DE3227262C3

DE3227262C3 - Verfahren zur Herstellung von menschlichem Tumor-Nekrose-Faktor und menschlicher Tumor-Nekrose-Faktor

Info

Publication number: DE3227262C3
Application number: DE3227262A
Authority: DE
Inventors: Masakazu Mitsuhashi; Haruo Ohnishi
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Mochida Pharmaceutical Co Ltd; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-07-21
Filing date: 1982-07-21
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2002-07-22
Also published as: DE3227262A1; SE9000532D0; AU560793B2; DE3227262C2; ATA283582A; SE8204382D0; AT387980B; US4495282A; GB2106117B; GB2106117A; SE9000532L; AU8620082A; SE8204382L; IT1196549B; IT8248855A0; CH664974A5; FR2513124A1; FR2513124B1

Description

Das Patent betrifft das im Anspruch 1, angegebene Verfahren zur Herstellung von menschlichem Tumor-Nekrose- Faktor. Anspruch 2 nennt den nach Anspruch 1 erhaltenen menschlichen Tumor-Nekrose-Faktor. Menschlicher Tumor-Nekrose- Faktor (nachstehend als "hTNF" bezeichnet) ist in diesem Zusammenhang als ein Faktor definiert, der zytotoxisch auf eine fibroblastartige Zellinie von Mäusen, L-929, als Targetzellen bzw. Zielzellen wirkt und ihre an schließende Zytolyse bewirkt.

Die guten Aussichten von hTNF als therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren sind mit einer großen Erwartung auf grund seiner Zytolysefunktion in Tumorzellen verbunden.

Obwohl TNF praktisch nicht artspezifisch ist, und daher die Möglichkeit der Verwendung von TNF nicht menschlichen Ur sprungs, z. B. aus Kaninchen oder Ratten, bei der Behandlung von menschlichen Krankheiten naheliegt, ist die Verwendung von hTNF aus lebensfähigen menschlichen Zellen erwünscht und sehr sicher, weil es weniger antigene Eigenschaften und andere Nebenwirkungen hervorbringt, wenn man es in einer derartigen Behandlung verwendet.

Wie von Ryuichi Aoki et al., Shin-Menekigaku Sosho, Bd. 6, "Lymphokines", Igaku Shoin Ltd., Tokyo, Japan (1979), und B. R. Bloom und P. R. Glade, "In Vitro Methods in Cell- Mediated Immunity", Academic Press, Inc. (1971), beschrieben wurde, bezeichnet man mit dem Ausdruck "Lymphotoxin" eine proteinartige Substanz, die Zytotoxizität bewirken kann, und die man intra- und/oder extrazellulär induzieren kann, beispielsweise indem man entweder sensibilisierte T-Zellen einem Antigen aussetzt oder nicht-sensibilisierte T-Zellen einem Lymphotoxinauslöser aussetzt, beispielsweise einem Mitogen, wie z. B. Phytohämagglutinin oder Concanavalin A. Es ist gut belegt, daß Lymphotoxin eine Zytotoxizität so wohl auf Tumorzellen als auch auf normale Zellen ausübt.

Wie von E. A. Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 72, Nr. 9, S. 3666 bis 3670 (1975), und E. Pick, "Tumor Necrosis Factor in Lymphokines", Bd. 2, S. 235 bis 272 (1981), Academic Press, Inc., beschrieben wurde, bezeichnet der Ausdruck "TNF" eine proteinartige Substanz, die man beispielsweise in Macrophagen induzieren kann, indem man parenteral an Kaninchen einen TNF-Auslöser verarbreicht, wie z. B. Bacille de Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum oder Endotoxin; und diese proteinartige Substanz kann eine hämorrhagische Nekrose von Meth A-Sarkom bewirken. Es ist ferner gut belegt, daß TNF praktisch keinerlei Zytolyse von normalen menschlichen Zellen bewirkt, aber eine bemerkenswerte Zytolyse sowohl der Targetzellinie von Mäusen, L-929, als auch von menschlichen Tumorzellen bewirkt.

Ferner ist in der US-PS 4 276 282 (Sugimito et al.) eine verbesserte Methode zur Herstellung von humanspezifischem Interferon (nachstehend als "HuIFN" bezeichnet) beschrieben, das eine Hemmungswirkung auf Virusinfektionen aufweist. Bei dieser bekannten Methode kann man unter Verwendung eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres als Wirt bestimmte menschliche Zellinien leicht vermehren, während man die nährende Körperflüssigkeit ausnützt, die von dem nicht-menschlichen warmblütigen Tier zugeführt wird, indem man die menschlichen Zellinien auf das nicht-menschli che warmblütige Tier transplantiert oder wahlweise dazu sie in eine übliche Diffusionskammer einsetzt, die derart ausgebildet ist, da sie die Körperflüssigkeit aufnimmt, und die Kammer in das Tier einsetzt bzw. an dem Tier an bringt; und indem man das Tier auf übliche Weise füttert. Das nicht-menschliche warmblütige Tier, das man verwenden kann, ist ein Tier, worin man die Zellinie vermehren kann: Beispielsweise Geflügel, wie z. B. Huhn oder Taube; oder Säugetier, wie z. B. Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, Pferd, Kuh, Meerschweinchen, Ratte, nackte Ratte, Hamster, Maus, nackte Maus oder Kaninchen. Diese US-PS lehrt jedoch keinerlei Möglichkeit der Verwendung eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres zur Herstellung von hTNF.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein leicht durchführbares Verfahren zur Herstellung von hTNF im technischen Maßstab sowie hTNF vorzusehen.

Die Erfindung betrifft gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Tumor-Nekrose-Faktor, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) eine oder mehrere Zellinien aus der aus BALL-1-, Namalva-, M-7002-, B-7101-, JBL-, EBV-Sa-, CCRF-SB- (=ATCC CCL 120), EBV-Wa-, TALL-1-, MOLT-3-, Nall-1- und EBV-HO-Zellen, CCRF-CEM-Zellen und Balm-2-Zellen, und anderen etablierten Zellinien, die man durch Transfor mieren von normalen Monozyten oder Granulozyten unter Verwendung eines beliebigen karzinogenen Virus, Mittels oder karzinogener Strahlung erhalten hat, bestehenden Gruppe einem oder mehreren alpha-Interferon- und/oder gamma-Interferonauslösern aussetzt und dadurch eine menschliche Tumor-Nekrose-Faktor-Erzeugung induziert,
(b) die Kultur bei 4°C und 1000 xg zentrifugiert, die über stehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Kochsalz lösung mit einem Gehalt von 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) dialysiert, die erhaltene Lösung unter Verwendung eines Membranfilters filtriert und dann lyophilisiert,
(c) aus dem so erhaltenen pulvrigen Produkt durch Adsorption und Desorption an einem Ionenaustauscher, Molekulargewichtsfraktionierung unter Anwendung der Gelfiltration, Einengen und Filtrieren unter Verwendung eines Membranfilters, das Humaninterferon entfernt und
(d) das humaninterferonfreie Produkt durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat und durch Affinitätschroma trographie unter Verwendung von Con A-Sepharose reinigt.

Die menschlichen Zellinien, die man erfindungsgemäß verwendet, sind solche, die man leicht transplantieren und in dem Tier vermehren kann, und die hTNF erzeugen: Bei spielsweise Namalva-Zellen, wie in Journal of Clinical Microbiology, Bd. 1, S. 116 bis 117 (1975) beschrieben ist; BALL-1, TALL-1- und NALL-1-Zellen, wie von I. Miyoshi in Nature, Bd. 267, S. 843 bis 844 (1977) beschrieben ist; M-7002- und B-7101-Zellen, wie in Journal of Immunology, Bd. 113, S. 1334 bis 1345 (1974) beschrieben ist; JBL-, EBV- Sa-, EBV-Wa-, MOLT-3- und EBV-HO-Zellen, wie in The Tissue Culture, Bd. 6, Nr. 13, S. 527 bis 546 (1980) beschrieben ist; CCRF-CEM-Zellen, CCRF-SB-Zellen (ATCC CCL 120); BALM-2-Zellen, die in Int. J. Cancer 20, 199-205 (1977) beschrieben sind; und andere etablierte Zellinien, die man durch Transformieren von normalen Monozyten oder Granulozyten unter Verwendung eines beliebigen karzinogenen Virus, Mittels oder von karzinogener Strahlung erhalten ist.

Gegebenenfalls kann man eine oder mehrere der beschriebenen Zellinien frei kombiniert in den Stufen bis zur hTNF-In duktion verwenden, die nachstehend genauer beschrieben ist. Menschliche Leukozyten, die hTNF erzeugen können und die man aus frischem menschlichen Blut gewonnen hat, kann man in Kombination mit einer oder mehreren der genannten Zellinien verwenden.

Der hTNF-Auslöser, den man erfindungsgemäß verwenden kann, kann einer oder mehrere Auslöser sein, der bzw. die die hTNF-Erzeugung in den menschlichen Zellen induzieren, die man durch Vermehrung der menschlichen Zellinie unter Ver wendung der nährenden Körperflüssigkeit erhalten hat, welche von dem Tier zugeführt wird: Beispielsweise sind ein üblicher α-Interferonauslöser (IFN-α-Auslöser), wie z. B. Virus, Nucleinsäure und Nucleotid; gamma-Interferon auslöser (IFN-gamma-Auslöser), wie z. B. Phytohämagglutinin, Concanavalin A, Mitogen aus Kermesgewächs (Phytolacca americana), Lipopolysaccharid, Endotoxin, Polysaccharid oder Bakterien als hTNF-Auslöser verwendbar: Im allgemeinen bevorzugt man einen IFN-α-Auslöser, weil man damit hTNF eines viel höheren Reinheitsgrades induzieren kann.

Bestimmte Antigene wirken als hTNF-Auslöser auf Zellen, die man mit dem jeweiligen Antigen sensibilisiert hat.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Kombination von IFN-α-Auslösern und IFN-gamma-Auslösern als hTNF-Aus löser vorteilhaft eine bemerkenswerte Steigerung der in duzierten hTNF-Erzeugung bewirkt.

Ferner wurde festgestellt, daß diese Kombination zur gleichzei tigen Erzeugung einer beträchtlichen Menge von humanspezifischem Interferon (HuIFN) zusätzlich zu den biologisch aktiven Substanzen einschließlich TNF führt.

Es ist also anzunehmen, daß man durch Verwendung eines derartigen Auslösers sowohl eine gleichzeitige und billige Massenherstellung von zwei oder mehr biologisch aktiven Substanzen ermöglicht, wie z. B. kostbares hTNF und HuIFN, als auch eine viel wirksamere Verwendung der vermehrten menschlichen Zellen ermöglicht.

Die menschliche Zellinie, die man erfindungsgemäß verwenden kann, ist eine Zellinie, die man in vitro auf übliche Weise vermehren kann. Um das erfindungsgemäße Verfahren wir kungsvoll durchzuführen, bevorzugt man die Verwendung von menschlichen Zellen, die man vermehrt hat, indem man die menschliche Zellinie auf ein nicht-menschliches warmblütiges Tier transplantiert oder wahlweise dazu die menschliche Zellinie sich in einer Diffusionskammer vom üblichen Typ vermehren ließ, durch welche die nährende Körperflüssigkeit eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres der Zellinie zugeführt wird: Im Gegensatz zu üblichen Methoden, wobei man lebende menschliche Zellen in vitro vermehrt, liefert die Methode unter Verwendung der Arbeitsweise in vivo nicht nur ein hTNF mit viel höherem Reinheitsgrad, sondern be nötigt ferner kein oder viel weniger Nährmedium mit einem Gehalt an teurem Serum und macht dadurch die Erhaltung der Kultur während der Zellvermehrung viel leichter.

Ferner kann man das erfindungsgemäße Verfahren von den üb lichen Zellvermehrungsmethoden in vitro unter Verwendung von Gewebekulturen dadurch unterscheiden, daß man zusätz liche Merkmale erzielen kann, nämlich eine viel besser sta bilisierte und raschere Zellvermehrung, eine höhere Zell produktion und eine außerordentlich erhöhte Ausbeute an hTNF pro Zelle.

Das nicht-menschliche warmblütige Tier, das man erfindungsgemäß verwenden kann, ist ein Tier, wie es in der US-PS 4 276 282 beschrieben ist.

Da die Transplantation einer derartigen menschlichen Zell linie auf das Tier unerwünschte Immunreaktionen bewirkt, ist es wünschenswert, zu einer möglichst starken Verminderung der Immunreaktion ein nicht-menschliches warmblütiges Tier im jüngsten möglichen Zustand zu verwenden, z. B. als Ei, Embryo oder Fetus oder als Neugeborenes oder jüngstes Tier.

Vor der Transplantation kann man ein derartiges Tier ferner mit Röntgenstrahlen oder gamma-Strahlen von etwa 200 bis 600 rem bestrahlen oder ein Antiserum oder Immunsuppressivum injizieren, um die Immunreaktion auf das niederste mögliche Niveau herabzudrücken.

Wenn man nackte Mäuse oder nackte Ratten als Wirtstier ver wendet, kann man, weil das Tier weniger unerwünschte Immun reaktionen sogar in seinem erwachsenen Zustand zeigt, auf das Tier leicht beliebige der genannten Zellinien ohne eine derartige Vorbehandlung transplantieren, und die Zellinien vermehren sich darin, wobei man weniger befürchten muß, daß unerwünschte Immunreaktionen bewirkt werden.

Man kann sowohl die Stabilisierung der Zellvermehrung als auch die Steigerung der hTNF-Erzeugung durch wiederholte Transplantation unter Verwendung von verschiedenen nicht menschlichen warmblütigen Tieren erzielen: Beispielsweise kann man diese Vorteile erzielen, indem man zuerst die Zell linie auf Hamster transplantiert und darin vermehrt und danach die vermehrten menschlichen Zellen auf nackte Mäuse neu transplantiert. In diesem Fall kann man die wiederholte Transplantation unter Verwendung eines nicht-menschlichen warmblütigen Tieres der gleichen Klasse oder Ordnung sowie der gleichen Art oder der gleichen Gattung durchführen.

Was den Körperteil des Tieres betrifft, auf den man die Zellinie transplantieren kann, kann man die Zellinie auf einen beliebigen Körperteil des Tieres transplantieren, sofern sich die Zellinie darin vermehrt: Beispielsweise in die Allantoishöhle oder intravenös, intraperitoneal oder subkutan.

Statt die Zellinie auf das Tier zu transplantieren, kann man beliebige der beschriebenen Zellinien leicht vermehren, indem man sie in eine übliche Diffusionskammer einbringt, deren Form und Größe verschieden sein kann, und die bei spielsweise ein Membranfilter, Ultrafilter oder Hohlfaser filter einer nominalen Porengröße von etwa 10^-7 bis 10^-5 m aufweist, das die Verunreinigung der Kammer mit tierischen Zellen verhindert aber die Zellinie mit der nährenden Kör perflüssigkeit versorgt; indem man beispielsweise intra peritoneal die Kammer in das Tier einbettet; und die Zell linie sich darin unter Verwendung der nährenden Körperflüssigkeit vermehren läßt, die vom Tier zugeführt wird.

Ferner kann man die Diffusionskammer beispielsweise auf dem Tier derart vorsehen und anordnen, daß die nährende Körperflüssigkeit und nährende Lösung in der Kammer frei durch die Kammer zirkulieren können. In diesem Fall kann man die Kultur in der Kammer während der Zellvermehrung durch ein oder mehrere transparente Seitenfenster beobachten, das bzw. die in einer oder mehreren der Kammerwände vorgesehen sind, und/oder man kann die Kammer wiederholt durch eine frische Kammer ersetzen, wodurch man sowohl die Zellver mehrung über den Lebenszeitraum hinaus fortsetzen, ohne das Tier zu töten, als auch die Zellproduktion pro Tier viel stärker steigern kann.

Da die Verwendung einer derartigen Diffusionskammer eine geringere Auslösung von unerwünschten Immunreaktionen be wirkt, weil keine direkte Berührung der menschlichen Zel len mit den tierischen Zellen stattfindet, kann man ein beliebiges nicht-menschliches warmblütiges Tier leicht als Wirt ohne Vorbehandlung verwenden, und man kann die vermehrten menschlichen Zellinien leicht daraus gewinnen.

Die Fütterung des Tieres kann man leicht auf übliche Weise durchführen, und es ist keinerlei Spezialbehandlung sogar nach der Transplantation erforderlich.

Der Zeitraum, den man benötigt, um eine maximale Zellver mehrung zu erzielen, beträgt im allgemeinen 1 bis 10 Wo chen. Die Anzahl der derart erhaltenen menschlichen Zellen kann etwa 10⁷ bis 10¹² pro Tier oder mehr betragen. Ins besondere vermehren sich die transplantierten menschlichen Zellen auf das etwa 10²- bis 10⁷-fache oder mehr, was eine etwa 10- bis 10⁶-fache oder noch höhere Ausbeute ist im Vergleich zu jener, die man unter Verwen dung der Vermehrungsmethode in vitro unter Verwendung eines Nährmediums erzielt: Demgemäß sind die vermehrten menschlichen Zellen vorzugsweise zur Lösung der Aufgabe der Erfindung geeignet.

Man kann eine beliebige Methode, durch welche in den ver mehrten menschlichen Zellen die Erzeugung von hTNF indu ziert wird, gemäß der Erfindung anwenden: Die vermehrten menschlichen Zellen kann man in dem Tier, das man als Wirt für die Zellvermehrung verwendet, einem hTNF-Auslöser aussetzen. Beispielsweise setzt man menschliche Zellen, die man in suspendiertem Aszites vermehrt hatte, oder Tumor zellen, die man beispielsweise subkutan gebildet hatte, direkt in vivo einem hTNF-Auslöser aus, induziert die hTNF- Erzeugung, gewinnt das erzeugte bzw. angesammelte hTNF aus Aszites, Serum und/oder Tumor und reinigt danach das hTNF.

Wahlweise dazu kann man die vermehrten menschlichen Zellen aus dem Tier gewinnen und danach in vitro einem hTNF-Aus löser aussetzen: Beispielsweise suspendiert man die ver mehrten menschlichen Zellen, die man durch Gewinnung aus der Aszitessuspension oder durch Extraktion und Zerteilen des massiven Tumors bzw. der massiven Tumoren erhalten hat, den bzw. die beispielsweise subkutan gebildet wurden, in einem Nährmedium, das man auf eine Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 40°C vorgewärmt hat, bis zu einer Zelldichte von etwa 10 ⁵ bis 10⁸ Zellen pro ml, setzt sie in vitro einem hTNF-Auslöser aus und sammelt danach das gebildete hTNF aus der Kultur.

Wenn man die menschliche Zellinie in einer üblichen Diffu sionskammer vermehrt, kann man die vermehrten menschlichen Zellen in der Kammer oder nach der Gewinnung daraus einem hTNF-Auslöser aussetzen.

Die derart erhaltenen menschlichen Zellen kann man ferner in vitro weitere 1 bis 4 d kultivieren und die Fortpflan zungszeit vor der hTNF-Induktion einstellen.

Die hTNF-Erzeugung pro Tier kann man ferner steigern, indem man beliebige der nachstehenden Methoden anwendet:

(1) eine Methode, worin man die vermehrten menschlichen Zellen einem hTNF-Auslöser in dem Tier aussetzt, das man als Wirt für die Zellvermehrung verwendet hat, die mensch lichen Zellen danach aus einem oder mehreren bestimmten Körperteilen des Tieres oder aus seinem gesamten Körper gewinnt und danach die menschlichen Zellen einem hTNF- Auslöser in vitro aussetzt;
(2) eine Methode, worin man menschliche Zellen wiederholt in vitro und/oder in vivo einem hTNF-Auslöser aussetzt; und/oder
(3) eine Methode, worin man die Diffusionskammer, die man in das Tier eingebettet oder auf dem Tier angebracht hat, wiederholt durch eine frische Kammer ersetzt.

Das derart erhaltene hTNF kann man leicht durch Reinigungs- und Abtrennungsmethoden unter Verwendung üblicher Maßnahmen sammeln, wie z. B. Einengen, Aussalzen, Dialyse, Filtrieren, Zentrifugieren und/oder Lyophilisieren. Wenn eine stärker gereinigte hTNF-Zubereitung erwünscht ist, kann man eine Zubereitung höchst möglicher Reinheit mit den genannten Methoden in Kombination mit anderen üblichen Methoden erhalten, z. B. Adsorption und Desorption an Ionenaustauschern, Gelfiltration, Elektrophorese und/oder Fraktionierung am isoelektrischen Punkt.

Wenn man anstelle der genannten Methoden eine Affinitäts chromatographie unter Verwendung entweder eines Antikörpers oder eines Mitogens als einem Liganden anwendet, z. B. Con A-Sepharose kann man eine raschere und leichtere Herstellung von hochreinem hTNF erzielen.

Die Erfindung betrifft ferner das entsprechend dem erfindungs gemäßen Verfahren herstellbare hTNF, das praktisch keinerlei Zyto toxizität gegenüber normalen menschlichen Zellen, jedoch eine bemerkenswerte Zytotoxizität gegenüber verschiedenen menschlichen Tumorzellen mit ihrer anschließenden Zytolyse bewirkt. Demgemäß kann man das gemäß der Ausführungs form des erfindungsgemäßen Verfahrens herstellbare hTNF vorteilhaft als prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen Krankheiten verwenden, die auf hTNF ansprechen, wie z. B. maligne Tumore, deren Behandlung bisher als sehr schwierig angesehen wurde.

Den hTNF-Gehalt prüfte man mit der TNF-Prüfmethode, die von E. Pick "Tumor Necrosis Factor in Lymphokines", Bd. 2, S. 235 bis 272, Academic Press, Inc. (1981) be richtet wurde, wobei man die Zellinie von Mäusen, L-929, in Gegenwart von hTNF für einen bestimmten Zeitraum in kubiert und die überlebenden Zellen zählt.

Den Gehalt an HuIFN prüfte man mit der üblichen Löcher reduktionsmethode, die in Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Bd. 20, Nr. 6, S. 616 bis 643 (1975) beschrieben ist, unter Verwendung von FL-Zellen aus menschlichem Amnion.

Den Hämagglutinierungstiter prüfte man mit der Methode, die in J. E. Salk, Journal of Immunology, Bd. 49, S. 87 (1944) berichtet wurde, mit einer leichten Modifizierung.

Nachstehend wird die Erfindung durch Versuche, Beispiele und Untersuchungen näher erläutert.

Die nachstehenden Herstellungsversuche erläutern die Er zeugung von hTNF.

Fähigkeit von in vitro oder in vivo vermehrten menschlichen Zellen, Tumor-Nekrose-Faktor zu erzeugen:

Herstellungsversuch 1: Zellvermehrung in vitro

Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1- Zellen, die aus B-Zellen stammten, transplantierte man in ein RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2), das man mit 20 Volumen-% fetalem Kälberserum ergänzt hatte, und kultivierte sie in Suspension bei 37°C. Die vermehrten menschlichen Zellen wusch man mit serumfreiem RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2), suspendierte sie danach in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung und erhielt eine Zell dichte von etwa 1×10⁶ Zellen/ml.

Herstellungsversuch 2: Zellvermehrung in vivo

Nachdem man neugeborenen Hamstern Antiserum, das man aus Kaninchen auf übliche Weise hergestellt hatte, zur Vermin derung der Immunreaktion injiziert hatte, transplantierte man den Tieren subkutan eine menschliche lympho blastartige Zellinie, BALL-1, die aus B-Zellen stammte, und fütterte danach die Hamster auf übliche Weise drei Wochen lang. Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, extrahierte man und zerteilte sie durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin. Danach wusch man die Zellen mit serumfreiem RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2) und sus pendierte sie wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 1×10⁶ Zellen/ml.

Vergleichsbeispiel

Nachdem man Antiserum, daß man aus Kaninchen auf übliche Weise gewonnen hatte, in neugeborene Hamster injiziert hatte, um ihre Immunreaktion zu vermindern, transplantierte man den Tieren subkutan eine menschliche lympho blastartige Zellinie, BALL-1-Zellen, und fütterte sie auf übliche Weise drei Wochen lang.

Die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 15 g extrahierte man, zerkleinerte sie und zerteilte sie durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin.

Die derart erhaltenen menschlichen Zellen wusch man mit serumfreiem RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2) und suspendierte sie wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 5×10⁶ Zellen/ml. Zu der Zellsuspension gab man sowohl Sendai virus als auch Phytomhämagglutinin in einer Menge von 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter bzw. etwa 200 µg/ml zu, inkubierte die Mischung danach bei 37°C 2 d und induzierte die Lymphotoxinerzeugung.

Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4°C und etwa 1000×980,7 cm/s² (1000 g) und dialysierte die über stehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Koch salzlösung mit einem Gehalt von 0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) 31 h lang. Die erhaltene Lösung, die eine Lymphotoxinaktivität aufwies, filtrierte man danach unter Verwendung eines Membranfilters, engte das Filtrat ein, lyophilisierte es und erhielt ein pulveriges Produkt.

Die Lymphotoxinausbeute betrug etwa 5×10⁷ Einheiten pro Hamster. Das Pulver enthielt ferner etwa 3,2×10⁷ Einheiten HuIFN.

Abtrennung des HuIFN-Bestandteils und Reinigung des Lymphotoxins in an sich bekannter Weise:

Den HuIFN-Bestandteil in dem erhaltenen pulverartigen Produkt entfernte man durch Adsorption und Desorption an einem Ionenaustauscher, Molekulargewichtsfraktionierung unter Anwendung der Gelfil tration, Einengen und Filtrieren unter Verwendung eines Membranfilters gemäß der Methode, die in G. Bodo, "Sympo sium on Preparation, Standardization and Clinical Uses of Interferon" 11-th International Immunobiological Symposium, 8 and 9 June 1977, Zagrev, Yugoslavia, beschrieben ist, engte das erhaltene HuIFN-freie Produkt ein und reinigte es durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat. Das erhaltene Produkt führte man danach einer Affinitäts chromatographie unter Verwendung von Phytohämagglutinin- Sepharose in einem 0,01 M Phosphatpuffer zu (0,01 Mol/l, pH-Wert 7,4) und eludierte den adsorbierten Teil, indem man eine frische Zubereitung des gleichen Puffers aufgab, der ferner 0,1 Mol/l (0,1 M) N-Acetyl-D-galactosamin enthielt.

Die eluierten Fraktionen, die eine Lymphotoxinaktivität aufwiesen, dialysierte man gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers jedoch ohne N-Acetyl-D-galactosamin, engte ein, lyophilisierte und erhielt ein pulverartiges Produkt.

Die spezifische Aktivität des derart erhaltenen Lympho toxins betrug etwa 30 000 Einheiten/mg Protein.

Eine Gelfiltration des pulverartigen Produktes bezüglich des Molekulargewichtes brachte die nachstehenden Ergebnisse: Das Produkt wurde in drei Bestandteile mit verschiedenen Molekulargewichten von etwa 7×10⁴ bis 9×10⁴ Dalton, etwa 3,5×10⁴ bis 5×10⁴ Dalton und etwa 1×10⁴ bis 2×10⁴ Dalton mit einem Aktivitätsverhältnis von etwa 1 : 1 : 2 aufgetrennt, das jeweils den beschriebenen α, β- und gamma-Lymphotoxinen hinsichtlich ihrer Molekulargewichte und anderen verfügbaren physikalisch chemischen Informationen entsprach. Alle Bestandteile waren Glycoproteine, und ihr Saccharidgehalt fiel in den Bereich von etwa 5 bis 45%, in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht.

Herstellungsbeispiel 1

Neugeborenen Hamstern injizierte man Antiserum, das man aus Kaninchen auf übliche Weise hergestellt hatte, verminderte ihre Immunreaktion soweit wie möglich, transplantierte ihnen danach subkutan eine menschliche Zellinie monzytischen Ursprungs, die man unter Verwendung von SV-40-Virus transformiert hatte, und fütterte die Hamster danach eine Woche lang auf übliche Weise. Danach injizierte man den Tieren intraperitoneal lebende BCG-Zellen in einer Impf lösung von 10⁷ Zellen pro Tier, unf fütterte die Tiere weitere zwei Woche lang.

Danach extrahierte man die erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 15 g, zerkleinerte sie und zerteilte sie durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin. Nachdem man die menschlichen Zellen mit Eagle′s Medium mit den minimalen Konzentrationen aller essentiellen Stoffe (pH-Wert 7,2) gewaschen hatte, welches man mit 5 Volumen-% menschlichem Serum ergänzt hatte, suspendierte man die Zellen in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 5×10⁶ Zellen/ml. Danach gab man zu der Zellsuspension E. coli-Endotoxin in einer Menge von etwa 10 µg/ml, in kubierte bei 37°C 16 h und induzierte die TNF-Erzeugung.

Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4°C und etwa 1000×980,7 cm/s² (1000 g), entfernte den Niederschlag und dialysierte die zurückbleibende überstehende Flüssig keit gegen eine physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pH-Wert 7,2) 21 h lang. Die erhaltene Lösung filtrierte man danach unter Verwendung eines Membranfilters, lyophilisierte das Filtrat, das eine TNF-Aktivität aufwies, und erhielt ein pulverartiges Produkt.

Den HuIFN-Bestandteil in dem pulverartigen Produkt ent fernte man durch Adsorption und Desorption mit einem Ionen austauscher, Molekulargewichtsfraktionierung unter Anwen dung der Gelfiltration, Einengen und Filtrieren unter Verwendung eines Membranfilters gemäß der Methode, die in G. Bodo, "Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon", 11th International Immunobio logical Symposium, 8 and 9 June 1977, Zagrev, Yugoslavia, beschrieben ist. Man reinigte das erhaltene HuIFN-freie Produkt durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat und durch Affinitäts chromatographie unter Verwendung von Con A-Sepharose und erhielt etwa 1×10⁶ Einheiten eines hochreinen TNF, das eine Zytolyse von Meth A-Sarkom bewirken konnte, und das prak tisch keinerlei Zytolyse von menschlichen normalen Zellen jedoch eine bemerkenswerte Zytolyse von menschlichen Tumor zellen bewirkte.

Das so erhaltene TNF enthielt keinen TNF-Auslöser, und seine spezifische Aktivität betrug etwa 350 000 Einheiten/mg Protein.

Herstellungsbeispiel 2

Nachdem man Antiserum, das man aus Kaninchen auf übliche Weise hergestellt hatte, neugeborenen Hamstern injiziert hatte, um ihre Immunreaktion zu vermindern, transplantierte man den Tieren subkutan eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, BALL-1, und fütterte die Tiere auf übliche Weise drei Wochen lang.

Nach dem Extrahieren und Zerkleinern der erhaltenen massiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 15 g zerteilte man die erhaltenen Tumore durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an Trypsin. Nachdem man die menschlichen Zellen mit serumfreien RPMI 1640-Medium (pH-Wert 7,2) gewaschen hatte, suspendierte man die menschlichen Zellen wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung bis zu einer Zelldichte von etwa 1×10⁷ Zellen/ml.

Zu der Zellsuspension gab man Sendaivirus und E. coli- Endotoxin in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter bzw. etwa 20 µg/ml und inkubierte danach 2 d die Zellsuspension bei 37°C und induzierte die TNF-Erzeugung.

Danach zentrifugierte man die Kultur bei 4°C und etwa 1000×980,7 cm/s² (1000 g) entfernte den Niederschlag, dialysierte die erhaltene überstehende Flüssigkeit gegen eine physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,01 Mol/l (0,01 M) Phosphatpuffer (pH 7,2) 21 h lang und filtrierte danach die erhaltene Lösung unter Verwendung eines Membranfilters. Danach konzentrierte man das Filtrat, das eine TNF-Aktivität aufwies, lyophilisierte es und erhielt ein pulverartiges Produkt.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 8,3×10⁷ Einheiten pro Hamster. Das Produkt enthielt ferner etwa 4,1×10⁷ Einheiten HuIFN.

Herstellungsbeispiel 3

Erwachsenen nackten Mäusen transplantierte man intraperi toneal eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, TALL-1, und fütterte die Tiere auf übliche Weise 5 Wochen lang. Danach injizierte man den Tieren intraperitoneal ein durch UV-Bestrahlung vorher inaktiviertes Newcastle-Disease-Virus in einer Impflösung von etwa 3000 Einheiten Hämagglutinierungstiter pro Tier, tötete die Tiere 24 h nach der Injektion und gewann danach den Aszites.

Den Aszites reinigte man, engte ihn ein und trocknete ihn wie in Herstellungsbeispiel 10 und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 6,2×10⁶ Einheiten pro nackte Maus. Das Produkt enthielt ferner etwa 4,5×10⁶ Einheiten HuIFN.

Herstellungsbeispiel 4

Neugeborenen Hamstern transplantierte man wie in Herstel lungsbeispiel 1 eine menschliche lymphoblastartige Zell linie, Namalva, und fütterte danach die Tiere auf übliche Weise 4 Wochen lang.

Wie in Herstellungsbeispiel 2 extrahierte man die erhaltenen masiven Tumoren, die sich subkutan gebildet hatten, von jeweils etwa 20 g, zerkleinerte sie und zerteilte sie wie im gleichen Beispiel und erhielt eine Zellsuspension mit einer Zelldichte von etwa 3×10⁶ Zellen/ml. Danach gab man zu der Zellsuspension Sendaivirus in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter, inku bierte danach bei 36°C 2 d und induzierte die TNF-Erzeu gung. Danach reinigte man die Kultur und engte sie ein wie in Herstellungsbeispiel 2 und erhielt ein Konzentrat das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 4,3×10⁷ Einheiten pro Hamster. Das Produkt enthielt ferner etwa 8,2×10⁶ Einheiten HuIFN.

Herstellungsbeispiel 5

Nachdem man eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, NALL-1-Zellen, in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert hatte, setzte man die Zellsuspension in eine zylindrische Diffusionskammer aus Kunststoff mit einem inneren Volumen von etwa 10 ml ein, welche mit einem Mem branfilter einer nominalen Porengröße von etwa 0,5 µm versehen war, und bettete die Kammer intraperitoneal in eine erwachsene Ratte ein.

Das Tier fütterte man danach auf übliche Weise 4 Wochen lang und entfernte danach die Kammer.

Die Zelldichte in der Kammer, die man erzielte, betrug etwa 5×10⁸ Zellen/ml, was das etwa 10²-fache oder mehr jener war, die man mit einer Gewebekulturmethode in vitro mit einem CO₂-Inkubator unter Verwendung eines Nährmediums erzielte.

Die vermehrten menschlichen Zellen suspendierte man wieder in einem frischen Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Herstellungsbeispiel 1 bis zur gleichen Zelldichte, gab zu der erhaltenen Zellsuspension ein durch UV-Bestrahlung vorher inaktiviertes Newcastle-Disease-Virus und Phytohämagglutinin in einer Menge von etwa 500 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter bzw. etwa 100 µg/ml, inkubierte danach 2 d die Zellsuspension bei 37°C und induzierte die TNF-Erzeugung.

Danach reinigte man die Kultur, konzentrierte sie und trocknete sie wie in Herstellungsbeispiel 2 und erhielt ein pulverartiges Produkt, das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 2,6×10⁷ Einheiten pro Ratte. Das pulverartige Produkt enthielt ferner etwa 9,4×10⁶ Einheiten HuIFN.

Herstellungsbeispiel 6

Eine menschliche lymphoblastartige Zellinie, JBL-Zellen, transplantierte man in die Allantoishöhlen von Eiern mit Embryonen, die man bei 37°C 5 d lang inkubiert hatte, und inkubierte die Eier weiter bei dieser Temperatur eine zusätzliche Woche lang.

Danach suspendierte man die vermehrten menschlichen Zellen in einem frischem Medium der gleichen Zusammensetzung wie in Herstellungsbeispiel 1 bis zu einer Zelldichte von 5×10⁶ Zellen/ml. Zu der Zellsuspension gab man danach Sendaivirus in einer Menge von etwa 1000 Einheiten/ml Hämagglutinierungstiter, inkubierte bei 37°C 1 d lang und induzierte die TNF-Erzeugung. Die Kultur reinigte man danach, konzentrierte sie wie in Herstellungsbeispiel 2 und erhielt ein Konzentrat, das eine TNF-Aktivität aufwies.

Die TNF-Ausbeute betrug etwa 1,5×10⁶ Einheiten pro 10 Eier mit Embryonen und die verfügbaren physikalisch chemischen Eigenschaften stimmten gut mit jenen überein, die von Carswell et al. berichtet wurden. Das Konzentrat ent hielt ferner etwa 4,0×10⁵ Einheiten HuIFN pro 10 Eier mit Embryonen.

Das erfindungsgemäße hTNF, das man in den beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung erhalten hat, ist vorteil haft als prophylaktisches und/oder therapeutisches Mittel gegen Krankheiten einsetzbar, die auf hTNF ansprechen.

Der Ausdruck "Krankheit, die auf hTNF anspricht" umfaßt in diesem Zusammenhang alle menschlichen Krankheiten, die man unter Verwendung von hTNF verhüten und/oder behandeln kann: Beispielsweise maligne Tumoren, wie z. B. Brustkrebs, Lungenkrebs, Gebärmutterkrebs, Blasenkrebs, Dickdarmkrebs, Magenkrebs, Leukämie, Lymphom und Hautkrebs.

Die nachstehenden Untersuchungen und Versuche erläutern die Wirksamkeit, Toxizität, die Anwendungsvorschriften und Dosierung des erfindungsgemäßen hTNF.
Untersuchung der Wirksamkeit und Toxizität von TNF:

Untersuchung 1

Nackten BALB/C-Mäusen transplantierte man subkutan in den Rückenbereich kleine Bruchstücke eines menschlichen Brust krebsgewebes.

Nachdem die erhaltenen massiven Tumoren auf etwa 200 mm³ angewachsen waren, injizierte man gleiche Mengen der TNF- Zubereitung von Herstellungsbeispiel 9 intravenös jeden Tag in einer Dosierung von entweder 100 Einheiten/kg/d oder 1000 Einheiten/kg/d. 15 d nach der ersten Injektion tötete man die Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Eine TNF-freie physiologische Kochsalzlösung injizierte man intravenös als Vergleich.

Tabelle I

Untersuchung 2

Gruppen von je 10 männlichen BDF₁-Mäusen pro Gruppe mit einem Gewicht von etwa 25 g pro Maus transplantierte man subkutan in den Rückenbereich Gewebestückchen von Lewis′s- Lungenkrebs von 2 mm im Quadrat. Nach einem Zeitraum von 8 d nach der Transplantation injizierte man den Tieren jeden Tag das TNF von Herstellungsbeispiel 1 in einer Dosierung von entweder 100 Einheiten/kg/d oder 1000 Einhei ten/kg/d. 21 g nach der ersten Injektion tötete man die Tiere und wog die erhaltenen massiven Tumoren. Die Ergeb nisse sind in Tabelle II gezeigt. Eine TNF-freie physio logische Kochsalzlösung injizierte man intravenös als Ver gleich.

Tabelle II

Untersuchung 3

Eine Prüfung der akuten Toxizität der TNF-Zubereitung von Herstellungsbeispiel 1 unter Verwendung von 20-d-alten Mäusen bestätigte, daß die Toxizität der TNF-Zubereitung außerordentlich gering ist, d. h. einen LD₅₀-Wert von 200 000 Einheiten/kg oder mehr nach intraperitonealer In jektion aufweist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Tumor-Nekrose-Faktor (hTNF), dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) eine oder mehrere Zellinien aus der aus BALL-1-, Namalva-, M-7002-, B- 7101-, JBL-, EBV-Sa, CCRF-SB- (=ATCC CL 120), EBV-Wa-, TALL-1-, MOLT-3-, Nall-1-, EBV-HO-Zellen, CCRF-CEM-Zellen und Balm-2-Zellen und anderen etablierten Zellinien, die man durch Transformieren von normalen Monozyten oder Granulozyten unter Verwendung eines beliebigen karzinogenen Virus, Mittels oder karzinogener Strahlung erhalten hat, bestehenden Gruppe einem oder mehreren α-Interferon- und/oder γ-Interferonauslösern aussetzt und dadurch eine Tumor-Nekrose-Faktor-Erzeugung induziert,
(b) die Kultur bei 4°C und 1000 x/g zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit gegen eine physiologische NaCl-Lösung mit einem Gehalt von 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) dialysiert, die erhaltene Lösung unter Verwendung eines Membranfilters filtriert und dann lyophilisiert,
(c) aus dem so erhaltenen pulvrigen Produkt durch Adsorption und Desorption an einem Ionenaustauscher, Molekulargewichtsfraktionierung unter Anwendung der Gelfiltration, Einengen und Filtrieren unter Verwendung eines Membranfilters, das Humaninterferon entfernt und
(d) das hIFN-freie Produkt durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von ConA-Sepharose reinigt.

2. Menschlicher Tumor-Nekrose-Faktor, erhältlich mit den Maßnahmen des Anspruchs 1 in der angegebenen Reihenfolge.