CH664974A5

CH664974A5 - Production du facteur de lyse des cellules-cibles.

Info

Publication number: CH664974A5
Application number: CH4420/82A
Authority: CH
Inventors: Masakazu Mitsuhashi; Haruo Ohnishi
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab; Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1981-07-21
Filing date: 1982-07-20
Publication date: 1988-04-15
Also published as: AT387980B; US4495282A; AU560793B2; SE9000532L; GB2106117A; IT1196549B; DE3227262C3; ATA283582A; FR2513124A1; SE9000532D0; FR2513124B1; SE8204382D0; SE8204382L; DE3227262C2; AU8620082A; IT8248855A0; GB2106117B; DE3227262A1

Description

DESCRIPTION

La présente invention apporte un procédé pour la production du facteur de lyse de cellules cibles (désigné ci-après par TCLF) qui peut être utilisé comme agent thérapeutique, en particulier contre les tumeurs malignes.

Le facteur de lyse suivant l'invention («Target Cell Lysis Factor», en abrégé TCLF) est un facteur de cytotoxicité vis-à-vis de la lignée fibroblastoïde de la souris L-929, avec cytolyse subséquente de ces cellules; deux types de TCLF sont connus jusqu'à présent, notamment la lymphotoxine et le facteur de nécrose tumorale (TNF).

Comme décrit par Ryuichi AOKI et coll., SHIN-MENE-KIGAKU SOSHO, vol. 6 «Lymphokines», publié par Igaku Shoin Ltd., Tokyo, Japan (1979), et B.R. Bloom et P.R. Giade, «In Vitro Methods in Cell-Mediated Immunity», publié par Academic Press,

Inc. (1971), la lymphotoxine désigne une substance protéinique, capable d'exercer la cytotoxicité intra- ou/et extracellulaire, qui peut être induite par exemple par l'exposition des cellules T sensibilisées à un antigène ou des cellules T non sensibilisées à un inducteur de lymphotoxine tel que mitogène comprenant la phytohémagglutinine ou concanavaline A. Il est bien établi que la cytotoxicité de la lymphotoxine s'exerce tant sur des cellules tumorales que sur des cellules normales.

D'après E.A. Carswell et coll., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, vol. 72, N° 9, p. 3666-3670 (1975) et E. Pick, «Tumor Necrosis Factor in Lymphokinese, vol. 2, p. 235-272 (1981), publié par Academic Press, Inc., le facteur de nécrose tumorale TNF est une substance protéinique inductible, par exemple, dans des macrophages par l'administration parentérale au lapin d'un inducteur de TNF, tel que bacille de Çalmet-Guérin (BCG), Corynebacterium parvum, ou endotoxine; il est capable de produire la nécrose hémorragique du sarcome Meth A. Il est également bien connu que le TNF ne donne lieu pratiquement à aucune cytolyse des cellules humaines normales, mais remarquablement sur les cellules cibles de la lignée L-929 de souris et sur les cellules tumorales de l'homme. L'activité prometteuse du TCLF, comme agent thérapeutique contre les tumeurs malignes, se double d'une forte utilité due à sa fonction cytologique sur les cellules tumorales. Bien que pratiquement la spécificité du TCLF ne laisse pas prévoir la possibilité d'utiliser du TCLF d'origine animale, par exemple du lapin ou du rat, pour traiter les maladies humaines, l'emploi du TCLF, provenant des cellules humaines viables, est re-commandable parce qu'il élimine l'antigénicité et les autres effets secondaires du traitement.

L'invention a pour but de trouver un procédé efficace et applicable à l'échelle industrielle pour la production du TCLF.

Ce but est atteint par un procédé du type mentionné dans l'introduction et caractérisé selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 1, éventuellement en combinaison avec un procédé du type caractérisé dans la revendication 2. Des modes d'exécution avantageux du procédé découlent des. revendications dépendantes 3 à 6.

L'invention concerne en plus le TCLF obtenu par le procédé caractérisé selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 7.

L'invention concerne aussi une composition thérapeutique définie par les caractères de la revendication 8. Des modes d'exécution particulièrement favorables de la composition sont définis par les revendications dépendantes 9 à 11.

C'est que les auteurs de la présente invention ont étudié différents procédés applicables à l'échelle industrielle pour la production du TCLF, ainsi que les applications potentielles de ce dernier comme agent thérapeutique pour les tumeurs malignes. Ils ont trouvé que de grandes quantités de TCLF peuvent être obtenues aisément à partir des cellules humaines, de préférence produites par la multiplication de lignées capables de former du TCLF, par exposition de ces cellules à l'action d'un inducteur approprié et ensuite collecte et purification du TCLF accumulé.

Ces études ont montré que le TCLF obtenu peut comprendre au moins 3 types de glycoprotéines de masses molaires différentes, d'environ 104 à105 u (daltons), qui n'ont pratiquement aucune action cytolytique sur des cellules humaines normales, mais une action remarquable sur les cellules tumorales humaines, ainsi que sur les cellules cibles de souris L-929.

La lignée de cellules humaines utilisable pour la présente invention peut être une de celles qui sont multipliables in vitro par des méthodes habituelles. Afin de réaliser l'invention d'une façon plus efficace, il est préférable d'utiliser les cellules humaines qui ont été multipliées par la transplantation de la lignée donnée dans un animal à sang chaud ou bien dans une chambre de diffusion de type usuel, dans laquelle elles ont été nourries avec un fluide de l'animal. Contrairement aux procédés habituels, où les cellules humaines sont multipliées in vitro, des teneurs bien plus fortes en TCLF sont obtenues par la méthode in vivo qui n'exige pas ou peu de milieu nutritif

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contenant du sérum coûteux; la culture des cellules est ainsi plus aisée.

USP N° 4 276 282 (Sujimoto et coll.) décrit un procédé perfectionné pour la production de l'interféron spécifique, humain, désigné par Hu-IFN, qui présente une activité inhibitrice des infections virales, mais ce brevet n'indique aucune possibilité d'utilisation d'animaux à sang chaud pour produire du TCLF.

Suivant la présente invention, certaines lignées de cellules humaines peuvent être aisément multipliées par l'utilisation d'un fluide nutritif d'un animal à sang chaud: cela est réalisé par la transplantation de ces cellules dans l'animal ou par l'emploi d'une chambre de diffusion recevant ce fluide nutritif de l'animal, la chambre étant placée dans le corps de ce dernier, qui est alimenté de la manière habituelle.

Par rapport à la méthode classique de multiplication des cellules in vitro, à partir de culture de tissu, le procédé suivant l'invention permet une multiplication plus régulière, plus rapide, à rendement plus grand avec une production plus importante de TCLF par cellule.

Les cellules humaines facilement transplantables et multipliables dans un corps d'animal, pouvant être employées suivant l'invention pour la production du facteur TCLF, sont par exemple Namalwa, Journal of Clinical Microbiology, vol. 1, p. 116-117 (1975); BALL-1, TALL-1 et NALL-1, selon I. Miyoshi, Nature, vol. 267, p. 843-844 (1977); M-7002 et B-7101, Journal of Immunology, vol. 113, p. 1334-1345 (1974); JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3 et EBV-HO, The Tissue Culture, vol. 6, N° 13, p. 527-546 (1980); CCRF-SB (ATCC CCL 120); BALM 2; DND-41. D'autres lignées de cellules établies conviennent, notamment celles qui proviennent de la transformation de monocytes ou de granulocytes normaux sous l'effet de tout virus, agent ou radiation carcinogène.

Une augmentation sensible de la vitesse de multiplication des cellules, et/ou de la production de TCLF par cellule, peut être réalisée par l'emploi d'une lignée de lymphoblastoïdes humains avec des gènes humains codant pour le TCLF au moyen de la fusion cellulaire au polyéthylène glycol ou au virus Sendai, ou bien par la technique de recombinaison de gènes avec de la nucléase, la ligase et l'ADN polymérase.

Il est bien entendu que l'énumération ci-dessus de différentes cellules est donnée seulement à titre d'exemple non limitatif.

Ainsi des leucocytes humains, préparés à partir du sang frais, peuvent être utilisés en combinaison avec les différentes lignées sus-indiquées.

Les animaux à sang chaud qui peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention, et dans lesquels la lignée des cellules appropriées est multipliable, sont tels que volailles, notamment poulet ou pigeon, mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, lapin, porc, cheval, vache, cochon d'Inde, rat, rat nu, hamster, souris et souris nue.

Afin de réduire au minimum l'immunoréaction, il est recomman-dable d'employer des animaux aussi jeunes que possible, de préférence dans un stade tel qu'oeuf, embryon, fœtus ou nouveau-né.

Avant la transplantation, l'animal peut être traité par des rayons X ou gamma, à environ 200 à 600 rem, ou par injection d'antisérum ou d'un immunosuppresseur. Un tel traitement, réducteur de l'immunoréaction, peut être omis lorsqu'on utilise la souris nue ou le rat nu.

Il est possible d'améliorer la stabilisation de la multiplication cellulaire et l'augmentation de la production de TCLF par des transplantations répétées dans différents animaux à sang chaud. Par exemple, on peut d'abord transplanter les cellules dans un hamster et ensuite, après leur multiplication, les retransplanter dans la souris nue. La retransplantation peut d'ailleurs avoir lieu dans un animal de la même espèce que pour la transplantation initiale.

En ce qui concerne l'endroit du corps de l'animal où effectuer la transplantation, il peut être choisi parmi tous ceux qui permettent la multiplication des cellules, par exemple cavité allantoïque, veine, péritoine, peau.

Dans le cas où la multiplication des cellules humaines est effectuée dans une chambre de diffusion placée dans le corps de l'animal, la chambre peut être munie d'un filtre, d'un ultrafiltre ou d'un filtre creux, d'une dimension nominale de pores d'environ 10~7 à 10-5 m pour éviter la contamination de la chambre avec les cellules animales, tout en laissant alimenter cette chambre avec le fluide nutritif du corps de l'animal. La chambre est insérée dans le corps de l'animal, par exemple sous le péritoine, de façon à y laisser circuler librement la solution nutritive. La culture des cellules peut être observée éventuellement par une fenêtre transparente placée dans la paroi de la chambre. La chambre peut être remplacée périodiquement par une autre chambre fraîche, de façon à continuer la multiplication sans sacrifier l'animal.

Le temps nécessaire à l'obtention du maximum de multiplications cellulaires est généralement de 1 à 10 semaines. Le nombre des cellules humaines ainsi obtenues peut s'élever à 107 à 1012 par animal, ou même davantage, autrement dit le nombre des cellules transplantées suivant l'invention est multiplié par 102 à 107, ou davantage, c'est-à-dire environ 10 à 106 fois plus de ce que l'on obtient par culture in vitro.

Les cellules humaines multipliées sont soumises à l'action de l'inducteur approprié de TCLF. Par exemple, les cellules multipliées dans une suspension d'ascite où les cellules tumorales, formées par exemple sous la peau, sont exposées in vivo directement à l'action de l'inducteur de TCLF, après quoi le TCLF formé est récolté par exemple à partir de l'ascite du sérum ou/et de la tumeur; il est ensuite purifié. On peut cependant d'abord récolter les cellules multipliées et les soumettre ensuite in vitro à l'action de l'inducteur. Pour cela, elles peuvent être suspendues dans un milieu nutritif, chauffées vers 20 à 40° C de façon à atteindre une densité de 105 à 108 cellules par ml, avant d'être soumises à l'action de l'inducteur de TCLF.

Dans le cas de l'utilisation d'une chambre de diffusion, l'induction peut avoir lieu dans cette chambre même ou après la récolte des cellules multipliées. Il peut être indiqué de continuer la culture in vitro pendant 1 à 4 jours après le retrait de la chambre de diffusion, avant le traitement par l'inducteur.

La production de facteur TCLF peut être augmentée par l'application d'un des modes opératoires suivants.

1) Les cellules humaines, multipliées, sont exposées à l'action de l'inducteur de TCLF, dans l'animal hôte lui-même dans lequel a eu lieu la multiplication; elles sont ensuite récoltées et à nouveau traitées par l'inducteur, cette fois in vitro ; cela peut concerner les cellules retirées d'une ou de plusieurs parties du corps de l'animal.

2) Les cellules humaines, multipliées, sont exposées de façon répétée à l'inducteur de TCLF in vitro ou/et in vivo.

3) La chambre de diffusion incorporée dans l'animal est remplacée successivement par une nouvelle chambre.

Parmi les inducteurs du facteur de lyse de cellules cibles, TCLF, on peut citer l'inducteur usuel d'a-interféron (IFN-a), tel que virus, acide nucléique ou nucléotide; inducteur de y-interféron (IFN-y), notamment phytohémagglutinine, concanavaline A, mitogène de phytolaque, lipopolysaccharide, endotoxine, Polysaccharide, ou bactéries. En général, un inducteur IFN-a est préférable, parce qu'il permet d'induire un titre beaucoup plus élevé en TCLF.

Certains antigènes n'agissent pas comme inducteurs de TCLF dans des cellules qui ont été sensibilisées avec cet antigène.

On a constaté que l'emploi conjoint des inducteurs IFN-a et IFN-y présente l'avantage d'une augmentation remarquable de la production de TCLF. Il s'avère également que cette combinaison conduit à la production simultanée de Hu-IFN. Cela signifie qu'avec de tels inducteurs on peut obtenir, à bas prix, une production en masse de simultanément deux, ou plus, substances biologiquement actives, notamment TCLF et Hu-IFN ; l'utilisation des cellules humaines, multipliées, est ainsi plus efficace.

Le TCLF obtenu peut être aisément récupéré avec purification et séparation par des méthodes classiques, par exemple par concentration, relargage, dialyse, filtration, centrifugation et/ou lyophilisation. Un produit de plus haute pureté peut être obtenu par les mé-

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ilioJes précédentes, combinées avec d'autres, par exemple adsorp-tion, désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, électropho-rèse ou/et fractionnement au point isoélectrique.

Au lieu des méthodes ci-dessus, on peut appliquer celle de la Chromatographie d'affinité avec de l'anticorps ou du mitogène comme ligand, par exemple «Con A-Sepharose» produit par Pharmacia Fine Chemicals AB à Uppsala (Suède); on peut atteindre ainsi une production plus rapide et plus abondante de TCLF de haute pureté.

Les trois glycoprotéines pouvant composer le facteur TCLF suivant l'invention ont respectivement les masses molaires d'environ 104 à 2 x 104, 3,5 x 194 à 5 x 104 et 7 x 104 à 9 x 104 u (daltons). Elles n'exercent pratiquement aucune cytolyse sur les cellules humaines normales, tout en cytolysant remarquablement les cellules humaines tumorales et également celles de la lignée L-929 de souris. Le TCLF est donc avantageusement utilisable comme agent prophylactique et/ou thérapeutique dans les cas de maladies justiciables de ce facteur, par exemple dans celui des tumeurs malignes dont le traitement était fort difficile jusqu'à présent.

Selon la présente description, les titres en facteur TCLF sont déterminés par le dosage de la lymphotoxine par la méthode de B.R. Bloom et P.R. Giade «In Vitro Methods in Cell-Mediated Immu-nity», publié par Academic Press, Inc. (1981) ou par celui de TNF par la méthode de E. Pick, «Tumor Necrosis Factor in Lymphoki-nese», vol. 2, p. 235-272, publié par Academic Press, Inc. (1981). Les cellules de la lignée L-929 de souris sont incubées en présence de TCLF pour un certain temps, après quoi les cellules survivantes sont comptées.

Les titres en Hu-IFN sont déterminés par la méthode classique de réduction sur plaque, utilisant des cellules humaines FL amniotiques; cette méthode est décrite dans «Protein, Nucleic Acid and Enzyme», vol. 20, N° 6, p. 616-643 (1975).

Quant à l'hémagglutination, ses degrés sont indiqués par la méthode de J.E. S ALK (Journal of Immunology, vol. 49, p. 87 de 1944) avec des légères modifications.

Des productions de lymphotoxine, un des types de TCLF, à partir de cellules humaines multipliées in vitro ou in vivo, sont décrites dans les expériences A qui suivent.

Expérience A-l (in vitro)

Des cellules humaines, de la lignée lymphoblastoïde d'origine de cellules B, BALL-1, ont été transplantées dans le milieu RPMI 1640 (pH 7,2), additionnées de 20% v/v de sérum fœtal de veau, et cultivées en suspension à 37° C. Les cellules ainsi multipliées ont été lavées avec du milieu RPMI 1640 exempt de sérum, puis remises en suspension dans du milieu frais de même composition, pour donner une densité cellulaire d'environ 106 cellules/ml.

Expérience A-2 (in vivo)

De l'antisérum de lapin, préparé à la manière habituelle, est injecté à des hamsters pour réduire l'immunoréaction de ceux-ci. On transplante alors à ces hamsters, en sous-cutané, des cellules humaines lymphoblastoïdes d'origine des cellules B, BALL-1 ; les animaux sont nourris normalement durant trois semaines. Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau, sont extraites et désagrégées par suspension dans une solution saline physiologique, contenant de la trypsine. Ensuite, les cellules sont lavées avec du milieu RPMI 1640 exempt de sérum (pH 7,2) et remises en suspension dans du même milieu, frais, jusqu'à une densité d'environ 106 cellules/ml.

Expérience A-3 (production de lymphotoxine)

Dans chacune des suspensions de cellules BALL-1 préparées aux expériences A-l et A-2 ci-dessus, on a effectué l'induction de la lymphotoxine à l'aide du virus de Sendai et/ou de phytohémagglutinine. Ces inducteurs étaient ajoutés à la suspension des cellules à raison respectivement de 300 titres d'hémagglutination par ml et/ou environ 50 ng par ml; les mélanges étaient ensuite laissés incuber à 37" C pendant 2 jours. Après l'incubation, on a noté la forte production simultanée de Hu-IFN-a et de Hu-IFN-y, ainsi que de lymphotoxine. Le tableau I donne la production de celle-ci.

On voit que la production de lymphotoxine in vivo est considérablement plus élevée qu'in vitro. L'emploi conjoint de virus Sendai et de phytohémagglutinine donne lieu à une action synergique extrêmement efficace, et plus forte in vivo. Il en résulte que l'emploi de l'inducteur IFN, très spécifique, préféré, est la combinaison d'IFN-a avec IFN-y pour l'induction de la lymphotoxine non spécifique de l'espèce animale.

Les exemples qui suivent illustrent la production de lymphotoxine et du TNF, c'est-à-dire des deux types de constituants du TCLF suivant l'invention. (Voir tableau I).

Tableau I

Inducteur de lymphotoxine

Productions en titres/ml

In v

Lymphotoxine itro

Hu-IFN

In

Lymphotoxine

>ivo

Hu-IFN

Virus Sendai (IFN-a)

Phytohémagglutinine (IFN-y)

Virus Sendai + phytohémagglutinine

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Exemple A-l:

A des hamsters nouveau-nés, on injecte d'abord de l'antisérum de lapin, préparé de la manière classique, afin de réduire leur immu-noréaction. Des cellules humaines de lignée lymphoblastoïde, BALL-1, sont alors transplantées sous la peau de ces animaux. Les hamsters sont nourris normalement pendant trois semaines. Les tumeurs massives formées, sous-cutanées, d'environ 15 g chacune, sont alors extraites, émincées et désagrégées par mise en suspension dans une solution saline, physiologique, contenant de la trypsine.

Les cellules humaines ainsi obtenues sont lavées avec du milieu RPMI 1640 (pH 7,2) exempt de sérum et remises en suspension dans du même milieu, frais, jusqu'à une densité d'environ 5 x 106 cellules/ml. A cette suspension on ajoute à la fois du virus de Sendai et de la phytohémagglutinine à environ respectivement 1000 titres d'hémagglutination par ml et 200 Hg/ml. Le mélange est laissé incuber à 37° C pendant 2 jours pour induire la formation de lymphotoxine. Après ce temps, la culture est centrifugée à 4° C sous environ 1000 g et le surnageant est dialyse pendant 21 heures contre une solution saline, physiologique, contenant 0,01 M de tampon phosphate à pH 7,2. La solution résultante, douée d'une activité de lymphotoxine, est ensuite filtrée sur membrane; le filtrat est concentré et lyophilisé pour former une poudre.

Le rendement en lymphotoxine est d'environ 5 x 107 unités par hamster; la poudre renferme également 3,2 x 107 unités Hu-IFN.

Exemple A-2:

Des cellules humaines BALL-1 sont mises dans le milieu minimal, essentiel, d'Eagle, de pH 7,4, additionné de 20% v/v de sérum fœtal de veau, et sont cultivées ainsi in vitro à 37° C. Après lavage des cellules multipliées, avec du milieu Eagle sans sérum, elles sont remises en suspension dans du même milieu, frais, jusqu'à la densité de 107 cellules/ml.

On ajoute alors à la suspension à la fois du virus de Sendai et de la concanavaline A, à raison de, respectivement, environ 1000 titres d'hémagglutination par ml et environ 5 |ig/ml; le mélange est incubé à 38° C durant une journée pour induire la production de lymphotoxine. Après centrifugation de la culture à 4° C sous environ 1000 g, le surnageant est dialysé 15 heures et traité comme à la fin de l'exemple précédent.

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Le rendement en lymphotoxine est d'environ 4,5 x 106 unités par litre de suspension, après l'induction. La production de Hu-IFN est d'environ 1,2 x IO7 unités/litre.

Exemple A-3:

Dans des souris nues, adultes, on transplante intrapéritonéale-ment des cellules humaines Namalva, après quoi les animaux sont nourris normalement pendant 5 semaines. On injecte alors aux animaux, toujours par voie intrapêritonéale, du virus de la maladie de Newcastle préalablement inactivé par des rayons ultraviolets,

dans un inoculum d'environ 3000 titres d'hémagglutination par animal.

24 heures après, les animaux sont sacrifiés et l'on récolte l'ascite formée. Celle-ci est purifiée et traitée comme dans l'exemple A-l pour l'obtention d'une poudre.

Le rendement en lymphotoxine est d'environ 9 x 106 unités par animal; la poudre contient également 5,2 x 106 unités de Hu-IFN.

Exemple A-4:

Les souris adultes sont irradiées aux rayons X à environ 400 rem, pour réduire leurs immunoréactions. On leur injecte ensuite, par voie sous-cutanée, des cellules humaines de la lignée lymphoblastoïde d'origine B, CCRF-SB. Les animaux sont nourris normalement durant 3 semaines. Les tumeurs massives, d'environ 10 g chacune, ainsi formées, sont extraites et traitées comme dans l'exemple A-l. On ajoute à la suspension de cellules obtenue du virus Sendai et de la concanavaline A en les quantités respectives d'environ 500 titres d'hémagglutination par ml et environ 0,8 jig par ml. On laisse l'incubation se poursuivre pendant 1 journée à 37° C pour induire la production de lymphotoxine.

Comme dans l'exemple A-l, la culture est purifiée et concentrée en un produit pulvérulent.

Le rendement en lymphotoxine est d'environ 2,4 x 107 unités par souris; la poudre renferme aussi environ 1,9 x 107 unités de Hu-IFN.

Exemple A-5:

Comme dans l'exemple A-l, on opère sur des hamsters nouveau-nés, avec des cellules humaines de la lignée lymphoblastoïde, JBL. On nourrit les animaux traités normalement pendant 4 semaines.

Les tumeurs massives formées sous la peau, d'environ 20 g chacune, sont désagrégées comme dans l'exemple A-l ; la suspension présente une densité d'environ 3 x 106 cellules/ml; elle est additionnée de virus Sendai à raison d'environ 1000 titres d'hémagglutination par ml, et soumise à l'incubation à 36° C pendant 2 jours. Après purification et concentration comme dans l'exemple A-2, la culture fournit par hamster 1,6 x 107 unités de lymphotoxine et 7 x 106 unités Hu-IFN.

Exemple A-6:

Des cellules humaines lymphoblastoïdes, EBV-HO, d'origine de cellules B, sont mises en suspension dans une solution saline, physiologique, et la suspension résultante est placée dans des chambres de diffusion cylindriques, en matière plastique, d'environ 10 ml de volume intérieur, munies d'un filtre de dimension nominale des pores d'environ 0,5 ji. Ces chambres sont insérées intrapéritonéale-ment dans les corps de rats adultes.

Les animaux sont nourris normalement pendant 4 semaines, après quoi les chambres sont retirées.

La densité des cellules multipliées dans les chambres est alors de 6 x 10® cellules par ml, soit environ 102 fois plus élevée que dans la culture in vitro avec un incubateur à C02 utilisant un milieu nutritif.

Les cellules humaines ainsi obtenues sont traitées comme dans l'exemple A-2. L'induction avec du virus de la maladie de Newcastle préinactivé thermiquement, à environ 500 titres d'hémagglutination par ml, et avec environ 100 |ig.de phytohémagglutinine/ml, est suivie d'une incubation de 2 jours à 37° C.

Purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-l, la poudre est obtenue avec un rendement en lymphotoxine d'environ 5,4 x 106 unités par rat, et elle contient 6,8 x 106 unités Hu-IFN.

Exemple A-7:

Des cellules BALL-1, de la lignée lymphoblastoïde humaine,

sont transplantées dans la cavité allantoïque d'œufs embryonnés, préincubés à 37° C pendant 5 jours; après la transplantation, les œufs continuent à être incubés encore durant une semaine. Les cellules multipliées sont récoltées des œufs et mises en suspension comme dans l'exemple A-l, pour donner une densité de 5 x 10e cellules/ml. On ajoute à la suspension du virus de Sendai à raison de 1000 titres d'hémagglutination par ml, et on laisse incuber 1 jour à 37° C. La culture est ensuite purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2.

Le rendement en lymphotoxine est d'environ 9 x 105 unités et 3,5 x 105 unités Hu-IFN pour 10 œufs embryonnés.

Exemple A-8:

Les opérations sont celles de l'exemple A-4, mais les cellules humaines utilisées de la lignée lymphoblastoïde sont les cellules MOLT-3.

Le rendement en lymphotoxine est alors d'environ 3,3 x 107 unités par souris. Le produit contient également environ 1,4 x 107 unités de Hu-IFN.

Exemple A-9:

Le constituant Hu-IFN, d'un produit en poudre obtenu selon l'exemple A-l, est éliminé par adsorption et désorption avec un échangeur d'ions, fractionnement suivant masse molaire par filtra-tion sur gel, concentration et filtration sur membrane, selon la méthode de G. BODO («Symposium sur Préparation, Standardisation et Applications chimiques de l'Interféron» — 11e Symposium International d'Immunobiologie, 8-9 juin 1977, Zagreb, Yougoslavie). Le produit résultant, exempt de Hu-IFN, est concentré et purifié par relargage au sulfate d'ammonium. Le produit résultant est traité par la Chromatographie d'affinité utilisant du phytohémag-glutinine-sépharose dans du tampon phosphate 0,01 M (pH 7,4); la partie adsorbée est éluée par une portion fraîche du même tampon additionné de 0,1 M N-acétyl D-galactosamine. Les fractions éluées, à activité de lymphotoxine, sont dialysées contre du tampon frais, mais exempt de galactosamine; elles sont concentrées et lyophilisées en poudre.

L'activité spécifique de la lymphotoxine ainsi obtenue est d'environ 30 000 unités par mg de protéine.

La filtration sur gel du produit pulvérulent a permis de séparer trois constituants de masses moléculaires différentes: environ 7 x 104 à 9 x 104 u (daltons), environ 3,5 x 104 à 5 x 104 et environ 104 à 2 x 104, ayant leurs activités dans les rapports d'environ 1:1:2. Cela correspondrait respectivement aux lymphotoxines a, ß et y, d'après leurs masses molaires et autres données physico-chimiques connues. Tous ces constituants sont des glycoprotéines et leur teneur en sac-charide est de l'ordre de 5 à 45%, selon la masse moléculaire.

Exemple A-10:

On opère sur des hamsters nouveau-nés, comme dans l'exemple A-l, en sous-cutané, mais les cellules humaines employées proviennent des monocytes transformés par des virus SV-40.

Nourriture normale une semaine. Injection intrapêritonéale avec des cellules vivantes BCG dans un inoculum, de 107 cellules par animal. De nouveau, nourriture normale deux semaines. Les tumeurs massives de 15 g environ chacune sont traitées comme dans les exemples précédents, avec du milieu d'Eagle, d'abord avec 5% v/v de sérum humain. Densité de la suspension 5 x 106 cellules; elle est additionnée de 10 (ig d'endotoxine d'E. coli par ml, et incubée à 37° C en 16 h. Centrifugation à 4° C sous 1000 g; dialyse comme à la fin de l'exemple A-2, mais en 21 heures.

Le constituant Hu-IFN est séparé, comme dans l'exemple A-9, par la méthode de G. BODO précitée.

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15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

664 974

6

Le TNF ainsi obtenu, exempt de son inducteur, présente une activité spécifique d'environ 350000 unités par mg de protéine.

Exemple A-ll:

Des hamsters sont traités comme dans l'exemple précédent; la transplantation sous-cutanée est faite avec des cellules humaines BALL-1. Nourriture normale 3 semaines. Tumeurs massives, d'environ 15 g chacune, traitées comme précédemment, lavage avec du milieu RPMI 1640. Suspension à environ 101 cellules/ml.

Inducteurs: virus Sendai 1000 titres d'hémagglutination/ml et en-dotoxine E. coli 20 ng/ml; 2 jours d'incubation à 37° C. Centrifugation à 4" C, dialyse et filtration, comme plus haut. On a obtenu du TNF lyophilisé à raison de 8,3 x 107 unités par hamster; il contient 4,1 x 107 unités Hu-IFN.

Exemple A-12:

Animal: souris nue, adulte. Cellules humaines: TALL. Nourriture normale 5 semaines. Injection de virus Newcastle dans les conditions décrites dans l'exemple A-3. Traitement de l'ascite comme dans l'exemple A-l 1. On obtient par souris 6,2 x 106 unités de TNF qui contient 4,5 x 106 unités Hu-IFN.

Exemple A-l3:

Souris adultes traitées comme dans l'exemple A-4, mais les cellules humaines transplantées, en sous-cutané, sont des Mono-1. Nourriture normale 3 semaines. Tumeurs massives de 10 g chacune, traitées selon l'exemple A-10. Ajouté concanavaline A et virus Sendai, laissé incuber 1 jour à 37° C, puis traité comme dans l'exemple A-ll. Rendement en TNF 6,8 x 107 unités par souris. Le produit contient environ 1,3 x 107 unités Hu-IFN.

Exemple A-14:

Animaux: hamsters nouveau-nés. Cellules humaines: NAMALWA. Opérations comme dans l'exemple A-10, ensuite comme A-ll. Rendement en TNF 4,3 x 107 unités par hamster. Le produit contient environ 8,2 x 106 unités Hu-IFN.

Exemple A-15:

Cellules humaines NALL-1 cultivées en chambre de diffusion comme dans l'exemple A-6. Resuspension dans du milieu frais selon la technique de l'exemple A-10. Purification et concentration comme dans l'exemple A-ll. Rendement en TNF environ 2,6 x 107 unités par rat. Le produit renferme 9,4 x 106 unités Hu-IFN.

Exemple A-16:

Cellules humaines JBL cultivées dans la cavité allantoïque de l'œuf, comme à l'exemple A-7. Ensuite, traitement comme dans l'exemple A-10. Rendement en TNF environ 1,5 x 106 unités pour 10 œufs; les propriétés physico-chimiques sont en accord avec celles de Carswell et coll. Le concentré renferme environ 4 x 10s unités de Hu-IFN pour 10 œufs.

Le TCLF obtenu suivant l'invention convient avantageusement en tant qu'agent prophylactique ou/et thérapeutique, notamment en injections, administration interne ou externe, collyre, etc., seul ou conjointement avec d'autres agents. Sont, par exemple, justiciables de cet agent des maladies telles que tumeurs malignes, notamment cancer du sein, carcinome du poumon, cancer utérin ou vésical, carcinome du côlon, cancer gastrique, leucémie, lymphoma ou cancer de la peau.

Les exemples de la série B suivants en montrent l'efficacité. Expérience B-l

Dans le dos de souris nues, on a implanté sous la peau des petits fragments de tissu humain du cancer du sein.

Lorsque la tumeur massive qui en est résultée a atteint environ 200 mm3, on a commencé à injecter aux souris, par voie intraveineuse, une préparation aliquote de TNF obtenue selon l'exemple A-10. L'injection était pratiquée tous les jours à raison de 100 unités/kg/jour ou 1000 unités/kg/jour. 15 jours après la première injection, les animaux ont été sacrifiés et on a pesé les tumeurs. Les résultats sont réunis au tableau II, dans lequel les nombres témoins s'entendent pour des souris auxquelles, à la place de TNF, on injectait une solution saline, physiologique. On voit un effet net du TNF en faveur de la diminution de la tumeur. A noter que l'écart de +0,4 est insignifiant en comparaison de +1,4 pour le témoin.

Tableau II

Traitement

Dosage/jour

Poids de la tumeur (g)

Témoin

—

11,0 + 1,4

TNF

100 U/kg

7,5 + 0,8

TNF

1000 U/kg

7,1 + 0,4

Expérience B-2

L'expérience analogue à celle de B-l est effectuée avec 10 souris mâles BD Fl pesant environ 25 g; le tissu cancéreux est celui du carcinome pulmonaire de Lewis. Après 10 jours, injections intraveineuses de TNF; 100 et 1000 unités/kg/jour. Le tableau III donne les résultats après 21 jours.

Tableau III

Traitement

Dosage/jour

Poids de la tumeur (g)

Témoin

—

7,5 + 0,5

TNF

100 U/kg/j

6,7 + 0,8

TNF

1000 U/kg/j

4,5 + 0,4

La combinaison est la même que pour l'expérience B-l .

Expérience B-3

La détermination de la toxicité aiguë du TNF de l'exemple A-10 sur des souris de 20 jours indique que cette toxicité est très faible, la DL50 étant de 200 000 unités/kg ou plus, par voie intrapêritonéale.

La série des expériences C qui suivent montre l'efficacité de la lymphotoxine.

Expérience C-l

Par la même technique que plus haut, on implante à des souris nues BALB/C, sous la peau du dos, des petits fragments de tissu humain cancéreux du sein. Lorsque les tumeurs ont atteint environ 200 mm3, on injecte aux souris des mélanges de lymphotoxines obtenus selon l'exemple A-9, par voie intraveineuse, deux fois par jour, à raison de 4 à 40 unités/kg/jour. Les résultats après 15 jours se trouvent au tableau IV.

Tableau IV

Traitement

Dosage/jour

Poids de la tumeur humide (g)

Témoin Mélange de lymphotoxines

4 U/kg 40 U/kg

10,8 + 1,2 7,9 ± 0,7 7,4 + 0,5

On notera l'amélioration marquée selon la dernière ligne.

Expérience C-2

Des essais analogues à C-l sont faits sur 10 souris mâles BDFj de 25 g, avec 2 mm2 de tissu carcinomique du poumon (Lewis).

Après 8 jours, injections intraveineuses de y-lymphotoxine de masse molaire 104" à 2 x 104 daltons obtenue dans l'exemple A-9. Le tableau ci-après montre les résultats après 21 jours.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

664974

Tableau V

Traitement

Dosage/jour (unités/kg)

Poids de la tumeur humide (g)

Témoin

—

7,3 ± 0,3

Mélange de

4

6,6 ± 0,7

lymphotoxines

40

4,7 ± 0,5

y-Lymphotoxine

4

6,1 ± 0,6

104-2 x 104 daltons

40

4,2 ± 0,4

Le résultat de la dernière ligne est remarquable.

Expérience C-3

Suivant la même technique que plus haut, on traite 20 souris mâles BDFj de 25 g; implantation sous la peau de cellules de la lignée L-1210 leucémique de souris. Ensuite injection journalière intraveineuse de substances indiquées au tableau VI, qui indique le temps de survie de 50% d'animaux.

Tableau VI

Essai

Traitement

Injections par jour

Une

Deux

Solution saline

9 jours

Témoin

Mitomycine C

0,5 mg/kg/jour

9 jours

Mélange de

30 unités/kg/jour

9 jours

15 jours lymphotoxines

300 unités/kg/jour

12 jours

16 jours terminées sur des cellules humaines normales et sur celles de tumeurs, de la manière habituelle. Ainsi trouve-t-on pour les cellules humaines normales, par exemple de l'intestin (lignée 407), du foie (Chang), du cœur (Girardi), une concentration très élevée, notam-5 ment 20 000 unités/ml ou davantage. Par contre, pour les cellules de tumeurs humaines, par exemple cellules KB de nasopharynx, les HEp-2 du larynx, HEL du carcinome pulmonaire, les concentrations sont très basses, à savoir respectivement 18, 24 et 33 unités/ml.

On voit donc l'utilité du TCLF suivant l'invention pour des trailo tements thérapeutiques ou préventifs . Dans le cas d'une tumeur maligne, il peut être indiqué, avant l'application du TCLF, de traiter le produit d'abord in vitro par un fragment de tissu de la tumeur du patient, afin d'exalter son immunogénicité, et l'administrer au malade avant la suite du traitement.

15 Les doses de TCLF à utiliser sont en général de 5 à 50 000 000 d'unités par jour pour un adulte; pour l'administration locale, par exemple pour un collyre ou une injection locale, 5 à 1000 000 d'unités par jour; dans le cas du traitement percutané ou sur des muqueuses, par exemple en suppositoires ou pommades, conviennent 20 surtout des doses de 10 à 5 000000 d'unités par jour; pour les applications systématiques, notamment intraveineuses ou intramusculaires, les doses préférées sont de 50 à 10 000000, et per os de 500 à 50 000 000 d'unités par jour. Les doses varient bien entendu selon les circonstances et suivant l'état du malade.

25 Le TCLF peut être mis sous toute forme médicamenteuse requise avec des supports appropriés, mais il est préférable que ce dernier en contienne au moins 5 unités par gramme.

Les exemples de la série B suivants montrent non limitativement quelques-unes des formes d'application du TCLF suivant l'inven-30 tion.

On voit que même avec une faible dose de lymphotoxine (30 unités) on peut obtenir de bons résultats en augmentant le nombre de doses journalières.

Expérience C-4

A 20 souris mâles BDF2, on implante des cellules de souris de la lignée P.388 de leucémie, à la manière décrite dans C-3. Après les injections intraveineuses de substances indiquées au tableau VII, on note le % d'animaux ayant survécu après certains nombres de jours.

Tableau VII

Essai

Témoin

Mélange de lymphotoxines

Traitement

Solution saline Mitomycine C 0,5 mg/kg/jôur

300 unités/kg/jour 1000 unités/kg/jour 3000 unités/kg/jour 10 000 unités/kg/jour

Jours de survie 1 6 15 30 80 % d'animaux

100 100

100 100 100 100

0

35

0

40

0

45

30

70

65

100

85

35

Il en résulte que des fortes doses de mélange de lymphotoxines, suivant l'invention, sont efficaces comme agent prophylactique ou thérapeutique.

Expérience C-5

Des déterminations sur souris de 20 jours ont montré que la toxicité aiguë du mélange de lymphotoxines, obtenu suivant l'exemple A-9, est extrêmement faible: la DL50 est de 10 000 unités/kg ou plus, par injection intrapêritonéale.

Les concentrations en mélange de lymphotoxines, requises pour 50% d'inhibition in vitro de la multiplication de cellules, ont été dé-

Exemple B-l:

20 000 unités de mélange de lymphotoxines, préparé suivant l'exemple A-9, sont dissoutes dans 200 ml de solution saline physiologique. La solution obtenue est filtrée sur membrane. Dans une série du tubes en verre stérilisés, on met 2 ml de la solution filtrée que l'on lyophilise et scelle de façon à constituer des doses prêtes à l'utilisation médicale.

Les injections de ce produit sont utiles pour le traitement du cancer du sein, du carcinome pulmonaire ou hépatique, de la leucémie, etc.

Exemple B-2:

45 Le mélange de lymphotoxines obtenu selon l'exemple A-3 est mélangé avec un minimum de paraffine liquide, et additionné de vaseline, de façon à former une pommade à 50 unités de lymphotoxine par gramme.

Cet onguent est utile pour le traitement du carcinome de la peau, 50 du cancer du sein ou du lymphadénome.

Exemple B-3:

Un collyre est préparé par mélange de 800 ml d'eau distillée, de 5 ml de P-phényl-éthyl alcool et de 40 000 unités de mélange de lym-55 photoxines préparé selon l'exemple A-6, le tout étant complété à 1000 ml de solution isotonique, par addition d'une solution de NaCl. Le collyre convient en particulier contre le rêtinoblastome.

Exemple B-4:

60

Des comprimés entériques enrobés sont préparés, de la manière classique, par mélange de l'amidon, du maltose et de la préparation de lymphotoxine de masse molaire de 104 à 2 x 104 daltons obtenue comme dans l'exemple A-9. Les comprimés de 100 mg, titrant 65 chacun 2000 unités lymphotoxine, sont enrobés d'ester phtalique de méthyl cellulose.

Ces comprimés sont recommandables pour le traitement du carcinome du côlon ou du foie.

664 974

8

Exemple BS:

500 000 unités de préparation de TNF obtenue suivant l'exemple A-10 sont dissoutes dans 200 ml de solution saline physiologique et la solution est filtrée stérilement sur membrane.

2 ml de portion aliquote de cette solution sont lyophilisés dans des tubes en verre stérilisés, puis scellés. Les tubes servent à des injections utiles au traitement du cancer du sein, du carcinome du poumon ou du foie, et de la leucémie.

Exemple B-6 :

Suivant le mode opératoire de l'exemple B-2, on prépare une pommade de TNF obtenu dans l'exemple A-ll ; elle titre 20000 unités TNF par gramme et a les mêmes applications que celles de l'exemple B-2.

Exemple B-7:

5 Un collyre est préparé comme en B-3, mais avec 20 000 000 unités de TNF préparé suivant l'exemple A-14. Il convient également au traitement du rétinoblastome.

Exemple B-8:

io Des composés entériques sont confectionnés de la manière décrite en B-4, mais avec du TNF de l'exemple A-12 à la place de la lymphotoxine. Ils titrent 200 000 unités TNF par comprimé de 100 mg et ont la même utilité que celle de l'exemple B-4.

R

Claims

664 974

1. Procédé de production d'un facteur de lyse de cellules cibles (désigné ci-après par l'abréviation TCLF), caractérisé en ce que des cellules humaines, capables de produire ce facteur, sont soumises à l'action d'un inducteur, après quoi le facteur TCLF est récolté et purifié.

2. Procédé de production d'un facteur de lyse de cellules cibles (désigné ci-après par l'abréviation TCLF) selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules humaines, capables de produire du TCLF, sont multipliés par leur transplantation dans le corps d'un animal à sang chaud ou dans un chambre de diffusion implantée dans un tel animal.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules humaines sont choisies parmi les lignées: BALL-1, NAMALWA, CCRF-SB, EBV, TALL-1, MOLT-3, NALL-1, Mono-1, JBL, EBV-HO et des cellules établies d'origine monocyti-que.

4. Procédé suivant une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inducteur est celui de IFN-a ou y, en particulier un virus, la phytohémagglutinine ou la concanavaline A, et que le TCLF est produit simultanément avec de l'interféron humain (Hu-IFN).

5. Procédé suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on recueille, à partir des cellules induites, le TCLF constitué par des glycoprotéines de masses moléculaires de 104 à IO5 u (daltons) avec 5 à 45% de saccharides, et en particulier au moins une des trois sortes de glycoprotéines ayant des masses molaires de 104 à 2 x 104, 3,5 x 104 à 5 x 104 à 7 x 104 à 9 x IO4 u (daltons).

6. Procédé suivant une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on recueille, en tant que TCLF, des lymphotoxines et/ou du facteur de nécrose de tumeurs (TNF).

7. TCLF obtenu par le procédé de préparation selon une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il renferme des glycoprotéines de masses moléculaires de 104 à 10s u (daltons) avec 5 à 45% de saccharides.

8. Composition thérapeutique, particulièrement utile contre les tumeurs malignes, caractérisée en ce qu'elle contient du TCLF obtenu par le procédé de préparation selon une des revendications 1 à 6, renfermant des glycoprotéines de masses moléculaires de 104 à 105 u (daltons) avec 5 à 45% de saccharides.

9. Composition thérapeutique suivant la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une des trois sortes de glycoprotéines de masses moléculaires respectivement de 104 à 2 x 104, 3,5 x 104 à 5 x 104 et 7 x 104 à 9 x 104 u (daltons), la teneur en TCLF y étant de préférence d'au moins 5 unités par gramme.

10. Composition thérapeutique suivant la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce qu'elle renferme à la fois du TCLF et de l'interféron humain (Hu-IFN).

11. Composition thérapeutique suivant une des revendications 8 à 10, caractérisée en ce qu'elle renferme des lymphotoxines et/ou du TNF.