DE2605576B2

DE2605576B2 - Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft von Carica papaya und Verwendung der isolierten Proteasen zur Herstellung von sterilisierten und lyophilisierten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparaten

Info

Publication number: DE2605576B2
Application number: DE2605576A
Authority: DE
Inventors: Dusan Milivojevic; Janez Perkavac
Original assignee: Lek Pharmaceuticals and Chemical Co dd
Current assignee: Lek Pharmaceuticals dd
Priority date: 1975-02-20
Filing date: 1976-02-12
Publication date: 1980-07-17
Also published as: BE838750A; YU40433B; FR2301267B1; YU40975A; DE2605576A1; GB1512491A; FR2301267A1; DE2605576C3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft von Carica papaya sowie die Verwendung der dabei erhaltenen isolierten Proteasen einzeh oder im Gemisch zur Herstellung von sterilisierten und lyophilisierten orthopädischen, neurochirurgischen oJerophthaimologibchen Präparaten.

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Isolierung und Reinigung der oben genannten proteolytischen Enzyme (Proteasen) Papain, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft von Carica papaya bekannt, beispielsweise durch Ausfällung der proteolytisch aktiven Fraktionen mit einem Salz (US-Pater ·.-schrift 32 10 257) oder durch partielle Ausfällung mit Alkoholen (US-Patentschrift 30 11952). Bei diesen Isolierungs- und Reinigungsverfahren sind die protcolytisch aktiven Enzyme stets von einem Teil der nicht-aktiven Bestandteile begleitet und alle Enzymfraktionen liegen in Form eines Gemisches vor.

Es ist auch bereits bekannt, daß die oben genannten Proteasen durch Säulcnchromatographie unter Verwendung bestimmter Kationenaustauscher isoliert und gereinigt werden können. Damit ist es möglich, die nicht-akliven Bestandteile von den aktiven Proteasen zu trennen, wobei die aktiven Proteasen in zwei verschiedene Fraktionen, nämlich in Chimopapain A und Chimopapain B, gelrennt werden (französische Patentschrift 19 52 192). Jede dieser Fraktionen enthält jedoch immer noch ein Gemisch aus zwei protcolytisch aktiven Proteinen.

Da für die Anwendung in der Humanmedizin die oben genannten Proteasen einzeln in Bezug auf ihre Toxizhät, ihre spezifische und immunologische Aktivität untersucht werden müssen, genügt die bisher erzielbare Isolierung und Reinigung der oben genannten Proteasen den heutigen Anforderungen nicht, da in den dabei erhaltenen Produkten stets Gemische der Proteasen vorliegen.

Aufgii')c der Erfindung war es daher, ein neues Verfahren /um Isolieren der Proteasen Papain, Chimopapain, !„ysci/ym und Proteinase X aus dem Milchsaft

h^r, von Carica papaya zu entwickeln, mit dessen Hilfe es möglich ist, auf technisch einfache und dennoch wirksame Weise die genannten Proteasen voneinander zu trennen, ohn? daß eine Ausfällung erforderlich ist, so daß diese zur Herstellung von orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparaten verwendet werden können.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst werden kann durch ein Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft von Carica papaya, das dadurch gekennzeichnet ist, daß roher Milchsaft von Carica papaya bei einem pH-Wert von 7 an einer mit einem am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Sephadex SP erhältlichen ChroiJiatographiematerial gefüllten Kolonne mit Tris-HCI- oder Phosphatpufferlösung mit einer von 0,01 M bis 1,0 M steigenden Ionenkonzentration Chromatographien wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich die einzelnen oben genannten Proteasen in reiner, proteoiytisch aktiver Form aus dem Milchsaft von Carica papaya isolieren, so daß die dabei erhaltenen Produkte zum Abbau von lokalen Gewebedeformationen, wie zum Beispiel Hernia disci, eingesetzt werden können.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der nach dem erfimiungsgemäßen Verfahren isolierten Proteasen einzeln oder im Gemisch zur Herstellung von sterilisierten und lyophilisierten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparaten durch Versetzen der Proteasen mit Natriumchlorid in einem Verhältnis von Protease : Salz von 1 :1 bis 1 :3.

Die dabei erhaltenen Präparate haben gegenüber bekannten, vergleichbaren Präparaten, beispielsweise gegenüber dem Präparat »Disease« (vgl. die französische Patentschrift 19 52 192) den Vorteil, daß sie stabiler sind als das bekannte Präparat, da sie Lyophilisate aus dem Gemisch Enzym/Nateriumchlorid darstellen, daß ihr Anwendungsgebiet breiter is,' als dasjenige des bekannten Präparats, das nur in der Ophthalmologie einsetzbar ist, und daß durch Zugabe von Proteinase X /u jedem der erfindungsgemäßen Präparate die Möglichkeil besteht, die enzymatische Wirkung der Präparate in hohem Maße zu steigern und die therapeutische Dosis herabzusetzen.

Bei dem in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Chromatographiematerial handelt es sich um ein am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Sephadex SP erhältliches, durch Sulfopropylgruppen substituiertes, polymerisicrtes Dextran. Es hat die Fähigkeit, Moleküle verschiedener Größe voneinander zu trennen. Durch eine geeignete Auswahl der Vernetzung eines solchen Dextrans ist es möglich, Moleküle mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 50 000 von anderen zu trennen, wobei die freien Sulfopropylgruppen als Kationenaustauscher wirken. Durch Veränderung der Bedingungen während der Chromatographie werden an ein solches Chromatographiematerial einzelne Bestandteile des Enzymgemisches aufgrund ihrer verschiedenen chemischen und physikalischen Eigenschaften gebunden und danach durch Eluieren wieder abgetrennt. Durch abwechselndes Auswaschen mit 0.5 η Salzsäure und 0,5 η Natronlauge kann das Chromatographiematcrial aktiviert bzw. nach seiner Verwendung regeneriert werden. Vor seiner Verwendung kann es innerhalb der Kolonne durch Verwendung eines geeigneten Puffersystems, wie /.. B.

•ines Tris-HCI- oder Phosphatpuffers, äquilibriert werden.

Das erfindungsgemäöe Verfahren wird in der Weise durchgeführt, daß roher getrockneter Milchsaft von Carica papaya in einer ausreichenden Menge in dem Anfangspuffer gelöst und die durch Zentrifugieren erhaltene klare Lösung in den Kopf einer mit dem oben genannten Chromatographiematerial gefüllten Chromatographiekolonne aufgegeben wird. Mit dem gleichen Puffer wirrt so lange eluiert, bis die nicht-aktiven Bestandteile des Gemisches vollständig entfernt sind, was durch Messung der UV-Absorption bei einer bestimmten Wellenlänge festgestellt wird. Anschließend wird mit einer von 0,01 M bis 1,0 M steigenden ionenkonzentration der Tris-HCI- oder Phosphatpufferlösung Chromatographien, so daß in den dabei erhaltenen aufeinander folgenden Eluaten die einzelnen Proteasen enthalten sind. Zuerst werden Papain und Chimopapain, danach Lysozym und Proteinase X eluiert. Zur Entfernung der Salze, die in der Pufferlösung enthalten sind, wird zweckmäßig zwischen Kolonne und Detektor ein Dialysator vorgesehen. Die einzelnen Lösungen der proleolytisch iktiven Enzyrr-; werden dann durch Ultrafiltration eingeengt und danach durch Lyophilisieren getrocknet Das getrocknete Enzym wird durch Elektrophorese kontrolliert und es wird seine spezifische Aktivität bestimmt Die Elektrophorese wird mit Celluloseacetat in einem Veronalpuffer bei einem pH-Wert von 8.6 und einer konstanten Spannung von 170 V durchgeführt. Die Elektrophoresezeit beträgt im allgemeinen 40 Minuten. Die Bänder werden in einer l°/oigen Lösung von Naphthalinschwarz 12 B (vgl. Fig. 1) entwickelt. Die spezifische Aktivität der einzelnen Proteasen wird nach dem Verfahren von Anson, beschrieben im »The Journal of General Physiology«, 1939, mit einem Hämoglobinsubstrat bei pH 7 und 37°C bestimmt. Parallel dazu wird die Aktivität auf einem synthetischen Substrat BEAE (N-a-Benzoyl-L-arginin-äthylester-hydrochlorid) kontrolliert (vgl. A. Lauwers und R. Ruyssen, »journal de Pharmacie d: Belgique«, 20, 1965, Seiten I bis 2, und N. Hennrich und W. Brummer, »Pharm. Ind.« 35, Nr. 4, 1973).

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Proteasen werden einzeln oder im Gemisch zur Herstellung eines sterilisierten und lyophilisierten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparats verwendet, indem man die einzelnen Proteasen oder ein Gemisch davon mit Natriumchlorid in einem Verhältnis von Protease : Salz von 1:1 bis 1 :3 versetzt. Die eingesetzt? Menge an Protease bzw. Proteascngemisch sollte der geforderten Wirkungsdosis entsprechen und vorzugsweise wird das Salz in einer solchen Menge verwendet, daß beim Auflösen des Präparats eine physiologische Lösung entsteht. Diese Lösung wird dann filtriert und die erhaltene sterile Lösung wird in Pcnicillinflaschcn dosiert und lyophilisiert.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Eine chromatographische Kolonne mit einem Durchmesser von 30 mm und einer Länge von 1000 mm wird mit dem am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Sephadex SP-50 bekannten Chromatographiematerial gefüllt, das in einem 0,01 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 (6 Teile Dinatriumhydrogenphosphat und 4 Teile Kaliumdihydrogenphosphat) suspendiert ist.

in Danach werden auf den Kopf der Kolonne 5 g Milchsaft von Carica papaya, gelöst in 3 bis 5 ml des Phosphatpuffers, aufgegeben. Die Kolonne wird so lange eluiert, bis die nicht aktiven Komponenten des Gemisches entfernt worden sind, bestimmt unter

Ii Verwendung eines UV-Absorptionsdetektors (vgl. in der Fig. 1 den mit N bezeichneten Maximalwert bei λ = 280 nm). Danach wird mit allmählich steigender Konzentration der Pufferlösung pJuiert, wobei am Schluß mit einem 1 M Puffer eluiert wird. Die in der

>o beiliegenden Zeichnung (Fig. 1) angegebenen Maxima A, B, C und D der elektrophorevschen Kontrolle entsprechen den Proteasen, Paua/n, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X. Die Ausbeute der einzelnen Fraktionen beträgt 40 Gew.-°/o nicht-aktive Komponen-

y> ten, 8 Gew.-°/o Papain, 32 Gew.-% Chimopapain 5 Gew.-% Lysozym und 15 Gew.-°/o Proteinase X.

Beispiel 2

Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird

M) wiederholt, wobei diesmal ein 0,01 M Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7 verwendet wird. Mit dem anfänglichen Puffersystem werden die nicht-aktiven Komponenten (Maximum N der Fig.2) eluiert und dann wird durch allmähliche Zugabe einer 1 M

r> Natriumchloridlösung die Auftrennung in Papain (A), Chimopapain und Lysozym (B) und Proteinase X (C) erzielt.

Beispiel 3

in Die in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen proteoiytisch aktiven Komponenten werden in einer wäßrigen Natriumchloridlösung in der Weise gelöst, daß die Konzentration an Natriumchlorid in Wasser 1,8% und die Konzentration an aktivem Enzym 200 mAnson-Ein-

·»■'· heilen auf 1 ml Salzlösung betragen. In eine Pcnicilinfiasche wird 1 ml der Enzym-Salzlösung eingefüllt und steril lyophilisiert. Das Lyophilysat enthält 0.01 g NaCI und 200 mAnson-Einheiten Enzym. Vor der Verwendung wird die Zubereitung in 2 ml bidestilliertem

v) Wasser gelöst.

In Abhängigkeit von der Aktivität des proteoiytisch aktiven Enzyms bzw. des proteoiytisch aktiven Enzymgemisches beträgt das Verhältnis von Enzym zu Saiz 1 : I bis 1 :3. In dem Beispiel 1 beschriebenen Verfahren

^r<^r> beträgt das Gewichtsverhältnis von Salz zu Enzym 1 :1,8. bei der oben angebenen Aktivität vcn 100 niAnson-Einheiten auf 1 ml physiologische Lösung. Ein in der Weise hergestelltes Präparat ist in der Orthopädie für die Behandlung von Hernia disci, in der Neurochirurgie

M) und der Ophthalrm logie verwendbar.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1, Verfahren zum Isolieren der Proteasen Papain, Chimopapain, Lysozym und Proteinase X aus dem Milchsaft von Carica papaya, dadurch gekennzeichnet, daß roher Milchsaft von Carica papaya bei einem pH-Wert von 7 an einer mit einem am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung Sephadex SP erhältlichen Chromatographiematerial m gefüllten Kolonne mit Tris-HCI- oder Phosphatpufferlösung mit einer von 0,01 M bis 1,0 M steigenden Ionenkonzentration Chromatographien wird.

Z Verwendung der nach Anspruch I isolierten Proteasen einzeln oder im Gemisch zur Herstellung is von sterilisierten und lyophilisierten orthopädischen, neurochirurgischen oder ophthalmologischen Präparaten durch Versetzen der Proteasen mit Natriumchlorid in einem Verhältnis von Protease: Salz von I : I bis 1 :3. m