LU84662A1 - Nouvelles glycoproteines,procedes pour leur preparation et agents therapeutiques contenant ces glycoproteines en vue de combattre les tumeurs - Google Patents

Description

Nouvelles glycoprotéines, procédés pour leur prépara-tion et agents thérapeutiques contenant ces glycoprotéines en vue de combattre les tumeurs.

La présente invention concerne de nouvelles 5 glycoprotéines obtenues à partir d’un extrait ou d’un produit surnageant dIun milieu de culture de cellules réticulo-endothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d’animaux à sang chaud, des procédés pour leur préparation, 10 ainsi que des agents thérapeutiques contenant, comme ingrédient actif, ces glycoprotéines individuellement ou en combinaison, en vue de combattre les tumeurs malignes·

On ne connaît aucune thérapie parfaite pour 15 combattre les tumeurs et, en dépit du fait que bon nombre d’agents thérapeutiques en vue de combattre les tumeurs ont été élaborés jusqu’à présent par un certain nombre de chercheurs dans le monde, de nombreuses tentatives ont été entreprises en vue d’uti— 20 liser de nouveaux agents thérapeutiques et des trai tements combinés à plusieurs agents dans le domaine clinique.

Les agents thérapeutiques en vue de combattre les tumeurs se classent sommairement dans deux 25 catégories, à savoir les agents chimiothérapeutiques et les agents immunothérapeutiques. Etant donné que ' les agents chimiothérapeutiques également connus sous le nom de substances cytotoxiques manifestent leur effet par la suppression non spécifique de la crois-; r 30 sance des cellules et que, partant, ils sont toxiques non seulement pour les cellules tumorales, mais également pour les cellules normales, sans compter m qu’ils provoquent de sérieuses réactions néfastes telles que la leucocytopénie, la stérilité féminine, 35 l’alopécie, le tératisme, les néoplasmes malins, etc., * /< * .

1 '•i·'": 2 des restrictions strictes sont imposées au dosage.

D*autre part, étant' donné que les agents immunothé— rapeutiques manifestent leur effet thérapeutique en % inhibant indirectement la croissance des tumeurs en 5 agissant sur les fonctions biophylactiques et non en inhibant directement la croissance des cellules tumorales, on risque beaucoup moins de voir se manifester de sérieuses réactions néfastes qu1avec les agents chimiothérapeutiques. Toutefois, très souvent, les 10 patients atteints de tumeurs ne retiennent pas suffisamment les fonctions biophylactiques et, par conséquent, 1* effet thérapeutique des agents immunothé— rapeutiques nlest pas toujours satisfaisant comparativement aux agents chimiothérapeutiques.

15 La Demanderesse a envisagé que les cellules réticulo-endothéliales qui jouent un rôle important dans les fonctions biophylactiques, produisaient une substance qui est efficace pour le traitement des tumeurs et elle a recherché cette substance.

20 Différents facteurs considérés comme agents thérapeutiques prometteurs pour combattre les tumeurs, par exemple, la Lymphotoxine, le facteur de nécrose des tumeurs, 1*Interferon, etc., avaient été obtenus à partir de cellules réticulo-endothéliales comme 25 indiqué par Granger, G.A. et al., Cellular Imraunology, volume 38, 338-402 (1978), Carswell, E.A. et al., " Proc, Natl. Acad, Sei., E.U.A., volume 72, 3666-33070 (1975) et Issacs, A. et al., Proc. Roy. Soc. Ser.

B., volume 147a 268 (1975) respectivement. De plus, ς 30 la Demanderesse a découvert récemment une méthode simple en vue d1isoler une importante quantité de facteur carcinolytique sous forme d'un mélange contenant les produits précités, à savoir la Lymphotoxine, le facteur de nécrose des tumeurs, etc., à partir 1 35 d'une culture de lymphoblastes cultivées chez les 1 1 ! » I hamsters dont la réponse immunologique a été suppri mée ; de plus, la Demanderesse a mentionné que ce facteur car-cinolytique était efficace contre des tumeurs expérimentales - transplantées chez un animal ("The Yomiuri", édition du matin, 5 22 novembre 1981).

Au cours des recherches entreprises sur le facteur carcinolytique, la Demanderesse a découvert que des glycoprotéines différentes des facteurs cytotoxiques précités tels que la Lymphotoxine, le facteur de nécrose des tumeurs, le facteur car-10 cinolytique, etc., étaient présentes dans un extrait ou un produit surnageant d'un milieu de culture de cellules réticuloendothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud, ces glycoprotéines étant caractérisées par un effet cytotoxique très puissant et sélectif 15 contre les cellules tumorales, et elle a élaboré plusieurs procédés pour la préparation de ces glycoprotéines sans difficulté.

Un objet de la présente invention est de fournir de nouvelles glycoprotéines exerçant une activité antitumeur.

Un autre objet de la présente invention est de fournir 20 des glycoprotéines exerçant une activité antitumeur et récoltées d'un extrait ou d'un produit surnageant d'un milieu de culture de cellules réticulo-endothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud.

Un autre objet de l’invention est de fournir des procé-25 dés de préparation de glycoprotéines antitumeurs à partir d'un extrait ou d'un produit surnageant d'un milieu de culture de cellules réticulo-endothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud.

* Un autre objet encore de la présente invention est de 30 fournir des agents thérapeutiques pour des tumeurs, contenant, com-1¾ me ingrédient actif, ces glycoprotéines antitumeurs individuelle- ! ment ou en combinaison.

j* En conséquence, la présente invention concer- | ne une glycoprotéine ayant les propriétés suivan- | 35 tes : 4 a) un poids moléculaire se situant dans l’intervalle allant de 7·000 à 90.000, déterminé par électrophorèse sur gel de dodécyl—sulfate de sodium L; « ou par filtration sur gel de "Sephadex” 3 5 b) réactions chromogènes : coloration indi quant la présence de protéines dans la réaction de Lowry 5 coloration indiquant la présence de liaisons peptides et décides aminés dans la réaction à la ninhydrine après hydrolyse avec 1*acide chlorhydri— 10 que 3 et coloration indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/acide sulfurique et dans la réaction au tryptophane/acide sulfurique 5 15 c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme 3 d) teneur en sucres : 8-45$ dont 6—28$ sont 20 des hexoses, 1-11$ sont des hexosamines et 1-6$ sont des acides sialiques, calculé sur la teneur totale en sucres 3 e) stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou 25 plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 3 et * f) destruction sélective des cellules tumo- raies pratiquement sans détruire les cellules nor— I males, c 30 Dans les dessins annexés : la figure 1 montre le spectre d’absorption des rayons infrarouges de CB^, mesuré à l’exemple 10 3 la figure 2 montre le spectre d’absorption des rayons infrarouges de CBmesuré à l’exemple 15 5 ; 5 ! .

la figure 3 montre le spectre d’absorption des rayons infrarouges de CBy?,mesuré à l’exemple 21 ; _ la figure 4 montre le spectre d’absorption des rayons infrarouges de CB-^j mesuré à l’exemple 29· 5 Etant donné que les glycoprotéines de la ‘ ** présente invention peuvent être divisées en quatre fractions ayant des poids moléculaires différents et des teneurs en sucres différentes, tout au long de la présente spécification, ces glycoprotéines sont clas-10 sées suivant la différence de poids moléculaire : une fraction ayant un poids moléculaire de 12.000-17*000 est appelée fraction carcinolytique X (désignée ci-après par CB^. ; pour le reste, cette remarque est également d’application) ; une fraction ayant un 15 poids moléculaire de 70*000-90.000 est appelée CB^q $ ’ - une fraction ayant un poids moléculaire de 40.000- 50.000 est appelée CB^ une fraction ayant un poids moléculaire de 7*000-9.000 est appelée CBY„. Lorsque toutes les fractions 0Βχ, 0Βχ^, ^®X3 20 doivent être prises en considération d’une manière générale, on utilise l’abréviation "CB" comme terme général.

On décrira plus en détail les propriétés physiques, chimiques et biologiques des glycoprotéi-25 nés suivant la présente invention.

CBX

a) Poids moléculaire : mesuré par filtration sur gel en utilisant du "Sephadex G—100” ("Pharmacia Co.11) et un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7?2) ; >7 30 comme solvant, le poids moléculaire est de 12.000- I 17.000.

I b) Réactions chromogènes : les résultats i des essais effectués sur une solution aqueuse de CB^. pour les réactions chromogènes sont repris dans 35 le tableau 1—1. La réaction de Lowry et la réaction

A

\ / 1 i ; uΛ t \ 6 à la N.inhydrine ont été effectuées conformément aux procédés décrits dans Seikagaku Jxkken Koza, volume 1, - "Quantitative Method of Proteins", 1971· La réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à 1*anthrone/ 5 acide sulfurique, la réaction au naphtol/acide sulfu rique, la réaction à l’indole/acide suifurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique ont été effectuées conformément aux procédés décrits dans "Seikagaku Jxkken Koza", volume 4j "Quantitative 10 ' Method of Sugars", 1971· De même, la réaction de

Holff a été effectuée conformément aux procédés décrits dans "Seikagaku Jxkken Koza", volume 3, "Quantitative Method of lipids", 1971· . Tableau 1-1 15 ___ Réaction chromogène Couleur Indication

Lowry Bleue Liaisons peptides

Ninhydrine Bleu-pourpre Acides aminés 20 Phénol/acide sul- Brune Sucres furique

Anthrone/acide Bleu verdâtre Sucres sulfurique et-naphtol/acide Pourpre Sucres 25 sulfurique

Indole/acide Brune Sucres sulfurique

Tryptophane/ Brun- Sucres acide sulfurique pourpre I i 30 Holff Incolore Pas de lipides

Comme indiqué ci-dessus, CBY donne des cou- À leurs indiquant la présence de protéines et de sucres, mais elle ne donne pas une couleur indiquant la pré-35 sence de lipides.

7 c) Aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans 1* eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme.

5 d) Teneur en sucres ï suivant la méthode de |s' "Spiro" (Spiro, H.A., "Methods in Enzymology", volume 8, 3-26 (i960)), la teneur en sucres de CB^. est de 27-33$ et sa composition en sucres est la suivante : 17-20$ d’hexoses, 5-7$ d’hexosamines et 5—6$ d’acides 10 sialiques.

e) Point isoélectrique : mesuré par isoélectrofocalisation sur "Ampholine”, son point isoélectrique est de 432-7,3* f) Peut être adsorbée sur "Sephadex" conju-15 gué avec "Ulex europeus agglutinin" dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7#2).

g) Stable vis—à—vis du poids moléculaire par filtration sur gel et vis-à-vis de 1*activité cytotoxique contre les cellules tumorales dans une 20 solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C

pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus.

h) Elle détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules 25 normales.

On a mesuré la cytotoxicité de CBY en cul- 5 Ä * tivant 10 cellules tumorales ou cellules normales dans 0,2 ml d’un milieu en présence de cette substance à 37°C pendant 48 heures dans une atmosphère à 5$ de i 30 CO2 et à 95$ d’air, puis en comptant le nombre de j cellules viables non colorées par le bleu "Trypan" 5 la cytotoxicité a été exprimée par la concentration i à laquelle l’accroissement du nombre de cellules a j été inhibé à 50$. Une unité de CB est la quantité j| 35 de la substance à laquelle la croissance de 10^ cel- y 1 / H i * 3 .

18

Iules de CB est inhibée à 50%, i) Provoque une différenciation de cellules tumoralesj cTest-à-dire qu*elle rétablit les cellules tumorales en cellules normales dans un essai 5 suivant la méthode de Hozumi et al. (Hozumi et al., "Cancer Research", volume 40, 2919-2924 (1980)) en utilisant des cellules M-l de la leucémie myélogène.

CBX1 a) Poids moléculaire : mesuré par filtra— 10 tion sur gel en utilisant du "Sephadex G-1O0" et un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2) comme solvant, le poids moléculaire est de 70*000-90.000.

b) Réactions chromogènes : les résultats des essais effectués sur une solution aqueuse de 15 CB^i pour les réactions chromogènes sont indiqués dans le tableau 1-2.

Tableau 1-2 Réaction chromogène Couleur Indication 20___

Lowry Bleue Liaisons peptides

Ninhydrine Bleu-pourpre Acides aminés

Phénol/acide Brune Sucres sulfurique 25 Anthrone/acide Bleu verdâtre Sucres sulfurique ' α-naphtol/acide Pourpre Sucres sulfurique *

Indole/acide ' Brune Sucres ! 30 sulfurique j Tryptophane/acide Brun- Sucres j sulfurique pourpre

Holff Incolore Pas de lipides __j_.

/ / ! 9 i % '

Comme indiqué ci-dessus, 0Βχ^ donne des couleurs indiquant la présence de protéines et de sucres, mais elle ne donne pas une couleur indiquant la présence de lipides.

5 c) Aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme.

d) Teneur en sucres : suivant la méthode 10 de "Spiro”,'la teneur en sucres de CB^ est de 35-45% et sa composition en sucres est la suivante : 23-28$ d’hexoses, 8—11$ d’hexosamines et 4—6$ d’acides sialiques.

e) Point isoélectrique : mesuré par iso- 15 électrofocalisation sur "Ampholine", son point iso- . électrique est de 4>3-6,2.

f) Peut être adsorbée sur "Sephadex" conjugué avec "Ulex europeus agglutinin" dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7?2).

20 g) Stable vis-à-vis du poids moléculaire par filtration sur gel et vis-à-vis de l’activité cytotoxique contre des cellules tumorales dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse 25 d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus.

Ih) Elle détruit sélectivement les cellules * tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales. La cytotoxicité de CB^q a été mesurée par les procédés décrits pour CB^· 13 0 X2 a) Poids moléculaire : mesuré par filtration sur gel en utilisant "Sephadex G—100" et un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2) comme solvant, le poids moléculaire est de 40.000-50.000.

Ib) Réactions chromogènes : les résultats des essais effectués sur une solution aqueuse de CßX2 Pour -*-es réactions chromogènes sont indiqués dans le tableau 1-3· 5 Tableau 1-3 Réaction chromogène Couleur Indication

Lowry Bleue Liaisons peptides 10 Ninhydrine Bleu-pourpre Acides aminés

Phénol/acide Brune Sucres sulfurique

Anthrone/acide Bleu verdâtre Sucres sulfurique 15 α-naphtol/acide Pourpre Sucres - sulfurique

Indole/acide Brune Sucres sulfurique

Tryptophane/acide Brun— Sucres 20 sulfurique pourpre

Il Holff Incolore Pas de lipides

Comme indiqué ci-dessus, 0Βχ2 donne des couleurs indiquant la présence de protéines et de 25 sucres, mais elle ne donne pas une couleur indiquant la présence de lipides, c) Aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l*eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le 30 benzène, l’hexane et le chloroforme, d) Teneur en sucres : suivant la méthode de "Spiro”, la teneur en sucres de CB^ est de ^ 30-37/ü et sa composition en sucres est la suivante : 20-23% d*hexoses, 6—8% d*hexos amines et 4-6% d*acides 9 35 sialiques.

11 e) Point isoélectrique : mesuré par iso-électrofocalisation sur 11 Ampho line ” , son point isoélectrique est de 4j2-733, f) Peut être adsorbée sur "Sephadex” conju- 5 gué avec "Ulex europeus agglutinin” dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7>2).

g) Stable vis-à-vis du poids moléculaire par filtration sur gel et vis-à-vis de l1activité cytotoxique contre des cellules tumorales dans une 10 solution aqueuse d*un pH de 23 de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d*un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus· h) Elle détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules 15 normales, La cytotoxicité de CB^ a été mesurée par les procédés décrits pour CB^., CBX3 a) Poids moléculaire : mesuré par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium, le poids 20 moléculaire est de 7·000-9·000.

b) Réactions chromogènes : les résultats des essais effectués sur une solution aqueuse de CBY<Î pour les réactions chromogènes sont indiqués dans le tableau 1-4· / ~

L* V

i ii 12

Tableau 1-4 - - Réaction chromogène Couleur Indication „ 5 Lowry Bleue Liaisons peptides

Ninhydrine Bleu—pourpre Acides aminés

Phénol/acide Brune Sucres sulfurique

Anthrone/acide Bleu verdâtre Sucres 10 sulfurique α-naphtol/acide Pourpre Sucres sulfurique

Indole/acide Brune Sucres sulfurique 15 Tryptophane/acide Brun- Sucres sulfurique pourpre

Holff Incolore Pas de lipides

Comme indiqué ci-dessus, CBY„ donne des JLo j, 20 couleurs indiquant la présence de protéines et de sucres, mais elle ne donne pas une couleur indiquant la présence de lipides.

c) Aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans 1 * eau, le chlorure de sodium aqueux et 25 un tampon de phosphate, et peu soluble dans le ben- ' zène, l’hexane et le chloroforme.

d) Teneur en sucres : suivant 3a méthode de "Spiro11, la teneur en sucres de CB^ est d.e 8-15% et sa composition en sucres est la suivante : 6-10% 30 d’hexoses, 1-2% d’hexosamines et 1-3% d’acides sia-? liques.

I „ e) Peut être adsorbée sur la carboxyméthyl- cellulose dans une chromatographie d’échange d’ions H dans un tampon de phosphate 0,05M (pH î 6,4) en uti— i; 35 lisant de la carboxyméthyl-cellulose.

; / ! / 13

f) Stable vis-à-vis du poids moléculaire par filtration sur gel et vis-à-vis de 1*activité cytotoxique contre des, cellules tumorales dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C

5 pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus, g) Elle détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales, La cytotoxicité de CBY0 a été mesurée par -Λ-Ο 10 les procédés décrit's pour CB^., h) La séquence d’acides aminés de la terminaison N de la fraction protéique est : alanine-alanine- ·

Les glycoprotéines de la présente invention 15 ont des caractéristiques communes en ce qui concerne • les réactions chromogènes, l’aspect, la solubilité, la stabilité, l’effet sur les cellules tumorales, etc,, mais elles se différencient l’une de l’autre en ce qui concerne le poids moléculaire et la teneur 20 en sucres, si bien que les substances respectives peuvent être distinguées l’une de l’autre.

Les glycoprotéines de la présente invention se distinguent clairement de la Lymphotoxine, du facteur de nécrose des tumeurs, d’un mélange de ces 25 derniers (c’est-à-dire un facteur carcinolytique) ou de l’Interferon (qui sont tous obtenus à partir de cellules réticulo-endothéliales, de lymphoblastes, de cellules leucémiques ou de fibroblastes) en ce * ·ν qui concerne les caractéristiques ci-après et, dès !: | - 30 lors, elles sont des substances manifestement différentes.

Plus spécifiquement, on sait que la Lymphotoxine est présente en trois types différents suivant le poids moléculaire, à savoir : l’ce-Lymphotoxine j ayant un poids moléculaire de 70,000-90*000, la ß— ; 35 Lymphotoxine ayant un poids moléculaire de 35,000- i ï / j ; 14 50.000 et la )f— Lymphotoxine ayant un poids moléculaire de 10.000-20.000 (Eds*, Cohen et al., Biology of the Lymphokinase, Academie Press, 1979)· En ce qui concerne le poids moléculaire, CB^. ressemble à la 5 Y -Lymphotoxine, CB-^, à 11 oc-Lymphotoxine et CB^ * à la ß-Lymphotoxine. Toutefois, comme 1 * indiquent Lucas et al. (Lucas, Z* J, et al., J. Immunology, volume 109s 1233 (1972)), la Lymphotoxine a un effet cytotoxique peu sélectif et elle détériore tant les 10 ' cellules normales que les cellules tumorales. En revanche, l1effet cytotoxique des glycoprotéines de la présente invention est sélectif vis-à-vis des cellules tumorales et, dès lors, elles sont nette— , ment différentes de la Lymphotoxine. De plus, les 15 glycoprotéines de la présente invention sont diffé rentes de la Lymphotoxine en ce qui concerne la capacité d*adsorption et la stabilité. Plus spécifiquement, bien que la Lymphotoxine préparée suivant le procédé de Granger et al. (Granger, G.A. et al, 20 Cellular Immunology, volume 38* 388-402 (1978)) ne soit pas ou ne soit que faiblement adsorbée sur ; "Sephadex” conjugué avec "Ulex europeus agglutinin” dans un tampon de phosphate 0,01M, les glycoprotéines de la présente invention y sont adsorbées. De plus, 25 les glycoprotéines de la présente invention sont j stables dans des solutions aqueuses ayant un pH de 2, de 7 et de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et elles sont également stables à un pH de 7 à 60°C ' pendant 3 heures ou plus. En revanche, la Lympho— 30 toxine subit une perte d*activité de 60$ ou plus j, après avoir été maintenue à 56°C pendant 4 heures* £ s I Le facteur de nécrosé des tumeurs exerce j un effet cytotoxique sélectif sur les cellules tumo- j raies et il a un poids moléculaire de 33·000-63·000, j 35 ainsi qu*une teneur en sucres de 0% (Carswell, E.A.

il / ;; 15 et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., volume 72, 3666-3670 (I975)) ou il a un poids moléculaire de 39*000 et une teneur en sucres de 40$ (The Nippon Keizai Shimbun, édition du matin, 23 août I98I) et, 15 sous ses deux formes, il est différent de CB^, de CB^ et de CB^ en ce ûu*· concerne 1® poids moléculaire, ainsi que de CB^ en ce Φ*1 concerne la teneur en sucres.

De plus, le facteur carcinolytique qui 10 contient ces facteurs cytotoxiques en combinaison, a un poids moléculaire dlenviron 35.000 (The Nippon Keizai Shimbun, édition du matin, 22 novembre 1981) et il se différencie des glycoprotéines de la pré— r sente invention en ce qui concerne le poids molécu- 15 laire.

Enfin, les glycoprotéines de la présente invention sont différents de l’Interferon du fait qu’elles n’exercent aucune activité antivirale.

On décrira ci—après les cellules utilisées 20 pour la production des glycoprotéines de la présente invention.

Les cellules provenant d’êtres humains ou d’animaux à sang chaud, que l’on utilise suivant la présente invention, peuvent être des cellules réti— 25 culo-endothéliales, des lymphoblastes, des cellules leucémiques et des fibroblastes ; on peut les utiliser soit dans une culture primaire, soit dans une lignée établie. De préférence, les cellules d’origine humaine sont souhaitables et sûres, car elles 30 donnent moins lieu à des réactions provoquées par antigénicité et à d’autres réactions néfastes en considération de l’utilisation de CB pour le traitement des maladies humaines. Comme cdLules de ce type, on peut choisir, par exemple, les cellules 35 BALL-1, les cellules TALL-1 et les cellules NALL-1 /> w ; 16 mentionnées par Miyoshi (Miyoshi, I·, Nature, volume 267, 843-844 (1977)), les cellules Namalwa décrites dans "Journal of Clinical Microbiology" (J. Clin*

Microbiol., volume 1, 116-117 (1975))* les cellules j.

5 M-7OO2 et les cellules B—7101 décrites dans "Journal ί of Immunology",(volume 1133 1334-1345 (1974))* les j cellules Flow 7000 (Flow Co.), les cellules JBL, les cellules EBV-Sa, les cellules EBV-Wa et les cellules EBV—HO décrites dans "The Tissue Culture" (volume 6, 10 527-546 (ΐ9δθ)), la lignée établie de cellules telles

que les cellules BALM 2, les cellules CCRF—SB

(ATCC CCL I20), etc., de même que les macrophages et les lymphocytes humains et également les cellules I d’une lignée établie de macrophages et de lymphocytes 15 humains traités avec différents virus, médicaments, radiations, etc*

Parmi les cellules provenant d’animaux à sang chaud, on peut choisir, par exemple, les cellules BALB/C 3T3 de souris (Flow Co*), les cellules 20 leucémiques de souris telles que les cellules L1210 (J, Natl. Cancer Inst., volume 13? 1328 (1953)) et les cellules P388 (Scientific Proceedings, Patholo-gists & Bacteriologists, volume 33j 603 (1957))3 le clone M-3 du mélanome de souris (Flow Co.), la tumeur 25 de rat LLC-WRC 256 (Flow Co,), les cellules du mélanome de hamster RPMI 1846 (Flow Co.), de même que des lymphocytes, des macrophages, etc. Il est entendu que les cellules pouvant être utilisées suivant la présente invention ne sont pas limitées à celles . 30 décrites ci-dessus.

On expliquera à présent le procédé de pré- I r ? paration des glycoprotéines (CB) de la présente invention.

.x y Le procédé de préparation de CB par des

•S

-j 35 cellules provenant d’êtres humains ou d’animaux à 1 f ‘À 17 sang chaud peut être choisi parmi des méthodes connues pour la production de substances actives avec des cellules et l’on peut récolter CB soit directement à partir des cellules, soit après avoir cultivé 5 celles-ci ou, si l’on désire obtenir une plus grande quantité de CB, ces cellules peuvent être exposées à un ou plusieurs inducteurs* Par exemple, les cellules provenant d’êtres humains ou d’animaux à sang chaud peuvent être mises en suspension dans un milieu appro— 10 prié et elles peuvent être alors exposées directement à un inducteur pour produire CB qui peut alors être récolté du milieu.

Comme inducteurs pour CB, d’une manière , générale, on peut utiliser une ou plusieurs substan— 15 ces choisies parmi les suivantes ; les pectines telles que la phytohémagglutinine, la concanavaline A, le mitogène de phytolaque, les lypopolysaccharides, les polysaccharides tels que le phosphomannane, le phosphate de dextrane, les endotoxines, les compo-20 sants de cellules microbiennes, les bactéries, les virus, les acides nucléiques, les polynucléotides, etc. De plus, pour les cellules sensibilisées aux antigènes, l’antigène correspondant sert également d’inducteur pour CB, 25 La CB ainsi obtenue peut être aisément isolée par des méthodes connues de purification telles que le relargage, la dialyse, la filtration, μ la centrifugation, la concentration, la lyophilisa tion, etc. Si l’on désire obtenir une purification | 30 plus poussée, on peut procéder à une adsorption et à ! une élution sur une résine échangeuse d’ions, à une | filtration sur gel, à une électrophorèse ou à une chromatographie d’affinité en utilisant, par exemple, "Sephadex11 conjugué avec un anticorps ou ”Ulex euro— 35 peus agglutinin", f Λ ^ ΐ » j 18

Si la CB doit être obtenue en une importante quantité, les cellules de la lignée établie peuvent être cultivéesdans le corps des animaux à sang chaud ainsi qulon l’exposera ci-après.

5 Les lignées établies de cellules provenant d’êtres humains ou d’animaux à sang chaud peuvent être des cellules réticulo-endothéliales, des lymphoblastes, des cellules leucémiques et des fibroblastes; de préférence, les lignées de cellules d’origine 10 humaine sont souhaitables et sûres, car elles donnent moins lieu à des réactions provoquées par antigénicité et d’autres réactions néfastes en considération de l’utilisation de CB pour le traitement des maladies , humaines. Comme lignées de cellules de ce type, on 15 peut utiliser l’une ou l’autre des lignées de cellu les décrites ci-dessus, par exemple, les cellules BALL-1, les cellules TALL-1, les cellules NALL—1, les cellules Namalwa, les cellules M-7002, les cellules B-7101, les cellules Flow 7000, les cellules 20 BALB/B 3T3j les cellules L1210, les cellules P388, les lymphocytes, les macrophages, etc.

Lorsque ces cellules doivent être cultivées dans le corps d’un animal à sang chaud, leur transplantation peut être effectuée directement ou, 25 comme décrit ci-après, indirectement en inoculant ces cellules dans une chambre et en plaçant celle-ci dans le corps. Les animaux à sang chaud chez lesquels ces cellules sont transplantées, pouvant être de la 1} même espèce ou d’espèces différentes, pour autant ! 30 que la lignée établie provenant d’un être humain ou j d’un animal à sang chaud puisse s’y développer. Par exemple, on peut employer des volatils tels que les poulets et les pigeons, de même que des mammifères

Itels que des chiens, des chats, des singes, des 35 chèvres, des porcs, des chevaux, des bovidés, des / / i; N.

! , 19 lapins, des cobayes, des rais, des hamsters., des souris ordinaires ou des souris nues·

Lorsqu'un de ces animaux reçoit, par transplantation, des cellules cultivées provenant d'un ani-5 mal d'une espèce différente, des réactions immuno logiques inopportunes peuvent se produire. En conséquence, afin de minimiser les risques de réactions immunologiques, on emploie avantageusement des animaux à 1* état le plus immature, par exemple, des 10 oeufs, des foetus, des embryons, des animaux à la naissance ou de jeunes animaux. En outre, les réactions immunologiques peuvent également être supprimées par des traitements préalables, par exemple, , en exposant ces animaux à des rayons X de 200-600 15 rems ou en leur injectant des agents immunodépres- ' seurs.

Lorsque l1animal devant être utilisé comme hôte, est une souris nue ou fait partie de la même espèce que 1*animal ayant les cellules devant être 20 transplantées, les réactions immunologiques sont faibles et, partant, ces cellules peuvent être transplantées chez cet animal où elles se développe-; ront rapidement sans aucun traitement préalable, si bien que 11utilisation de telles cellules est parti-25 culièrement commode.

En variante, une croissance constante des cellules peut également être assurée et l'on peut | apgmenter la quantité de CB formée à partir de ces cellules en transplantant des cellules d'un animal 30 à sang chaud chez un autre animal à sang chaud, par , exemple, en transplantant des cellules provenant d'un être humain ou d'un animal à sang chaud chez des hamsters où elles se développeront, pour retransplanter ensuite ces cellules chez des souris nues, 35 Dans ce cas, la transplantation peut être effectuée ! //^ \ i w 20

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I ? entre les mêmes classes ou les mêmes divisions, ainsi qu’entre les mêmes espèces ou les mêmes genres.

Le site auquel les cellules provenant d’un être humain ou d’un animal à sang chaud doivent être 5 transplantées, peut être n’importe quel site où les cellules transplantées peuvent se développer ; par exemple, on peut choisir librement la cavité allan-toïque, les veines, la cavité abdominale et les régions sous—cutanées.

10 Au lieu de transplanter directement et de laisser se développer des lignées établies de cellules provenant d’un être humain ou d’un animal à sang chaud dans le corps d’animaux à sang chaud, l’une ou l’autre des lignées établies de cellules mentionnées 15 ci-dessus peut être inoculée et peut se développer ' dans une chambre classique de diffusion pouvant avoir différentes formes et différentes dimensions, chambre que l’on place, par exemple, dans la cavité péritonéale du corps des animaux à sang chaud. La 20 chambre de diffusion est conçue pour permettre la croissance de ces cellules en facilitant l’absorption des fluides du corps de l’animal comme éléments nutritifs et cette chambre comporte également des membranes filtrantes poreuses, par exemple, un filtre 25 à membrane dont les pores ont une dimension —7 —1 d’environ 10 ' à 10 0 m, des ultrafiltres ou des ·> fibres creuses empêchant la migration des cellules . hors de la chambre et permettant, aux fluides du corps, d’y pénétrer comme éléments nutritifs.

30 Au besoin, la chambre de diffusion peut être conçue et installée, par exemple, sur la surface ! du corps de l’animal de façon à mettre le fluide nu tritif contenu dans la chambre en contact avec le fluide du ; * .

! corps de l’animal, pour les faire ensuite circuler ^ J 35 afin que l’on puisse observer, à travers un voyant,^ ; / 21 ; la croissance des cellules inoculées dans cette chambre. La chambre de diffusion peut également être conçue de telle sorte qu’elle puisse être déconnectée du corps de l’animal et qu’ainsi,%les 5 cellules puissent se développer tout au long de la durée de vie de l’animal, augmentant ainsi le rendement en cellules par animal.

Le procédé dans lequel on utilise ces chambres de diffusion, offre d’autres avantages ; en 10 effet, étant donné que les cellules des lignées étar blies provenant d’êtres humains ou d’animaux à sang chaud ne sont pas mises directement en contact avec les cellules de l’animal, ces cellules peuvent être aisément récoltées et, du fait que des réactions 15 immunologiques inopportunes sont moins susceptibles de se produire, on peut utiliser différents animaux à sang chaud sans devoir les soumettre à un traitement préalable d’immunodépression.

Les animaux chez lesquels les cellules ont 20 été transplantées, peuvent être nourris et entretenus de la manière habituelle, tandis qu’aucune précaution spéciale n’est nécessaire, même après la transplantation, ce qui constitue une méthode commode.

La période requise pour la croissance des 25 cellules des lignées établies provenant d’êtres humains ou d’animaux à sang chaud est généralement , de 1-10 semaines. On a trouvé que le nombre de 7 12 cellules ainsi obtenues était d’environ 10—10 cellules ou plus par animal, 30 En d’autres mots, le procédé suivant la présente invention pour la production de CB est extrêmement avantageux, car les lignées établies de cellules provenant d’animaux à sang chaud sont mul- 2 7 tipliées d’environ 10 à 10 fois ou plus vis-à-vis 35 du nombre de cellules inoculées directement à l’ani— /„ il ' 11 22 1 δ mal, ou d1 environ 10-10° fois ou plus comparativement au cas dans lequel les cellules sont cultivées dans un milieu nutritif.

I La production de CB à partir des cellules 5 développées d'une lignée établie provenant d'êtres humains ou d'animaux à sang chaud peut être effectuée de diverses manières. On peut également récolter ces cellules directement du corps dans lequel elles se sont développées. Par exemple, on peut récolter 10 directement CB des cellules'obtenues en laissant se développer les cellules transplantées des lignées établies provenant d'êtres humains ou d'animaux à sang chaud dans des ascites sous forme d'une suspen-

Ision ou en les laissant se développer par voie sous— 15 cutanée.

En variante, la production de CB peut être effectuée en utilisant un inducteur après la croissance des lignées établies de cellules provenant d'êtres humains ou d'animaux à sang chaud, dans le 20 corps d'un animal, en appliquant l'inducteur direc tement in vivo ou in vitro après avoir prélevé les cellules du corps. Par exemple, les cellules d'une lignée établie provenant d'êtres humains ou d'animaux à sang chaud, qui se sont développées dans des ascites 25 desquelles elles ont été récoltées ou celles qui ont été isolées et dissociées d'une tumeur sous—cutanée comprenant les cellules d'une lignee établie provenant d'êtres humains ou d'animaux à sang chaud, peu-vent être mises en suspension dans un milieu nutri—

30 tif maintenu à une température d'environ 20 à 40°C

r g pour obtenir une concentration d'environ 10 —10 cellules par ml, pour les exposer ensuite à un inducteur de CB* amorçant ainsi la production de CB que l'on peut ensuite récolter.

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ί 23

De plusj lorsque les cellules d’une lignée établie provenant d’êtres humains ou d’animaux à sang chaud sont développées dans une chambre de diffusion, elles peuvent en être récoltées directement ou, après 5 avoir été retirées une fois de la chambre, elles peuvent être récoltées soit directement, soit même après exposition à un ou plusieurs inducteurs#

De plus, on peut même accroître davantage le rendement en CB par animal en adoptant, par exem-10 - pie, une méthode dans laquelle les cellules d’une lignée établie provenant d’êtres humains ou d’animaux à sang chaud et qui se sont développées dans le corps d’un autre animal, sont exposées à un inducteur afin d’amorcer la production de CB in situ, les cellules 15 ainsi développées, qui ont été récoltées d’un site spécifique ou de tout le corps du même animal, étant ensuite exposées à un inducteur afin d’amorcer la production de CB, une méthode dans laquelle les cellules utilisées sont à nouveau exposées à un induc— 20 teur afin d’amorcer la production de CB, une méthode dans laquelle une chambre de diffusion placée dans ou raccordée au corps de l’animal est remplacée par une nouvelle afin d’accroître le nombre de cellules obtenues, et analogues# 25 Pour amorcer la production de CB, on peut utiliser l’un ou l’autre des inducteurs de CB décrits ci—dessus et la CB ainsi obtenue peut être fractionnée en 0Βχ, CB^, CBX2 et CB^ respectives ayant les poids moléculaires spécifiés et ce, en adoptant les 30 procédés connus de séparation et de purification qui ont été décrits ci-dessus# A présent, on décrira l’efficacité, la toxicité, la méthode d’utilisation et le dosage de la CB ainsi obtenue.

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Expérience 1 : Sélectivité de 1*effet cytotoxique * r

Des échantillons de lCr cellules de chaque ; lignée de cellules tumorales comprenant des cellules KB (cancer nasopharyngien), des cellules MX-1 (cancer 5 du sein, fournies par le Docteur Shigeru Tsukagoshi, 11 Cancer Institute11), des cellules HEp—2 (cancer de la gorge) et des cellules HEL (hépatome, Flow Co,) et des lignées de cellules normales comprenant des cellules 407 d'intestin, des cellules de coeur de 10 Girardi, des cellules de foie de Chang, des cellules de Vero (rein de singe) et des cellules MDCK (rein de chien) (Flow Co,), toutes soumises à une culture préalable pendant 24 heures respectivement, de même 7 que 105 cellules P388 et 10~* cellules L1210 (leucé- 15 mie, fournies par le Docteur Shigeru Tsukagoshi,

"Cancer Institute") (qui ont été utilisées immédiatement) ont été cultivées chacune dans 1 ml de milieu d*Eagle contenant 10$ de sérum de veau et à 37°C

pendant 48 heures dans une atmosphère à 5% de CO2 et 20 à 95$ d'air avec chaque substance d1essai. Ensuite, sous im microscope à lumière, on a compté le nombre de cellules viables non colorées par le bleu Trypan et, vis-à—vis du témoin auquel on a attribué la valeur 100, on a calculé la concentration de la subs— 25 tance d1essai à laquelle 50$ des cellules ont été tuées. Comme substances d1essai, on a utilisé CB^ obtenue à 1*exemple 10, CB^ obtenue à 1*exemple 16, 0Βχ2 obtenue à ^exemple 20, CB^ obtenue à 1* exemple 26 ou 29, un mélange de CB^. et de CB^, un mélange ! .. 30 de CBde CBy1 , de CB^ et de CB^a un mélange de | CB-£2 e_k de CB^2 a des α-, β- et X —Lymphotoxines obtenues par un procédé connu (Granger, G,A, et al,, Cellular Immunology, volume 38, 388-402 (1978))^ le i facteur carcinolytique séparé de CBY à l'exemple 1 et 35 la Mitomycine C. Une unité des Lymphotoxines et du /f ’ L- ^ ^ 25 facteur carcinolytique est exprimée par un indice classique qui est basé sur la cytotoxicité sur des cellules L de souris (Eds., Bloom, B.R· & Grade, P.R. ,!In Vitro Methods in Cell-mediated Immunity”, 5 Academie Press, 1979)· Les résultats sont repris dans les tableaux 2-1 à 2-4.

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; <; 0 0 fi fi ooofi ! H O H P fi OHfia i - i r / TABLEAU 2-3 28

Nom des Concentration pour une cellules Espèce inhibition à 50% de la 5 croissance_ I ™Χ3^Λ> Mito-

(unités/ (unités/ mycine ml) ml) C

(ug/ml ' 10_________ KB Humaine 1,0 1,0 35

Cellu— HEp-2 Humaine 1,5 1,7 18 les HEL Humaine 1,3 1*4 25 r tumo- MX-1 Humaine 1,8 1,7 30 15 raies L1210 Souris 3*1 2,9 44 P388 Souris 3,4 3,5 37

Intestin Humaine > 1,000 >1,000 35 407 20 Coeur Humaine >1,000 >1,000 44

Cellu- Girardi les Foie Humaine >1,000 >1,000 21 norma— Chang les Vero Singe 620 580 50 25 MDCK Chien 510 540 44

Culture Rat 87Ο 910 61 primaire . . Foie de — — — — rat 30 _____ ; Remarques : *1) CBY_ obtenue à l1exemple 26 -Λ-3 *2) CB^ obtenue à 1* exemple 29.

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I TABLEAU 2-4 29 !

Nom des Espèce Concentration pour une I! *" cellules inhibition à 50% de la 5 croissance ____ r A** ·* B-'2 ^ C*3) (uni- (uni- (uni-tés/ml) tés/ml) tés/ml) 110 KB Humaine 1,0 1,0 1,0

Cellu- HEp-2 Humaine 1,5 1,4 1,6 les HEL Humaine 1,6 1,7 1,9 tumo- MX-1 Humaine 1,8 1,7 1,6 raies L1210 Souris 3,0 3,2 3,0 15 P388 Souris 3,1 3,4 3,2

Intestin Humaine >1.000 >1.000 >1.000

Cellu- 407 les Coeur Humaine >1.000 >1.000 >1.000 20 nor- Girardi males Foie Humaine >1.000 >1.000 >1.000

Chang

Vero Singe 610 590 580 MDCK Chien 580 610 600 25 _____

Remarques : *1) Mélange de CBX et de 0Βχ^

*2) Mélange de 0Βχ, de 0Βχ^, de 0Βχ^ et de CBY

- *^·ο *3) Mélange de CB^ e_b de 0Βχ^ 30

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L-^ ί 30

Comme on le constate d’après les résultats ci-dessus, CB analogue au facteur carcinolytique a détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales. Toute-_ 5 fois, les intensités de l'effet cytotoxique sur les tumeurs respectives étaient différentes entre CB et le facteur carcinolytique. En revanche, l’a-Lympho-toxine, la ß-Lymphotoxine et la mitomycine C ont exercé une cytotoxicité non sélective vis-à-vis des 10 cellules normales et des cellules tumorales.

Expérience 2 : Influence sur des souris chez lesquelles on a transplanté le sarcome 180 ou la tumeur d’Ehrlich.

Chez des souris mâles (famille ddY) pesant 15 25-30 g, on a transplanté, par voie intrapéritonéale, 3 x 10^ cellules par animal du sarcome 180 ou de la tumeur ascitique d’Ehrlich et l’on a observé les jours de survie, A partir du premier jour après la transplantation, on a administré quotidiennement 20 par voie intraveineuse,à des groupes de cinq souris, la CB^ obtenue à l’exemple 6, la CB^ obtenue à l'exemple 15, la CB.^ obtenue à l'exemple 20 et la , CBY obtenue à l’exemple 26 ou 29 et ce, jusqu’à la

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mort. Les résultats sont exprimés par le pourcentage 25 moyen de jours de survie vis-à-vis du groupe témoin i ces résultats sont repris dans les tableaux 3-1 à 3-3·

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/i f \___ i i TABLEAU 3-1 31 î , Tumeur Substance d*essai Dose quo— Nombre tidienne moyen de 5 j ours de survie ____{%) CBj 1,2 unité/kg 111

Sarcome 4 unités/kg 131 10 180 ' 12 unités/kg 104 chez la Mitomycine C 0^5 mg/kg 140 souris Cyclophosphamide 20 mg/kg 172 CB-£ 1,2 unité/kg 141 15 Tumeur 4 unités/kg 159 asciti- 12 unités/kg I87 que Mitomycine C 0a5 mg/kg 168 d1 Ehrlich Cyclophosphamide 20 mg/kg 212

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h t : I 32 j TABLEAU 3-2 ( j | i ^Tumeur Substance d’essai Dose quo- Nombre tidienne moyen de 5 jours de survie ____(%) CB^ 1 unité/kg 113

Sarcome 3 unités/kg 133 ' 10 l80 10 unités/kg l60 chez la 0Βχ2 1 unité/kg 110 souris 3 unités/kg 135 10 unités/kg 159 Mitomycine C 0,5 mg/kg 138 15 Cyclophosphamide 20 mg/kg 170 CB^ 1 unité/kg 139

Tumeur 3 unités/kg 164 * asciti- 10 unités/kg 187 20 que CBX2 1 u^i^é/kg 135 d’Ehrlich 3 unités/kg 161 i 10 unités/kg 189 I Mitomycine C 0,5 mg/kg I64

Cyclophosphamide 20 mg/kg 206 ! 25 ___

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f î r ί i: {/ J 1 TABLEAU 3-3 33 .

, Tumeur Substance d’essai Dose quo— Nombre tidienne moyen de ß 3 ours de survie ______(*)

CBX3*l) 1 unité/kg HO

Sarcome 3 unités/kg 12 9 10 180 10 unités/kg 157 chez la CBX^2) 1 unité/kg 108

souris 3 unités/kg 131 I

10 unités/kg 150

Mitomycine C 0,5 mg/kg 142 15______ 0Βχ2*1) 1 unité/kg 139

Tumeur 3 unités/kg 155 ascitique 10 unités/kg l8l d*Ehrlich CBY *2) 1 unité/kg 132 Λ j 20 3 unités/kg 157 10 unités/kg 179 Mitomycine C 0,5 mg/kg 166 25 Remarques : "x'l) CB^ obtenue à l’exemple 26 *2) CBY_ obtenue à l’exemple 29.

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Comme on le constate clairement d’après „ les résultats ci-dessus, CB a exercé un effet anti tumeur significatif sur les souris chez lesquelles 30 on avait transplanté respectivement le sarcome l80 1 v w et la tumeur d’Ehrlich.

i il 34

Expérience 3 : Influence sur le nombre de jours de survie de souris leucémiques.

Chez des souris mâles de la famille BDF..

>* * · pesant 20-25 g, on a transplanté, par voie intra-5 péritonéale, 10~* cellules/animal de la leucémie L1210 de la souris ou 10^ cellules/animal de la leucémie P388 de la souris et l’on a observé le nombre de jours de survie. On a administré par voie intrapéritonéale, à des groupes de cinq souris, 0Βχ obtenue 10 à l'exemple 10, CB^ obtenue à l'exemple 16, CB^ obtenue à l'exemple 20 et CBY, obtenue à l'exemple 26

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ou 29 soit quotidiennement un jour après la transplantation jusqu'à la mort (pour CB^., CB^q et CB^), soit une fois le lendemain de la transplantation 15 (pour CBY ). Les résultats sont exprimés par le « pourcentage du nombre moyen de jours de survie vis- à-vis du groupe témoin 3 ces résultats sont repris dans les tableaux 4-1 à 4-3· TABLEAU 4-1 20 ____

Tumeur Substance d'essai Dose quo- Nombre tidienne moyen de jours de survie 25____{%) CBX 0,4 unité/kg 105

Leucémie 1,2 unité/kg 123 L1210 de 4 unités/kg 151 la souris Mitomycine C 0,5 mg/kg 128 30 Cyclophosphamide 20 mg/kg I72 CB^ 0,4 unité/kg ΓΪ3

Leucémie 1,2 unité/kg 128 P388 de 4 unités/kg 144 la souris Mitomycine C 0,5 mg/kg 133 35 Cyclophosphamide 20 mg/kg 147 / f it TABLEAU 4-2 35 ;

Tumeur Substance d’essai Dose quo- Nombre tidienne moyen de 5 3 ours de survie ____{%) CB^ 3 unités/kg 108

Leucémie 10 unités/kg 122 10 L1210 de 30 unités/kg 149 la souris CB^ 1 unité/kg 110 3 unités/kg 121 10 unités/kg 151

Mitomycine C 0,5 mg/kg 136 15 Cyclophosphamide 20 mg/kg 149 CBY1 1 unité/kg 110

Leucémie 3 unités/kg 126 P388 10 unités/kg 147 20 de la CB^ 0,3 unité/kg 109 souris 1 unité/kg 125 3 unités/kg 151

Mitomycine C 0,5 mg/kg 130

Cyclophosphamide 20 mg/kg 145 25 ___, ‘ ί h ; ii ! ; 36 4 i TABLEAU 4-3

Tumeur Substance d’essai Dose quo- Nombre tidienne moyen de i 5 jours de : survie ___(*) CBX3Î{.1) 10 unités/kg 109 30 unités/kg 120 10 Leucémie 100 unités/kg 149 L1210 de 0Βχ3*2) 10 unités/kg 111 la souris 30 unités/kg 121 100 unités/kg 146

Mitomycine C 5,0 mg/kg 132 15_____ CBY-.v.l) 10 unités/kg 122

Aj 30 unités/kg 145 Leucémie 100 unités/kg 176 P388 de 0Βχ^2) 10 unités/kg 120 20 la souris 30 unités/kg 148 100 unités/kg 171

Mitomycine C 5,0 mg/kg 141 25 Remarques : *1 ) CB„0 obtenue à l’exemple 26 'x‘2) CBYO obtenue à l’exemple 29.

Λά I Comme on le constate clairement d’après les résultats ci—dessus, CB a exercé un effet anti— tumeur significatif chez les souris présentant res-30 pectivement la leucémie L1210 et la leucémie P388.

| ; j 37

Expérience 4 : Influence sur le nombre de jours de survie de souris présentant le carcinome du poumon.

Dans la cuisse droite de souris mâles de la 5 famille BDF1 pesant 20-25 g, on a transplanté, par voie intramusculaire, 2 x 10υ cellules du carcinome du poumon de Lewis et l'on a observé le nombre de jours de survie. Un jour après la transplantation, on a administré quotidiennement par voie intraveineuse, 10 à des groupes de six souris, CB^. obtenue à 1*exemple 7, CBX1 obtenue à l'exemple 17, CB^ obtenue à l'exemple 22 et CBY<J obtenue à l'exemple 26 ou 29 et ce, jus— qu'à la mort. Les résultats sont exprimés par le pourcentage du nombre moyen de jours de survie vis-15 à-vis du groupe témoin ; ces résultats sont repris dans les tableaux 5-1 et 5-2.

TABLEAU 5-1

Substance d'essai Dose quoti- Nombre moyen de 20 dienne jours de survie ___{%) 0Βχ 1,2 unité/kg 104 4 unités/kg 112 12 unités/kg 146 25 Mitomycine C 0,5 mg/kg 121

Cyclophosphamide 20 mg/kg 16 3 / ί-^ \ Π

J

TABLEAU 5-2 38 j Substance d’essai Dose quoti- Nombre moyen de dienne dours de survie 5__--^- 0Βχ1 1 unité/kg 107 3 unités/kg 113 10 unités/kg 145 ; 0Βχ2 1 unité/kg 109 10 3 unités/kg 121 10 unités/kg 143 CBX3*1) 1 unité/kg 115 3 unités/kg 143 10 unités/kg 157 15 CB '”'2) 1 unité/kg 111

AJ

3 unités/kg 136 10 unités/kg 159

Mitomycine C 0,5 mg/kg 120

Cyclophosphamide 20 mg/kg 1^4 20 __

Remarques : *1) CBV- obtenue à l'exemple 26

AJ

, *2) CBY0 obtenue à l'exemple 29· j -Λ-3

Expérience 5 · Influence sur le nombre de jours de 25 survie de souris atteintes de mélanome.

Dans le dos de souris mâles de la famille BDF- pesant 20-25 g, on a transplanté, par voie sous-j . cutanée, 10° cellules/animal du mélanome B 16 de la 1 souris et l'on a observé le nombre de jours de survie.

30 Un jour après la transplantation, on a administré quotidiennement par voie intraveineuse, à des groupes de sept souris, 0Βχ obtenue à l'exemple 10 et 0Βχ3 obtenue à l'exemple 26 ou 29 et ce, jusqu'à la mort.

• Les résultats sont exprimés par le pourcentage du 35 nombre moyen de jours de survie vis-à-vis du groupe ί , / I / 39 témoin $ ces résultats sont repris dans les tableaux 6-1 et 6—2.

TABLEAU 6-1 5 Substance d’essai Dose quoti- Nombre moyen dienne de jours de _____survie (%)_ CB-£ 1,2 unité/kg 112 4 unités/kg 135 10 ' 12 unités/kg 180

Mitomycine C 0,5 mg/kg 138

Cyclophosphamide 20 mg/kg 158 TABLEAU 6-2 15 ____

Substance d’essai Dose quoti- Nombre moyen dienne de jours de __survie (%)_ CBY-*1) 1 unité/kg 110 A j 20 3 unités/kg 131 10 unités/kg 178 1 unité/kg 116 3 unités/kg 129 10 unités/kg 176 25 Mitomycine C 0,5 mg/kg 140

Remarques î *l) CB„0 obtenue à l'exemple 26

AJ

*2) CBYO obtenue à l’exemple 29.

AJ

Comme on le constate clairement d'après les 30 résultats ci-dessus, CB a manifestement exercé un effet antitumeur sur les souris atteintes du mélanome B 16.

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40

Expérience 6 : Influence sur la métastase du cancer du poumon.

Dans le dos de souris mâles de la famille BDF^ pesant 20-30 g (6 animaux dans chaque groupe), 5 on a transplanté ,par voie sous-cutanéejdes segments carrés de 2 mm du cancer du poumon de Lewis. A partir du 9© jour après la transplantation, on a administré^ par voie intraveineuse^une fois par jour pendant 12 jours C£$xl obtenue à 1* exemple 15, 0Βχ2 obte-10 nue à 1*exemple 20 et le facteur carcinolytique. Le 21e jour après la transplantation, on a isolé et pesé la masse de la tumeur primaire et l*on a calculé le nombre de nodules de métastase formés dans les poumons suivant la méthode de Wexler, H. (J. Natl.

15 Cancer Institute, volume 36, 641 (1966)). Les résultats sont repris dans les tableaux 7-1 et 7-2.

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43

Comme on le constate clairement d’après les résultats ci-dessus/ CB^ a supprimé très efficacement le cancer primaire du poumon et ses métastases, tandis que le facteur carcinolytique n’a exercé presque aucun 5 effet sur les métastases du poumon.

Expérience 7 ï Effet sur la différenciation de cellules tumorales.

Suivant le procédé de Hozumi, M. et al. ("Cancer Research”, volume 40, 2919-2924 (1980)), on 10 a mis 5 x 10~* cellules de la leucémie myéologène aiguë M-l (fournies par le Dr. Motoo Hozumi, "Saitama Cancer Center”) en suspension dans 1 ml de milieu dlEagle contenant 10# de sérum de veau, ainsi que des acides aminés et des vitamines en quantités égales à deux 15 fois les teneurs habituelles 5 on y a ajouté chaque substance d’essai et on a effectué une culture à 37°C pendant 48 heures sous une atmosphère à 5# de CO2 et I à 95# d’air. Ensuite, on a remis les cellules en suspension dans un milieu contenant 0,2# de particu-20 les de latex de polystyrène (Dow Chemical Co.), on I les a incubées à 37°C pendant 4 heures puis, sous un £ microscope à lumière, on a compté le nombre de cellu— I les qui orvfc absorbé les particules par phagocytose, I ainsi que le nombre de cellules totales ; le taux de I 25 différenciation a été calculé d’après le rapport de ces cellules. Les résultats sont repris dans le I tableau 8.

. r .7 * fi ! £ 1 - *: & I '...........' I 44 B . TABLEAU 8 B Substance d’essai Concentration Taux de dif— B férenciation I 5___{%) B Témoin 1 H CB^ 0j 004 unité/ml 8 I 0,04 unité/ml 11

Il 0,4 unité/ml 18

B 10 Dexaméthasone 20,0 ng/ml I 25 I

B CBj. a provoqué la différenciation.

B Expérience 8 : Essai pyrogène B Conformément au procédé décrit dans la I 15 pharmacopée japonaise, on a administré CB^ obtenue B à 1’ exemple 3 par voie intraveineuse à des lapins B blancs en une dose de 100 unités par animal. Le B tableau 9 reprend les résultats de la mesure de la B température rectale relevée au cours drune période 120 ultérieure allant jusqu’à 3 heures et ce, en utilisant un thermomètre du type à thermocouple.

TABLEAU 9

Lapin Poids Température rectale avant et apres 25 (kg) l’injection de CB^ (°C)

Avant 1 heure 2 heures 3 heures l’injec- plus plus plus ___tion__tard__tard tard 30 A 2,0 38,90 38,70 38,80 38,80 B 2,0 38,90 38,90 38,97 38,97 C 2,0 39,25 39,25 39,22 39,30 .

45

Expérience 9 ï Influence sur des souris atteintes du cancer des mamelles.

Dans le dos de souris nues de la famille ” BALB/C pesant 20-25 g (6 animaux dans chaque groupe), 5 on a transplanté/par voie sous-cutanéeydes segments carrés de 2 mm du cancer du sein humain MX-1. A partir du 14e jour après la transplantation, pendant 14 jours, on a administré,par voie intraveineuse,aux souris, CBY_ obtenue à 1*exemple 26 ou 29. Le 15e jour 10 après la première administration, on a mesuré le volume de la tumeur primaire. Les résultats sont repris dans le tableau 10.

TABLEAU 10 15 Substance d’essai Dose quoti- Volume de la dienne tumeur *l) ___(cm3)_ Témoin 9*7 + 2,2 CB^'^) 1 unité/kg 7,6 + 1,3 20 3 unités /kg 4*3 + 1,3* 10 unités/kg 2,2 + 0,9** CBX3*^ 1 7/3 ± 1*2 3 unités/kg 4*6 + 1*4* 10 unités/kg 2,0 + 1,0** 25 Mitomycine C 0,5 mg/kg 4*4 + 1,1*

Remarques : *1) (Valeur moyenne) + (erreur type).

*2) CBY„ obtenue à l’exemple 26.

V -"-O

*3) CB obtenue à l’exemple 29,

“O

30 * Valeur statistiquement différente du groupe témoin à un degré de signification de 5% ou moins.

** Valeur statistiquement différente du groupe témoin à un degré de signifi-35 cation de 1% ou moins.

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Z

4ö

Expérience 10 : Influence sur la tumeur provoquée parle méthylcholanthrèn e ·

Dans 1*abdomen latéral de souris de la famille ddY pesant 20-25 g (8 animaux dans chaque 5 groupe), on a injecté,par voie sous-cutanée,du 3— méthylcholanthrène en solution dans de 1*huile d'olive à raison de 0,5 mg/souris. Environ 60 jours après l'injection de 3—méthylcholanthrène, pendant 21 jours, on a administré une fois par jour, par voie 10 intraveineuse,aux souris la CBY- obtenue à l'exemple 26 ou 29« Le 21e jour après la première administration de CBY0, on a mesuré le volume de la tumeur.

A3

Les résultats sont repris dans le tableau 11.

TABLEAU 11 15 ___

Substance d’essai Dose quoti- Volume de la dienne tumeur *1) _________(cm3)_ Témoin 10,5 + 2,3 20 CBX3*2) 1 ^ité/kg 8*5 + 1*4 3 unités/kg 5,4 + 1,4* 10 unités/kg 2,5 + 0,7** CBX3^^ 1 8,9 ± 1,5 3 unités/kg 5,1 + 1*3* 25 10 unités/kg 2,2 + 0,8**

Mitomycine C 0,5 mg/kg 6,6 + 1,3*

Remarques ï *1) (Valeur moyenne) ± (erreur type), *2) CBY0 obtenue à l'exemple 26 •A3 30 *3) CBY„ obtenue à l'exemple 29.

* Valeur statistiquement différente du groupe témoin à un degré de signifi— , cation de 5% ou moins, * ** Valeur statistiquement différente du È , s > · - - ' 35 groupe témoin à un degre de signifi— ! cation de t% ou moins.

't /> 5. e i I Comme on le constate clairement d’après les résultats ci-dessus, CBY0 a manifestement exercé

B

fl un effet antitumeur sur la tumeur spontanée.

I Expérience 11 : Essai de toxicité (une seule adminis— 5 tration)· A des souris mâles de la famille BDF^ H pesant 20-25 g (10 animaux dans chaque groupe), on a I administré CB par voie intraveineuse et l’on a observé I le nombre d’animaux morts pendant 7 jours. Les 10 fl' 10 animaux ont tous survécu sans présenter des change- I ments dans le poids du corps et l’état général même lors de l’administration de 10.000 unités/kg de CB^., I de CB^ ou de CB^ ou de 100.000 unités/kg de CBj^* I Expérience 12 : Essai de toxicité (administration I 15 continue pendant 30 jours).

I A des souris mâles de la femille BDF^ pesant 20-25 g (10 animaux dans chaque groupe), on a adminis— B tré CB par voie intraveineuse pendant 30 jours et l’on fl a observé le nombre d’animaux morts, de même que les fl 20 changements survenant dans le poids du corps et l’état H général. Le poids du corps a été relevé entre 9 et H 10 heures et l’observation de l’état général a été fl effectuée le 10e, le 20e et le 30e jour conformément fl au procédé d’Arvien (Science, volume 36, 123 (1962)).

fl 25 Au cours de cette période de 30 jours, aucun animal H _ n’est mort lorsqu’on a administré 1.000 unités/kg/ fl jour de CB^., de CB^ ou de CB^ ou 10.000 unités/kg/ fl * jour de CB^ et la courbe du gain de poids était plus fl ou moins la même que celle du groupe témoin. De plus, fl 30 on a constaté que l’état général était normal tout fl comme dans le groupe témoin.

fl Comme on peut le constater d’après les ex— fl périences ci-dessus, CB supprime sélectivement la fl croissance des cellules tumorales et, en outre, non fl 35 seulement elle supprime remarquablement la métastase ·· - - — *· ***:*.: - Λ 48 du cancer, mais elle est également extrêmement efficace contre différentes tumeurs en étant toujours très sûre même à des doses supérieures à celle à laquelle l’effet pharmaceutique se manifesterait. En conséquence, CB 5 est extrêmement utile pour la thérapie de différentes tumeurs telles que le cancer de 1*estomac, le cancer du poumon, l’hépatome, le cancer du colon, le cancer du sein, le cancer de l1utérus, la leucémie, etc, CB peut être administré sous forme de pré-10 parafions classiques, par exemple, sous forme d’injec-tions, de gouttes oculaires, de gouttes nasales, d’inhalations, de préparations topiques, de prépara— tions orales, de préparations rectales, de préparations vaginales, etc, La dose thérapeutique quoti— 15 dienne de CB pour un adulte n’est pas particulièrement limitée en raison de sa haute sécurité mais, en règle générale, elle est de 0,5 à 500,000 unités, de préférence, de 0,5 à 5,000 unités pour l’application topique, de 20-100,000 unités pour l’administration systé-20 mique, par exemple, pour l’injection intraveineuse, l’injection intramusculaire, etc,, et de 50 à 500,000 unités pour l’administration orale 5 cette dose peut avantageusement être réglée suivant la méthode d’utilisation ou la gravité des maladies, La préparation 25 peut contenir CB^, CB^, CB^ et CB^ individuellement ou en combinaison l’une avec l’autre dans n’importe quel rapport désiré, " CB peut être formulée en préparations phar maceutiques par n’importe quelle méthode classique en 30 utilisant des supports, des bases et des excipients pharmaceutiquement acceptables, etc. De préférence, on l’utilise sous forme de préparations orales telles que des préparations entériques, par exemple, des capsules, des comprimés, des poudres, etc,, sous forme 35 de préparations rectales telles que des suppositoires, / * ? 49 .

sous forme d’injections telles que des injections aqueuses, sous forme de préparations reconstituables d’une poudre lyophilisée que l’on dissout dans de l’eau distillée pour l’injection avant l’utilisation, 5 ainsi que sous forme de préparations topiques telles que des onguents, des lotions, etc. En outre, on peut formuler CB sous forme de gouttes oculaires, de gouttes nasales ou d’inhalations.

Parmi les supports et excipients solides que 10 l’on peut avantageusement utiliser suivant l’invention, il y a, par exemple, les excipients ordinaires tels que le lactose, le mannitol, l’amidon de mais et la fécule de pomme de terre, les agents liants tels que la cellulose cristalline, les dérivés de la cellulose, 15 la gomme arabique, l’amidon de mais et la gélatine, les agents désintégrants tels que l’amidon de mais, la fécule de pomme de terre et la carbohydroxyméthyl-cellulose de calcium, de même que des lubrifiants tels que le talc et le stéarate de magnésium. Parmi 20 les supports liquides que l’on peut avantageusement utiliser suivant l’invention, il y a, par exemple, l’eau distillée pour injection, la solution saline physiologique, les huiles végétales pour injection, de même que les glycols tels que le propylène-glycol 25 et le polyéthylène-glycol.

On donnera ci-après des exemples, mais l’invention n’y est nullement limitée.

Exemple 1

On a mis des lymphocytes humains (2 x 10*^ 30 cellules) en suspension dans 4*000 ml de milieu

d’Eagle contenant 10% de sérum de veau et on a effectué une culture à 37°C pendant 48 heures dans une atmosphère à 5% de C02 et à 95% d’air. Ensuite, on a soumis le produit surnageant du milieu de culture 35 à une dialyse contre un tampon de phosphate 0,0lM

/ / 7_ I(pH î 7j2) et, à partir du produit de dialyse, on a obtenu une fraction relarguée avec 40-80$ de sulfate d1 ammonium· On a à nouveau soumis cette fraction à une dialyse contre ce tampon de phosphate, puis 5 à une filtration sur gel en utilisant "Sephadex G-100" (Pharmacia Co,)· On a recueilli une fraction d’un poids moléculaire de 12,000-17*000 que l’on a appelée fraction CB^ brute, tandis que la fraction éluée antérieurement a été appelée fraction brute du facteur 10 carcinolytique. On a adsorbé la fraction de CB^ bru te sur du "Sephadex” conjugué avec "Ulex europeus ag-glutinin” (Maruzen Oil Co.) en éluant avec un tampon de phosphate 0,01M contenant du fucose 0,5M, Après élimination du fucose par dialyse, on a à nouveau 15 adsorbé 0Βχ sur le "Sephadex" conjugué avec "Ulex europeus agglutinin", puis on a procédé à une élution par un procédé à gradient en utilisant un tampon de phosphate (pH : 7#2), éluant ainsi la CB^ purifiée.

On a obtenu une quantité totale de 0,02 mg de CB^·, 20 L1 activité totale de la CB^. obtenue était de 150 unités (déterminée par le procédé décrit ci-dessus). Dès lors, l’activité spécifique de la CB^. purifiée était de 7*500 unités/mg.

Exemple 2 25 On a mis des lymphocytes bovins (2 x 10^ cellules) en suspension dans 1,000 ml de milieu d*Eagle contenant 10$ de sérum de veau et on a effectué une culture à 37°C pendant 48 heures dans une atmosphère à 5$ de CO^ et à 95$ d’air. Ensuite, on 30 a soumis le produit surnageant du milieu de culture aux procédés de l’exemple 1 pour purifier la CB^ et l’on a obtenu 0,01 mg de CB^. L’activité totale de la CB.£ obtenue était de 20 unités et, dès lors, l’activité spécifique de la CB^. purifiée était de 35 2,000 unités/mg.

51

Exemple 3

On a mis des lymphocytes de souris (5 x 10^ cellules) en suspension dans 5«000 ml de milieu d’Eagle contenant 10$ de sérum de veau et on 5 a effectué une culture à 37 °C pendant 48 heures dans une atmosphère à 5% de CO2 et à 95$ d’air* Ensuite, on a soumis le produit surnageant du milieu de culture aux procédés de l’exemple 1 afin de purifier la CBX et l’on a obtenu 0,12 mg de CBY. L’activité totale Λ 10 de la 0Βχ obtenue était de 4 00 unités et, dès lors, l’activité spécifique de la 0Βχ purifiée était de 3.333 unités/mg.

Exemple 4

On a mis des cellules BALL-1 (lignée de 15 cellules humaines, 1 x 10^° cellules) que l’on a soumises à une culture préalable, en suspension dans 2.000 ml de milieu d’Eagle contenant 10$ de sérum de veau et on a effectué une culture à 37°C pendant 48 heures sous une atmosphère à 5^ de CO^ et à 95% d’air. 20 Ensuite, on a soumis le produit surnageant du milieu de culture aux procédés de l’exemple 1 pour purifier 0Βχ et l’on a obtenu 0,7 mg de 0Βχ. L’activité totale de la CBX ainsi obtenue était de 4*000 unités et, dès lors, l’activité spécifique de la 0Βχ purifiée était 25 de 5·714 unités/mg.

Exemple 5

On a mis des cellules Flow 7000 (lignée de fibroblastes humaines, 3 x 10^ cellules), qui ont été développées par culture, en suspension dans 600 ml 30 de milieu d’Eagle contenant 10$ de sérum de veau et on a effectué une culture à 37°0 pendant 48 heures sous une atmosphère à 5$ de CO2 et à 95% d’air. Ensuite, on a soumis le produit surnageant du milieu de culture aux procédés de l’exemple 1 pour purifier 35 la 0Βχ et l’on a obtenu 0,005 mg de 0Βχ. L’activité / 52 totale de la CB^ obtenue était de 10 unités et, dès lors, l’activité spécifique de la CB^ purifiée était de 2a000 unités/mg.

Exemple 6 5 On a mis des lymphocytes humains (2 x 10^^ cellules) en suspension dans 4»000 ml de milieu d*Eagle contenant 10% de sérum de veau et, après addition de phytohémagglutinine (Difco Co.) à une concentration finale de 50 ^.g/ml, on a effectué une 10 culture à 37°C pendant 48 heures sous une atmosphère à 5% de (Χ>2 et à 95/» d’air* Ensuite, on a soumis le produit surnageant du milieu de culture aux procédés de l’exemple 1 pour purifier la CB^ et l’on a obtenu . 1 mg de CB^.. L’activité totale de la CB-^ obtenue 15 était de 10.000 unités et, dès lors, l’activité spé cifique de la CBj. purifiée était de 10,000 unités/mg. Exemple 7

On a mis des cellules Flow 7000 (lignée de fibroblastes humaines, 3 x 10^ cellules) en suspension 20 dans 600 ml de milieu d’Eagle contenant 10% de sérum de veau et, après addition de phytohémagglutinine à une concentration finale de 50 ^îg/ml, on a effectué une culture à 37°0 pendant 48 heures sous une atmosphère à 5% de C02 et à 95$ d’air. Ensuite, on a soumis 25 le produit surnageant du milieu de culture aux procédés de l’exemple 1 afin de purifier la CB^. et on a obtenu 60 jLg de CB-£. L’activité totale de la CB^ obtenue était de 48Ο unités et, dès lors, l’activité spécifique de la CB^. purifiée était de 8.000 unités/mg.

30 Exemple 8

On a mis des cellules TALL-1 (lignée de cellules humaines, 9 x 10^) développées par culture, en suspension dans 800 ml de milieu d’Eagle contenant 10% de sérum de veau et, après addition de phytohémag-35 glutinine à une concentration finale de 50 ^ig/ml, on / 53 a effectué une culture à 37°C pendant 48 heures sous une atmosphère à 5% de CO^ et à 95% d1air. Ensuite, on a soumis le produit surnageant du milieu de culture aux procédés de 1* exemple 1 pour purifier la 5 0Βχ et l’on a obtenu 0,8 mg de 0Βχ. L1 activité totale de la 0Βχ obtenue était de 7*500 unités et, dès lors, 1*activité spécifique de la 0Βχ purifiée était de 9*375 unités/mg.

Exemple 9 10 On a soumis des souris adultes à un traite ment préalable par irradiation avec des rayons X d’environ 400 rems pour supprimer leur réponse immunologique, puis on y a transplanté des cellules TALL—1 ' (origine humaine) par voie sous-cutanée* On a ensuite 15 nourri les souris pendant trois semaines. On a isolé la masse de la tumeur qui s’est formée par voie sous-cutanée et qui pesait environ 10 g, on l’a hachée et dissociée dans une solution saline physiologique contenant de la trypsine, puis on a recueilli les 20 cellules dispersées* On a traité ces cellules conformément au procédé de l’exemple 1 pour obtenir 0Βχ. Le rendement en 0Βχ était d’environ 190 unités par souris.

Exemple 10 25 On a mis des cellules BALL-1 (lignée de cellules humaines, 9 x 10^ cellules) en suspension dans 1.800 ml de milieu d’Eagle contenant 10$ de sérum de veau et, après addition de 9 x 10^ unités formatrices de plaques du virus de Sendai (HVJ), on 30 a effectué une culture à 37°C pendant 48 heures sous une atmosphère à 5% de CO2 et à 95% d’air. Ensuite, „ on a soumis le produit surnageant du milieu de cul ture aux procédés de l’exemple 1 pour purifier 0Βχ et l’on a obtenu 720 jig de 0Βχ. L’activité totale 35 de la 0Βχ obtenue était de 7.920 unités et, dès lors, 154 1* activité spécifique de la CB^. purifiée était de 11.000 unités/mg.

On a dissous la CB^ obtenue dans une solution saline physiologique à une concentration de 1 mg/ 5 ml et 1*on a mesuré la rotation optique de la solution à 598 nm (ligne Na, D) à 26,5-28,5°C au moyen d’un polarimètre (Nihon Bunko DIP-181) en utilisant une microcellule de 10 mm dans le parcours de la lumière, La valeur zéro a été attribuée à la rotation optique H 10 de la solution saline physiologique faisant office de [fl témoin, CB^ était lévogyre, M 0n a transformé 10 ^ig de la 0Βχ obtenue ci- H dessus en microcomprimés avec une poudre de bromure 9 . de potassium pour en mesurer le spectre d1 absorption 15 des rayons infrarouges, La mesure intégrée (60 fois)

Ia été effectuée au moyen du spectrophotomètre à 1*infrarouge de transformation de Fourier fX—6201 ("Analect Instruments Co,"), Les résultats obtenus sont reproduits dans la figure 1 annexée, 20 Exemple 11

Chez des souris nues adultes, on a transplanté, par voie sous-cutanée, des cellules BALL-1 (origine humaine), puis on a nourri les souris pendant trois semaines. On a isolé la masse delà tumeur 25 qui s’est formée par voie sous-cutanée et qui pesait environ 10 g (pour chaque souris), on l’a hachée, puis on l’a dissociée dans une solution saline phy-- siologique contenant de la trypsine et ensuite, on a recueilli les cellules dispersées. On a lavé ces 30 cellules avec un milieu d’Eagle contenant 5% de sérum humain, puis on a mis 2 x 10^ cellules en suspension dans 2,000 ml du même milieu et on a effectué une culture à 37°C pendant 48 heures sous une atmosphère à 5% de CO2 et à 95% d’air. Ensuite, on a 35 soumis le produit surnageant du milieu de culture aux i procédés de 1’ exemple 1 pour obtenir CB^· Le rendement en CB^. était d* environ 200 unités par souris H nue .

I Exemple 12 B 5 On a mis des cellules JBL (lignée de cellu— B les humaines) en suspension dans une solution saline B physiologique, puis on a déposé la suspension dans B une chambre cylindrique de diffusion en matière plas- B tique ayant une capacité d1environ 10 ml et munie B 10 d’un filtre à membrane dont les pores avaient une B dimension d’environ 0,5 micron ; on a ensuite placé B cette chambre dans la cavité péritonéale d’un rat B adulte. On a nourri le rat pendant quatre semaines, fl puis on en a retiré la chambre, B 15 On a trouvé que la concentration des cel— fl g B les humaines ainsi obtenues était d’environ 5 x 10 fl 3 B cellules par ml, ce qui représente environ 10 fois B ou plus la concentration obtenue par culture in vitro B dans un milieu nutritif sous une atmosphère à 5% de B 20 (Χ>2 et à 95% d’air. Une quantité totale de 1 x ÎO*-^ B cellules JBL obtenues par le procédé décrit ci-dessus B a été mise en suspension dans 4·000 ml de milieu B d*Eagle contenant 10% de sérum de veau et on a effec— B tué une culture à 37°C pendant 48 heures sous une B 25 atmosphère à 5% de CO2 et à 95% d’air. Ensuite, on B a soumis le produit surnageant du milieu de culture B aux procédés de l’exemple 1 pour obtenir CB^-· Le B * rendement en CB·^ était d’environ 350 unités par rat, B Exemple 13 B 30 Chez des souris nues adultes, on a trans- B planté, par voie sous-cutanée, des cellules BALL-1 B (origine humaine) , puis on a nourri les souris pen— B dant cinq semaines. Ensuite, à chaque souris, on a

Il injecté, par voie intrapéritonéale, 1 mg de phyto- B 35 hémagglutinine, puis on a sacrifié les souris 24 heu— I / 56 res après 1*injection et l'on a recueilli 1*ascite.

On a centrifugé 1*ascite à 4°C et l'on a soumis 1,000 g du produit surnageant obtenu à une dialyse contre une solution saline physiologique conte- 5 nant un tampon de phosphate 0,0lM (pH ï 7j2), pen- * dant 15 heures. On a également soumis la solution à une ultrafiltration avec un filtre à membrane et l'on a concentré le filtrat pour obtenir une solution contenant CB^· La quantité de 0Βχ était d'environ 10 8,000 unités par souris nue.

Exemple 14

On a mis des cellules NALL-1 (lignée de cellules humaines) en suspension dans une solution saline physiologique et on a versé la suspension 15 ainsi obtenue dans une chambre cylindrique de diffusion en matière plastique ayant une capacité d'environ 10 ml et pourvue d'un filtre à membrane dont les pores avaient une dimension d'environ 0,5 micron ; on a placé cette chambre dans la cavité péritonéale d'un 20 rat adulte. On a nourri ce rat pendant 4 semaines, puis on en a retiré la chambre. On a lavé les cellules ainsi développées avec un milieu d'Eagle contenant 5% de sérum humain et on les a remises en suspension dans le même milieu en une concentration d'environ 25 5 x 10^ cellules par ml, A la suspension, on a ajouté environ 200 ^ig/ml de phytohémagglutinine et on a incubé le mélange à 37°C pendant deux jours pour amor-. cer la production de 0Βχ, On a purifié la CB^ ainsi obtenue et on l'a concentrée comme décrit à l'exemple 30 1, puis on l'a soumise également à une lyophilisation pour obtenir une poudre de 0Βχ . Le rendement en 0Βχ était d'environ 15*000 unités par rat,

U

57

Exemple 15

Conformément aux procédés décrits à 11 exemple 6, on a cultivé des lymphocytes humains et l’on a soumis le produit surnageant du milieu de culture à 5 une purification pour obtenir une fraction purifiée d’un poids moléculaire de 70.000—90.000. Cette fraction a été appelée CB^· L’activité totale de 0,1 mg de CB^ purifiée était de 5*000 unités et, dès lors, l’activité spécifique de la 0Βχ1 purifiée était de 10 50.000 unités/mg.

On a mesuré la rotation optique de la CB^ obtenue ci-dessus comme décrit à l’exemple 10. 0Βχ^ était dextrogyre.

On a effectué la mesure du spectre d’absorp-15 tion des rayons infrarouges de la CB^ obtenue ci-dessus comme décrit à l’exemple 10. Les résultats sont reproduits dans la figure 2 annexée.

Exemple 16

Conformément aux procédés décrits à l’exem-20 pie 10, on a cultivé des cellules BALL—1 et on a soumis le produit surnageant du milieu de culture à une purification pour obtenir une 0Βχ^ purifiée. L’activité totale de 100 yag de la CB^ purifiée obtenue était de 4*200 unités et, dès lors, l’activité 25 spécifique de la CB^ purifiée était de 42.000 unités/ mg*

Exemple 17

Conformément aux procédés décrits à l’exemple 7y on a cultivé des cellules Flow 7000 et on a 30 soumis le produit surnageant du milieu de culture à une purification pour obtenir 10 ^ig de CB^ purifiée.

* L’activité totale de la 0Βχ^ obtenue était de 250 Ç. unités et, dès lors, l’activité spécifique de la 0Βχ^ ί purifiée était de 25.000 unités/mg.

L

- ' j-.

I Exemple 18

Conformément aux procédés décrits à 1 ’ exemple 2 , on a cultivé des lymphocytes bovins et on a soumis le produit surnageant du milieu de culture à 5 une purification pour obtenir 0,002 mg de CB^ puri fiée· L*activité totale de la CB^ obtenue était de 14 unités et, dès lors, 1*activité spécifique de la CBX1 purifiée était de 7«000 unités/mg·

Exemple 19 10 Conformément aux procédés décrits à l1exem ple 4j on a cultivé des cellules BALL-1 et l’on a soumis le produit surnageant du milieu de culture à une purification pour obtenir 0,2 mg de 0Βχ1 purifiée· " L’activité totale de la CB^ obtenue était de 2,300 15 unités et, dès lors, l’activité spécifique de la 0Βχ^ purifiée était de II.5OO unités/mg.

Exemple 20

Conformément aux procédés décrits à l’exemple 6, on a cultivé des lymphocytes humains et on 20 a soumis le produit surnageant du milieu de culture à une purification pour obtenir une fraction purifiée ayant un poids moléculaire de 40.000-50,000, Cette 3 fraction a été appelée CB^· L’activité totale de 9 0,25 mg de laCBX2 purifiée ainsi obtenue était de 9 25 5,200 unités et, dès lors, l’activité spécifique de 9 la 0Βχ2 purifiée était de 20.800 unités/mg.

9 Exemple 21 9 * Conformément aux procédés décrits à l’exem- 11 pie 10, on a cultivé des cellules BALL—1 et l’on a j* 30 soumis le produit surnageant du milieu de culture à 3 une purification pour obtenir 75 de CB^ purifiée.

9 L’activité totale de la CB^ obtenue était de 10.000 9 unités et, dès lors, l’activité spécifique de la rl CBX2 Purifiée était de 133·333 unités/mg.

59

On a mesuré la rotation optique de la CBy2 obtenue ci-dessus comme décrit à l’exemple 10. La CB^2 était dextrogyre.

On a effectué la mesure du spectre d’absorp-5 tion des rayons infrarouges de la CBy2 obtenue ci- dessus comme décrit à l’exemple 10. Les résultats sont reproduits dans la figure 3 annexée.

Exemple 22

Conformément aux procédés décrits à l’exem-10 pie 7> on'a cultivé des cellules Flow 7000 et l’on a soumis le produit surnageant du milieu de culture à une purification pour obtenir 20 jig de CBy2 purifiée. L’activité totale de la 0Βχ2 obtenue était de 500 unités et, dès lors, l’activité spécifique de la 15 CB-£2 purifiée était de 25.000 unités/mg.

Exemple 23

Conformément aux procédés décrits à l’exemple 2, on a cultivé des lymphocytes bovins et l’on a soumis le produit surnageant du milieu de culture à 20 une purification pour obtenir 0,001 mg de CBy2 purifiée. L’activité totale de la CBy2 obtenue était de 40 unités et, dès lors, l’activité spécifique de la CB^2 purifiée était de 40.000 unités/mg.

Exemple 24 25 Conformément aux procédés décrits à l’exem- « pie 43 on a cultivé des cellules BALL-1 et l’on a soumis le produit surnageant du milieu de culture à * une purification pour obtenir 0,25 mg de CBy2 puri fiée. L’activité totalede la CBy2 obtenue était de 30 2.900 unités et, dès lors, l’activité spécifique de la CB^2 purifiée était de 11.600 unités/mg.

Exemple 25

On a mis des lymphocytes humains (2 x 10A cellules) en suspension dans 4·000 ml de milieu 35 d*Eagle contenant 10% de sérum de veau et, après 4

* U

60 avoir ajouté de la phytohémagglutinine en une concentration de 50 ^îg/ml, on a cultivé la suspension à 37°C pendant 48 heures sous une atmosphère à 5% de CO2 et à 95% d’air. Ensuite, on a soumis le produit 5 surnageant du milieu de culture à une dialyse con tre un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7^2) et, à partir du produit de dialyse, on a obtenu une fraction que l’on a relarguée avec 40-80$ de sulfate d’ammonium. On a à nouveau soumis cette fraction à 10 une dialyse contre ce tampon de phosphate, puis on l’a soumise à une filtration sur gel en utilisant du "Sephadex G-100" pour obtenir une fraction ayant un poids moléculaire de 7«000-9«000 que l’on a appelée "fraction brute de CB^”· 15 On a adsorbé la fraction brute de CBY„ sur

AO

du Sephalose conjugué avec de la phytohémagglutinine en éluant avec un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7,2) contenant de la N-acétyl—D-galactosamine 0,5M. Après élimination de la N—acétyl—D-galactosamine par dia— 20 lyse, on a appliqué la solution obtenue à de la car-boxyméthyl-cellulose équilibrée avec un tampon de phosphate 0,05M (pH : 6,4)3 puis on a procédé à une élution avec un tampon de phosphate 0,05M (pH : 6,4) contenant du chlorure de sodium 0,5M. De la sorte, 25 on a obtenu 0,1 mg de CBY_· L’activité totale de la

AO

CB-y.. obtenue était de 5·000 unités·

Exemple 26

On a soumis des hamsters nouveau-nés à un traitement préalable par injection d’un antisérum 30 préparé à partir de lapins selon la méthode habituelle afin de réduire le plus possible leur réponse immunologique, puis on y a transplanté par voie sous-cutanée des cellules BALL-1 et on les a ensuite nourris pendant trois semaines. On a isolé la masse 35 des tumeurs qui se sont formées par voie sous-cutanée /« t /, · -· * \ 61 et qui pesait environ 15 g, puis on a haché cette masse et on l*a dissociée dans une solution saline physiologique. Après avoir lavé les cellules ainsi obtenues avec un milieu d1Eagle exempt de sérum, on 5 a mis 1 x 10** cellules en suspension dans 150 ml de milieu d1Eagle contenant 10$ de sérum de veau et, après addition de 9 x 10^ unités formatrices de plaques du virus de Sendai (HVJ), on a effectué une culture à 37°C pendant 48 heures sous une atmosphère 10 à 5% de CO2 et à 95% d*air. On a soumis le produit surnageant du milieu de culture à une dialyse contre un tampon de phosphate 0,01M (pH : 732) et, à partir du produit de dialyse, on a obtenu une fraction que l*on a relarguée avec 40-80$ de sulfate 15 d1ammonium. On a à nouveau soumis cette fraction à une dialyse contre ce tampon de phosphate, puis on l*a soumise à une filtration sur gel en utilisant du "Sephadex G-100" pour obtenir une fraction ayant un poids moléculaire de 7*000-9000 que l*on a appelée 20 fraction brute de CBY/J* On a adsorbé cette fraction brute de CBY_ sur du Sephalose conjugué avec de la concanavaline A en éluant avec un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7 j 2) contenant de 1 * a—méthyl-D-mannoside 0,5M. Après élimination de 11α-méthyl—D-mannoside 25 Par dialyse, on a appliqué la solution à de la car— boxyméthyl-cellulose équilibrée avec un tampon de * phosphate 0,05M (pH : 6), puis on a effectué une - élut ion avec un tampon de phosphate 0,05M (pH : 7,8).

L*activité totale de0,2ntg delà CBYO obtenue était de 30 12.000 unités et son point isoélectrique était de 6,3-7,8.

Exemple 27

On a mis des cellules Flow 7000 (3 x 10*^ cellules) en suspension dans 1 litre de milieu 35 d1 Eagle contenant 10$ de sérum de veau et, après ad— /: 62 dition de phytohémagglutinine à une concentration finale de 50 ^ig/ml, on a effectué une culture à 37°C pendant 48 heures sous une atmosphère à 5% de CO2 et à 95% d’air* On a soumis le produit surnageant du 5 milieu de culture aux procédés de l’exemple 26 pour purifier la CB^ l’on a obtenu 0,1 mg de CB^· L’activité totale de la CBY<J obtenue était de 3*100 -Λ-Ο unités.

Exemple 28 10 On a mis des lymphocytes bovins (5 x 10*** cellules) en suspension dans 10 litres de milieu d’Eagle contenant 10% de sérum de veau et on a effectué une culture à 37° C pendant 48 heures sous une atmosphère à 5% de CO2 et à 95% d’air. Ensuite, on 15 a soumis le produit surnageant du milieu de culture aux procédés de l’exemple 26 pour purifier la CB^g et l’on a obtenu 0,1 mg de CBYO purifiée. L’activité totale de la CB^ obtenue était de 1700 unités. Exemple 29 20 On a mis des cellules BALL-1 (5 x 10** cellules) développées par culture, en suspension dans 100 1 de milieu d’Eagle contenant 10% de sérum de veau et on a effectué une culture à 37°C pendant 48 heures sous une atmosphère à 5% de CX>2 et à 95$ 25 d’air. Ensuite, on a soumis le produit surnageant du milieu de culture à une dialyse contre un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2) et l’on a obtenu une fraction que l’on a relarguée avec 40-80$ de sulfate d’ammonium. On a à nouveau soumis cette - 30 fraction à une dialyse contre ce tampon de phosphate, puis on l’a soumise à une filtration sur gel en utilisant du nSephadex G—100" pour obtenir une fraction ayant un poids moléculaire de 7*000-j 9*000. On a adsorbé cette fraction sur du Sephalose j 35 conjugué avec de la phytohémagglutinine, puis on a ! 4 i ^ i 1.

Iélué avec un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2) contenant de la N-acétyl-D-galactosamine 0,5M. Après élimination de la N-acétyl—D-galactosamine par dialyse, on a appliqué la solution dialysée à de la 5 carboxyméthyl-cellulose équilibrée avec un tampon de Tris 0,05M (pH : 7*2), puis on a élué avec un tampon de Tris 0,05M (pH ï 8) contenant du chlorure de sodium 0,5M et l'on a ainsi obtenu 0,1 mg de 0Βχ^ purifiée. L'activité totale de la CB^ obtenue 10 était de 8.200 unités et son point isoélectrique était de 8-9*2.

On a mesuré la rotation optique de la CB^ obtenue ci-dessus comme décrit à 1*exemple 10. La CBX3 n!avait pas de rotation optique.

15 On a effectué la mesure du spectre d1 ab sorption des rayons infrarouges de la CB^ obtenue ci-dessus comme décrit à l'exemple 10. Les résultats sont reproduits dans la figure 4 annexée.

Exemple 30 (injections aqueuses) 20 0Βχ 100.000 unités

Chlorure de sodium 9 g

Eau distillée pour injection, pour compléter à 1,000 ml.

On a pesé la CB^ et le chlorure de sodium 25 et on les a mélangés, puis on les a dissous dans 500 ml d'eau distillée pour injection et on a réglé le volume total à 1.000 ml avec de l'eau distillée pour injection. On a filtré cette solution aqueuse dans des conditions stériles en utilisant un filtre 30 à membrane et l'on a déposé 2 ml de chaque filtrat dans des récipients stérilisés en verre que l’on a scellés pour préparer des injections aqueuses. Exemples 31-33

On a effectué des procédés analogues à ceux 35 décrits à l'exemple 30 pour CB^, CB^ CB^^ afin 64 j , de préparer respectivement des injections aqueuses.

Exemple 34 (injections lyophilisées) CBY 100.000 unités

A

Albumine de sérum humain 5 à 20% 10 ml

Chlorure de sodium 9 g

Eau distillée pour injection, pour compléter à 1.000 ml*

On a pesé et mélangé la CB^- et le chlorure 10 de sodium, puis on les a dissous dans une solution obtenue en ajoutant la quantité prédéterminée de l’albumine humaine à 500 ml d’eau distillée pour injection et l’on a réglé le volume total à 1.000 ml avec de l’eau distillée pour injection. On a filtré 15 cette solution dans des conditions stériles avec un filtre à membrane et on a déposé 2 ml de chaque filtrat dans des récipients stérilisés en verre que l’on a ensuite lyophilisés et scellés pour préparer une I poudre lyophilisée pour injection.

20 Exemples 35-37

On a effectué des procédés analogues à ceux I de l’exemple 34 pour CB^, CB^ eh CB^ afin de pré- i parer respectivement une poudre lyophilisée pour in- j ection.

; 25 Exemple 38 (Gouttes oculaires) 0Βχ 100.000 unités

Chlorure de sodium 5 g " Chlorobutanol 5 g ï Eau distillée pour in— M 30 jection, pour compléter à 1.000 ml.

M On a pesé les ingrédients ci-dessus et on S les a dissous dans 950 ml d’eau distillée pour in— I jection. On a réglé le volume total à 1.000 ml et J| on a filtré la solution dans des conditions stériles 35 en utilisant un filtre à membrane pour obtenir une I“ préparation pour gouttes oculaires.

Exemples 39-41

On a effectué des procédés analogues à ceux de 1* exemple 38 pour CB-^ , CB^ a^n de for- 5 mer respectivement des préparations pour gouttes oculaires.

Exemple 42 (Suppositoires) CB^ 100.000 imités

Polyéthylène-glycol 1500 250 g 10 Polyéthylène-glycol 4000 environ 750 g 1.000 g

On a pesé les ingrédients ci-dessus et on a mélangé convenablement les quantités totales de I CB^. et de polyéthylène-glycol 1500 , ainsi que 500 g 15 du polyéthylène-glycol 4000, après quoi on a ajouté H le reste de polyéthylène-glycol 4000 pour obtenir un I poids total de 1.000 g, on a continué à mélanger con- 9 venablement et, par fusion, on a transformé le mélange gfl en suppositoires à 5*000 mg pour administration par · 9 20 voie rectale.

19 Exemples 43-45

On a effectué des procédés analogues à ceux de l’exemple 42 pour CB^, CB^ *"®X3 de pré parer respectivement des suppositoires administrables 25 par voie rectale.

- Exemple 46 (gouttes nasales) CB^. 100.000 unités

Chlorure de sodium 5 g

Chlorobutanol 5 g 30 Eau distillée, pour compléter à 1.000 ml.

On a pesé les ingrédients ci-dessus et on les a dissous dans 950 ml d’eau distillée. On a réglé la solution obtenue à un volume total de 1.000 35 ml avec de l’eau distillée afin de préparer une solu- !<.

Ition pour gouttes nasales·

Exemples 47-49

On a effectué des procédés analogues à ceux de 1* exemple 46 pour CB^ , CB^ CB^ a^n S de préparer respectivement une solution pour gouttes nasales·

Exemple 50 (comprimés entériques enrobés) CB^. 1*000.000 unités

Lactose 64 g 10 Fécule de pomme de terre environ 30 g

Alcool polyvinylique 3 g

Stéarate de magnésium 3 g 100 g 15 On a pesé respectivement les ingrédients ci-dessus, on a mélangé les quantités totales de CB-^ et de lactose, ainsi qu’à peu près la moitié de la quantité de fécule de pomme de terre, puis on a ajouté le reste de cette dernière au mélange afin d’obtenir 20 un poids total de 94 g et on a malaxé le mélange pour le rendre homogène. Au mélange obtenu, on a ajouté une solution aqueuse d’alcool polyvinylique et l’on a préparé des granulés par le procédé de pastillage par voie humide. On a séché les granules, 25 on les a mélangés avec le stéarate de magnésium et on en a formé des comprimés à 200 mg. On a enrobé les comprimés de phtalate de méthyl-cellulose pour obtenir des comprimés entériques enrobés.

Exemples 51—53 30 On a effectué des procédés analogues à ceux de l’exemple 50 pour CB^, CB^ et CB-^ afin de préparer respectivement des comprimés entériques enrobés.

F

y / iiS / i 67

Exemple 54 (onguent) CB^. 100.000 unités

Paraffine liquide 10 g

Vas eline environ_1.000 g ζ 1.000 g - On a pesé les ingrédients ci—dessus respec tivement, puis on a malaxé convenablement la CB^ avec la paraffine liquide, on y a ajouté 500 g de la Vaseline et on a mélangé convenablement. Au 10 mélange, on a ajouté progressivement le reste de la Vaseline pour obtenir un poids total de 1.000 g et l1on a mélangé convenablement le mélange pour préparer un onguent.

Exemples 55-57 15 On a effectué des procédés analogues à ceux de 11 exemple 54 pour CB^, CB^ et CB^ afin de préparer respectivement un onguent.

i

Claims (40)

1. 68
2. 1, Forme pratiquement purifiée d*une glycoprotéine (CB) produite par des cellules d * animaux à sang chaud, exerçant un effet antitumeur et 5 ayant les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : dans 1*intervalle de 7.000 à 90*000 par filtration sur gel de "Sepha-dex" ou par électrophorèse sur gel de dodécyl-sul-fate de sodium j 10 b) réactions chromogènes : donne une cou leur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d*acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse 15 avec lucide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à 1*anthrone/ acide sulfurique, la réaction à lTindole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfu-20 rique j c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l1eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l*hexane et le chloroforme 5 25 d) teneur en sucres : teneur totale en sucres : 8-45% dont 6-28$ sont des hexoses, 1—11$ sont des hexosamines et 1-6$ sont des acides sialiques 5 % e) stabilité ; stable dans une solution 30 aqueuse d*un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d,un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; et f) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire 35 les cellules normales. C 1 69
3. 2. Forme pratiquement purifiée d,une glycoprotéine (CB^.) suivant la revendication 1, exerçant un effet antitumeur et ayant les propriétés suivantes : 5 a) poids moléculaire : 12.000 — 17*000 5 b) réactions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d*acides aminés 10 dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec 1*acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à 1*anthrone/ acide sulfurique, la réaction à l,indole/acide 15 sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique ; c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans 11 eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le ben- 20 zène, l’hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres : teneur totale en sucres : 2J-33% dont 17-20$ sont des hexoses, 5-7% sont des hexosamines et 5—6% sont des acides sialiques ; 25 e) point isoélectrique ï 4j2-753 > ·> f) capacité dladsorption : peut être adsor- bée sur "Sephadex" conjugué avec "Ulex europeus ag-glutinin1' dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 73^)1 g) stabilité : stable dans une solution 30 aqueuse d!un pH de 2, de 7 °u de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d,un pH de 7 à 6o°C pendant 3 heures ou plus 3 h) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire 35 les cellules normales 5 et /» L ii) différenciât ion î établit une différenciation des cellules tumorales·
4. 3· Forme pratiquement purifiée d*une glycoprotéine (CB^) suivant la revendication 1, 5 exerçant un effet antitumeur et ayant les proprié tés suivantes : a) poids moléculaire : 70»000-90«000 ; b) réactions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réac-10 tion de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et dTacides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l1acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide 15 sulfurique* la réaction à l^nthrone/acide sulfuri que, la réaction à l^ndole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique ; c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans 1* eau, le chlorure de sodium aqueux et 20 un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l*hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres : teneur totale en sucres ; 35-45$ dont 23-28$ sont des hexoses, 8-11$ sont des hexosamines et 4—6$ sont des acides siali— 25 ques ; e) point isoélectrique : 433-6,2 ; f) capacité d*adsorption : peut être adsorbée sur ‘'Sephadexf1 conjugué avec ’Ulex europeus agglutinin’dans un tampon de phosphate 0,01M 30 (pH i 7,2); g) stabilité : stable dans une solution aqueuse d*un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d,un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; et 71 h) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales·
5. 4. Forme pratiquement purifiée d’une 5 glycoprotéine (CB^) suivant la revendication 1, exerçant un effet antitumeur et ayant les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 40.000-50,000 5 b) réactions chromogènes : donne une cou-10 leur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrîne après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant 15 la présence de sucres dans la réaction au phénol/ acide sulfurique, la réaction à l1anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique 3 c) aspect et solubilité : poudre blanche 20 soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et i un tampon de phosphate et peu soluble dans le benzène, I l’hexane et le chloroforme 3 I d) teneur en sucres : teneur totale en J sucres î 30-37$ dont 20-23$ sont des hexoses, 6-8$ j 25 sont des hexosamines et 4-6$ sont des acides siali- j · ques 5 I e) point isoélectrique : 432-7>3 5 f) capacité d’adsorption ï peut être I adsorbée sur "Sephadex" conjugué avec “Ulex europeus i ; 30 agglutinin'dans un tampon de phosphate 0,01M 1 (pH : 7,2) 3 : g) stabilité : stable dans une solution,, aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant j. 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un j 35 pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 3 et F 5' ; -7 ; : / . 72 , h) cytotoxicité r détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire f les cellules normales* 5* Forme pratiquement purifiée d’une 5 glycoprotéine (CBY) suivant la revendication 1, -*•3 exerçant un effet antitumeur et ayant les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 7·000“9·000 ; b) réactions chromo gènes : donne une cou— 10 leur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant 15 la présence de sucres dans la réaction au phénol/ acide sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique 5 c) aspect et solubilité s poudre blanche 20 soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate,et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme 3 d) teneur en sucres : teneur totale en sucres î 8-15$ dont 6-10$ sont des hexoses, 1-2$ 25 sont des hexosamines et 1-3$ sont des acides sia-» liques 5 e) capacité d’adsorption : peut être ad-sorbée sur la carboxyméthyl-cellulose dans une chromatographie d’échange d’ions dans un tampon de phos- 30 phate 0,05M (pH : 6,4) en utilisant la carboxyméthyl-cellulose 3 f) stabilité : stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 °u de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un 35 pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 3 f / / j Ig) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales 3 et h) la séquence des acides aminés de la « 5 terminaison N de sa fraction protéique est Alanine- M Alanine-.
6. 16· Procédé de préparation d’une glycoprotéine (CB) exerçant un effet antitumeur, caractérisé en ce qu’il consiste à développer une source 10 de cellules provenant d’animaux à sang chaud et extraire, de cette source de cellules ou d’un produit surnageant d’un milieu de culture de cette source, une forme pratiquement purifiée d’une glycoprotéine ayant les propriétés suivantes : 15 a) poids moléculaire : se situe dans ^in tervalle allant de 7*000 à 90.000 par filtration sur gel de "Sephadex" ou par électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium ; b) réactions chromogènes : donne une cou-20 leur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d*acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec 1*acide chlorhydrique et donne une couleur 25 indiquant la présence de sucres dans la réaction au « phénol/acide sulfurique, la réaction à 1*anthrone/ acide sulfurique, la réaction a l’indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique 5 30 c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres : teneur totale en 35 sucres : 8—45$ dont 6—28$ sont des hexoses, 1—11$ 74 sont des hexosamines et 1-6$ sont des acides sialiques 3 e) stabilité : stable dans une solution aqueuse d*un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 5 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d'un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 3 et f) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales, 10 7, Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que cette glycoprotéine (CB^) possède les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 12,000-17*000 3 h) réa tions chromogènes : donne une cou-15 leur indiquant la présence de protéines dans la réaction cb Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d1acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec 1*acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la pré— 20 sence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à 11anthrone/acide sulfurique, la réaction à l,indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique 3 c) aspect et solubilité : poudre blanche 25 soluble dans l*eau, le chlorure de sodium aqueux et ’ un tampon de phosphate, et peu soluble dans le ben zène,l*hexane et le chloroforme 3 d) teneur en sucres : teneur totale en sucres : 27-33$ dont 17-20$ sont des hexoses, 5-7$ t 30 sont des hexosamines et 5-6$ sont des acides siali ques 3 e) point isoélectrique : 4i2-7 y 3 3 Ïf) capacité d*adsorption : peut être ad- sorbée sur "Sephadex” conjugué avec Ulex europeus ag— 35 glutinin dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 75^)3 f, 75 g) stabilité : stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; 5 h) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales j et i) différenciation : établit une différenciation des cellules tumorales.
7. 8. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que cette glycoprotéine (CB^) possède les propriétés suivantes : a) poids moléculaire î 70.000-90.000 $ b) réactions chromogènes : donne une cou- 15 leur indiquant la présence de protéines dans la réac tion de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction a la Ninhydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la pré- 20 sence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l'indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique 5 c) aspect et solubilité : poudre blanche 25 soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et » un tampon de phosphate, et peu soluble dans le ben zène, l’hexane et le chloroforme m3 d) teneur en sucres : teneur totale en sucres : 35-45% dont 23-28$ sont des hexoses, 8-11$ 30 sont des hexosamines et 4-6$ sont des acides siali-ques ; e) point isoélectrique : 4^3-6,2 ; f) capacité d’adsorption : peut être adsor- : bée sur"Sephadex”conjugué avec*Ulex europeus agglu- 35 tinin” dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7,2) ·, / : -C-'-N. i 2 76 g) stabilité : stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de H à 4°C pendant * 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; et 5 h) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales.
8. 9. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que cette glycoprotéine (CB^) P°s-10 sède les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 40.000-50,000 j b) réactions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la pré- 15 se ce de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, 20 la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique j Ic) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le ben— 25 zène, l’hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres : teneur totale en sucres : 30-37% dont 20-23$ sont des hexoses, 6-8$ sont des hexosamines et 4-6$ sont des acides sialiques i 30 e) point isoélectrique : 4,2-7,3 5 f) capacité d’adsorption : peut être ad-sorbée sur Sephadex” conjugué avec "uiex europeus agglutinin” dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7,2) 5 (•*9 H g) stabilité : stable dans une solution 9 aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant H ‘ 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un 9 pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 1 et 9. h) cytotoxicité î détruit sélectivement 9 les cellules tumorales pratiquement sans détruire 9 les cellules normales· 9 10· Procédé suivant la revendication 6, 9 caractérisé en ce que cette glycoprotéine (CB^) Pos~ 9 10 sède les propriétés suivantes : 9 a) poids moléculaire : 7.000-9«000 ; SB b) réactions chromogènes : donne une cou— 9 leur indiquant la présence de protéines dans la réac— 9. tion de Lowry, donne une couleur indiquant la présence 9 15 de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réac- 9 tion à la Ninhydrine après hydrolyse avec l’acide 9 chlorhydrique et donne une couleur indiquant la pré— 9 sence de sucres dans la réaction au phénol/acide 9 sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, 9 20 la réaction à 1’indole/acide sulfurique et la réaction 9 au tryptophane/acide sulfurique ; 9 c) aspect et solubilité : poudre blanche 9 soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et ^B un tampon de phosphate, et peu soluble dans le ben— 25 zène, l’hexane et le chloroforme ; 9. d) teneur en sucres : teneur totale en ^B sucres : 8-15$ dont 6-10$ sont des hexoses, 1—2$ 9. sont des hexosamines et 1-3$ sont des acides siali- 9 ques 5 9 30 e) capacité d’adsorption : peut être adsor- 9 hée sur*la carboxyméthyl-cellulose dans une chromato- 9 graphie d’échange d’ions dans un tampon de phosphate 9 0,05M (pH : 6,4) en utilisant la carboxyméthyl-cellu- 9 lose j 78 f) stabilité : stable dans une solution aqueuse d'un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d'un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 5 5 g) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales $ et h) la séquence des acides aminés de la terminaison N de sa fraction protéique est Alanine-10 Alanine -.
9. 11. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que les cellules de la source sont choisies parmi le groupe comprenant les cellules réticulo-endothéliales, les lymphoblastes, les cellu- 15 les leucémiques et les fibroblastes, ces cellules pouvant être des cellules non établies ou des cellules de lignées établies.
10. 12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que les lignées établies de cellu— 20 les sont choisies parmi le groupe comprenant BALL-1, TALL-1, NALL-1, Namalwa, M-7002, B-7101, Flow 7000, .JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-HO, BALM2 et CCRF-SB qui sont toutes d'origine humaine.
11. 13· Procédé suivant la revendication 11, 25 caractérisé en ce que les lignées établies de cellu les sont choisies parmi le groupe comprenant BALB/C 3T3 de la souris, les cellules leucémiques L1210, P388 de la souris, le done M-3 du mélanome de la souris, la tumeur LLC-WRC 256 du rat et le mélanome 30 RPMI 1846 du hamster qui proviennent toutes d'animaux à sang chaud.
12. 14· Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que les cellules non établies sont choisies parmi le groupe comprenant les macrophages I 35 humains et les lymphocytes humains. ] î / . I L— 79 .
13. 15. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que les cellules non établies sont « choisies parmi le groupe comprenant les lymphocytes et les macrophages provenant d'animaux à sang chaud. „ 5 16. Procédé suivant la revendication 6, tv- caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à transplanter directement des cellules d’une lignée établie provenant d’êtres humains ou d’animaux à sang chaud dans les corps d’animaux à sang chaud de 10 la même espèce ou d’une espèce différente et extraire cette glycoprotéine des tumeurs formées par des cellules transplantées, soit directement, soit après que la tumeur ait été cultivée et développée in vitro.
14. 17· Procédé suivant la revendication 6, 15 caractérisé en ce qu’il comprend les étapes qui con sistent à placer des chambres de diffusion (dans lesquelles on a inoculé une source de cellules d’une lignée établie provenant d’êtres humains ou d’animaux à sang chaud) chez des animaux à sang chaud de telle 20 sorte qu’elles reçoivent l’alimentation d’un fluide corporel de ces animaux, laisser se développer cette source de cellules et extraire cette glycoprotéine des cellules développées, soit directement, soit après qu’elles aient été cultivées et développées 25 in vitro.
15. 18. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que les cellules de la source précitée sont exposées à l’action d’un ou de plusieurs inducteurs.
16. 19. Glycoprotéine exerçant un effet anti tumeur, caractérisée en ce qu’elle.est préparée par le procédé suivant la revendication 6.
17. 20. Glycoprotéine exerçant un effet anti-tumeur, caractérisée en ce qu’elle est préparée par 35 le procédé suivant la revendication 7· U ; I 8° til i kf
18. 121. Glycoprotéine exerçant un effet anti- tumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé suivant la revendication 8,
19. 22. Glycoprotéine exerçant un effet anti-5 tumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé suivant la revendication 9·
20. 23. Glycoprotéine exerçant un effet antitumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé suivant la revendication 10.
21. 24. Glycoprotéine exerçant un effet anti tumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé suivant la revendication 11. H 25· Glycoprotéine exerçant un effet anti- tumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par 15 le procédé suivant la revendication 12.
22. 26. Glycoprotéine exerçant un effet anti-tumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé suivant la revendication 13·
23. 27. Glycoprotéine exerçant un effet anti-20 tumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé suivant la revendication 14·
24. 28. Glycoprotéine exerçant un effet antitumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé suivant la revendication 15.
25. 29. Glycoprotéine exerçant un effet anti tumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé suivant la revendication 16,
26. 30· Glycoprotéine exerçant un effet antitumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par 30 le procédé suivant la revendication 17·
27. 31. Glycoprotéine exerçant tin effet anti-% tumeur, caractérisée en ce qu'elle est préparée par le procédé suivant la revendication 18.
28. 32. Agent thérapeutique pour combattre 35 les tumeurs, cet agent contenant, comme ingrédient ï: /> f 7 ! i S 81 actifj une quantité antitumeur efficace d’au moins une des glycoprotéines CB^ * CB^ * CB^2 et CB^ exerçant un effet antitumeur et ayant les propriétés suivantes : 5 a) poids moléculaire : se situe dans l’in tervalle de 7»000 à 90.000 par filtration sur gel de‘Sephadex“ ou par électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium ; b) réactions chromogènes : donne une cou- 10. leur indiquant la présence de protéines dans la réac tion de Lowry* donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant 15 la présence de sucres dans la réaction au phénol/ acide sulfurique* la réaction à 1’anthrone/acide sulfurique* la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique ; c) aspect et solubilité : poudre blanche 20 soluble dans l’eau* le chlorure de sodium aqueux et > un tampon de phosphate* et peu soluble dans le ben zène* l’hexane et le chloroforme } c d) teneur en sucres : teneur totale en | sucres : 8-45% dont 6-28$ sont des hexoses* 1-11$ j , 25 sont des hexosamines et 1-6$ sont des acides siali ques ; j. e) stabilité : stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2* de 7 ou de 11 à 4°C pendant t 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un 30 pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 5 et , f) cytotoxicité : détruit sélectivement Îles cellules tumorales pratiquement sans détruire £ les cellules normales. [ 33· Agent suivant la revendication 32* 35 caractérisé en ce que la glycoprotéine (CB^) possède / i L— 82 les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 12.000-17*000 ; b) réactions chromo gènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réac- 5 tion de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide 10 sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique $ c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et 15 tampon de phosphate, et peu soluble dans le ben zène, l’hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres ï teneur totale en sucres : 27-33$ dont 17-20$ sont des hexoses, 5-7$ sont des hexosamines et 5-6$ sont des acides siali- 20 ques j e) point isoélectrique : 4*2-7,3 * f) capacité d’adsorption î peut être adsor-bée surHSephadex" conjugué avec“Ulex europeus agglu-tinin"dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2) } 25 g) stabilité : stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2,de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; h) cytotoxicité î détruit sélectivement les 30 cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales 5 et i) différenciation : établit une différenciation des cellules tumorales. 34* Agent suivant la revendication 32, 35 caractérisé en ce que la glycoprotéine (CB^) possède L. Iles propriétés suivantes ï a) poids moléculaire : 70*000-90.000 ; b) réactions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réac-5 tion de Lowry, donne une couleur indiquant la pré sence de liaisons peptides et d'acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l'acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/ 10 acide sulfurique, la réaction à l'anthrone/acide sulfurique, la réaction à l'indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique j c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l'eau, le chlorure de sodium aqueux et 15 un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme 5 d) teneur en sucres : teneur totale en sucres : 35-45% dont 23-28$ sont des hexoses, 8-11$ sont des hexosamines et 4-6$ sont des acides siali-20 ques ; e) point isoélectrique : 4^3-6,2 ; f) capacité d'adsorption : peut être adsorbée sur Sephadex"1 conjugué avec "ülex europeus agglutinin* dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2)j 25 g) stabilité : stable dans une solution aqueuse d'un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d'un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; et h) cytotoxicité ï détruit sélectivement 30 les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales.
29. 35· Agent suivant la revendication 32, caractérisé en ce que la glycoprotéine (CB^) possède les propriétés suivantes î ^ 84 a) poids moléculaire : 40.000-50,000 5 b) réactions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la 5 présence de liaisons peptides et d*acides aminés dans !^ίi la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec 1* acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/ acide sulfurique, la réaction à 1*anthrone/acide 10 sulfurique, la réaction à l'1 indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique 5 c) aspect et solubilité î poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le ben-15 zène, l’hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres : teneur totale en sucres : 30-37$ dont 20-23$ sont des hexoses, 6-8$ sont des hexosamines et 4-6$ sont des acides sialiques ; 20 e) point isoélectrique : 4*2-7,3 j f) capacité d’adsorption î peut être adsor— bée sur "Sephadex“ conjugué avec “Ulex europeus aggluti-nin'dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2) ; g) stabilité : stable dans une solution 25 aqueuse d’un pH de 2, de 7 o*1 de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 5 et h) cytotoxicité : détruit sélectivement " les cellules tumorales pratiquement sans détruire les 30 cellules normales.
30. 36. Agent suivant la revendication 32, * caractérisé en ce que la glycoprotéine {CBYO) possède les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 7.000-9.000 5 : h î ' 85 b) réactions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réac- 5 tion à la Ninhydrine après hydrolyse avec 1*acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à 1’ anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction 10 au tryptophane/acide sulfurique 5 c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans 11 eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzè- ' ne, l’hexane et le chloroforme ; 15 d) teneur en sucres : teneur totale en sucres : 8-15$ dont 6-10$ sont des hexoses, 1-2$ sont des hexosamines et 1—3$ sont des acides sialiques 5 e) capacité d’adsorption : peut être adsor-bée sur la carboxyméthyl—cellulose dans une chroma- 20 tographie d’échange d’ions dans un tampon de phosphate* 0,05M (pH : 6,4) en utilisant la carboxyméthyl-cellulose ; f) stabilité : stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 25 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 5 g) cytotoxicité : détruit sélectivement les. * cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales ; et 30 h) la séquence des acides aminés de la ter minaison N de sa fraction protéique est Alanine-Alanine—, 37* Agent suivant la revendication 32, caractérisé en ce que l’ingrédient actif est un mé— 35 lange d’au moins deux membres choisis parmi le groupe / 86 comprenant 0Βχ, CB^ , 0Βχ2 et 0Βχ^ en n* importe quelle combinaison désirée· * 38· Agent thérapeutique pour combattre les tumeurs, caractérisé en ce qu*il contient un support 5 pharmaceutiquement acceptable et, comme ingrédient actif, une quantité antitumeur efficace d’au moins une des glycoprotéines CB^-, CB^, CB^ e"b 0Βχ^ exerçant un effet antitumeur et ayant les propriétés suivantes : 10 a) poids moléculaire : se situe dans ^in tervalle de 7.000 à 90,000 par filtration sur gel de Sephadex ou par électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium 5 b) réactions chromogènes : donne une cou- I5 leur indiquant la présence de protéines dans la réac tion de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d*acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la pré- 20 sence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à 1*indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique $ c) aspect et solubilité : poudre blanche 25 soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et * un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres : teneur totale en sucres : 8-45% dont 6-28% sont des hexoses, 1-11$ sont - 30 des hexosamines et 1-6% sont des acides sialiques j e) stabilité : stable dans une solution Ï aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; et I/> /1^ 87 f) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les’ ^ cellules normales·
31. 39· Agent suivant la revendication 38, 5 caractérisé en ce que la glycoprotéine (CB^.) possède les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 12.000-17·000 ; b) réactions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la 10 réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et décides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec 1*acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/ 15 acide sulfurique, la réaction à l*anthrone/acide sulfurique, la réaction à l'indole/acide sulfurique, et la réaction au tryptophane/acide sulfurique ; c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans lleau, le chlorure de sodium aqueux et 20 un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme 3 d) teneur en sucres : teneur totale en sucres : 27-33% dont 17-20$ sont des hexoses, 5-7$ sont des hexosamines et 5-6$ sont des acides siali— 25 ques ; e) point isoélectrique : 4,2-7,3 * f) capacité d*adsorption : peut être adsor— ! bée sur Sephadex conjugué avec Ulex europeus agglu- tinin dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2) 3 j ^ 30 g) stabilité : stable dans une solution I aqueuse d*un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant i 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d*un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 3 h) cytotoxicité : détruit sélectivement 35 les cellules tumorales pratiquement sans détruire / ! } . : 88 J les cellules normales j et; * i) différenciation î établit une différenciation des cellules tumorales. * 40. Agent suivant la revendication 38, 5 caractérisé en ce que la glycoprotéine (CB^q) possède » les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 70.000-90.000 ; b) réactions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la 10 réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la - présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec 11 acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide 15 sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique ; c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans 1 * eau, le chlorure de sodium aqueux et 20. un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme 5 d) teneur en sucres î teneur totale en sucres : 35-45% dont 23-28$ sont des hexoses, 8-11$ sont des hexosamines et 4-6$ sont des acides sialiques 5 25 e) point isoélectrique : 4*3-6,2 ; . f) capacité d'adsorption : peut être adsor— bée sur Sephadex" conjugué avec"Ulex europeus agglu-* tininwdans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7*2) 5 . % g) stabilité : stable dans une solution 30 aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant j 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 5 et r h) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les 35 cellules normales. / 89
32. 41· Agent suivant la revendication 38, caractérisé en ce que la glycoprotéine (CB^) possède les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 40.000-50.000 5 5 b) réa tions chromogènes : donne une cou leur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l’acide 10 chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à 1’indole/acide sulfurique et la * réaction au tryptophane/acide sulfurique 5 15 c) aspect et solubilité · poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres : teneur totale en 20 sucres ï 30-37$ dont 20-23$ sont des hexoses, 6-8$ sont des hexosamines et 4—6$ sont des acides sialiques ; e) point isoélectrique ï 4j2“7>3 5 f) capacité d’adsorption : peut être adsor- 25 bée sur "Sephadex" conjugué avec "ülex europeus agglu— tinin" dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7j2) 5 g) stabilité : stable dans une solution t axjueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant } 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un 130 pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus, et h) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales.
33. 42. Agent suivant la revendication 38, 35 caractérisé en ce que la glycoprotéine (CB^) possède 90 les propriétés suivantes î a) poids moléculaire : 7«000-9«000 } b) réactions chromogènes î donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la 5 réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la * présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l1acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/ 10 acide sulfurique, la réaction à 1*anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique } c) aspect et solubilité : poudre blanche ► soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et 15 un tampon de phosphate, et peu soluble dans le ben-, zène, l’hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres : teneur totale en sucres î 8-15% dont 6-10% sont des hexoses, 1-2$ sont des hexosamines et 1-3% sont des acides sialiques} 20 e) capacité d’adsorption ï peut être adsor- bée sur la carboxyméthyl-cellulose dans une chromatographie d'échange d’ions dans un tampon de phosphate 0,05M (pH î 6,4) eu utilisant la carboxyméthyl-cellu— lose 5 25 f) stabilité : stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus } g) cytotoxicité : détruit sélectivement les 30 cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales et h) la séquence des acides aminés de la terminaison N de sa fraction protéique est Alanine-Alanine—. ÿ < / : /· ( L 4 91
34. 43· Agent suivant la revendication 38, caractérisé en ce que 1*ingrédient actif est un mélange d’au moins deux membres du groupe comprenant C&£, CBj-χ , CB^2 efc CB^ en n’importe quelle combinai-, 5 son désirée. U-
35. 44· Procédé pour le traitement des tumeurs, caractérisé en ce qu’il consiste à administrer, à des patients souffrant d’une ou plusieurs tumeurs, une quantité antitumeur efficace d’au moins une des glyco— 10 protéines choisies parmi le groupe comprenant CB^, CBX15 CBX2 et CBX33 Ces glycoprotéines exerçant un effet antitumeur et ayant les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : se situe dans 1* in- « tervalle de 7·000 à 90.000 par filtration sur gel de
36. 15 Sephadex ou par électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium 5 b) réa tions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de 20 liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à 1’anthrone/aeide sulfurique, la réaction 25. l’indole/acide sulfurique et la réaction au trypto-phane/acide sulfurique 3 c) aspect et solubilité : poudre blanche * soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le ben-jj ; 30 zène, l’hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres : teneur totale en su- : cres : 8—45% dont 6-28% sont des hexoses, 1—11% sont des hexosamines et 1-6% sont des acides sialiques 5 e) stabilité : stable dans une solution 35 aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 /1 /; 7 i 92 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 5 et f ) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les r 5 cellules normales·
37. 45· Procédé suivant la revendication 44a caractérisé en ce que la glycoprotéine (CB^) possède les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 12,000-17-000 $ 10 h) réactions 'chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec 1*acide chlorhy-15 drique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à 1*anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction au trypto-phane/acide sulfurique ; 20 c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon cfe phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme 5 d) teneur en sucres : teneur totale en su-25 cres : 27-33% dont 17-20$ sont des hexoses, 5-7$ sont des hexosamines et 5-6$ sont des acides sialiques $ « e) point isoélectrique : 4s2-7,3 > $ f) capacité d’adsorption : peut être adsor- Ibée sur ^Sephadex*'conjugué avec "Ulex europeus aggluti-30 ninç dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7>2) \ g) stabilité : stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 93 h) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les s cellules normales $ et i) différenciation : établit une différen- r 5 ciation des cellules tumorales.
38. 46· Procédé suivant la revendication 44j caractérisé en ce que la glycoprotéine (CB^) possède les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 70.000-90.000 $ 10 b) réactions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d1acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec 1*acide chlorhy-15 drique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction au tryp-tophane/acide sulfurique 5 20 c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme $ d) teneur en sucres : teneur totale en su— 25 cres : 35-45$ dont 23-28$ sont des hexoses, 8-11$ sont ' des hexosamines et 4—6$ sont des acides sialiques ; e) point isoélectrique : 4?3-6,2 ; f) capacité d’adsorption : peut être adsor— bée sur"Sephadex“ conjugué avec‘lülex europeus aggluti— 30 nin“dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7j2) 3 g) stabilité î stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant 24 F· heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; et 1 / I —' I 94 h) cytotoxicité * détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales. ^ 47. Procédé suivant la revendication 44, 5 caractérisé en ce que la glycoprotéine (CB^) possède les propriétés suivantes : a) poids moléculaire : 40.000-50.000 ; b) réactions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réaction 10 de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction à la Ninhydrine après hydrolyse avec l’acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfuri— 15 que, la réaction à 1’anthrone/acide sulfurique, la réaction à 1’indole/acide sulfurique et la réaction au tryptophane/acide sulfurique ; c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et 20 un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme ; d) teneur en sucres ï teneur totale en sucres : 30-37$ dont 20-23$ sont des hexoses, 6-8$ sont des hexosamines et 4-6$ sont des acides siali- 2. ques 5 [. . e) point isoélectrique : 4>2-7,3 5 If) capacité d’adsorption : peut être adsor-- bée sur'‘S ephadex" conjugué avec “(Jlex europeus agglu- tînin" dans un tampon de phosphate 0,01M (pH : 7,2) ; 30 g) stabilité : stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 ou de 11 à 4°C pendant jj 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un ? pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus 5 et h) cytotoxicité · détruit sélectivement les L; 0 35 cellules tumorales pratiquement sans détruire les fi '(__^ 95 cellules normales.
39. 48. Procédé suivant la revendication 44s ^ caractérisé en ce que la glycoprotéine (CBY0) possède AJ les propriétés suivantes : , 5 a) poids moléculaire : 7.000-9*000 j b) réa tions chromogènes : donne une couleur indiquant la présence de protéines dans la réaction de Lowry, donne une couleur indiquant la présence de liaisons peptides et d’acides aminés dans la réaction 10. la Ninhydrine après hydrolyse avec 1*acide chlorhydrique et donne une couleur indiquant la présence de sucres dans la réaction au phénol/acide sulfurique, la réaction à l’anthrone/acide sulfurique, la réaction à l’indole/acide sulfurique et la réaction . 15 au tryptophane/acide sulfurique $ c) aspect et solubilité : poudre blanche soluble dans l’eau, le chlorure de sodium aqueux et un tampon de phosphate, et peu soluble dans le benzène, l’hexane et le chloroforme ; 20 d) teneur en sucres : teneur totale en su cres : 8-15% dont 6-10$ sont des hexoses, 1—2$ sont des hexosamines et 1-3% sont des acides sialiques $ e) capacité d’adsorption : peut être adsor— bée sur la carboxyméthyl-cellulose dans une chromato- 25 graphie d’échange d’ions dans un tampon de phosphate 0,05M (pH : 6,4) en utilisant la carboxyméthyl-cellulose i f) stabilité ï stable dans une solution aqueuse d’un pH de 2, de 7 on de 11 à 4°C pendant 24 130 heures ou plus et dans une solution aqueuse d’un pH de 7 à 60°C pendant 3 heures ou plus ; g) cytotoxicité : détruit sélectivement les cellules tumorales pratiquement sans détruire les cellules normales et ' -»tii 96 h) la séquence des acides aminés de la terminaison N de sa fraction protéique est Alanine— ^ Alanine-*
40. 49· Procédé suivant la revendication 44^ 5 caractérisé en ce qu*on administre, aux patients, un mélange d*au moins deux membres choisis parmi le groupe comprenant CBCB^, CB^ ei CB^.^ en nrimpor- Ite quelle combinaison désirée. Uavvxa