DE69813137T2

DE69813137T2 - Pflanzenextrakt, verfahren zu dessen herstellung und seine verwendungen in der human- und tiermedizin

Info

Publication number: DE69813137T2
Application number: DE69813137T
Authority: DE
Inventors: Jean Hubert GILLESSEN
Original assignee: FEVA N V; Feva Nv
Current assignee: FEVA N V; Feva Nv
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2018-04-17
Also published as: JP2000503684A; WO1998046244A1; NO318787B1; DE69813137D1; NO985906D0; NO985906L; PT912191E; CN1226831A; EP0912191A1; AU6856498A; CA2258501C; EP0912191B1; KR20000016714A; ES2191296T3; BR9804850A; ATE236648T1; CA2258501A1; DK0912191T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pflanzenextrakte, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Anwendung in der Biotechnologie und Therapie, insbesondere aufgrund ihrer Aktivität als zellwachstums- und wachstum hemmender Faktor.
Pflanzen besitzen oft unerwartete therapeutische Eigenschaften oder Bestandteile, die als solche aktiv sind. Besonders für die Behandlung von Erkrankungen, die schwer zu behandeln sind, wie etwa Krebs und dergleichen, sind Pflanzen eine potentielle Quelle für Medikamente.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist nunmehr unerwarteterweise festgestellt. worden, daß Extrakte, die biologisch aktiv sind, aus Pflanzen hergestellt werden können, insbesondere aus Gemüsepflanzen, die Glucid, Protein, Glycoprotein und Terpen enthalten. Für diesen Zweck können solche Gemüsepflanzen verwendet werden wie Kartoffeln, Rettich, Rübe, Bete, Karotte, Jerusalem-Artischocke, Süßkartoffel, Raps, Gurke, Kürbis, Zucchini, Tomate und dergleichen. Diese Liste ist nicht erschöpfend.
Die Extrakte gemäß der Erfindung werden gemäß den folgenden aufeinanderfolgenden Phasen hergestellt:

– Pressen der ausgewählten Pflanzen zu Brei;
– kalte oder heiße Behandlung des erhaltenen Breis in einem wäßrigen oder organischen Lösungsmittel;
– Verdampfen des Lösungsmittels, bis ein festgelegter Konzentrationsgrad erreicht ist;
– fakultativ weitere Reinigung des so erhaltenen Extraktes mit einem oder mehreren der folgenden Verfahren, wie etwa Thermokoagulation, Reinigung mit Ammoniumsulfat, Ausfällung, Chromatographie auf Gel oder Ionenaustauschharz.

Ein Extraktionsverfahren, das es möglich macht, drei Fraktionen mit einer bestimmten Aktivität zu erhalten, ist bereits in der französischen Patentanmeldung FR-A-2 732 347 im Namen der Firma BIO MEDIA beschrieben worden.
Gemäß der Erfindung werden die Extrakte noch weiter gereinigt, was zu 16 Molekülen des Typs Glucid, Protein, Glycoprotein, Terpen und Peptid mit Molekulargewichten von 5.000, 7.500, 10.000, 12.000, 15.000, 20.000, 30.000, 40.000, 65.000, 82.000, 105.000, 130.000, 180.000, 200.000, 220.000, 250.000 Daltons geführt hat. Alle diese Moleküle sind in Wasser leicht löslich.
Diese Moleküle können erhalten werden durch weitere Reinigung des Extraktes mit Chromatographie auf Q-Hyper-DTM20-Gel. 11 Moleküle werden hierdurch erhalten, die bei 0,09 M, 0,15 M, 0,21 M, 0,25 M, 0,32 M, 0,45 M, 0,52 M, 0,70 M, 0,78 M, 0,85 M, 1,02 M NaCl eluieren.
Im Eluat der Säule finden sich die niedermolekularen Bestandteile, die weiter durch Chromatographie auf einer zweiten Säule gereinigt werden können, die auf QMA-Gel beruht. Fünf Fraktionen wurden bei 0,05 M, 0,08 M, 0,12 M, 0,20 M und 0,27 M NaCl eluiert.
Von den 16 verschiedenen Bestandteilen, die auf diese Weise erhalten wurden, wurde die Aktivität bestimmt, wie in den Beispielen beschrieben.
Die toxikologischen und pharmakologischen Untersuchungen, die in den Beispielen beschrieben sind, zeigen das Fehlen von Toxizität der Verbindungen gemäß der Erfindung sowie deren signifikante Eigenschaften.
Die 14 Moleküle mit mitogener Aktivität gemäß der Erfindung können jeweils als solche oder in unterschiedlichen Konzentrationen für unterschiedliche Zwecke verwendet werden, wie etwa für die Herstellung von Kulturmedien für Forschung und Diagnose, für die Herstellung von Molekülen und Impfstoffen für therapeutische Verwendung für Human- oder Tiermedizin oder für kosmetische Verwendung.
Die fünf Moleküle, die die Vermehrung von Mikroorganismen stimulieren, können mit Vorteil auf dem Gebiet von Fermentationskulturmedien, für die Herstellung von Mikroorganismen oder von Molekülen für Human- und Tiertherapeutika, Kosmetika oder das Agrobusiness verwendet werden.
Die drei Moleküle, die eine Wirkung auf den Stoffwechsel haben, sollen vorteilhafterweise in Human- und Tiermedizin im Falle von Gewichtsmangel oder Wachstumsproblemen verabreicht werden, oder für bakteriologische Diagnostika.
Die zwei Moleküle, die zellinhibierende Aktivität haben, sollen vorteilhafterweise aufgrund ihrer cytostatischen Kapazität als Antitumormittel und Antikrebsmittel verabreicht werden.
Die Erfindung wird in den folgenden nicht-beschränkenden Beispielen weiter veranschaulicht werden.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Isolierung von aktiven Substanzen
1.000 Gramm eines frischen, gesunden Kürbis werden zerdrückt, um ein feines Püree zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene Püree wird für zwei Stunden mit 500 Gramm kaltem Wasser behandelt. Die erhaltene Paste (E1) wird anschließend entweder zentrifugiert oder filtriert, um den Brei (E2) zusammeln.
Der so erhaltene Extrakt wird anschließend durch Thermokoagulation in Gegenwart von Alkohol, Caprylsäure, Essigsäure und Ammoniumsulfat gereinigt. Nach Zentrifugation wird der Überstand gewonnen und anschließend einer Ultrafiltration unterworfen, um partikuläre Salze zu eliminieren und die richtige Filtratkonzentration zu erhalten.
Mit chromatographischer Reinigung auf Q-Hyper-DTM20-Gel des so erhaltenen Konzentrats werden 11 Moleküle erhalten, die bei 0,09 M, 0,15 M, 0,21 M, 0,25 M, 0,32 M, 0,45 M, 0,52 M; 0,70 M, 0,78 M, 0,85 M, 1,02 M NaCl eluieren. Im folgenden wird Bezug genommen werden auf die unterschiedlichen Fraktionen auf der Grundlage der Konzentration, bei der sie eluieren.
Die niedrigeren Molekulargewichte finden sich im Eluat, wenn die Säule beladen wird. Sie werden auf einer zweiten Säule auf QMA-Gel gereinigt und eluierten bei 0,05 M, 0,08 M, 0,12 M, 0,20 M und 0,27 M NaCl.
BEISPIEL 2
Aktivität
Die in Beispiel 1 isolierten Moleküle zeigen eine hohe mitogene Kapazität für alle tierischen oder menschlichen Zellen, mit Ausnahme der Moleküle, die bei 0,32 M auf Q-Hyper-DTM20-Gel und bei 0,12 M auf QMA-Gel isoliert werden, die eine signifikante zellwachstumshemmende Aktivität besitzen.
BEISPIEL 3
Toxikologische Studie
Tests, die sowohl in vivo als auch in vitro durchgeführt wurden, zeigen die geringe Toxizität und gute Toleranz der aktiven Inhaltsstoffe gemäß der Erfindung.
Die Zelltoxizität in vitro wurde unter Verwendung von Neutralrot und MTT bestimmt. Bei einer Dosis von 600 μg/ml wurde keine Toxizität im Kulturmedium nachgewiesen.
Die folgenden in vivo-Tests wurden durchgeführt. Alle Moleküle, die mitogene Aktivitäten zeigten, wurden an Mäusen getestet. Diese Studie erwies das Fehlen von Toxizität. Die intraperitoneale Injektion von 0,5 ml einer 100 g/l-Lösung von jedem dieser Moleküle bei zwei Gruppen mit 24 männlichen Tieren und 24 weiblichen Tieren bewirkte keine Mortalität nach sieben Tagen.
Dieselben Tests wurden mit denselben Dosen unter Verwendung der Moleküle durchgeführt, die das Zellwachstum hemmen. Zu Beginn des Experimentes wurde ein durchschnittlicher Gewichtsverlust von 3–4% bei den behandelten Tieren beobachtet. Dies war der Fall für sowohl die Weibchen als auch die Männchen. Vier bis fünf Tage nach Injektion hatten die Tiere ihr normales Wachstum wieder erreicht, was die Nicht-Toxizität der Moleküle gemäß der Erfindung beweist.
BEISPIEL 4
Pharmakologische Studie
Ergebnisse von pharmakologischen Tests, die hier berichtet sind, zeigen die signifikanten Eigenschaften des aktiven Inhaltsstoffs gemäß der Erfindung.
1. Mitogene Aktivität
Die Tests wurden durchgeführt an Stammkulturen von CRFK- und VERO-Zellen, unter Verwendung von NUNC-Platten mit 6 Vertiefungen und HAM-F12-Medium.
Das Medium wurde mit 200.000 Zellen/Milliliter bestreut. Jedes Molekül wurde in Zellkultur relativ zu den Kontrollen getestet, die nur aus HAM F12 und HAM F12 + 10% fötales Kalbsserum (FCS) bestanden, in Dosen, die von 0,025 g/l bis 4 g/l reichten.
Für jedes Moleleül wurde der beste Konzentrationsbereich im Hinblick auf die Aktivität bestimmt. Die durchschnittlichen Aktivitäten liegen zwischen 0,05 g/l und 0,05 g/l.
Die nachgewiesene Vermehrungsrate der Zellen variierte zwischen 3 und 5, abhängig vom getesteten Molekül, d.h. bei einer Ausgangsmenge von 200.000 Zellen/ml werden 600.000 bis 1.000.000 Zellen/ml gebildet. Die Vermehrungsrate ist vergleichbar mit den Werten, die mit den SVF-Zellen erreicht werden: 900.000 bis 1.000.000 Zellen/ml.
Die mitogene Kapazität der Moleküle gemäß der Erfindung wurde anschließend an mehr als 120 Zell-Linien getestet, die im ATCC genannt sind, oder in Primokultur-, tierischen, eukaryontischen, menschlichen oder diploiden Zellen.
Zusätzlich zu ihrer Aktivität auf den Zell-Linien wurde beobachtet, daß die Moleküle, die bei 0,09 M, 0,15 M, 0,70 M, 0,85 M und 1,02 M eluierten, in ähnlicher Weise eine beträchtliche Vermehrungskapazität auf Mikroorganismen zeigen. So zeigten Tests, die an Lactobacillus durchgeführt wurden, einen Anstieg in der Biomasse von 30% in 24 Stunden relativ zur Kontrolle.
2. Hemmungsaktivität
In Tests, die unter denselben Bedingungen durchgeführt wurden, erzeugten die Moleküle, die bei 0,32 M auf der Q-Hyper-DTM20-Säule und 0,12 M auf der QMA-Säule eluierten, eine Gesamthemmung des Zellwachstums in Dosen zwischen 0,5 g/l und 1 g/l.
Diese zwei Moleküle hemmten in ähnlicher Weise das Wachstum des vollständigen Panels von Tumorzellen, das vom NCl gefordert wird (62 Stammkulturen).
3. Wirkung auf den Metabolismus in vivo
Diese Studie wurde durchgeführt mit den Molekülen, die bei 0,21 M, 0,45 M auf der Q-Hyper=DTM20-Säule und bei 0,20 M auf der QMA-Säule eluierten. Verschiedene Gruppen von 24 männlichen Mäusen und 24 weiblichen Mäusen erhielten 0,5 ml einer 100 g/l-Lösung des Moleküls für Tests.
Die Moleküle der Erfindung bewirkten eine durchschnittliche Gewichtszunahme von 8,25% bei sowohl den männlichen als auch den weiblichen Mäusen, relativ zu den Kontrollgruppen, die nur eine Injektion von 0,5 ml einer 100 g/l-Lösung Natriumchlorid enthielten.

Claims

Biologisch aktive Verbindung, erhältlich mit einem Verfahren, das die folgenden Schritte umfaßt: a) Pressen eines Pflanzenmaterials zu Brei; b) Unterwerfen des erhaltenen Breis unter eine kalte oder heiße Behandlung mit einem wäßrigen oder organischen Lösungsmittel; c) Entfernen des Lösungsmittels, bis ein festgelegter Konzentrationsgrad erreicht ist; und d) Reinigen des so erhaltenen Extraktes mit einem oder mehreren der folgenden Verfahren: Thermokoagulation, Reinigung mit Ammoniumsulfat, Ausfällung, Chromatographie auf Gel oder Ionenaustauschharz; e) weiteres Reinigen des Extraktes auf einer Q-Hyper-DTM20- Gelchromatographiesäule, Eluieren der Säule und anschließend Sammeln von Fraktionen, die bei bestimmten Konzentrationen des Elutionsmittels eluieren, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Verbindung bei 0,09 M NaCl, 0,15 M NaCl, 0,21 M NaCl, 0,25 M NaCl, 0,32 M NaCl, 0,45 M NaCl, 0,52 M NaCl, 0,70 M NaCl, 0,78 M NaC1, 0,85 M NaCl oder 1,02 M NaCl eluiert.
Biologisch aktive Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren weiter den Schritt umfaßt: f) weiteres Reinigen des Eluats aus Schritt e) auf einer QMA-Gelchromatographiesäule, Eluieren der Säule und anschließend Sammeln von Fraktionen, die bei bestimmten Konzentrationen des Elutionsmittels eluieren, wobei die Verbindung bei 0,05 M NaCl, 0,08 M NaCl, 0,12 M NaCl, 0,20 M NaCl oder 0,27 M NaCl eluiert.
Biologisch aktive Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, die erhalten wird aus einer Pflanze, die ausgewählt ist aus Kartoffeln, Rettich, Rübe, Bete, Karotte, Jerusalem-Artischocke, Süßkartoffel, Raps, Gurke, Kürbis, Zucchini und Tomate.
Biologisch aktive Verbindung nach Anspruch 1, die bei 0,09 M NaCl, 0,15 M NaCl, 0,21 M NaCl, 0,25 M NaCl, 0,45 M NaCl, 0,52 M NaCl, 0,70 M NaCl, 0,78 M NaCl, 0,85 M NaCl oder 1,02 M NaCl eluiert, oder nach Anspruch 2, die bei 0,05 M NaCl, 0,08 M NaCl, 0,20 M NaCl oder 0,27 M NaCl eluiert, oder Kombinationen davon, zur Verwendung als ein Mitogen für eukaryontische Zellen.
Biologisch aktive Verbindung nach Anspruch 1, die bei 0,32 M NaCl eluiert, oder nach Anspruch 2, die bei 0,12 M NaCl eluiert, oder einer Kombination davon, zur Verwendung als zellwachstumshemmendes Mittel.
Biologisch aktive Verbindung nach Anspruch 1, die bei 0,21 M NaCl oder 0,45 M NaCl eluiert, oder nach Anspruch 2, die bei 0,20 M eluiert, zur Verwendung als Mittel zur Stimulierung des Stoffwechsels.
Biologisch aktive Verbindung nach Anspruch 1, die bei 0,09 M NaCl, 0,15 M NaCl, 0,70 M NaCl, 0,85 M NaCl oder 1,02 M NaCl eluiert, oder Kombinationen davon, zur Verwendung als Mitogen für Mikroorganismen.
Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Verbindung mit einer biologischen Aktivität, die aus der Beeinflussung des Zellwachstums besteht, wobei das Verfahren umfaßt: a) Pressen eines Pflanzenmaterials zu Brei; b) Unterwerfen des erhaltenen Breis unter eine kalte oder heiße Behandlung mit einem wäßrigen oder organischen Lösungsmittel; c) Entfernen des Lösungsmittels, bis ein festgelegter Konzentrationsgrad erreicht ist; d) Reinigen des so erhaltenen Extraktes mit einem oder mehreren der folgenden Verfahren: Thermokoagulation, Reinigung mit Ammoniumsulfat, Ausfällung, Chromatographie auf Gel oder Ionenaustauschharz; e) Unterwerfen des Extraktes unter eine chromatographische Trennung auf einem Q-Hyper-DTM20-Gel und Eluieren der Säule mit einem NaCl-Gradienten; und f) fakultativ weiteres Unterwerfen des Eluats aus Schritt e) auf einer Säule mit QMA-Gel und Eluieren der Säule mit einem NaCl-Gradienten.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß a) die Behandlung des erhaltenen Breis mit kaltem Wasser durchgeführt wird, b) das so erhaltene Material durch Zentrifugation oder Filtration konzentriert wird, c) eine Thermokoagulation anschließend in Gegenwart von Alkohol, Caprylsäure, Essigsäure und Ammoniumsulfat durchgeführt wird, d) der so erhaltene Extrakt zentrifugiert wird, e) der Überstand einer Ultrafiltration unterworfen wird, um den Extrakt zu erhalten.
Medikament für Human- oder Veterinärgebrauch, das wenigstens eine der biologisch aktiven Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 7 umfaßt.
Kulturmedium, das wenigstens eine der biologisch aktiven Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 7 umfaßt.