die Zellen können durch Zentrifugieren der Kultur: geerntet werden.^· ; V

Zusammensetzung des; Rogosa-Kulturmediums , ,

Trypticase · · '" ;' "' '-·\ '' '';" ' ' 10 g ;."/:':.". ·'· ' ,.·. -' -\. .' '".

..Hefe-Extrakt "· ::_ : . ;. "- ..·,.' ^: ' 5 'g ^; '' ' \ ' ' ' .-.,'.;

Tryptose ' " ' .' ; ; ' > . ' . :. ,..;:"$' g '" / " ... " '':' . '

V ^; " '· ';·:. 64 222 12 — 7 — " ' ' ' · ' ' ·' '

i'riaminoniumcitrat . 2 g

fween 80 \ . .. ' ; ·,-. ... , .·'. ^:; '_ ; ^; '/.. . ¹ 8 Glukose

Salzlösung ^X1 .

Destillliertes Wasser

(pH 7, Hitzesterilisation bei 121 ⁰C für 15 Minuten)

X₁ = MgSO₄ ;· 7H₂O PeSO_A ·

29	g	1	& ;;;.'"
	2	M	Liter
bis	5;':,	inutön
r 15	68	s : ..
11,	4	. :£'-"ν, -
0»	ml
^::^;;2,
10Ö

₄ g ₄* 2H₂O Destilliertes Wasser

Herstellung des TRS-PoIysaccharide

Im folgenden wird ein Beispiel eines typischen Herstellungsverfahrens des^TRS-PoIysaccharide der vorliegenden Brfin^- dung gegebent .'.- / · ·.,·...' '". ' ' _.. .-.; ·^: ":; .'^' \ ·.' ;-,' ^;Λν/.^:

1. Sammlung der Mikroorganismen

Jedß,r der oben aufgeführten mikrobiellen'Stämme wird in einem Rogosa Kulturmedium geimpft und ohne Rühren bei 37 ⁰O über 5 bis 10 Stunden unter aeroben Bedingungen inkubiert, wobei man eine entsprechende Kulturbrühe mit einer gewissen leiiens-· fähigen bakteriellen Zellkonzentration erhielt. Die KuI-turbruhe wurde kontinuierlich bei 12 000 U/min zentrifugiert und die gewonnenen Bakterienzellen zwei bis dreimal in Salzlösung (0,85% NaCl) gewaschen·

2. Aufspaltung der Bakterienzellen

a) Die gewaschenen Zellen wurden in physiologischer Salzlösung suspendiert und zur Aufspaltung bei 115 ⁰G über 10 Minuten wärmebehandelt. -.· * ·'V ....

b) Die gewaschenen und in physiologischer Salzlösung suspendierten Bakterienzelleh wurden durch Zerschällung (15 KO, 60 min), ffrench press und andere übliche Verfahren aufgespalten. ." . ^;; .: ' '.-. ^: '' ''. ^ . .'! ··

:' .· -ν .:;/.... ·: , ; ;: · 64" 22^-. 12;

3. Entfernung yon Pett aus der 'Zelle ν :

Die aufgespaltene Zellsuspension wird Mt Ohlorofom-iflfttianol (2:1 \ Vol/Vol) vermischt. Die Kompoiäenten, die, durch das organische Lösungsmittel extrahierbar sind, wurden dann vollständig durch Zentrifugieren bei 3 000 U/min über 10 min entfernt und die Chlorpformschicht yerworfen.

4· Behandlung mit proteolytischen Enzymen';

Die wie oben aufgeführt entfettete Probe wftrde mit proteo-Iytischen Enzymen wie Pronase, Trypsin und Pepsin nach üblichen Verfahren behändeIt· Von diesen proteolytischen Enzymen ist Pronase für den Zweck am geeighetsiten· Die Bedingungen für die Behandlung mit diesen Snzymen sind in "Methods in Enzymology" Bd· VIII, S«26 (1966) beschriebejai.

5. ,Reinigung '_:-;_: . .. ' ' ;; ;';.' ..','. '.,\ ' ' 'V- '-'h.: ^:: "λ ^;^^:·'.ν "^;' Das zentrifugierte Überstehende des proteolytischien Realctionsgemisches wurde mit Fällungsmitteln wie Trichloressigsäure oder Ammoniumsulfat versetzt, um die ProtedLhfralction auszufällen und zu entfernen. Die überstehende Fraktion wurde dann mit entsprechenden Hukleasen oder proteolytischen .Enzymen behandelt, um die Nukleinsäurebestandteile wie DWS und RIiS oder Proteine in: der Fraktion zu entfernen. Wach diesen enzymatischem Behandlungen wurde wiederholt dä^Lysiort. '. ; '..' ^; ' . ', ' · ' ' . , ".^::'..' '" :.. ' .·; . ' . . .' '

Die teilweise gereinigte Fraktion wurde anschließend einer Wiederholung weiterer Jjleinigungsprozeduren wie Gelfiltration und Säulenchromatografie unterworfen und schließlich erhielt man eine reine Form des Polysaccharids, das als.TRS-PoIySaC-charid bezeichnet wurde. ! ;

Im allgemeinen kann diesemTRS-Polysaccharid mit seinen physikoiichemischen Charakteristika, wie sie; oben aufgefühi't sind, durch viele der Isolierungs- und Reinigungsverfahren

". : .·. : ;·:-... ;:.^: 64 222 12

- 9 - ' ' .: ' ; > /.:. '. - -;;

hergestellt werden, die im Fachgebiet weitgehend eingesetzt werden, wie Fällung-Lösung und Extraktion, Lösungsmittelextraktion, Dialyse, Säulenchromatografie, Elektrophorese, Gelfiltration oder irgendeine Kombination dieser Verfahren· Die vorliegende Erfindung ist daher auf kein spezielles Verfahren beschränkt· .

Die Zubereitung der vorliegenden Srfindung ist bezogen auf die Zübereitungsverfahren hypotriglyoeridemisch aktiver Produkte, die aus einem Polysaccharid bestehen aund durch Mikroorganismen erhalten werden, die zur Art Streptococcus gehören, da die pharmakologische Wirksamkeit in der PoIysaccharidfraktion gefunden wurde. Das wird in detaillierter Form in jedem der folgenden Beispiele beschrieben. :

xis ist zu beachten, daß hypotriglycerideraische Wirksamkeit im überstehenden der Kulturbrühe etwa Y5 von der in der Bakterienzelle beträgt, ^;..;

Physikochemische Gharakteristika des rRS-Polysaccharids

Die physikochemischen uns physiologischen Charakteristika des TRS-Polysaccharids der vorliegenden Erfindung sind folgende. . ' . ' . ; ' ;· ,.; ' ', ;' .. ;--^; ,

1» Chemische Natur und LÖslichkeitseigenschaften Die pulverisierte Probe, die man nach dem Entsalzen und Gefriertröckaen erhielt, war ein nicht-hygroskopisches weißes Pulver mit hoher Löslichkeit («''«TOO mg/ml> in Wasser aber nur teilweiser Löslichkeit in Ethanol, Methanol und Aceton und Üniöslichkeit In Ether und Chloroform.

2.. Molmasse · ' ' '. ." ''. ' -' ' . ' ; '/ ' ",' , ·. " / > /^: ':' Die Molmasse des Polysaccharids (TRS) Würde auf 14 ÖOÖ + 3 000 nach Gelfiltration geschätzt, mit verschiedenen Dextranen als Vergieichsmaßstab, die ^ine unterschiedliche Kolmasse aufwiesen, unter Verwendung einer Töyopearl HW 55-

; ; ,/ ;.. ^: ;H 222 Ϊ2

- ίο - . : ν'.; .· · / '. - : :.,^:ν\

Säule, versehen mit einem 25 mM tris-HCl-Pufferj der 0,3 M WaCl (pH 7,5) enthielt.

3. Spezifische Drehung Die spezifische Drehung des genannten TRS^Polysaccharids

' ^: ' .' '- _— OQ ' ' ' ' '·

in 1,8 Mas se/Völliger Lösung, Z^7jy* beträgt +190,1 (Doxt rorotation), bestimmt mittels eines Polarimeters DIP-4-». ^;

4» Zuckerzusammensetzung · ;

a) Vier mg der Probe wurden mit O,2 M TFA (irifluoressigsäure) bei 100 ⁰G 7 Stunden behandelt; die Probe wurde mit 0,2 ml Hexamethyldisilazan (20% Vol/Völ in Pyridin) und 0,02 ml Trimethylchlorsilan vermischt, 1$ Minuteja gerührt und nach Stehenlasöen über 5 Minuten gaschromatisch untersuctit, um Glukose, Rhamnose usw. zu bestimmen. Die 'i?rennüngssäulentemperaturi-rbetrug 179 ⁰G. Uronsäure usw. würde über die

H₂SO.-Methode (modifizierte/Bitter-Muilr-Methode; Bitter,!, und Muir,H. Anal.Biochenu £, 33,0: (1962) bestimmt· Die Zuckerzusammeasetzung des Polysaccharids war ί Glukose 70,3 $, Rhamnose 13>7 % und Uronsäure; 16,0 %>

5. Säure-Base-Gharäkteristik ^; ' ^{: :}'Λ '

Der pH-Wert der 0,1 und 0,5 %1έβΑ\--ίο'.8ϋώβ·^αν;ΦΚ|3»ΡοΪ3Γ3_είθθ1ΐΒ 2?ids betrug 6,71 . ..' ' ': ;; '· ' ' / '; .;:" ^:· - ./ ;""/:":.', . . . '.v,.; ..;.' '

6. Infrarot-Absorptionsspektrum

Bas Infrarot-Absorptionsspektrum des TRS-Polys.accharids, ge messen mit einem ifrarotspektrometer (Modell JASGO A-302) ist aus Fig. 1 zu entnehmen, worin die Absaiöse und die Ordinate die Wellenzahl und die Prozente transmission (Durchlässigkeit) angeben«.

7· Blementaranalyse iiine iilementaranalyse mittels eines ßleüießtaranalysators

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·- 11 -- . ' ' .·. . ' ' ' ..·-, . - -

(Modell 240 B,Perkin-iSlmer) führte zu folgendem Ergebnis: G 3.7,2: %, H 6,4 % und /0 56,4 % beim 'rilS-Polysaccharid,Die ; Summenformel ist ^ x^c.Ap^·

8. Schmelzpunkt

Der Schmelzpunkt des TRS-Polysaccharids la£ bei 235 bis 241 Q, gemessen mit einem Schmelzpunktgerät Modell Y_anaco ^P-3. " ' ': ' · :. ' . ' ' ..: :..: ''.^: .. ·: · -' ' ' . .'. ',' · ^^:. >.-

9. Physiologische Charakteristikä

Das TRS-Polysaccharid ist bei der Reduzierung des Bluttriglyceridspiegels in Säugetieren wirksam, wenn es oral ver* abroicht wird. Diese Aktivität ist im Breich von wenigstens -80 ⁰C bis 115 °C und bei pH 4,1 bis 11 stabil, wenn das TRS-Polysaccharid gelagert wird, T

PharmakoloRische Wirkungen des TRSrPolysaccharids 1. Pharmakologische Effekte \ ,

Wie aus jedem folgende« Beispiel hervorgeht, ist das vorliegende antiarteriosklerotische Pharmazeutikum mit dem TRS-Polysaccharid der vorliegenden Erfindung bei der Reduzierung des Bluttriglyceridspiegels in Säugetieren außerordentlich wirksam. Dementsprechend ist dieses Pharmazeutikum ein nützliches therapeutisches oder vorbeugendes Medikament für Krankheiten aus dem Bereich Arteriosklerose, Hyperlipidämie, Hyperlipoproteinämie, Xanthomatose, Cholezystolithiasis, Hypertension, Diabetis und andere, ·

Die erfindurigsgemäße Zubereitung kann Säugetieren auf oralem, intraperitonealem und intravenösem Wege sowie auf anderen Wegen verabreicht werden. Die Menge pro Dosiseinheit liegt bsi etwa 1^g bis 0,5 g/kg Körpermasse· Bevorzugt ist die orale Gabe bei etwa 0,01 bis 100 mg/kg Körpermasse. I¹Ur die vorliegende uJrfindung kann eine beliebige firzneimitteiform

; .64 222 12

:- 12 - : '.- '.. · ^; '/^; .- , : '.'.' ' ' :

gewählt werden, sie kann eingesetzt werden als Lösung in physiologischer Kochsalzlösung und anderen, Injektionen, als pulverförmiges Lyophilisat oder auf andere Weise in Pulverform überführt, als Suppositorien, als mit einer # Schutzhülle überzogene Tabletten, als süblinguale Tabletten, als Granulate, Tabletten, Kapseln usw* mit entsprechenden Trägerstoffen, verdünnenden Basen, Verdünnangsmitteln üsw·

2. Akute Soxizität

Wie ..aus den nachfolgenden Beispielen hervorgeht, liegt die LDc₀ aes TRS-Polysaccharids der vorliegenden Erfindung bei mehr als 1 200 mg/kg Körpermasse, wenn es der Maus intraperitoneal verabreicht worden war. Das Bedeutet, daß die Substanz bei oraler Gabe im wesentlichen nicht toxisch ist·

Die Erfindung wird nun durch Beispiele weiter erläutert, die jedoch keine Beschränkung darstellen sollen«

Beispiel 1 - Herstellung und Reinigung des TRS-Polysaccharids -

Streptococcus faecium FlSRM BP-296 wurde geimpft in 2 1 Rogosa Kulturmedium bei einer Endkonzentration von 1 χ 10 Bakterien/ml· fias geimpfte Medium wurde bei 37 ⁰C 10 Stunden ohne Rühren unter aeroben Bedingungen inkubiert, wobei man \Ö^y Bakterien/ml Kulturbrühe erhielt. Die Bakterientellen wurden durch kontinuierliches Zentrifugieren bei 12 000 U/ min gewonnen, mit physiologischer Kochsalzlösung (0,85% NaGl) gewaschen und in deöel^ben Lösung suspendiert, um 100 ml der Zellsuspension bei einer Konzentration von 2 χ 10 /ml zu erhalten,, :

Die oben genannte Bakterienzellsuspension wurde bei 115 ⁰C über 10 Minuten wärmebehatidelt und dreimal mit Chloroform-

'64 222 12

Methanol (2:1, Vol/Vol) behandelt, um Fette zu entfernen.

Die entfettete bakterielle Suspension wurde mit 3 000 U/min 10 Hinuten zentrifugiert, und die untere Schicht, d.i. die Ohioroformschicht, wurde verworfen· Die wäßrige Schicht wurde als Ausgangsmaterial in den folgenden Reinigungsschiritten eingesetzt. _;

Das Ausgangsmaterial wurde dann mit 20 mg' Pronase (Sigma-Protease Typ XIV) in 100 ml Phosphatpuffer (pH 7,8) versetzt,¹ der 0,0015 M GaCl₂ enthielt, bei 47 ⁰C über 24 Stunden. ISs erfolgte eine weitere Behandlung mit 10 mg Pronase unter den gleichen Bedingungen. Die experimentellen Bedingungen der Behandlung mit Pronase sind in "Methods in Enzymology" Bd. VIII 3. 26 (1966) aufgeführt.

Das mit Prqnase behandelte Material wurde durch ZentrifU-gierung bei 3000 U/min über 10 Minuten in die ausgefällte und die überstehende Fraktion getrennt. Die üierstehehde fraktion wurde mit ¹/9 Volumen 100%ger (Masse/Vol) rrichlbressigsäure (TÄC) versetzt, bei 4 ⁰C über 3 Stunden unter iiühren stehen gealssen und dann mit 3000 U/min 10 Minuten zentrifugiert, wobei man die ausgefällte und die überstehende Fraktion erhielt. Die ausgefällte Fraktion würde mit dem > gleichen Volumen 10$iger TCA versetzt und das gleiche Verfahren wiederholt. Das erhaltene überstehende wurde dreimal mit iSthylether zwecks Entfernung von I¹CA gewaschen, in 5Öml destilliertem Wasser gelöst, mit 1 N NaOH neutralisiert, zur vollätändigen Entfernung von üXJA dialysiert und schließlich lyophilisiert, wobei man 253 mg (Trockenmasse) der überstellenden Fraktion erhielt.

Die erhaltene überstehende Fraktion wurde mit der oben beschriebenen Pronase behandelt und dialysiert, um zu 176 mg ,, (Trockenmasse) der dialysierten Fraktion zu gelangen

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>35ΟΟ). Die dfalysierte Fraktion wurde als Reinigungsfraktion I bezeichnet·

Die genannte Reinigungsfraktion I wurde über einen Sephadex G-TOO-S a'ulenchromatographen fraktioniert, der 0,05 M Tris-HCl-Puffer enthielt. Das Säulenchromatogramm der Reinigungsfraktion I bei einer Eluierungsrate von 1 ml/min ist aus Fig. 2 zu entnehmen j die Abszisse weist das Eluierungsvolumen (ml) und die Ordinate die Konzentration der eluierfcen Substanz (/ig/ml) auf» Eine Fraktion nach 124 ml wurde ge- · sammelt und als Reinigungsfraktion II bezeichnet (93»6 mg irockenmasse)ν

Pig.3 zeigt ein Säulenchromatogramm der Reinigungsfraktion II bestimmt mit einer !ioyopearl HW-SSJi¹ -Säule, ausgerüstet mit einem 25.mil Tris-HCl-Puffer, der 0,3 M KaGl enthielt. Die iiluie rungs rate betrüg 1 ml/min. In Fig. 3 stellen die Kurven 1, 2 und 3 die entsprechenden Blüierungsprofile von Zucker, Protein und Nukleinsäure dar. _:,

Das gereinigte TRS-Polysaccharid (87,9 mg Trockenmasse) wurde isoliert durch Sammeln des Teiles, der in 80 bis 100 ml Fraktionen eluiert wurde.

Fig. 4 zeigt das Säulenchromatogramm des TRS-Polysaccharids unter den gleichen experimentellen Bedingungenwie sie in Fig. 3 zu sehen ist· Die physikochemischen Charakteristika des TRS-Polysaccharids sind oben aufgeführt·

Tabelle 3 zeigt die Ausbeute und die Mengen an Protein, bestimmt nach dem Lowry-Verfahren, MS nach dem 0rcinol-Verfahren, DNS nach dem Diphenylamin-Verfahren ujad Zucker 'nach dem Phenol-HoSO,-Verfahren in jedem Herstellungsverfahren. Die V»_erte in der Tabelle weisen die Trockenmasse (mg) der Ausbeute und die Masse% der chemischen Bestandteile aus.

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' ^: . .' . ' -. ". . " ."ν' .·..'.. . ' SpeSzif,-Fraktionen Ausbeute Protein MS DNS Zucker Aktiva-

; ' ·.-' ^:- .- . ·. ·. . ' . .. · ·: .. tat

Überstehendes	258	6	14,	1	1	,8	Sp.	76,	3	7,1
Reini-gungs.frakt. I	176	9.	2,	8	1	,6	Sp.	95,	6	10,2
Heinigungsfräkt II;	93,	2,	1	0	,9-	Sp.	97,	0	12,3
TRS-PoIysaccharid	87,	Sp	•		Ρ·	Sp.	100		23,0

Sp.' = Spuren ' . ' "[ . .. : .. : ' ';/ - '. : ·'

Die spezifische Aktivität, die in Tabelle 3 ausgewiesen wird, zeigt die relative Aktivität der 'friglyceridreduktion, bei jeder Fraktion bei gewöhnlichen Rattek pro Masseeinheit, an, wobei die der wärmebehandelten Bakterienzeilen, die oben genannt wurden, 1 ist. Assayvorfahren für die Triglyceridreduzierende Aktivität in Tisrexperimenten sind weiter unten in Beispiel 2 ausgeführt. ; :

Es wurde bestätigt, daß das TRS-Polysaccharid von den anderen Bakterienstämmen, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, ebenso vvie in diesem Beispiel albrgetrennt und gereiaigt werden kann, jedoch mit leichten Unterschieden in der Ausbeute.

Beispiel 2 Pharmakologische Wirkung des TRS-Polysaccharids

1. iiypotriglyceridemische Aktivität (1)

Proben mit physiologischer Kochslzlösung, die das Äquivalent von 16 mg/kg Körpermasso des lyophilisierten TR3*Polysacharids enthielten, wurden hergestellt. Diese Proben wurden bei einer täglichen Dosis von 1ml gewöhnlichen Ratten (18 Wochen alt, männlich, durchschnittliche Körpermasse 246 g, 10 Ratten, pro 'Gruppe.)·'oral verabreicht sowie gewölinlichen und (Krankheits)keimfreien Mäusen (18 Wochen alt, männlich,

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durchschnittliche Körpermaase 30 g, 10 Mäuse pro Gruppe). Die Ratten und Mäuse wurden 8 bis 12 Wochen aufgezogen. Dann wurde von der Abdominalaörta dieser Tiere Blut gesammelt und von dem Gesamtblut Serumproben durch Zentrifugieren abgetrennt. Mit dem Trigycerid TGWAKO (Ac e ty lace tonverfahren) wurde dann der Triglyceridspiegel bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Die in der'Tabelle aufgeführten Werte stellen die Reduktionsrate {%) von den Werten der Kontrollgruppe dar, denen keine Probe dosiert worden ist. Die Zusammensetzung (Masse%) der Diät, die nach Belieben gegeben wurde, ist aus Tabelle 5 zu entnehmen.

' . Tiere	Tabelle 4	Filterpapier	Reduktionsrate (%)
Gewöhnliche Ratten Gewöhnliche Mäuse keimfreie Mäuse	(12 Wochen) C 8 Wochen) (8 Wochem)	40,5 45,1 39,6
Tabelle 5 Zusammensetzung	Masseprozent
i . ·. ·· ' -.· '. :'' · : Kasein Sojabohnenöl Weizenstärke Minerale Vitamin gemisch pulverisiertes	20 10' 61 4 2 ^: . ' 3

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2. Hypotriglyceridemische Aktivität (2)

Die oben genannten Gaben wurden oral verabreicht bei einer täglichen Dosis von 1 ml bei gewöhnlichen Ratten (18 Wochen alt, männlich, durchschnittliche Körpermasse 238 g, 15 Ratten pro Gruppe) und gewöhnlichen keimfreien Mäusen (18 Wochen alt, männlich, durchschnittliche Körpermasse 31 g, 10 Mäuse pro Gruppe) über 4 Wochen verabreicht. Der Bluttriglyceridspiegei wurde wie oben genannt bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 genannt.

Die Begriffe "Cholesterinzusatz¹¹ und "Fruktosezusatz" bedeuten die Zugabe von 1 % Cholesterol zur oben genannten Diät und den Ersatz von Fruktose für die Gesamtmenge an Weizenstärke in der oben geannten Diät. Die Werte in der Tabelle stellen die Reduktionsrate (%) dar, gemessen an den Werten der Kontrollgruppe ohne Dosierung«

Tabelle 6 ,

Tiere Reduktionsrate (%) i

keimfreie Mäuse ^X1 45,4

gewöhnliche Mäuse ^X1 41,6

gewöhnliche Ratten ^X1 43,2

gewöhnliche Ratten ^X2 42,0

^X1 - Diät mit Cholesterinzusatz ,

^X2 = Diät mit Fruktösezusatz

3· Hypotriglyceridemische Aktivität (3)

Physiologische Kochsalzproben, die 4 mg/ml TRS-Polysaccharid enthielten, wurden mit einer täglichen Dosis von 1 ml pro Ratte über 2 Wochen hyperlipidämischen Ratten (18 Wochen al-fej· männlich, durchschnittliche Körpermasse 250 g,

64 222 12 -18.-

5 Ratten pro Gruppe) verbreicht, die mit einer Cholesterinzusatzdiät gfüttert wurden· Der Bluttriglyceridspiegel wurde wie oben beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 7 zu entnehmen· Der Wert der Verabreichungsgruppe ist die Triglyceridrate (Reduktion) in-% zur Kontrollgruppe ohne Dosierung·

Tabelle 7

. *

Tiere Reduktionsrate (%)

mit Verbreichung 45,0

•Kontrolle " 0

4. Dosisabhängigkeit

Physiologische Kochsalzproben, die ,0,1 mg bis 20 mg/ml TRS·¹· Polysaccharid enthielten, wurden oral bei einer täglichen Dosis von 1 ml pro gewöhnliche Ratte (6 Wochen alt, männlich, durchschnittliche Körpermasse 216 g, 5 Ratten pro Gruppe) über 4 Wochen verabreicht. Der Bluttriglycerinspiegel wurde wie oben beschrieben bestimmt (bei der Kontrollgruppe erfolgte keine Dosierung). Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 aufgeführt·

Tabelle 8 Dosis (mg/Ratte) Reduktionsrate (% Durchschn_e.)

Kontrolle ... 0

0,1 < 10,0

1 '•7,4

10 43,0

20 48,2

64 222 12 ".-.19 - .''

5. Akute Toxizität ·

Physiologische Kochsalzproben (0,5 ml/Mgus), die 1, 10 und 100 mg des TRS-Polysaccharids enthielten, wurden intrape» ritoneal IRC-Mäusen verbreicht (6 Wochen alt, durchschnittliche Körpermasse 31,6 + 0,6 g, 10 Mäuse pro Gruppe)· Die thanatobiologische Beobachtung der Mäuse wurde über 14 Tage !durchgeführt. Die Kontrollsubstanz war physiologische Kochsalzlösung. ,

Die LD,-₀-Werte, berechnet nach der Behrens-Kärber-Methode, l4gen bei mehr als 1200 mg/kg Körpermasse. Die Substanz war nichttoxisch bei oraler Gabe,

6. Pharmazeutische Zubereitungen

(1) Bine 25 g-Menge des gereinigten TRS-Polysaccharids wurde gleichmäßig mit 275 mg gereinigtem Stärkepulver vermischt und Tabletten für die orale Verabreichung geformt.

10

Jede Tablette entsprach einer Dosis von 10 wärmebehandelten Zellen pro kg Körpermasse für einen Erwachsenen mit,einer Körpermasse von 50 kg.

(2) Das TRS-Polysaccharid wurde gleichmäßig mit verdünnenden Basen wie Kalziumkarbonat, Lactose usw., Gleitmitteln wie Stearinsäure, Talkum usw. und andren Additiven vermischt und die Tabletten dann für die orale Verabreichung geformt. Die tägliche Dosis des TRS-Polysaccharids liegt üblicherweise bei 0,1 mg bis 100 mg/kg Körpermasse.

(3) Das TRS-Polysaccharid (900 mg) wurde suspendiert und gelöst in destilliertem Wasser (30 ml), mit Sirup gesüßt und dann ein Sirup hergestellt.

Claims

- 20 -. Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung eines hypotriglyceridemisch aktiven Polysaccharide, das in der Lage ist Bluttriglycerid in Säugetieren zu reduzieren und folgende Merkmale auf»

·'. 'weist:-.. ^v '. ' ' .' ... .

a) Spezifische Drehung/ocJ/q⁹ = +190,1 (1,8 Masse/Vol% Lösung)

b) Molmasse durch Gelfiltration 14 000 + 3 000

c) Zuckerzusammensetzung (Masse% durch Gaschromatografie) Glukose 70,3; Rhamnose 13,7; Uronsäure 16,0

d) Säure-Base-Charakteristika: neutrale Polysaccharide«

gekennzeichnet dadurch, daß ein Mikroorganismus der Art Streptococcus in einem entsprechenden Kulturmedium dafür kultiviert wird und das hypotriglyceridemisch aktive Polysaccharid aus den kultivierten Zellen des Mikroorganismus und/oder dem Überstehenden der Kulturbrühe gesammelt wird,

2# Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus^wenigstens ein solcher ist« der aus der aus S. faecium, S. faecalis« S, avium, S, bovis, S» sail» varius, S. durans, S, mitis und S. equinus bestehenden Gruppe ausgewählt wurde#

3, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus wenigstens ein Stamm ist, der aus der aus S. faecium FERM BP-296 (ZIMET 10 976), S· faecalis

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FERM BP-297 (ZIMET 10 977), S, avium FERM BP-298 (ZIMET 10 978), S. salivarlus FERM 8P-299 (ZIMET 10 979), S. durans FERM BP-300 (ZIMET 10 980), S₀ mitis FERM BP-301 (ZIMET 10 981) und S. equinus FERM BP-302 (ZIMET 10 982) bestehenden Gruppe ausgewählt wurde·

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das hypotriglyceridemisch aktive Polysaccharid durch Aufspaltung der Zellen des aus der Kulturbrühe gewonnenen Mikroorganismus gesammelt wird und die Polysaccharidfraktion davon abgetrennt wird·

5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das hypotriglyceridemisch aktive Polysaccharid aus dem Oberstehenden der Kulturbrühe gewonnen wird durch Abtrennen einer Polysaccharidfraktion davon«

Hierzu ¹T Seiten Zeichnungen