CH650799A5 - Verfahren zur herstellung von lipopolysacchariden mit antitumoraktivitaet und immunotherapeutische mittel gegen tumore. - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung von Antitumor-Lipopolysaccharide und auf immunothera-peutische Mittel gegen Tumore, welche die Lipopolysaccha-ride als Wirkstoffe enthalten.
Vor kurzem wurden umfangreiche Versuche unternommen, um aus dem Zellkörper von verschiedenen Bakterien und bakteriellen Produkten Komponenten zu extrahieren, die wirksam sind zur Bekämpfung von Krebs. Besonders intensive Versuche wurden unternommen, um karzino-statische Mittel mit niedriger Toxizität herzustellen durch Extrahieren von Komponenten mit karzinostatischer Aktivität aus dem Zellkörper von Mycobacteria.
Darüberhinaus wurden ausgedehnte klinische Versuche unternommen zur Bekämpfung von Krebs unter Verwendung von Komponenten des BCG-Zellkörpers oder des Zellkörpers von anderen Mycobacteria als immunotherapeu-tische Mittel gegen verschiedene Krebsarten von Tieren. BCG-Zellkörper enthalten jedoch Komponenten, die Nebenwirkungen hervorrufen, ebenso wie wirksame Komponenten, und eine gesteigerte Verabreichung des Zellkörpers per se ist sehr gefährlich. Daher war es erwünscht, immuno-therapeutische Mittel zu entwickeln durch Entfernen der Komponenten, die Nebenwirkungen hervorrufen, aus dem Zellkörper, und die effektiven Komponenten allein selektiv zu extrahieren oder die Aktivität der wirksamen Komponenten durch Behandlung oder auf andere Weise zu steigern. So wurde eine Zellwandskelettkomponente von BCG entwik-kelt (siehe JP-AS veröffentlicht unter Nr. 28813/1979), Muramyldipeptid (JP-AS veröffentlicht unter den Nummern 156812/1977 und 98922/1978) und eine Glycolipid enthaltende langkettige Fettsäure in einer wachsähnlichen Substanz D (siehe JP-AS veröffentlicht unter den Nummern 3514/1978 und 28830/1979).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher die in den Ansprüchen 1,3 und 4 definierten Verfahren zur Herstellung der wirksamen Lipopolysaccharide.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die immunotherapeutischen Mittel gegen Tumore, welche die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen als Wirkstoffe enthalten.
Die Mittel haben den Vorteil, dass sie keine Nebenwirkungen aufweisen. Es wurde gefunden, dass, wenn der junge und schwache Zellkörper des menschlichen Tuberkelbazillus Mycobacterium tuberculosis, Stamm Aoyama B oder Mycobacterium tuberculosis, Stamm H37R.V (ATCC Nr. 25 618 vom 21. Januar 1970), extrahiert wird mit heissem Wasser und die gewonnene Lipopolysaccharidkomponente einer fraktionellen Reinigung unterworfen wird, Lipoarabinomannan erhalten wird, das eine Antitumor-Aktivität ohne Nebenwirkung hat. Es wurde ferner gefunden, dass wenn dieses Lipoarabinomannan oder lipidfreie Arabinomannan, erhalten durch Entfernen der Fettsäuren aus diesem Lipoarabinomannan durch Verseifung, chemisch modifiziert wird mit einer Fettsäure, ein chemisch modifiziertes Lipoarabinomannan erhalten wird, das vergleichbar oder besser ist als Lipoarabinomannan, das extrahiert und gereinigt wurde aus den Zellkörpern hinsichtlich der Antitumor-Aktivität, und dass dieses keine Nebenwirkung hat.
Die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen Mycobacterium tuberculosis, Stamm Aoyama B und Micro-bacterium tuberculosis, Stamm H37RV, waren vor dem Anmeldetag der Öffentlichkeit zugänglich. (H37RV: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology S. 683,8. Aufl; der Mikroorganismus kann bei ATCC bezogen werden ; Aoyama B: Jap. J. of Microbiol. 1976 Vol. 20 S. 183 - 190, J. surg. Onkol. 1977 Vol. 9 S. 359-370). Die Mikroorganismen sind im «General Catalogue of Cultures of Microorganisms main-tained in Japanese Collections, Higher Education & Science Bureau, Ministery of Education, Japan, Tokyo 1953» auf Seite 82 erwähnt.
Die Komponenten des immunotherapeutischen Mittels gegen Tumoren gemäss der Erfindung, das Verfahren zur Herstellung derselben und die therapeutischen Wirkungen werden nun im folgenden im einzelnen beschrieben unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Experimente.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wird das Verfahren zur Extraktion des Lipopolysaccharids beschrieben.
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
650799
(1-1) Ein Sauton-Kulturmedium wird beimpft mit Mycobacterium tuberculosis, Stamm Aoyama B, und 14 Tage aerob kultiviert. Der Zellkörper wird durch Filtration abgetrennt und mit kaltem Wasser gewaschen, und sodann wird zur Aufschlämmung des Zellkörpers in Wasser destilliertes 5 Wasser zugefügt. Die Zellkörperdispersion wird 120 min auf 100°C erwärmt und filtriert, wobei eine wässrige Lösung des Zellkörperextraktes erhalten wird. Dann wird Sulfosalicyl-säure zu der Lösung zugefügt, wobei die Proteinkomponente ausfällt, und die Lösung wird dann durch Zentrifugieren 10 getrennt. Die überstehende Lösung wird dialysiert unter Verwendung einer Dialysemembran, und die innere Flüssigkeit wird gemischt mit Äthylalkohol in einer Menge entsprechend dem 9fachen Volumen der inneren Flüssigkeit, und die Mischung wird durch Zentrifugieren abgetrennt und das aus- 15 gefallene rohe Lipopolysaccharid gewonnen.
Das rohe Lipopolysaccharid wird in destilliertem Wasser gelöst und gemischt mit der gleichen Menge Äthylalkohol und die Mischung durch Zentrifugieren getrennt. Die überstehende Lösung wird eingeengt und in einem Molekularsieb 20 behandelt, entsprechend einer hochwirksamen Flüssig-Chro-matographie unter Verwendung einer Kolonne, beschickt mit TSK Gel 4000 SW, TSK Gel 3000 S Wund TSK Gel 2000 SW, Produkte der Firma Toyo Soda K.K., und es wurde sodann eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 10 000- 2s 16 000 abgetrennt. Die Fraktion wurde dialysiert, konzentriert und weiter gereinigt durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Agarose-Beadconcanavalin A, ein Produkt der Firma E.Y. Laboratories, wobei ein gereinigtes Lipopolysaccharid erhalten wurde. 30
(1-2) Mycobacterium tuberculosis, Stamm H37Rvwird unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1-1 kultiviert. Der erhaltene Zellkörper wird in derselben Weise behandelt wie in Beispiel 1-1 beschrieben, wobei ein rohes Lipopolysaccharid erhalten wird, das gereinigt wird nach denselben 35 Verfahren wie in Beispiel 1-1 beschrieben, so dass ein gereinigtes Lipopolysaccharid erhalten wird.
Experiment 1
Im folgenden wird die Analyse der Monosaccharidkompo- 40 nenten des Lipopolysaccharids beschrieben.
(1-1) Das gereinigte Lipopolysaccharid, erhalten gemäss Beispiel 1-1, wird mit Schwefelsäure hydrolysiert, neutralisiert mit Amberlite 1R-45 (Hydroxylform) und identifiziert durch Dünnschichtchromatographie. Es wurden Arabinose, 45 Mannose und Glucose festgestellt (Arabinose : Mannose :
Glucose = 6:4: Spur). Das vorstehende durch Hydrolyse und Neutralisation erhaltene Produkt wird reduziert und ace-tyliert nach bekannten Verfahren und die erhaltene Alditol acetatmischung mittels Gaschromatographie bestimmt unter Verwendung von drei verschiedenen Arten von Kolonnen. Es wurde bestätigt, dass die Mischung besteht aus 61 mol % Arabinose, 38 mol % Mannose und 1 mol % Glucose. Daher ist bestätigt, dass die Saccaridkomponente dieses Lipopolysaccharids Arabinomannan ist.
(1-2) Die Monosaccharidkomponenten des gereinigten Lipopolysaccharids, erhalten gemäss Beispiel 1-2, werden in derselben Weise analysiert wie im Experiment 1-1 beschrieben. Auf diese Weise wurde festgestellt, dass die gereinigte Probe besteht aus 56 mol % Arabinose und 44 mol % Mannose. Auf diese Weise ist bestätigt, dass die Saccharidkompo-nente dieses Lipopolysaccharids Arabinomannan ist.
Experiment 2
Analyse der Saccharidkettenstruktur des Lipopolysaccharids.
(2-1) Das gereinigte Lipopolysaccharid, erhalten gemäss Beispiel 1-1, wird vollständig methyliert gemäss dem Verfahren von Hakomori, das methylierte Lipopolysaccharid wird dann hydrolysiert mit Schwefelsäure, neutralisiert mit Amberlite 1R-45 (Hydroxylform) und reduziert sowie acety-liert gemäss bekannten Verfahren. Die erhaltene teilweise methylierte Alditolacetatmischung wird mittels Gaschromatographie unter Verwendung von vier verschiedenen Arten von Kolonnen und einer SCOT Kapillarkolonne bestimmt. Die festgestellten Spitzen werden verglichen mit Spitzen von Standard-teilweise methylierten Alditol-Acetaten, die getrennt synthetisiert werden, und die entsprechende teilweise methylierte Saccharidkomponente wird identifiziert und bestimmt. Ferner wird die entsprechende Saccharidkomponente bestimmt und identifiziert aus Teilen der entsprechenden Spitzen von GC-MS.
In Tabelle 1 sind die quantitative Beziehung des teilweise methylierten Alditolacetats, bestimmt durch Gaschromatographie, und die Bindungen angegeben.
(2-2) Das gereinigte Lipopolysaccharid, erhalten gemäss Beispiel 1-2, wird in derselben Weise behandelt wie im Experiment 2-1 beschrieben. Das quantitative Verhältnis des teilweise methylierten Alditolacetats, bestimmt mittels Gaschromatographie, und die Bindungen sind in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 1
Festgestelltes Saccharid
Angegebene Bindung
Verhältnis von 2-O-Methylara-binose(= 1,0)
Mol %
Bemerkungen
2,3,5-Tri-O-methyl-D-arabinose
2,3-Di-O-methyl-D-arabinose
3,5-Di-O-methyl-D-arabinose
2-O-Methyl-D-arabinose
(Araf) 1 ■ 5 (Araf) 1 • 2 (Araf) 1
? (Araf) 1
1,2 8,0 1,4
1,0
6,2 41,0 7,2
5,1
59,5 mol %
2,3,4,6-Tetra-O-methyl-D-mannose (Manp) 1 — 2,5 12,8
3,4,6-Tri-O-methyl-D-mannose 2 (Manp) 1 — 1,2 6,1
2,3,4-Tri-O-methyl-D-mannose — 6 (Manp) 1 — 1,4 7,2
3,4-Di-O-methyl-D-mannose _^(Manp)l^ 2,8 14,4
40,5 mol %
Total
19,5
100
650799
4
Tabelle 2
Festgestelltes Saccharid
Angegebene Bindung
Verhältnis von 2-O-Methylara-binose(= 1,0)
Mol %
Bemerkungen
2,3,5-Tri-O-methyl-D-arabinose
2,3-Di-O-methyl-D-arabinose
3,5-Di-O-methyl-D-arabinose
2-O-Methyl-D-arabinose
(Araf) 1 5 (Araf) 1 • 2 (Araf) 1
^ (Araf) 1
0,9 12,4 2,3
1,0
3,0 41,5 7,7
3,3
55,5 mol %
2,3,4,6-Tetra-O-methyl-D-mannose (Manp) 1 — 2,8 9,4
3,4,6-Tri-O-methyl-D-mannose —■ 2 (Manp) 1 —• 2,7 9,0
2,3,4-Tri-O-methyl-D-mannose — 6 (Manp) 1 — 5,3 17,7
—^ 2
3,4-Di-O-methyl-D-mannose g (Manp) 1 -*■ 2,5 8,4
44,5 mol %
Experiment 3
Analyse der Fettsäuren in dem Lipopolysaccharid.
(3-1) Zu 1 mg des gereinigten Lipopolysaccharids, erhalten gemäss Beispiel 1-1, wird 1 ml Methylalkohol, enthaltend 100 ng Methyllaurat als interner Standard und 3,3 % Salzsäure zugefügt und die Mischung durch Methanolyse in einem verschlossenen Rohr, gefüllt mit Stickstoff, zersetzt. Die erhaltene Mischung wird bei niedriger Temperatur eingedampft und gelöst in Methylenchlorid. Durch Gaschromatographie unter Verwendung von zwei Arten von Kolonnen werden die Bestandteile der Fettsäuren identifiziert und bestimmt durch die Retentionszeit des Standard-Fettsäuremethylesters. Die Spitzen der entsprechenden Fettsäuremethylester werden identifiziert durch GC-MS.
Die Ergebnisse der gaschromatographischen Bestimmung sind in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 4
25
Methyllaurat
(interner Standard)
Methylmyristat
Methylpalmitat
Methylheptadecanoat
Methylstearat
Methyltubercurostearat
30
Total
35
(100 Llg)
6,6 (ig 27,2 x 10-9 mol 39,6 Hg 146,4 x 10"9mol 0,4 ^g l,4xl0~9mol 13,2 Hg 44,2 xlO-9 mol 19,8ji.g 63,4xl0_9mol
79,6 [ig 282,6 x 10~9mol
Tabelle 3
Methyllaurat
(interner Standard)
Methylmyristat
Methylpalmitat
Methylheptadecanoat
Methylstearat
Methyloleat
Methyltubercurostearat
(100 (ig)
10,4Hg 42,9xlO-9mol 89,5 Hg 330,9 x IO"9 mol 0,5 Hg 1,8 xlO"9 mol 37,3 Hg 125,0 x IO"9 mol 0,2 Hg 0,7 x IO'9mol 12,8Hg 41,0xlO"9mol
Total
150,7 Hg 542,3 x 10'9 mol
Durch die obigen Ergebnisse wird bestätigt, dass der Fettsäuregehalt der Lipopolysaccharidprobe ungefähr 15 Gew. % beträgt (150,7 Hg pro 1 mg Polysaccharid), und es ist anzunehmen, dass das Lipopolysaccharid (durchschnittliches Molekulargewicht 13 000), das gemäss Beispiel 1-1 erhalten wurde, ungefähr 7,6 Fettsäuren enthält (1950 Grammäquivalente).
(3-2) Das gereinigte Lipopolysaccharid, erhalten gemäss Beispiel 1-2, wird nach denselben Verfahren behandelt wie in Beispiel 3-1 beschrieben und auf diese Weise identifiziert und die Fettsäurekomponenten bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 4 angegeben.
Aus den obigen Ergebnissen geht hervor, dass der Fettsäuregehalt der Lipopolysaccharideprobe ungefähr 8 Gew. % 40 beträgt (79,6 Hg pro 1 mg Polysaccharid), und es ist anzunehmen, dass das Lipopolysaccharid (durchschnittliches Molekulargewicht 12,000), erhalten gemäss Beispiel 1-2, etwa 3,9 Fettsäuren enthält (1000 Grammäquivalente).
45
Experiment 4
Analyse der Struktur der Fettsäurebindung des Lipopolysaccharids so (4-1 ) Das gereinigte Lipopolysaccharid, erhalten gemäss Beispiel 1 -1, wird behandelt mit Methylvinyläther in Dime-thylsulfoxid in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure als Katalysator, um die freien Hydroxylgruppen zu methoxäthy-lieren. Die Fettsäuren werden entfernt durch Verseifung und ss die Hydroxylgruppen, die freigesetzt wurden, werden methy-liert gemäss dem Hakomoriverfahren. Dann werden die Me-thoxyäthylgruppen durch Hydrolyse entfernt unter Verwendung einer Säure enthaltend Methylalkohol, und durch Hydrolyse mit einer Säure wird eine teilweise methylierte so Monosaccharidmischung erhalten. Die Mischung wird reduziert und acetyliert gemäss bekannten Verfahren, und die Acetate werden mittels Gaschromatographie analysiert unter Verwendung von drei verschiedenen Arten von Kolonnen und Xylitol als interner Standard. Die Identifikation und 65 Bestimmung wird durchgeführt durch Vergleich mit den Standard Alditolacetaten der freien und teilweise methylierten Monosaccharide.
Die identifizierten Spitzen sind in Tabelle 5 angegeben.
.5
650799
Tabelle 5
5-Methyl-D-arabinitol
2-Methyl-D-arabinitol
3-Methyl-D-arabinitol D-Arabinitol
6,14 mol % 2,48 mol % 0,33 mol % 50,27 mol %
59,22 mol %
2-Methyl-D-mannitol 0,02 mol %
3- oder 4-Methyl-D-mannitol 0,22 mol % 6-Methyl-D-mannitol 1,04 mol % D-Mannitol 39,50 mol %
40,78 mol %
Total
100 mol % (einschliesslich 10,23 Gew.% Fettsäureester des Monosaccharids)
Bindungspositionen die 5- und 2-Position der Arabinoseein-heiten und die 6-Position der Mannoseinheiten sind.
Aus den Analyseergebnissen, erhalten in den Experimenten 1-2,2-2,3-2 und 4-2, kann entnommen werden, s dass das Lipopolysaccharid, erhalten gemäss Beispiel 1-2, ein Lipopolysaccharid ist, das ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 12 000 hat, das aus Arabinomannan besteht mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 11 000, zusammengesetzt aus etwa 42 Arabinoseein-10 heiten und etwa 34 Mannoseeinheiten und im Durchschnitt 4 oder 5 Fettsäuren mit 14-19 Kohlenstoffatomen (hauptsächlich Palmitinsäure), die an das Arabinomannan gebunden sind.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Lipopolysaccharids ls durch Binden einer Fettsäure an ein Polysaccharid ist bekannt. Gemäss der vorliegenden Erfindung kann durch Binden einer geeigneten Fettsäure an ein lipidfreies oder nie-driglipidhaltiges Arabinomannan nach diesem bekannten Verfahren ein für die Immunotherapie von Tumoren höher 20 wirksames Lipoarabinomannan hergestellt werden.
Aus den obigen experimentellen Ergebnissen geht hervor, dass ungefähr eine Fettsäure pro 10 Moleküle des zugrundeliegenden Monosaccharids gebunden ist, und die meisten der 25 Bindungspositionen die 5-Position der Arabinoseeinheiten und der Rest die 2-Position der Arabinoseeinheiten, die 6-Positionen der Mannoseeinheiten und andere Positionen sind.
Aus den Analyseergebnissen der Experimente 1-1,2-1,3—130 und 4-1 kann erwartet werden, dass das gemäss Beispiel 1-1 erhaltene Lipopolysaccharid ein solches ist, das ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 13 000 hat, das aus Arabinomannan besteht mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 11 000, zusammengesetzt aus etwa 47 35 Arabinoseeinheiten und etwa 30 Mannoseeinheiten und etwa 8 Fettsäuren mit 14-19 Kohlenstoffatomen (hauptsächlich Palmitinsäure), die an das Arabinomannan gebunden sind.
(4-2) Das gereinigte Lipopolysaccharid, erhalten gemäss Beispiel 1 -2, wird in derselben Weise behandelt wie in Expe- 40 riment 4-1 beschrieben. Die Spitzen des erhaltenen teilweise methylierten Alditolacetats werden in Tabelle 6 angegeben.
Tabelle 6
45
5-Methyl-D-arabinitol
2-Methyl-D-arabinitol
3-Methyl-D-arabinitol D-Arabinitol
3,29 mol % 1,60 mol% 0,03 mol % 50,57 mol %
55,49 mol %
50
2-Methyl-D-mannitol 0,01 mol %
3- oder 4-Methyl-D-mannitol 0,03 mol % 6-Meihyl-D-mannitol 1,00 mol % D-Mannitol 43,47 mol %
44,51 mol %
Total
100 mol % (einschliesslich 5,96 Gew.% Fettsäureester des Monosaccharids)
65
Aus den obigen experimentellen Ergebnissen geht hervor, dass ungefähr eine Fettsäure gebunden ist pro 16 Moleküle des zugrundeliegenden Monosaccharids, und die meisten der
Beispiel 2
(2-1) Dieses Beispiel beschreibt das Verfahren zur Herstellung von Lipoarabinomannan aus lipidfreiem Arabinomannan. Der in Beispiel 1-1 verwendete Zellkörper wird alkalisch extrahiert, und ein Arabinomannan mit einem Molekulargewicht von 8500 - 14 000 wird mittels Molekularsieb in derselben Weise hergestellt, wie beschrieben im Beispiel 1-1. Das auf diese Weise erhaltene Arabinomannan wird weiter gereinigt durch Affinitätschromatographie, getrocknet, und 10 mg des getrockneten Arabinomannans werden dann 20 h lang bei 50°C in N,N-Dimethylformamid-pyridin umgesetzt mit 10 mg Palmitinsäureanhydrid. Zu der Reaktionsmischung wird Äthyläther zugefügt und die Ausfällung durch Zentrifugieren abgetrennt, gewaschen mit Äthyläther und getrocknet, wobei 11 mg Lipoarabinomannan erhalten werden.
Durch Analyse wird bestätigt, dass die Saccharidketten-struktur des vorstehend erhaltenen Lipoarabinomannans im wesentlichen dieselbe ist wie diejenige bei den Experimenten
1-1 und 2-1. Insbesondere wurde bestätigt, dass Palmitinsäure hauptsächlich in 5 Stellung der Arabinoseeinheit in der Arabinomannankette gebunden ist in einer Menge von etwa 9,8 Gew. %, und dass das durchschnittliche Molekulargewicht etwa 12500 beträgt.
(2-2) Der in Beispiel 1-2 verwendete Zellkörper wird mit Alkali extrahiert, wobei Arabinomannan erhalten wird, das gereinigt wird in derselben Weise wie beschreiben in Beispiel
2-1.10 mg des getrockneten Arabinomannans wird umgesetzt mit 8 mg Palmitoylchlorid bei 37°C während 16 h in N,N-Dimethylformamid-Pyridin. Es wird Äthanol zu der Reaktionsmischung zugefügt und die Ausfällung durch Zentrifugalabtrennung gewonnen, gewaschen mit Äthyläther und getrocknet, wobei 10 mg Lipoarabinomannan erhalten werden.
Durch Analyse wurde bestätigt, dass die Saccharidketten-struktur des vorstehend erhaltenen Lipoarabinomannans im wesentlichen dieselbe ist wie die bei den Beispielen 1-2 und 2-2 festgestellten. Insbesondere wurde bestätigt, dass Palmitinsäure hauptsächlich in 5-Stellung der Arabinoseeinheiten der Arabinomannankette gebunden ist in einer Menge von ungefähr, 7,6 Gew. %, und dass das durchschnittliche Molekulargewicht etwa 12 000 beträgt.
Beispiel 3
Dieses Beispiel erläutert das Verfahren zur Herstellung von Lipoarabinomannan aus niedriglipidhaltigem Arabinomannan.
650799
6
(3-1)5 mg Arabinomannan mit einem Fettsäuregehalt von etwa 3 Gew. %, erhalten in derselben Weise wie in Beispiel 1-1 beschrieben, werden mittels Ultraschall behandelt mit 10 mg Palmitoylchlorid in Pyridin, wobei die Reaktion 18 h lang bei 37°C durchgeführt wird. Zu der Reaktionsmischung wird Äthylalkohol zugefügt, die Ausfällung abgetrennt, gewaschen mit Äthyläther und getrocknet, wobei 4,3 mg Lipoarabinomannan erhalten werden.
Durch Analyse wird bestätigt, dass die Saccharidketten-struktur im wesentlichen dieselbe ist wie bei den Experimenten 1-1 und 2-1. Insbesondere wurde bestätigt, dass die Palmitinsäure hauptsächlich in 5-Position der Arabinoseein-heit und in 6-Position der Mannoseeinheit der Arabinomannankette gebunden ist in einer Menge von etwa 28 Gew. %, und dass das durchschnittliche Molekulargewicht etwa 14 000 beträgt.
(3-2) 5 mg Arabinomannan mit einem Fettsäuregehalt von etwa 2 Gew. %, erhalten in derselben Weise wie in Beispiel 1 -2 beschrieben, wird durch Ultraschall behandelt mit 8 mg Palmitoylchlorid in Pyridin, und die Reaktion wird 18 h lang bei 37°C durchgeführt. Dann wird Äthylalkohol zu der Reaktionsmischung zugefügt und die Ausfällung abgetrennt, gewaschen mit Äthyläther und getrocknet, wobei 3,8 mg Lipoarabinomannan erhalten werden.
Durch Analyse wurde bestätigt, dass die Saccharidketten-struktur im wesentlichen dieselbe ist wie diejenige gemäss den Experimenten 1-2 und 2-2. Insbesondere wurde bestätigt, dass Palmitinsäure hauptsächlich in 5-Stellung der Arabinoseeinheiten und in 6-Stellung der Mannoseeinheiten der Arabinomannankette in einer Menge von ungefähr 18 Gew.% gebunden ist und das durchschnittliche Molekulargewicht ungefähr 13 500 beträgt.
In den Beispielen 2 oder 3 kann Stearinsäure anstelle von Palmitinsäure verwendet werden.
Experiment 5
Es wurde die Antitumor-Aktivität geprüft.
Bei ddY-Mäusen (weiblich, 10 Wochen alt), die sensitiviert waren mit BCG, wurden Zellen ( 1 x 106) des Sarcoma-180 Tumors subkutan transplantiert. Beginnend mit dem nächsten Tag wird das Lipoarabinomannan, angegeben in Tabelle 7, steril gelöst in einer physiologischen Salzlösung, hypoder-misch verabreicht an Gruppen von Mäusen, jede Gruppe bestehend aus 8 Mäusen, in einer Menge von 0,02 [ig bis 2,0 p,g pro Maus, sowie jeden darauffolgenden Tag 8mal. 30 Tage nach der Transplantation der Tumorzellen wurden die Testtiere getötet und die Tumorgewichte gemessen. Die Antitumor-Aktivität der Lipoarabinomannane wird ausgewertet, bezogen auf das festgestellte Tumorgewicht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben.
Tabelle 7
Gruppe
Verabreichte
Tumorgewicht± S.E. (g)
T/C(%)
Menge (p.g)
Kontrolle
2,71 ±0,32
100
ArMn-la)
0,02
2,54 ±0,43
93,7
ArMn-la)
0,2
1,78 ±0,26*
65,7
ArMn-la)
2,0
1,70 ±0,29*
62,7
Kontrolle
2,82 ±0,40
100
ArMn-2b>
0,02
1,90 ±0,52
67,4
ArMn-2«
0,2
1,62 ±0,24**
57,4
ArMn-2b)
2,0
1,74 ±0,25**
61,7
Tabelle 7 (Fortsetzung)
Gruppe
Verabreichte
Tumorgewicht± S.E. (g)
T/C(%)
Menge (ug)
Kontrolle
2,53 ±0,33
100
ArMn-3c)
0,02
1,87 ±0,40
73,9
ArMn-3c)
0,2
1,53 ±0,27*
60,5
ArMn-3c)
2,0
1,54 ±0,27*
60,9
Kontrolle
2,85 ±0,21
100
ArMn-4d)
0,02
1,52 ± 0,82**
53,3
ArMn-4d)
0,2
1,40±0,15**
49,1
ArMn-4d)
2,0
1,83 ±0,17**
64,2
Kontrolle
3,24 ±0,46
100
ArMn-5e)
0,02
2,21 ±0,22**
68,2
ArMn-5e)
0,2
1,63 ±0,21**
50,3
ArMn-5e)
2,0
1,77 ±0,24**
54,6
Kontrolle
3,12±0,32
100
ArMn-60
0,02
1,95 ±0,19**
62,5
ArMn-6°
0,2
1,51 ±0,14**
48,4
ArMn-6f)
2,0
1,80 ±0,20**
57,7
Kontrolle
3,35 ±0,34
100
ArMn-78)
0,02
2,34 ±0,22**
69,9
ArMn-7s)
0,2
1,49 ±0,36**
44,8
ArMn-7g)
2,0
1,67 ±0,34**
49,9
Bemerkungen:
a) Lipoarabinomannan, extrahiert und gereinigt nach dem Verfahren beschrieben in Beispiel 1-1 (Fettsäuregehalt = 3 Gew.%)
b) Lipoarabinomannan, extrahiert und gereinigt gemäss Beispiel 1-1 (Fettsäuregehalt = 15 Gew.%)
c) Lipoarabinomannan, hergestellt durch Binden von Palmitinsäure an das lipidfreie Arabinomannan mittels Esterbindungen gemäss Beispiel 2-1 (Palmitinsäuregehalt = 10 Gew.%)
d) Lipoarabinomannan, hergestellt durch Binden von Palmitinsäure an niedriglipidhaltiges Lipoarabinomannan mittels Esterbindungen gemäss Beispiel 3-1 (Palmitinsäuregehalt = 28 Gew.%)
e) Lipoarabinomannan, extrahiert und gereinigt gemäss Beispiel 1-2 (Fettsäuregehalt = 8 Gew.%)
f) Lipoarabinomannan wie gebildet durch Binden von Palmitinsäure an lipidfreies Arabinomannan durch eine Esterbindung in Beispiel 2-2 (Palmitinsäuregehalt = 7,6 Gew.%)
g) Lipoarabinomannan gebildet durch Binden von Palmitinsäure an niedriglipidhaltiges Lipoarabinomannan durch Esterbindung gemäss Beispiel 3-2 (Palmitinsäuregehalt = 18 Gew.%)
T/C (%): Das Verhältnis des Tumorgewichts in der Lipopolysaccharid-verab-reichten Gruppe zu dem Tumorgewicht in der Kontrollgruppe
* P <0,05
** P<0,01
Wie aus den Ergebnissen von Tabelle 7 hervorgeht, haben die Lipopolysaccharide gemäss der Erfindung, d.h. sowohl das Lipoarabinomannan, hergestellt durch Binden einer Fettsäure an ein lipidfreies oder niedriglipidhaltiges Arabinomannan, und das Lipoarabinomannan, extrahiert und gereinigt aus dem Zellkörper, einen grossen Hemmefekt auf das Wachstum des Tumors, wobei eine kleine Menge verabreicht wird. Das Arabinomannan mit einem höheren Fettsäuregehalt hat einen besonders hohen Antitumoreffekt bei Verabreichung einer geringen Menge.
Die Verabreichung des erfïndungsgemâssen Lipopolysaccharids als immunotherapeutisches Mittel beim Menschen erfolgt als hypodermische Injektion. In dem folgenden Bei-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
7 650 799
spiel wird die Herstellung einer hypodermischen Injektions- Der Zellkörper des Tuberkelbazillus oder der Extrakt des-
lösung beschrieben. selben, dessen Antitumor-Aktivität bestimmt wurde, ist eine
Mischung von komplizierten chemischen Verbindungen. Im
Beispiel 4 Gegensatz hierzu ist das Lipoarabinomannan gemäss der
1 mg Lipopolysaccharid gemäss der Erfindung (erhalten 5 Erfindung ein Lipopolysaccharid mit einer definierten gemäss Beispiel 1,2 oder 3) wird gelöst in einer geeigneten chemischen Zusammensetzung, die isoliert und gereinigt
Menge einer physiologischen Kochsalzlösung für eine Injek- wird. Darüberhinaus zeichnet sich das Lipopolysaccharid tion von 100 ml. Die Lösung wird hergestellt als hypoder- gemäss der Erfindung gegenüber dem Zellkörper dadurch mische Injektionslösung enthaltend 10 des Lipopoly- aus, dass Nebenwirkungen vermieden werden können,
saccharids gemäss bekannten Verfahren. Die Injektion wird io Daher ist das Lipopolysaccharid gemäss der vorliegenden
1- bis 3 mal pro Woche hypodermisch verabreicht (10-30 |j.g Erfindung ein wertvolles immunotherapeutisches Mittel als Lipopolysaccharid). gegen Tumoren.
B
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung eines gegen Tumore aktiven Lipopolysaccharides mit Arabinomannan als Polysaccharid und Fettsäuren, die durch Esterbindung an das Arabinomannan gebunden sind, wobei der Fettsäuregehalt in dem Lipopolysaccharid 1-28 Gew. % beträgt, dadurch gekennzeichnet, dass man den menschlichen Tuberkelbazillus Mycobacterium tuberculosis, Stamm Aoyama B oder Mycobacterium tuberculosis, Stamm H37R.V züchtet und der Zellkörper der erhaltenen Mikroorganismen einer Heisswasser-extraktion unterworfen wird, und das erhaltene Extrakt gereinigt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe Palmitinsäure, Myristinsäure, Stearinsäure, Tuberculostearin-säure, Heptadecansäure, Oleinsäure und Linolsäure, und das Lipopolysaccharid folgende Monosaccharid-Zusammenset-zung aufweist: 30-74 mol % Arabinose, 20-50 mol % Man-nose, 0-10 mol % Glucose und 0-13 mol % Galactose.
3. Verfahren zur Herstellung eines gegen Tumore aktiven Lipopolysaccharides mit Arabinomannan als Polysaccharid und Fettsäuren, die durch Esterbindung an das Arabinomannan gebunden sind, wobei der Fettsäuregehalt im Lipopolysaccharid 1-28 Gew. % beträgt, dadurch gekennzeichnet, dass der menschliche Tuberkelbazillus, Mycobacterium tuberculosis, Stamm Aoyama B oder Mycobacterium tuberculosis, Stamm H37R.V gezüchtet wird, die Zellkörper der erhaltenen Mikroorganismen alkalisch extrahiert werden, das erhaltene Arabinomannan-Polysaccharid enthaltende Extrakt gereinigt und das erhaltene Polysaccharid mit Fettsäuren verestert wird.
4. Verfahren zur Herstellung eines gegen Tumore aktiven Lipopolysaccharides mit Arabinomannan als Polysaccharid und Fettsäuren, die durch Esterbindung an das Arbabino-mannan gebunden sind, wobei der Fettsäuregehalt im Lipopolysaccharid 1 bis 28 Gew. % beträgt, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 ein Lipopolysaccharid herstellt und das erhaltene Lipopolysaccharid mit zusätzlichen Fettsäuren verestert.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe Palmitinsäure und Stearinsäure, und dass das erhaltene Lipopolysaccharid folgende Monosaccharid-Zusammensetzung aufweist: 30-74 mol % Arabinose, 20-50 mol % Mannose, 0-10 mol % Glucose und 0-13 mol % Galactose.
6. Gegen Tumore aktives Lipopolysaccharid, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.
7. Gegen Tumore aktives Lipopolysaccharid, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 3.
8. Gegen Tumore aktives Lipopolysaccharid, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 4.
9. Immunotherapeutisches Antitumormittel, dadurch gekennzeichnet, dass es als aktive Komponente ein Lipopolysaccharid, gemäss einem der Ansprüche 6,7 oder 8 enthält.
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