DE2513848A1

DE2513848A1 - Verfahren zur gewinnung ununterbrochener staemme von tumorzellen in vitro

Info

Publication number: DE2513848A1
Application number: DE19752513848
Authority: DE
Inventors: Henri Dr Febvre
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1974-03-27
Filing date: 1975-03-27
Publication date: 1975-10-09
Also published as: NL7503607A; BE826886A; JPS50129786A; GB1474006A; FR2265861B2; CH606438A5; FR2265861A2; US4017361A

Description

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Patentanwälte:

Dipl.-Ing. Tiedtke Dipl.-Chem. BüWing Dipl.-Ing. Kinne

8 München 2, Postfach 202403 Bavariaring 4

Tel.: (0 89) 53 96 53-56 Telex: 5 24845 tipat

cable: Germaniapatent München

27. März 1975 B 6530/FOOl/CAS

CHOAY S. A.
Paris, Frankreich

Verfahren zur Gewinnung ununterbrochener Stämme von Tumorzellen in vitro

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung ununterbrochener Stämme von Tumorzellen in yitro.

Die FR-PS 73 04491 vom 8. Februar 1973 auf den Namen CHOAY S.A. (die der DT-OS 2 406 084 entspricht) betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung eines immunodepressxven Human-Ant ilympho zy ten serums und das nach diesem Verfahren erhaltene Serum, das frei von antierythrozytischer und ant it hrpiib ο zy tischer Wirkung ist und bei Verabreichung einer Antigenmasse an ein geeignetes Tier entsteht, wobei diese Antigenmasse im wesent-

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lichen aus dem zellfreien Überstehenden einer oder mehrerer Kulturen von ununterbrochenen, von Humanlymphozyten ausgehenden Stämmen oder aus gewissen Fraktionen dieses Überstehenden besteht. Nach der genannten FR-PS werden die in ununterbrochenen Stämmen gebildeten Lymphozyten im Hinblick auf die Gewinnung des genannten Überstehenden ohne Aufnahme anderer Informationen als der Ihnen in natürlicher Weise eigenen Informationen gezüchtet.

Es ist andererseits bekannt, daß - wenn man einen chirurgisch entnommenen Tumor in eine Kultur bringt - das Kultursystem verschiedene Typen von Zellen enthält, nämlich lymphoide Zellen, insbesondere Lymphozyten und Monozyten, Zellen des Stützgewebes (Stroma), insbesondere von fibroblastischem Aussehen, sowie Tumorzellen.

Die bisher beschriebenen Tumorzellen-Erstkulturen in vitro weisen sich schnell vereinigende Flächen auf; aber nach dieser Phase schneller Vermehrung beobachtet man von dem vierten Tage ab den Zerfall der Tumorzellen, der nach einer Spanne von zwei bis drei Wochen vollständig ist. Der Zerfall wird besonders deutlich, wenn man versucht, die Kulturen mit Trypsin wieder "auszubessern".

Der Erfinder konnte feststellen, daß dieser Zerfall von Tumorzellen in allen Fällen erfolgt, wo man eine wirklich sehr

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ausgeprägte Zytotoxizität der Lymphozyten beobachtet, die sich, vor dem chirurgischen Eingriff auf den aus menschlichen Gehirntumoren stammenden Zellscheiben zeigt (vergl.: H. Febvre, A. Moutte und J.P. Constans, Compte-Rendus Acad. Sciences Paris 275, 2191-2194, Nr. 19, 1972: "Nachweis einer Antitumorimmunität durch zellulare Vermittlung beim Menschen auf Grund allogener Antigene"): Diese Kulturen werden ab dem vierten Tag nach der Explantation schnell von großen Zellen mit gewellten Membranen befallen, welche die morphologischen Eigenschaften von Lymphozyten, die sich in lymphoblastoide Zellen entwickelt haben, oder von aktivierten Monozyten mit zytotoxischer und makrophager Wirkung zeigen. In diesen Fällen verwandeln sich die lymphoiden Zellen in Gegenwart von Tumoralantigenen der Tumorzellen in lymphoblastoide Zellen, die zytocide und makrophage Wirkungen zeigen, und andererseits gewinnen die durch das genannte Tumoralantigen aktivierten Monozyten in vitro eine selektive zytocide und makrophage Aktivität gegenüber Tumorzellen, wobei diese zwei Arten aggressiver Zellen die tumorfreien Zellen des Stützgewebes unversehrt lassen (hinsichtlich der Definition und der Entwicklung von Lymphozyten und Monozyten wird zweckmäßigerweise auf das Werk von Marcel Bessis hingewiesen: "Lebende Blutzellen und ihre Ultrastruktur'¹, Springer Verlag Berlin-Heidelberg-New York, insbesondere Seiten 419-452 und 489-499).

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Die vorstehenden Überlegungen machen deutlich, weshalb es schwierig ist, in vitro hergestellte, ununterbrochene Stämme aus Kulturen von Tumorzellen zu gewinnen, die aus chirurgischen Eingriffen _an "bösartigen Tumoren stammen.

Es wurden Versuche unternommen mit dem Ziel, die Entwicklung der. Zerfallsreaktion der Tumorzellen in vitro zu verhindern: Die nach dem Stande der Technik vorgeschlagenen Verfahren zur Herstellung ununterbrochener Stämme von Tumorzellen in vitro sind zwei Typen zuzuordnen, nämlich den Zelldissoziationen und den Organkulturen. Bei dem ersten Typ des Verfahrens beginnt man mit einer kleinen Anzahl von Tumorzellen, aus denen sich ein ausgesuchter ZeIlstamm bildet; diese Arbeitsweise ist jedoch sehr langsam, da selbst wenn alle 18 Stunden eine Zellvermehrung erfolgt - es dennoch viel Zeit erfordert, um eine in ununterbrochenem Stamm gebildete Tumorzellkultur zu erhalten. Das Verfahren zur Gewinnung von Tumorzellen in vitro durch eine Organkultur gestattet nicht die Gewinnung von ununterbrochenen Stämmen.

Die Notwendigkeit, über ununterbrochene reine Stämme von Tumorzellen in vitro verfügen zu können, die leicht, schnell und in ausreichenden Mengen erhältlich sind, wird mehr und mehr zu einem Zwang: Die Verfügbarkeit von Kulturen von in ununterbrochenen Stämmen gebildeten menschlichen Tumorzellen in vitro gestattet den Forschern, sie zur Aufklärung der Krebsbildungsvorgänge beim Menschen

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zu benutzen und die Aktivität neuer kanzerostatischer und kanzerolytischer Arzneimittel zu beurteilen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, durch das man einfach, schnell und zuverlässig in vitro ununterbrochene Stämme von Tumorzellen gewinnen kann, da es bisher nicht möglich war, dieses Ziel mit den bekannten Methoden zu erreichen.

Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zur Gewinnung ununterbrochener Stämme von Tumorzellen in vitro, insbesondere ausgehend von menschlichen Tumorzellen von chirurgischen Eingriffen an bösartigen Tumoren, und ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturen der Tumorzellen in vitro in Gegenwart von menschlichem Antilymphozytenserum nach der oben genannten FR-PS hergestellt werden, das es durch Neutralisation der gegenüber Tumorzellen aggressiven Zellen gestattet, in vitro ununterbrochene Stämme von Tumorzellen herzustellen.

Man erhält so erfindungsgemäß in vitro kontinuierliche Stämme von menschlichen Tumorzellen nach einem Verfahren, das hinsichtlich Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit und Eonstanz der Ergebnisse ausgezeichnet ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die sehr schnelle Herstellung von Tumorzellen in ununterbrochenen Stämmen, denn die

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Anwesenheit des menschlichen Antilymphozytenseriims nach der FR-PS 73 04491 in dem Kultursystem erlaubt den wachsenden Tumorzellen, sich ohne Widerstand zu entwickeln.

Die Erfindung wird aus der folgenden Beschreibung verständlicher, die Beispiele für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bringt. Diese Beispiele dienen jedoch lediglich zur Erläuterung des Erfindungsgegenstandes, ohne diesen einzuschränken.

Beispiel 1

Behandlung von Karzinomkulturen mit menschlichen Antilymphozytenseren.

Die Zellen aus einer Flasche mit Karzinomkultur werden von dem Trypsin getrennt und in dem Medium Moore RPMI 1640 mit 2 % komplementfreiem Kalbsserum wieder suspendiert.

Diese Zellen werden in aliquoten Anteilen, die 5*10 Zellen in 0,5 ml Medium entsprechen, auf Reagenzgläser verteilt. Man setzt während 30 Minuten 1 ml Antilymphozytenserum zu, das im Kulturmedium auf 1/100 verdünnt wurde, und dann während 90 Minuten 0,5 nil vakuumgetrocknetes Kaninchenkomplement, das in dem Kulturmedium auf 1/20 verdünnt wurde. Die Röhrchen werden im Wasserbad auf 37 ⁰C gehalten, und der pH-Wert wird zwischen ?,S u#ä ?,f eingestellt. Zu Jedem Versuch wurde ein Kontrollversuch ohne Komplement durchgeführt.

Die Reagenzgläser werden dann zentrifugiert; die Zellen wer-

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den in 2 ml Kulturmedium mit einem Zusatz von 15 % Kalbsembryoserum suspendiert. Jede Probe wird auf Makrotestplatten (Greiner) kultiviert.

Die Kulturen werden 24 bis 48 Stunden in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % COp bebrütet. Die Kulturen werden dann unter einem umgekehrten Phasenkontrastmikroskop (Phasenobjektiv Wild 6X) untersucht .

Vier Seren sind geprüft worden; die Ablesungen wurden ohne Sicht gemacht:

1) AU 55, Antiserum vom Pferd, das mit Lymphozyten der normalen

menschlichen Thymusdrüse überimmunisiert ist,

2) AU 56, Antiserum vom Pferd, das mit in ununterbrochenem Stamm

(Mischung aus 5 verschiedenen Stämmen) kultivierten Lymphozyten aus peripherem Blut überimmunisiert ist,

3) AU 59, Antiserum vom Pferd, das mit dem Überstehenden dieser fünf

Lymphozytenkulturen überimmunisiert und nach der eingangs genannten FR-PS 73 04491 hergestellt wurde,

4) AU 61, Antiserum vom Pferd, das in gleicher Weise wie AU 59 hergestellt wurde.

Nur die Seren AU 59 und AU 61 entsprechen der FR-PS 73 04491.

Bei den Kulturen, die mit dem Antilymphozytenserum in Gegenwart von Komplement behandelt wurden, stellt man ein Verschwinden

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der zytociden Zellen in den mit den Seren ATJ 59 und AU 61 behandelten Kulturen fest. Die Wirkung ist "bei den beiden anderen geprüften Seren (AU 55 und AU 56) viel undeutlicher und scheint nicht sehr spezifisch zu sein. Tatsächlich beobachtet man eine gewisse Zytotox' zität für die Tumorzellen.

Bei den Kontrollversuchen ohne Komplement fehlt die Zytotoxizität. Die Kulturen ohne Antilymphozytenserum, die in Gegenwart des Komplements gebildet wurden, belegen, daß das benutzte Komplement bei der angewandten Verdünnung nicht zytotoxisch ist.

Beispiel 2 Gewinnung von ununterbrochenen Stämmen

Das Human-Antilymphozytenserum nach der FR-PS 73 04491 hat sich bei Kulturen aus Eingriffen, bei denen in drei Fällen Gehirnmetastasen von Karzinomen entnommen wurden, als aktiv erwiesen und mit den Tumorzellscheiben positive Lymphoidreaktionen gezeigt:

Gehirnmetastase eines Karzinoms der Nebenniere (T 249)

.Zytotoxizität bei 70 %.
Gehirnmetastase eines Brustkarzinoms (T 268)

.Zytotoxizität bei 23 %.
Gehirnmetastase eines Schilddrüsenkarzinoms (T 272) .Zytotoxizität bei 16 %.

Die Karzinomkulturen sind direkt in den Kulturflaschen behan delt worden, um die zytociden Zellen bei der ersten oder zweiten Vei

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Setzung auszuschalten, wodurch die Isolierung der drei Stämme der Karzinome von Schilddrüse, Nebenniere und Brust möglich wurde.

Die Wirkung des Antiserums AU 59 ist sehr schnell. Bei den schon "bestehenden Kulturen auf den Lamellen beobachtet man die typische Reaktion der Zytotoxizitat bei den zytociden Zellen 15 bis 20 Minuten nachdem die mit diesem Serum behandelten Kulturen mit dem Komplement in Kontakt gebracht wurden. Es tritt eine plötzliche Zurückziehung des Kerns ein, der sich von dem Zytoplasma zu trennen scheint.

Die erhaltenen Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt;

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Tabelle der Ergebnisse

Reaktionen der lymphoiden Zellen bei erkrankten Tumorträgern 1) Gehirntumore

Namen Diagnostik Zytotoxizität Lymphoidreak- Tumorder Lymphozyten tion i. d. Kultur stamme

+ nein

260	Bar.	Glioblastom	47
261	CoI.	Glioblastom	28
267	Cho.	Astrocytom	42
		bösartig
271	Bre	. Glioblastom	0
274	Lah	. Glioblastom	57
267	Duf	. Astrocytom	0
		bösartiK

nein da

2) Metastasen und Tu.more außerhalb des Gehirns 249 AIa. Karzinom, Metast.

(Nebenniere) 71 % 263 Sam. Karzinom, Metast.

(Brust) 67 % 265 fioz. Karzinom, Metast.

(Brust) 26 % 268 Eng. Karzinom, Metast.

(Brust) 23 % 270 Lao. Sarcam 22 %

272 Oud. Kareinom,Metast,

(Schilddrüse) 16 %

273 Vor. Rabdomyosarcom 0 %

da
(SerumAU59

nein

da
(Serum AÜ59)

nein

da
(Serum AU59)

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Zusammenfassend läßt sich aus der obigen Tabelle entnehmen, daß in ununterbrochenen Stämmen nur solche Tumorzellen entwickelt werden konnten, die entweder von chirurgischen Eingriffen bei Kranken stammten und keine eigene Zytotoxizität ihrer Lymphoidzellen gegenüber Zellscheiben zeigen, die ein Tumorantigen besitzen, oder die in Gegenwart von Human-Antilymphozytenserum gemäß den Mermalen der FE-PS 73 04491 dargestellt wurden.

Aus der vorstehenden Beschreibung folgt, daß man nach der vorliegenden Erfindung über ein Verfahren zur Bildung ununterbrochener Stämme von Tumorzellen in vitro verfügt, während bisher die Herstellung solcher ununterbrochener Stämme in vitro unmöglich war. Das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet die Schnelligkeit, Reinheit, Zuverlässigkeit und Konstanz bei dieser Herstellung.

Zusammengefasst betrifft das Verfahren die Gewinnung von Tumorzellkulturen in vitro, speziell menschlicher Herkunft. Man stellt Tumorzellkulturen in vitro her ausgehend insbesondere von menschlichen Tumorzellen, die aus chirurgischen Eingriffen bei bösartigen Tumoren stammen; man gibt in das Kultursystem Anti-Humanlymphozytenserum gemäß I¹R-PS 73 04491 (DT-OS 2 406 084), das die zytociden und makrophagen Aktivitäten der in dem Zellsystem vorhandenen lymphoblastoiden Zellen und aktivierten Monozyten gegenüber den Tumorzellen neutralisiert und so den Aufbau kontinuierlicher Stämme von Tumorzellen in vitro gestattet.

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Die in vitro erhaltenen ununterbrochenen Stämme der Tumorzellen können zur Aufklärung der Krebsbildungsvorgänge beim Menschen und zur Beurteilung der Aktivität neuer kanzerostatischer und kanzerolytischer Heilmittel dienen.

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Claims

Patentansprüche -

\\J Verfahren zur Gewinnung kontinuierlicher Stämme von Tumorzellen in vitro, insbesondere ausgehend von menschlichen Tumorzellen, die aus chirurgischen Eingriffen bei bösartigen Tumoren stammen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Tumorzellkulturen in vitro in Gegenwart eines Human-Antilymphozytenserums nach FR-PS 73 04491 bildet, das die zytociden und makrophagen Aktivitäten der in dem Zellsystem vorhandenen Lymphoblastoidzellen und aktivierten Monozyten gegenüber den Tumorzellen neutralisiert und so den Aufbau von ununterbrochenen TumorzeIlstämmen in vitro ermöglicht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Tumorzellkulturen in vitro mit dem Human-Antilymphozytenserum nach der FR-PS 73 04491 in Gegenwart von Komplement behandelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Tumorzellkulturen in vitro mit dem Human-Antilymphozytenserum nach der FR-PS in Gegenwart von Reizmitteln behandelt, welche die Tumorzellkonzentration der Kulturen steigert.
4. Ununterbrochene reine Stämme von Tumorzellen in vitro, die nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 3 hergestellt sind.

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