DE3407823C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft ein Lipopolysaccharid mit den Merkmalen des Anspruches 1, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Es ist bekannt, daß aus den Zellwänden von Bakterien, z. B. Mycobacterium tuberculosis bzw. Mycobacterium govis BCG extrahierte Lipopolysaccharide, auch solche, die Arabinose und Mannose enthalten, vielfältige physiologische Wirkungen (Antitumorwirkung, Beeinflussung des Immunsystems u. ä.) zeigen. Die nach den bekannten Methoden gewonnenen Lipopolysaccharide weisen jedoch verhältnismäßig starke Nebenwirkungen auf.
Die Bemühungen sind deshalb darauf gerichtet, Bakterien aufzufinden, aus denen sich Lipopolysaccharide nicht nur effektiv, sondern auch in solcher Form gewinnen lassen, daß sie bei therapeutischer Verwendung keine unerwünschten Nebenwirkungen hervorrufen. In diesem Zusammenhang sind Bakterien der Gattungen Mycobacterium, Propionibacterium und Nocardia untersucht worden. Hierbei wurden verschiedene physiologisch wirksame Komponenten isoliert und gereinigt. Weitere Untersuchungen waren darauf gerichtet, durch Modifizierung dieser Komponenten Substanzen mit gesteigerter Wirksamkeit herzustellen. Beispielsweise wurden eine Zellwand-Gerüstkomponente (vgl. offengelegte japanische PA 28 813/1979), Muramyldipeptid (vgl. offengelegte japanische PA 1 56 812/1977), ein modifiziertes Produkt dieses Dipeptids (vgl. offengelegte japanische PA 98 922/1978), ein eine langkettige Fettsäure enthaltendes Glycolipid (vgl. offengelegte japanische PA 28 830/1979) und ein Heißwasser-Extrakt (vgl. japanische Patente Nos. 6 393/1961 und 43 842/1973) dargestellt.
Ferner wurde in jüngerer Zeit ein Lipopolysaccharid beschrieben, welches durch Reinigung eines Heißwasser- Extrakts von Zellkörpern des menschlichen Tuberkelbazillus erhalten wurde, sowie ein synthetisches Lipopolysaccharid, welches durch Kuppeln dieses Lipopolysaccharids mit einer Fettsäure über eine Esterverbindung entsteht (vgl. offengelegte japanische PA 8 320/1981).
Die nach dem bekannten Verfahren erhaltenen Wirkstoffe konnten jedoch nicht befriedigen, vor allem was das Auftreten von Nebenwirkungen anbetrifft.
Der Erfindung liegt hiernach die Aufgabe zugrunde, ein für die Immunisierung, zur Tumorbekämpfung und Zellverjüngung einsetzbares Lipopolysaccharid zur Verfügung zu stellen, das die den bekannten Lipopolysacchariden anhaftenden Nebenwirkungen nicht mehr aufweist. Im Rahmen dieser Aufgabe werden aus Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis Stamm Aoyama B (menschlicher Tuberkelbazillus), Mycobacterium bovis (Rindertuberkelbazillus) und Propionibacterium acnes (nichtpathogener anaerober Bazillus) gewonnene Produkte untersucht. Hierbei wurde festgestellt, daß bei Verwendung eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels in dem Medium zur Extraktion von Zellen dieser Bakterien diejenigen Substanzen leicht abgetrennt werden können, welche für die bisher beobachteten Nebenwirkungen verantwortlich sind. Die Lösung der Erfindungsaufgabe besteht hiernach in den im Kennzeichen des Anspruches 1 angegebenen Merkmalen und Maßnahmen.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Lipopolysaccharids wird nachfolgend im einzelnen beschrieben.
Ein Zellkörper, der durch Kultivieren von Actinomyces und/ oder einem verwandten Bakterium in einem entsprechenden Kulturmedium aerobisch oder anaerobisch erhalten wurde, wird durch Filtrieren unter Verwendung eines Zellentfernungs- Filters oder durch Zentrifugaltrennung gesammelt und die gesammelten Zellen werden in destilliertem Wasser erneut suspendiert. Die Suspension wird durch Erhitzen sterilisiert und die toten Zellen werden erneut durch Filtrieren oder Zentrifugaltrennung gesammelt. Die gesammelten toten Zellen werden in einer wäßrigen Lösung eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels, wie Triton X-100® (Polyoxyethylen-tert.-octylphenyläther) bei Raumtemperatur gerührt. Dabei wird durch Filtrieren oder Zentrifugaltrennung ein Extrakt erhalten. Diesem wird ein geeignetes organisches Lösungsmittel zugesetzt, um ein rohes Lipopolysaccharid auszufällen, das anschließend in einer wäßrigen Lösung eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels, wie Triton X-100® gelöst wird. Die Lösung wird durch eine Säule mit einem geeigneten Anionenaustauscherharz geschickt, um saure Komponenten durch Adsorption zu entfernen. Da es sich bei dem Lipopolysaccharid um eine Substanz mit hohem Molekulargewicht handelt, kann mittels einer Molekularsieb- Kolonne, wie Bio-Gel A-5m® eine das Lipopolysaccharid enthaltende Fraktion gewonnen werden. Diese wird vermittels einer Dialysemembran dialysiert, die interne Flüssigkeit mit α-Amylase, Amylo-glucosidase oder Proteinase behandelt und erhitzt, um das Enzym auszufällen, und die überstehende Flüssigkeit dialysiert, entsalzt und gefriergetrocknet, um schließlich das gereinigte Lipopolysaccharid zu gewinnen.
Jeder beliebige Mikroorganismus, der als "Part 17, Actiomycetes and Related Organisms" in Bergey's Manual, Auflage 1974, klassifiziert worden ist, kann als Ausgangsbakterium für die Zwecke der Erfindung verwendet werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Zellen können mit Hilfe eines mechanischen Verfahrens unter Verwendung eines Ultraschallwellen-Generators oder einer French-Presse pulverisiert oder mit einem organischen Lösungsmittel entfettet werden.
Das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid ist ein weißes oder grau-weißes Pulver. Es wird in verdünntem Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst, um eine milchig-weiße Lösung zu bilden, ist jedoch in einem organischen Lösungsmittel unlöslich. Es enthält ein Polysaccharid, mit D-Arabinose und D-Mannose als Hauptbestandteil und Fettsäuren mit 14 bis 19 Kohlenstoffatomen, die mit dem Polysaccharid über eine Esterbindung verknüpft sind. Dabei liegen die D-Arabinose und D-Mannose in einem bestimmten Verhältnis zueinander vor (vgl. Anspruch 1).
Das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid besitzt vermutlich eine hydrophobe Micellen-Struktur und verhält sich bei den verschiedenen Methoden zur Bestimmung des Molekulargewichts als eine Substanz mit sehr hohem Molekulargewicht.
Das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid kann auch mittels einer wäßrigen Lösung von Alkali oder einer Alkali-Pufferlösung extrahiert werden.
Die bei den Untersuchungen der physiologischen Wirkungen des erfindungsgemäßen Lipopolysaccharids, wie Antitumoraktivität, Zellverjüngungsaktivität, Antikörpererzeugungs- Beschleunigungsaktivität und Phagocytenaktivierungsaktivität, gewonnenen Ergebnisse werden anschließend im einzelnen beschrieben. Hierbei wurden die in den Beispielen 1, 2 und 3 beschriebenen Lipopolysaccharide eingesetzt. Zur Kontrolle diente eine physiologische Kochsalzlösung.
Bei den nachfolgend beschriebenen Antitumor-Wirsamkeitstests wird der Index durch die Wirkung des erfindungsgemäßen Lipopolysaccharids auf die Verlängerung der Lebensdauer einer cancerösen Maus dargestellt.
8 Wochen alte männliche Mäuse der Art BALB/c mit einem Körpergewicht von 24,5±1,0 g wurden als Untersuchungstiere eingesetzt und die Bauchfellhöhle jeder Maus wurde mit 1 × 10⁵ Zellen von Meth A Ascites-Tumor inokuliert. Die Mäuse wurden in Gruppen eingeteilt, wovon jede aus 10 Mäusen bestand. Im Anschluß an den nächsten Tag wurde die Probensubstanz in die Bauchfellhöhle einmal am Tag für einen Zeitraum von 7 Tagen verabfolgt. Der T/C-Wert wurde aus der mittleren Überlebenszeit gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
In der Kontrollgruppe wurden 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung in die Bauchfellhöhle nach dem gleichen Schema, wie es oben beschrieben wurde, verabfolgt.
Der Test wurde am 60. Tag beendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt, aus der bestätigt wird, daß das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid einen großen Lebensverlängerungs-Effekt auf cancerogene Mäuse mit dem oben erwähnten Tumor besitzt.
Tabelle 1
Bestimmung der Antitumor-Wirksamkeit durch die Verlängerung des Lebens von cancerösen Mäusen
Die Ergebnisse des Antitumor-Wirkungstests unter Verwendung des Tumor-Verbreitungsverhinderungseffekts als ein Index werden nun beschrieben.
8 Wochen alte weibliche Mäuse des Typs C57BL/6 mit einem Körpergewicht von 20,1±1,1 g wurden als Testtiere verwendet und jede Maus wurde unter die Haut im Inguinalbereich mit 1 × 10⁵ Zellen des durch Methylcholanthren induzierten Tumors MC-1 inokuliert. Die Mäuse wurden in Gruppen eingeteilt, wobei jede Gruppe aus 10 Mäusen bestand. Vom 10. Tag nach der Inokulierung wurde die Probensubstanz in die Bauchfellhöhle einmal pro Tag alle 4 Tage verabfolgt. Am 21. Tag wurde die Größe des Tumors (Länge × Breite, mm²) mittels einer Anzeigen-Tastvorrichtung gemessen und der Tumor-Verbreitungsverhinderungseffekt wurde berechnet auf der Basis des T/C-Wertes, der nach der folgenden Gleichung berechnet wurde:
Jede Probensubstanz wurde steril als eine Lösung in 0,2 ml physiologischer Kochsalzslösung verabfolgt. In der Kontrollgruppe wurde eine physiologische Kochsalzlösung in einer Menge von 0,2 ml pro Maus nach demselben Schema, wie es oben beschrieben wurde, verabfolgt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt, aus der bestätigt wurde, daß das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid eine hohe Verbreitungsverhinderungs-Wirksamkeit gegenüber dem oben erwähnten Tumor bei Mäusen aufweist.
Tabelle 2
Messung der Antitumor-Wirksamkeit durch Inhibierung der Verbreitung des Tumors
Die Ergebnisse des Tests zur Zellverjüngungsaktivität (cell juvenescent activity) werden nachfolgend beschrieben.
Normale Milzzellen von 8 Wochen alten weiblichen Mäusen des Typs C57BL/6 gesammelt und zusammen kultiviert mit 100 µg des Lipopolysaccharids nach Beispiel 1, 2 oder 3. Die Aufnahmemenge von ³H-Thymidin durch die Zellen wurde gemessen und die Zellaktivierungs-Wirkung des Lipopolysaccharids wurde berechnet. In der Kontrolle wurden Zellen zusammen mit der entsprechenden Menge physiologischer Kochsalzlösung kultiviert. In jeder Testgruppe wurde der Test durchgeführt, indem Zellen von einem Tier gesammelt wurden, und der Test wurde an fünf Tieren wiederholt.
Die erhaltenen Testergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben, aus der bestätigt worden ist, daß das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid die Aufnahmemenge von Thymidin durch Mäuse-Milzzellen hervorragend steigert und Zellaktivierungs- und Verjüngungswirkungen aufweist.
Zellverjüngungs-Wirksamkeit
Probensubstanz
Aufnahmemenge von ³H-Thymidin (c.p.m.)
Kontrolle (physiologische Kochsalzlösung)
8298±201
Lipopolysaccharid nach Beispiel 1 66 139±5379
Lipopolysaccharid nach Beispiel 2 43 271±2110
Lipopolysaccharid nach Beispiel 3 76 045±4998
Die Ergebnisse des Tests zur Antikörperbildungs-Steigerungswirksamkeit werden nachfolgend beschrieben.
Die Probensubstanz (100 µg) nach Beispiel 1, 2 oder 3 wurde zusammen mit 10⁸ roten Blutkörperchen von Schafen (SRBC) in die Schwanzenden-Vene von 8 Wochen alten weiblichen Mäusen des Typs C57BL/6 verabfolgt (jede Gruppe bestand aus 5 Mäusen) und die Milz wurde nach 4 Tagen herausgenommen. Die Anzahl der Anti-SRBC-Plaque bildenden Zellen (PFC) wurde nach der Methode von Cunningham und Sjenberg gezählt und mit derjenigen der Kontrollgruppe verglichen. Der Ansprech-Index wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt, aus der bestätigt wurde, daß das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid eine Substanz ist, die deutlich die Erzeugung eines Antikörpers zu SRBC steigert und an der Einstellung der Immunität Anteil hat.
Tabelle 4
Einflüsse auf die Erzeugung des Antikörpers zu roten Blutkörperchen von Schafen
Die Ergebnisse des Tests zur Phagocyten-Aktivierungswirkung sind nachfolgend beschrieben.
Die in Beispiel 1, 2 oder 3 erhaltene Probensubstanz wurde in die Bauchfellhöhle von 8 Wochen alten männlichen Mäusen der Art BALB/c verabfolgt (100 µg in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung) und nach 2 Tagen wurde das peritoneale Ödem herausgenommen. Sodann wurden 10³ Tumor-Meth A- Zellen pro 2 × 10⁴ an einem Kunststoff-Tisch anhaftenden Zellen in den peritonealen Zellen zugefügt und die Kultivierung wurde für 24 Stunden in einem zu Rinderembryo- Serum zugegeben und die Kultivierung wurde 16 Stunden fortgesetzt. Die Wirkung der aktivierten Macrophage auf die Tumorzellen wurde berechnet auf der Grundlage der Aufnahmemenge von ³H-Thymidin und die Macrophagen-Aktivierungswirkung der Probensubstanz wurde berechnet auf der Basis dieser Wirkung. Die Mäuse wurden in Gruppen eingeteilt, wobei jede Gruppe aus 10 Mäusen bestand, und in der Kontrollgruppe wurde 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung anstelle der Probensubstanz verabfolgt. Das Aktivierungsverhältnis wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt, aus der bestätigt wurde, daß das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid eine Substanz ist, die die Aktivierung der Mäuse-Macrophage unterstützt.
Inhibierungseffekt bezüglich der Verbreitung von Tumorzellen durch Macrophagen
Probensubstanz
Aktivierungsverhältnis (%)
Lipopolysaccharid nach Beispiel 1
82,6
Lipopolysaccharid nach Beispiel 2 77,3
Lipopolysaccharid nach Beispiel 3 89,4
Wenn das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid in die Bauchfellhöhlen von weiblichen Mäusen der Art C57BL/6 und männlichen Mäusen der Art BALB/c in Dosen von 5 g/kg/Tag nacheinander für 7 Tage verabfolgt wurde, war keine Änderung in den Testtieren bewirkt worden, und es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid sehr gering toxisch ist.
Das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid ist gegenüber Actinomyceten und verwandten Bakterien inhärent und umfaßt ein Polysaccharid, welches D-Arabinose und D-Mannose als Hauptbestandteil enthält, und eine Fettsäure, die hauptsächlich aus Palmitinsäure und Tuberculostearinsäure zusammengesetzt ist, die mit dem Polysaccharid durch eine Esterbindung verbunden ist. Wie sich aus den voranstehenden Testergebnissen ergibt, ist das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid ausgezeichnet in seiner Antitumor- Wirkung, seiner Zellverjüngungs-Wirkung und seiner Immunisierungs- Wirkung. Dieses Lipopolysaccharid ist deswegen wertvoll, weil es keine Nebeneffekte zeigt, die in Bezug auf die Zellen per se inhärent sind. Demzufolge wird erwartet, daß das erfindungsgemäße Lipopolysaccharid als ein immunotherapeutisches Mittel für Tumore oder als ein Immunisierungsmittel verwendet werden wird.
Ferner kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren das oben erwähnten Lipopolysaccharid in effizienter Weise durch einen einfachen Vorgang unter Verwendung eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels erhalten werden. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren hervorragend als ein industrielles Verfahren geeignet.
Nachfolgend wird die Erfindung in Einzelheiten unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die den Umfang der Erfindung in keiner Weise beschränken, beschrieben.
Beispiel 1
Das Mycobacterium tuberculosis Stamm Aoyama B wurde in Sauton's Medium für 5 Wochen kultiviert und die Zellen wurden durch Filtrieren gewonnen, mit Wasser gewaschen und in destilliertem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde erhitzt und bei 100°C für 20 Minuten sterilisiert. Die toten Zellen wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und einer 1,5%igen wäßrigen Lösung von Triton X-100® (etwa das 5fache des Gewichts der nassen Zellen) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Die Zentrifugaltrennung wurde unter 196,2 N für eine Zeit von 20 Minuten durchgeführt, der Überstand wurde durch eine Dialysemembran dialysiert und Ethylalkohol wurde der internen Flüssigkeit in einer Menge, die etwa dem 9fachen des Volumens der internen Flüssigkeit entsprach, zugegeben. Das Gemisch wurde gerührt und die Zentrifugaltrennung wurde unter 49 N für einen Zeitraum von 10 Minuten durchgeführt. Der Niederschlag wurde gesammelt und mit Ethylalkohol und anschließend mit Ethylether gewaschen, um ein rohes Lipopolysaccharid zu erhalten. Dieses rohe Lipopolysaccharid wurde in einer 50 mM Lösung von NaCl gelöst und die Lösung wurde auf eine Molekularsieb-Säule gegeben (beispielsweise Bio-Gel A-5m®), die mit einer 50 mM Lösung von NaCl äquilibriert worden war. Die Eluierung wurde mit der gleichen Lösung durchgeführt, um eine milchig-weiße Fraktion, die durch das Molekularsieb entfernt wurde, zu sammeln. Die Fraktion wurde in fließendem Wasser unter Verwendung einer Dialysemembran über Nacht dialysiert und die interne Flüssigkeit wurde mit α-Amylase und anschließend mit Amyloglucosidase behandelt. Die Lösung wurde erneut dialysiert, entsalzen und gefriergetrocknet, um ein Lipopolysaccharid zu erhalten. Die Ausbeute betrug etwa 0,1% auf der Basis der nassen Zellen. Aus den Analysenergebnissen wurde gefunden, daß diese Substanz ein Lipopolysaccharid war, welches 56% eines Polysaccharids, das als Bestandteils- Saccharide D-Arabinose und D-Mannose in einem Verhältnis von 1 : 4 enthielt, und 44% einer Fettsäure-Komponente, die sich hauptsächlich aus gesättigten Fettsäuren mit 16, 18 und 19 Kohlenstoffatomen zusammensetzte, umfaßte.
Beispiel 2
Das Mycobacterium bovis BCG wurde in Sauton's Medium für eine Zeit von 4 Wochen kultiviert und die erhaltenen Zellen wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet und mit Ether- Ethanol (1 : 1, v/v) und anschließend mit Chloroform-Methanol (1 : 1, v/v) entfettet. Sodann wurden die Zellen 20 Minuten in destilliertem Wasser auf 100°C erhitzt und durch Filtrieren rückgewonnen. Die rückgewonnenen Zellen wurden mit den gleichen Verfahrensschritten, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurden, behandelt, um ein Lipopolysaccharid zu erhalten. Die Ausbeute lag bei etwa 1% auf der Basis der trockenen Zellen. Aus den Ergebnissen der Analyse wurde gefunden, daß die Substanz ein Lipopolysaccharid war, welches 59% eines Polysaccharids, das als Hauptbestandteil die Saccharide D-Arabinose und D-Mannose in einem Verhältnis von 1 : 4 enthielt, und 41% einer Fettsäurekomponente, die sich hauptsächlich aus gesättigten Fettsäuren mit 16, 18 und 19 Kohlenstoffatomen zusammensetzte, umfaßte.
Beispiel 3
Das Propionibacterium acnes C-7 wurde anaerob in einem GAM-Brühmedium für 4 Tage gemäß der stationären Kultivierungsmethode kultiviert. Die durch Zentrifugalabtrennung gewonnenen Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzslösung gewaschen, mittels einer French-Presse pulverisiert und einer Zentrifugaltrennung unterworfen. Die pulverisierten Zellen wurden in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde, behandelt, um ein Lipopolysaccharid zu erhalten. Die Ausbeute betrug 0,2% auf der Basis des Gewichtes der nassen Zellen. Aus den Ergebnissen der Analyse wurde gefunden, daß das Lipopolysaccharid 60% eines Polysaccharids umfaßt, das D-Arabinose und D-Mannose in einem Verhältnis von 1 : 3 und 40% einer Fettsäurekomponente, die hauptsächlich Fettsäuren mit 15 bis 18 Kohlenstoffatomen enthält, aufweist.
Eine Kultur des Mycobacterium tuberculosis Stamm Aoyama B ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt worden und ist der ständigen Sammlung unter der Nummer ATCC No. 31 726 zugefügt worden.
Eine Kultur des Mycobacterium bovis Stamm BCG ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt worden und ist der ständigen Sammlung unter der Nummer ATCC No. 19 015 zugefügt worden.
Eine Kultur des Propionibacterium acnes C-7 (gesammelt und aufbewahrt in der medizinischen Fakultät, Gifu Univ., Gifu, Japan) ist die gleiche Kultur, die in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, als ATCC No. 11 827 hinterlegt wurde.

Claims (2)

1. Lipopolysaccharid, das neben Fettsäuren ein Polysaccharid enthält, dessen Hauptbestandteil aus D-Mannose und D-Arabinose gebildet ist, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Kultivierung von Myco- oder Propionibakterien oder Actinomyces gewonnene Zellen mit einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel extrahiert werden und der Extrakt mit einem Molekularsieb gereinigt wird und welches einen Fettsäureanteil von 37 bis 47%, der sich hauptsächlich aus Fettsäuren mit 14 bis 19 Kohlenstoffatomen zusammensetzt, und einen Polysaccharidanteil von 53 bis 63% enthält, wobei 3 bis 4 Moleküle D-Mannose auf 1 Molekül D-Arabinose entfallen.
2. Verfahren zur Herstellung eines Lipopolysaccharids, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Kultivierung von Myco- oder Propionibakterien oder Actinomyces gewonnene Zellen mit einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel extrahiert werden und der Extrakt mit einem Molekularsieb gereinigt wird.
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