DE2331144A1 - Wasserloesliche extrakte von mycobacterien - Google Patents

Wasserloesliche extrakte von mycobacterien

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DE2331144A1
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acid
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Pierre Jolles
Geb Samour Daniele Migliore
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Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
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Description

PATENTANWALT* ? ? ? 1 ΐ 4 Λ
DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖN WAF «Γ DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALCK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLDPSCH DIPL-ING. SELTING
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS
Köln,, den 15.6.1973 AvK/Ax
Agence Nationale de Valorisation de la Recherche (ANVAR) Neuilly-sur-Seine/Frankreich
Wasserlösliche Extrake von Mycobacterien
Die Erfindung betrifft wasserlösliche Extrakte von Mycobacterien, ihre Herstellung und ihre Verv/endung als immunologische Adjuvantien.
Gewisse Mycobacteriuiapräparate haben die Fähigkeit, die Antikörperbildung zu fördern und zu verstärken (J. Freund, Adv. Tuberc. Res., £, I30 (1956))» naben jedoch gewisse Nachteile, z.B. die Auslösung von experimenteller Arthritis bei der Ratte (B.H.V/aksmann und Mitarbeiter, Immunology-, !.ι 54 (1958); H. G. White und Mitarbeiter ,Immunology, 7_, 158 (1964-)). In diesen verschiedenen aktiven Substanzen ist ein Polysaccharid (Poly) an ein Peptidoglykan (PA) gebunden.
Insbesondere besteht ein "Wachs D" von Mycobacterium tuberculosis var. hominis aus einem Lipidteil, der über Esterbindung an den wasserlöslichen PoIy-PA-Teil gebunden ist.
Es ist möglich, den wasserlöslichen Teil (Poly-ΡΑ) nach chemischen Verfahren, z.B. durch Verseifung (J.Asselineau, C.R.Acad. Sei., 229, 791 (19'+9)) oder Acetylierung
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(P.Jolles und Mitarbeiter, Immunology, ΛΆ_, 159 (1968)) oder nach biochemischen Verfahren, die auf der Wirkung eines Enzyms beruhen (A.Adam und Mitarbeiter, Proc, Nat. Acad. Sei. USA, 69., 851 (1972); Yanagida, Isao, Osaka Daigaku Shigaku Zasshi, Ij?, 111 (1970): Chem. Abstr., 76, 1$7 850 r (1972)) herzustellen. Alle diese auf chemischem oder biochemischem Wege erhaltenen wasserlöslichen Teile sind nicht gleichmäßig und regelmäßig als immunologische Adjuvantien wirksam. Dieses unregelmäßige Verhalten ist insbesondere auf mehr oder weniger starke Modifikationen der Zucker zurückzuführen.
Gemäß der Erfindung wurde nun gefunden, daß es möglich ist, aus Mycobacterien, die durch Behandlungen, die nicht die Zucker zerstören oder die nicht die Verwendung von Enzymen erfordern, von Lipiden befreit worden sind, wasserlösliche Extrakte zu erhalten, die als Adjuvantien wirksam sind und keine Arthritis auslösen.
Die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung sind Substanzen, deren Molekulargewicht zwischen 3500 und 3O.OOO liegen kann. In allen diesen Substanzen ist ein Stickstoffteil, dessen Struktur derjenigen des Peptidoglykans der Wand gleichgestellt werden kann, mit nichtaminierten reduzierenden Zuckern wie Mannose, Glucose, Galactose und Arabinose assoziiert. Diese Substanzen können nach der Methode von A. Aebi und Mitarbeitern, Bull. Soc. Chim. Biol. , 35., 661 (1953) hergestellten, von Lipiden befreiten Bakterienresten von Mycobacterien erhalten werden, nämlich entweder durch milde Extraktion (Homogenisierung in wässrigem Medium) mit anschließender Anwendung der üblicherweise angewandten physikalischchemischen Methoden der Isolierung und Reinigung wie Aussalzung, Zentrifugieren, Dialyse und Chromatographie, oder durch Einwirkung von Pyridin in Gegenwart oder • Abwesenheit von Essigsäureanhydrid mit anschließender Extraktion mit Äthanol oder Wasser und Anwendung der
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üblicherweise angewandten Isolierungs- und Reinigungsmethoden wie Aussalzung, Zentrifugieren, Dialyse und Chromatographie.
Die milde Extraktion liefert auf diese Weise einen wasserlöslichen Extrakt, der als "PoIy-PA" bezeichnet ist und die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen hat:
Aussehen: weißes Pulver (nach Gefriertrocknung)
Zusammensetzung:
a) Aminosäuren (Molverhältnis): Alanin (3), Glutaminsäure (2), α,α1-Diaminopimelinsäure (2).
b) Aminozucker (Molverhältnis): N-Acetylglucosamin (2), N-GIykoIylmuraminsäure (2); Anwesenheit von N-Acetylgalactosamin.
c) Reduzierende Zucker ohne Aminogruppe: Arabinose, Galactose, Anwesenheit von Mannose.
d) Lipide: unter 0,5 %·
Molekulargewicht (berechnet auf Basis von 3 Alaninresten pro Molekül): 14 000 ± 2 000.
Sedimentationskonstante S?o (bestimmt mit der Beckman-Apparatur): 2.
Die Behandlung mit Pyridin in Gegenwart von Essigsäureanhydrid ergibt eine wasserlösliche Substanz, die als ■ "Substanz A" bezeichnet wird und die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen hat:
Aussehen: gelbes Pulver (nach Gefriertrocknung)
Zusammensetzung:
a) Aminosäuren (Molverhältnis): Alanin (3), Glutaminsäure (2), α, α' -Diaminopimelinsäure (2).
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b) Aminozucker '(Molverhältnis): N-Acetylglucosamin (2), N-Acetylmuransäure (2).
c) Reduzierende Zucker ohne Aminogruppe: Mannose, Glucose, Anwesenheit von Arabinose, Abwesenheit von Galactose.
d) Lipide sind nicht vorhanden.
Molekulargewicht (berechnet auf Basis von 3 Alaninresten pro Molekül): 4- 000 ± 200.
Sedimentationskonstante S?q (bestimmt mit der Beckman-Apparatur): 0,7
Die Behandlung mit Pyridin allein ergibt zwei wasserlösliche Substanzen: Eine Substanz mit hohem Molekulargewicht (26 500 ± 500), nachstehend als "Substanz B" bezeichnet, und eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht, nachstehend als "Substanz G" bezeichnet.
Die Substanz C hat die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen:
Aussehen: weißes Pulver (nach Gefriertrocknung)
Zusammensetzung:
a) Aminosäuren (Molverhältnis): Alanin (3)> Glutaminsäure (2), α,α'-Diaminopimelinsäure (2).
b) Aminozucker (Molverhältnis): N-Acetylglucosamin (2), N-GlykoIylmuransäure (2).
c) Reduzierende Zucker ohne Aminogruppe: Arabinose, Galactose, Mannose.
Molekulargewicht (Berechnet auf Basis von 3 Alaninresten im Molekül): 6 000 ± 500.
Für das Verfahren gemäß der Erfindung eignen sich virulente oder nicht-virulente Mycobacterien menschlichen oder nicht-menschlichen Ursprungs, bei denen die Anwesen-
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ORIGINAL INSPECTS)
heit eines "Wachses D" nachgewiesen werden konnte. Geeignet sind beispielsweise Mycobacterium tuberculosis, var. hominis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium tuberculosis, var. bovis, Stämme LA und BB usw.
Die gemäß der Erfindung erhaltenen wasserlöslichen Substanzen sind als Adjuvantien wirksam und erzeugen keine Arthritis.
Die Wirksamkeit als Adjuvantien wird am Meerschweinchen, Hartley-Stamm, nach der Methode von S.G. White und Mitarbeitern, Immunology, 7.» 158 (1964) und die arthrogene Wirkung und Schutzwirkung nach den Methoden bestimmt, die von F.Bonhomme, CR. Acad. Sei., Heihe D, 263, 1 422 (1966) und CR. Acad. Sei., Reihe D, 265, 2 115 (1967), beschrieben werden.
Beim Meerschweinchen bewirken die wasserlöslichen Substanzen gemäß der Erfindung eine Steigerung des Gehalts an Antikörpern bei subkutan injizierten Dosen von 0,1 mg oder über 0,1 mg.
Die neuen Produkte gemäß der Erfindung sind wertvoll in der Human- oder Veterinärmedizin zur Steigerung des Widerstandes gegen Virus- oder Bakterieninfektionen. Sie bewirken eine Steigerung der Bildung von Antikörpern, : die gegen pathogene Mikroorganismen wirksam sind, und können mit der Verabreichung von Vakzinen kombiniert werden, um eine maximale Antikörperreaktion sicherzustel-. len.
Die Erfindung umfaßt ferner pharmazeutische Zubereitungen, die wenigstens eine wasserlösliche Substanz gemäß der Erfindung in Kombination mit einem oder mehreren verträgliehen Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen und gegebenenfalls mit anderen Arzneistoffen wie Antibiotika, Lipide, abschwellende Mittel und Vakzinen, enthalten. In diesen Zubereitungen ist das Produkt gemäß der Erfindung im
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allgemeinen in einer Konzentration von mehr als 0,1 % enthalten. Diese Zubereitungen können oral, rektal, parenteral oder als Aerosole Aerabreicht werden.
In der Humantherapie hängen die Dosen von der gewünschten Wirkung ab. Sie können zwischen 10 und 50 mg/Tag für den Erwachsenen liegen.
Die Herstellung der wasserlöslichen Substanzen gemäß der Erfindung vird in den folgenden Beispielen beschrieben.
Beispiel 1
100 g Bakterienreste, erhalten aus Mycobacterium tuberculosis var. hominis, Stamm Peurois, nach der Methode von A. Aebi und Mitarbeitern, werden in 500 ml Wasser mit einer Mühle (Ultra-Turrax) gemahlen und homogenisiert. Man rührt 5 Stunden bei 200C und zentrifugiert 30 Minuten bei 4°C (4000 UpM) und erhitzt die überstehende Schicht auf 80 C. Man gibt Ammoniumsulfat in einer Menge zu, daß eine Lösung mit 40 % Sättigung erhalten wird. Nach 12 Stunden bei 4 C und Zentrifugieren für 30 Minuten erhält man eine Fällung (
Zum Überstand gibt man Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß eine zu 70 % gesättigte Lösung erhalten wird. Nach 12 Stunden bei 4°C und Zentrifugieren für 30 Minuten unter den gleichen Bedingungen erhält man eine . Fällung (P70).
Die Fällungen P^0, P70 und der erhaltene letzte Überstand (S70) werden anschließend getrennt gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die verschiedenen Lösungen, die nicht dialysieren, werden gefriergetrocknet. Hiebei werden 1,2 g der Fraktion P40, 1,4 g der Fraktion P70 und 0,9 g der Fraktion S70 erhalten, die den größeren Teil der biologisch aktiven Substanz enthält.
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Die letztgenannte Fraction wird durch Chromatographie an DEAE-Cellulose, die mit einem 0,05-molaren Phosphatpuffer bei Pjt 7 ins Gleichgewicht gebracht wird, gereinigt, wobei mit einem 0,05-moIaren Natriumeitrat— puffer bei ρττ 5 eluiert wird. Hierbei werden 400 mg gereinigtes PoIy-PA erhalten*
Nach Filtration an Biogel PlO, wobei mit Wasser eluiert wird, werden I50 &6 PoIy-PA von hoher Reinheit erhalten. Die Zusammensetzung des erhaltenen PoIy-PA wird wie folgt ermittelt:
a) Die Zusammensetzung an Aminosäuren und Aminozuckern wird mit einem Autoanalysator (Typ Teehnicon) nach totaler Hydrolyse mit 6N Salzsäure bei 110°C für 18 Stunden bzw. 6 Stunden bestimmt.
b) Die Zusammensetzung an neutralen Zuckern ohne Aminogruppe wird nach Hydrolyse mit 2N Salzsäure für 2 Stunden bei 110 C qualitativ durch Papierchromatographie (Whatman EFr. 1; Lösungsmittel: Butanöl-Pyrldin-Wasser, Vblumenverhältnis 6:4:3) und quantitativ mit einem Zucker-Autoanalysator (Typ Teehnicon) bestimmt.
c) Die Bestimmung der Lipide erfolgt durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel nach totaler Hydrolyse und Extraktion mit Äther.
Das in der vorstehend beschriebenen Y/eise erhaltene • gereinigte PoIy-PA hat die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen:
Aussehen: weißes Pulver
Zusammensetzung:
JO a) Aminosäuren (Molverhältnis): Alanin (3), Glutaminsäure (2), α,α'-Diaminopimelinsäure (2).
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b) Aminozucker (Molverhältnis): N-Acetylglucosamin (2), N-Glykolylmuramsäure (2); Anwesenheit von N-Acetylgalactosamin.
c) Reduzierende Zucker ohne Aminogruppe: Arabinose, Galactose, Anwesenheit von Mannose.
d) Lipide: unter 0,5 %
Der Gehalt an Aminosäuren beträgt 6,2 %, der Gehalt an Aminozuckern 7 bis 8 %, und der Rest besteht aus reduzierenden Zuckern ohne Aminogruppe.
Molekulargewicht (berechnet auf Basis von drei Alaninresten im Molekül): 14.000 ± 2.000.
Sedimentationskonstante: 2
Beispiel 2
20 g Bakterienreste aus Mycobacterium tuberculosis var. hominis, Stamm EUr7Ra, in 250 ml eines Gemisches von Pyridin und Essigsäureanhydrid (Volumenverhältnis 3:2) werden 36 Stunden bei 28°C gerührt. Nach Zusatz von 25OO ml Äthylalkohol wird eine weitere Nacht gerührt. Der unlösliche Teil wird durch Zentrifugieren (4000 UpM) abgetrennt. Der Überstand wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 200 ml V/asser aufgenommen. Der in V/asser unlösliche Teil wird durch Zentrifugieren (4000 UpM) abgetrennt. Der Überstand wird an einer Säule von Biogel P10 filtriert. Nach Gefriertrocknung werden 100 mg wasserlösliche Substanz A erhalten, deren Zusammensetzung wie folgt bestimmt wird:
a) Die Zusammensetzung an Aminosäuren und Aminozuckern wird nach totaler Hydrolyse mit 6N Salzsäure bei 110 G für 18 Stunden bzw. 6 Stunden mit einem Autoanalysator (Typ Technicon) bestimmt.
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b) Die Zusammensetzung an Zuckern ohne Aminogruppe wird nach Hydrolyse mit 2N Salzsäure für 2 Stunden bei 110°C qualitativ durch Papier Chromatographie (7/hatman Nr. 1, Lösungsmittel: Butanol-Pyridin-7/asser (Yolumen-Verhältnis 6:4:J)) und quantitativ durch Gaschromatographie mit einem Zucker-Autoanalysator nach Methylierung und Silylierung unter Verwendung eines Hewlett-Packard-Chromatographen bestimmt.
c) Die Bestimmung der Lipide erfolgt durch Dünnschicht-Chromatographie an Kieselgel nach totaler Hydrolyse und Extraktion mit Äther.
Die in der oben beschriebenen Weise erhaltene wässerlösliche Substanz A hat die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen:
Aussehen: gelbes Pulver
Zusammensetzung
a) Aminosäuren (Molverhältnis): Alanin (3), Glutaminsäure. (2), α,α'-Diaminopimelinsäure (2).
b) Aminozucker (Molverhältnis): N-Acetylglucosamin (2), N-Acetylmuramsäure (2).
c) Reduzierende Zucker ohne Aminogruppe: Mannose, Glucose; Anwesenheit von Arabinose, Abwesenheit von Galacto.sc.
d) Lipide nicht vorhanden.
Der Gehalt an Aminosäuren beträgt. 3I - 5 %, der Gehalt an Aminozuckern 25 ί 5 %·, und der Rest besteht aus reduzierenden Zuckern ohne Aminogruppe (11 %) und Acetylfunktionen, die an die reduzierenden Aminozucker oder Nicht-Aminozucker durch Acetylierung gebunden sind.
Molekulargewicht (berechnet auf Basis von drei Alaninresten im Molekül): 4000 ί 200.
Sedimentationskonstante: 0,7
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Beispiel 3
20 g Bakterienreste von Mycobacterium tuberculosis var. hominis, Stamm Test, in 250 ml Pyridin werden 36 Stunden bei 280C gerührt. Nach Zusatz von 2500 ml Äthylalkohol wird eine weitere Nacht gerührt. Der durch Zentrifugieren abgetrennte unlösliche Teil wird in 100 ml Wasser mit einer Mühle (Ultra-Turrax) homogenisiert. Man rührt 48 Stunden bei 400C, zentrifugiert 30 Minuten bei 4°C (4000 UpM) und erhitzt den Überstand auf 80°C. Man gibt Ammoniumsulfat in einer Menge zu, daß man eine zu 40 °/o gesättigte Lösung erhält. Nach 12 Stunden bei 4 C und Zentrifugieren für 30 Minuten erhält man eine Fällung
Zum Überstand gibt man Ammoniumsulfat in einer Menge, daß eine zu 70 % gesättigte Lösung erhalten wird. Nach 12 Stunden bei 4°C und Zentrifugieren für 30 Minuten unter den gleichen Bedingungen erhält man eine Fällung (P70).
Die Fällungen Y1 0 und P70 und der letzte erhaltene überstand (S70) v/erden anschließend getrennt gegen destiliertes Wasser dialysiert. Die verschiedenen Lösungen, die nicht dialysieren, v/erden gefriergetrocknet. Hierbei werden eine Fraktion P/,o, eine Fraktion P70 und 0,8 g einer Fraktion S70 erhalten, die den größeren Teil der biologisch aktiven Substanzen enthält. Die letztgenannte Fraktion wird durch Chromatographie an DEAE-Cellulose, die mit einem 0,05-molaren Phosphatpuffer bei p^ 7 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, gereinigt, wobei mit einem 0,05-molaren Natriumeitratpuffer bei pH 3 eluiert v/ird. Nach Dialyse und Gefriertrocknung v/erden hierbei entsprechende Fraktionen, 0,15 S wasserlösliche Substanz B und 0,1 g wasserlösliche Substanz C erhalten. Die Zusammensetzung der Substanz C wird nach den in Beispiel 2 beschriebenen Methoden bestimmt.
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Die in der oben beschriebenen Weise erhaltene wasserlösliche Substanz C hat die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen:
Aussehen: weißes Pulver nach Gefriertrocknung.
Zusammensetzung ·
a) Aminosäuren (Molverhältnis): Alanin (3)j Glutaminsäure (2), α,α'-Diaminopimelinsäure (2)
b) Aminozucker (Molverhältnis): N-Acetylglucosamin (2), N-Glykolylmuramsäure (2)
c) Reduzierende Zucker ohne Aminogruppe: Arabinose, Galactose, Mannose.
d) Lipide sind nicht vorhanden.
Der Gehalt an Aminosäuren beträgt 16 ί 3 %, der Gehalt an Aminozuckern 16 ί 5 %, und der Rest besteht aus reduzierenden Zuckern ohne Aminogruppe.
Molekulargewicht (berechnet auf Basis von drei Alaninresten im Molekül): 6000 ί 500.
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Claims (13)

  1. Pat entansprüche
    "\j Wasserlösliche Extrakte von Mycobacterien, die von Lipiden befreit und aus virulenten oder nicht-virulenten Mycobacterien menschlichen oder nicht-menschlichen Ursprungs, bei denen die Anwesenheit eines "Wachses D" nachweisbar ist, erhalten worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Molekulargewicht zwischen 3500 und 30' 000 und Eigenschaften von Adjuvantien haben und keine Arthritis erzeugen.
  2. 2. Wasserlösliche Extrakte nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen:
    Aussehen: weißes Pulver (nach Gefriertrocknung);
    Zusammensetzung:
    a) Aminosäuren (Molverhältnis): Alanin (3), Glutaminsäure (2), α ,α'-Diaminopimelinsäure (2);
    b) Aminozucker (Molverhältnis): N-Acetylglucosamin (2), N-Glykolylmuramsäure (2); Anwesenheit von N-Acetylgalactosamin;
    c) Reduzierende Zucker ohne Aminogruppe: Arabinose, Galactose; Anwesenheit von Mannose;
    d) Lipide: unter 0,5 %\
    Molekulargewicht (berechnet auf Basis von 3 Alaninresten im Molekül): 14 000 ί 2 000; Sedimentationskonstante S„„: 2.
  3. 3. Wasserlöslicher Extrakt nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen:
    Aussehen: gelbes Pulver (nach Gefriertrocknung); Zusammensetzung:
    a) Aminosäuren (Molverhältnis): Alanin (3), Glutamin-
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    säure (2), α,α*-Diaminopimelinsäure (2);
    b) Aminozucker (Molverhältnis): N-Acetylglucosamin (2), N-Acetylmuramsäure (2);
    c) Reduzierende Zucker ohne Aminogruppe: Mannose, Glucose, Anwesenheit von Arabinose, Abwesenheit von Galactose;
    • d) Abwesenheit von Lipiden;
    Molekulargewicht (berechnet auf Basis von drei Alaninresten im Molekül): 4000 + 200;
    Sedimentationskonstante Sp0: 0,7·
  4. 4. Wasserlöslicher Extrakt nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften und Kennzahlen:
    Aussehen: weißes Pulver nach Gefriertrocknung; Zusammensetzung:
    a) Aminosäuren (Molverhältnis): Alanin (3), Glutaminsäure (2), α,α1-Diaminopimelinsäure (2);
    b) Aminozucker (Molverhältnis): N-Acetylglucosamin (2), M-Glykolylmuramsäure (2);
    c) Reduzierende Zucker ohne Aminogruppe: Galactose, ' Mannose, Arabinose;
    Molekulargewicht (berechnet auf Basis von drei Alaninresten im Molekül): 6000 ί 500.
  5. 5. Wasserlösliche Extrakte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Mycobacterien der Gattung Mycobacterium tuberculosis, vai-« hominis erhalten worden sind.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Extrakten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
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    a) von Li'piden befreite Bakfcerienreste von Mycobacterien einer milden Extraktion unterwirft und dann die hierbei extrahierte Substanz auf physikalischchemischem Wege isoliert und reinigt oder
    b) die von Lipiden befreiten Bakterienreste von Ivlycobacterien mit Pyridin in Anwesenheit oder Abwesenheit von Essigsäureanhydrid behandelt und dann die erhaltenen Produkte mit Äthanol oder Wasser extrahiert und dann die wasserlöslichen Substanzen nach physikalisch-chemischen Methoden isoliert und reinigt.
  7. 7· Verfahren zur Herstellung des Extraktes nach Anspruch
    2, dadurch gekennzeichnet, daß man die von Lipiden befreiten Bakterienreste von Mycobacterien durch Homogenisierung in wässrigem Medium extrahiert und das erhaltene Produkt durch aufeinanderfolgende Aussalzung, Zentrifugierung, Dialyse und gegebenenfalls Chromatographie isoliert.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, daß Mycobacterium tuberculosis, var. hominis, Stamm Peurois, verwendet wird.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Homogenisierung im wässrigen Medium und Zentrifugierung zwei Aussalzungen mit Ammoniumsulfat mit jeweils anschließender Zentrifugierung, anschließende Dialyse des erhaltenen Uberstandes gegen destilliertes Wasser und Säulenchromatographie vornimmt und den aktiven wasserlöslichen Extrakt isoliert.
  10. 10. Verfahren zur Herstellung des Extraktes nach Anspruch
    3, dadurch gekennzeichnet, daß 'nan von Lipiden befreite Bakterienreste von Mycobacterien mit einem Gemisch von Pyridin und Essigsäureanhydrid behandelt, Äthylalkohol
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    zusetzt, die im Alkohol lösliche Fraktion in Wasser aufnimmt und den erhaltenen wasserlöslichen Extrakt isoliert und durch Chromatographie reinigt.
  11. 11. Verfahren zur Herstellung des Extraktes nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man von Lipiden befreite Bakterienreste von Mycobacterien mit Pyridin behandelt, Äthylalkohol zusetzt, die im Alkohol unlösliche Fraktion durch Homogenisierung im wässrigen Medium extrahiert und dann nach Zentrifugierung die wasserlösliche Fraktion zweimal mit Ammoniumsulfat jeweils mit anschließender Zentrifugierung aussalzt, den erhaltenen überstand gegen destilliertes Wasser dialysiert und schließlich den wasserlöslichen Extrakt durch Chromatographie isoliert und reinigt.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß Mycobacterium tuberculosis, var. hominis, Stamm H^7Ra5OdCr Mycobacterium tuberculosis, var. hominis, Stamm Test, verwendet wird.
  13. 13. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend wenigstens einen Extrakt nach Anspruch 2, 5 oder 4 und verträgliche Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe.
    309882/1312
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