INTERFERON ET PREPARATION LE CONTENANT.
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ron et de compositions en renfermant, ainsi que leur utilisation pour le traitement ou la prévention de certaines maladies.
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blié par Kodansha, Ltd; Tokyo, 1975), par D.A.J. Tyrrell �Interferone and its clinical potential", publié par William Heinemann Médical Books, Ltd, Londres, 1976), et dans "Protein, Nucleic acid
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Ltd, Tokyo, interferon est un terme utilisé pour définir une sub-
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rement par des cellules vivantes, lors de leur exposition à des inducteurs tels que virus, bactéries, protozoaires, rickettsies, acide nucléique, endotoxine ou polysaccharide, et qui se révèle active pour inhiber, de manière non spécifique, la multiplication de différents virus dans les cellules. Depuis sa découverte, l'interferon est considéré comme un agent thérapeutique et préventif prometteur pour le traitement des maladies virales.
Ces dernières années, on lui a reconnu une activité antitumorale à la fois sur les tumeurs virales et non virales..
Comme l'interferon est spécifique de l'espèce considérée, seul l' . interferon provenant de cellules humaines, vivantes, se révèle efficace pour la prévention et le traitement des maladies de l'homme*
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est obtenu par séparation à partir de sang frais, mais sa conservation et son alimentation, en grande quantité et à faible coût, sont très difficiles,
On a aussi essayé d'utiliser, pour la production d'interferon, des cellules vivantes, obtenues par ensemencement de cellules humaines
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tefois, les procédés in vitro ne sont pas utilisables sur une large
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une grande quantité de serum humain, et de donner une multiplication instable, une faible vitesse de multiplication et une faible concentration cellulaire.
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voir une production industrielle d'interferon suffisante, pour la prévention et le traitement des maladies chez l'homme.
La présente invention permet d'éviter ces inconvénients de l'art antérieur et d'obtenir une production industrielle facile- <EMI ID=9.1>
traitement de certaines maladies.
Le nouveau procédé selon l'invention consiste à transplanter des cellules humaines, classées, c'est-à-dire "établies", à des animaux à sang chaud, ou à ensemencer ces cellules dans une chambre de diffusion où elles se multiplient; tandis que l'animal les alimente au moyen de ses fluides du corps nutritifs et à exposer les cellules résultantes, in vitro ou in vivo, à l'action d'un
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bien plus efficace que celui de l'art antérieur pour la prévention ou le traitement de certaines maladies.
Comparé aux procédés classiques de l'art antérieur, utilisés pour la multiplication des cellules in vitro, le procédé selon l'invention présente l'avantage de ne pas exiger, ou d'exiger beaucoup moins de milieu nutritif complété avec du sérum humain coûteux il présente également l'avantage d'un maintien beaucoup plus facilede la multiplication des cellules établies et d'une activité
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cellules humaines établies peuvent se multiplier facilement dans les corps d'autres animaux à sang chaud, soit par transplantation directe des cellules dans ceux-là, ou bien par introduction d'une chambre de diffusion contenant ces cellules dans un animal ali-
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avec son fluide de corps nutritifs. De plus, comparé aux procédés classiques in vitro, le.procédé selon l'invention présente les caractéristiques supplémentaires d'une multiplication plus rapide et plus stable des cellules humaines établies, et de la possibilité d'obtenir une production plus forte de cellules et un rendement supérieur en lnterferon.,
On peut utiliser toutes les cellules humaines établies, susceptibles de se-multiplier facilement une fois transplantées dans le corps d'autres animaux à sang chaud. Par exemple, on peut utiliser conformément à l'invention des cellules humaines établies
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cellule HUF-2, et cellule WI-38, décrites dans *Protein,, Nucleic
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Shuppan Co. Ltd, Tokyo, et des cellules établies dérivées de cellules de tumeurs humaines telles que cellule Namalva décrite dans Journal of Clinical Microbiology, Vol. 1, pp. 116-117 (1975), cellule BALL-1, cellule TALL-1 et cellule NALL-1 décrites par Isao <EMI ID=15.1>
On peut se servir, conformément à l'invention, de tout ,animal à sang chaud, pourvu que les cellules humaines, établies,
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de la volaille comme poulet ou pigeon, et des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, bovin, cheval� lapin, cobaye, rat, hamster, souris normale et souris nue.
Comme les animaux sont susceptibles de présenter des immuno-réactions indésirables, lors de la transplantation chez eux des cellules humaines établies, il est de beaucoup préférable d'utiliser des animaux sous la forme la plus prématurée possible, savoir oeuf, embryon, foetus, animal jeune ou nouveau-né, pour exploiter l'immuno-paralysie. Préalablement à la transplantation des cellules, l'animal peut être prétraité par irradiation aux rayons X ou gamma à 200-600 rem, ou bien avec un antisérum ou un agent immuno-suppresseur qui diminue les immuno-réactions.
La souris "nue" est souhaitable comme animal à sang
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y transplanter sans prétraitement des cellules humaines établies, qui s'y multiplient rapidement. La multiplication des cellules humaines établies peut être de plus stabilisée par une première transplantation chez le hamster, suivie d'une transplantation dans la souris "nue", où est provoquée la formation d'interferon à activité accrue. Dans ce cas, les cellules multipliées sont à nouveau transplantables du corps d'un animal à sang chaud au corps d'un
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homme. Les cellules humaines établies peuvent être transplantées
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Au lieu de les faire se multiplier directement dans les corps des animaux, on peut ensemencer les cellules humaines établies, dans une chambre de diffusion, de forme et de dimension variables, munie d'une membrane filtrante dont les pores mesurent
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ultra-filtre ou fibre creuse, et placer cette chambre dans le corps d'un animal, par exemple dans le péritoine, afin de permettre l'alimentation des cellules au moyen des fluides nutritifs du corps de l'animal.
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Eventuellement, la multiplication des cellules humaines établies, peut être réalisée dans la chambre de diffusion avec circulation du fluide nutritif du corps de l'animal à sang chaud, à l'intérieur et l'extérieur du milieu nutritif de la chambre. Dans ce cas, si la chambre est située sur le corps de l'animal, on peut observer au travers de la paroi de la chambre où en est la multiplication, et le nombre de cellules par animal peut être encore accru, sans sacrifier sans nécessité l'animal, par l'enlèvement de la chambre, ensemencement des cellules dans une autre chambre contenant un milieu nutritif frais et mise en place de cette dernière sur le même animal.
Le procédé avec chambre de diffusion permet d'utiliser tout animal à sang chaud, sauf l'homme, pour la multiplication des cellules humaines établies, sans nécessité d'un prétraitement pour déprimer les immuno-réactions ; de plus dans ce cas, les cellules multipliées dans la chambre peuvent être récoltées facilement sans contamination par les cellules de l'animal, puisqu'il n'y a pas de contact direct entre elles, et il n'y a pas de danger de réactions indésirables.
Après la transplantation des cellules humaines, l'animal est alimenté selon le procédé habituel, sans traitement spécial.
La durée de la multiplication des cellules humaines établies est ordinairement de 1 à 20 semaines. Lorsque les cellules établies, transplantées, proviennent de leucocytes humains, normaux ou tumoraux, la vitesse de multiplication cellulaire est si rapide qu'elle peut s'achever habituellement en 1 à 5 semaines.
On trouve que le nombre des cellules humaines multipliées est de l'ordre de 10 7 à 10<1><2> ou plus, par. animal.
Autrement dit, les procédés selon l'invention sont très avantageux pour la production d'interferon, car le nombre de cellules transplantées ou ensemencées dans l'animal, est multiplié
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obtenu par les procédés antérieurs, in vitro, de multiplication des mêmes cellules en milieu nutritif.
. Les cellules humaines vivantes, multipliées" peuvent être amorcées par tout procédé connu pour produire l'interferon. La partie du corps de l'animal où les cellules se multiplient peut être exposé à l'action d'un agent de formation d'interferon. Par <EMI ID=23.1> <EMI ID=24.1>
l'agent de production d'interferon, des cellules humaines en cours de multiplication, en suspension dans la cavité péritonéale, ou des cellules humaines tumorales, formées sous la peau, suivie de .la collecte et de la purification de l'interferoH ainsi obtenu. La formation d'interferon peut également s'effectuer par récupération des cellules humaines multipliées à partir du corps de l'animal, suivie par leur exposition in vitro à l'action <EMI ID=25.1>
humaines, obtenues par collecte dans la cavité intrapéritonéale après multiplication, ou celles que l'on obtient pas dissociation de tumeurs massives, humaines, isolées, qui se forment sous la peau du corps de l'animal, sont mises en suspension dans un milieu
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sont exposées à l'action d' un agent de formation d'interferon, qui est ensuite recueilli et purifié.
Lorsque les cellules se multiplient dans des chambres
de diffusion, elles peuvent être exposées à l'action des agents de formation d'interferon dans ces chambres, ou après en avoir été extraites, Lors de la formation de l'interferon, la production de celui-ci peut être encore accrue par des procédés connus tels que l'amorçage utilisant de l'interferon, et le procédé de "superinduction" au moyen d'un inhibiteur métabolique.
La production d'interferon par animal peut être en outre augmentée par les procédés suivants (a) un procédé au cours duquel le nombre de cellules vivantes par animal peut être augmenté, sans sacrifice inutile de l'animal, par enlèvement de la chambre, suivi de l'ensemencement de ses cellules dans une autre chambre contenant un milieu nutritif frais, que l'on place ensuite sur le même animal ; (b) un procédé au cours duquel les cellules humaines, après multiplication dans le corps,dtun animal, sont expo-
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in vitro, les mêmes cellules étant utilisées une ou plusieurs fois. Conviennent par exemple comme agents de formation d'interferon : virus, bactérie, protozoaire, rickettsie, acide nucléique, endotoxine, et.polysaccharide.
L'interferon obtenu peut être facilement purifié par des procédés de purification connus, par exemple, par relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyophilisation. Eventuellement, la préparation ainsi obtenue d'interferon <EMI ID=29.1> peut 4tre à nouveau purifiée par des procédés connus tels qu'adsorption et désorption avec un échangeur d'ions, filtration sur gel, chromatographie d'affinité, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse.
L'activité de l'interferon est déterminée par la méthode
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humain, décrite dans "Protein, Nucleic Acid and Enzyme ', vol.20,
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Les exemples A suivants constituent une illustration
non limitative de la production d'interferon selon l'invention. EXEMPLE A-1
On transplante par voie sous-cutanée à des souris sans poils, "nues"
(atrichie), adultes, des cellules BALL-1 établies, de provenance humaine, et on les alimente de manière habituelle pendant 3 semaines. 109 environ de tumeur massive, par animal, formée sous la peau, sont isolés, coupés finement, mis en suspension dans une solution saline contenant de la trypsine, pour dissocier la tumeur en cellules, et les cellules sont recueillies par centrifugation. El-
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pH 7,2 et 37[deg.]C, contenant 5% en volume par volume de sérum humain, et remises en suspension pour donner une concentration de l'ordre
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unités/ml d'interferon partiellement purifié, spécifique de l'espèce humaine, et on fait incuber pendant 2 heures environ, puis on ajoute comme agent de production d'interferon du virus de Sendai titrant 300 hémoagglutinine/ml, et l'on fait incuber pendant 20 heures supplémentaires. La solution incubée est centrifugée à
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cellules. La partie surnageante est dialysée contre une solution tampon 0,1 M, de pH 2, contenant de l'acide chlorhydrique et du
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lution tampon-phosphate à 0,01 M, de pH 7,2; pendant 1.2 heures ; ensuite on filtre avec précaution à l'aide d'une membrane filtrante. Le filtrat .est concentré et lyophilisé en une poudre d'interferon
à activité élevée. L'activité en interferon est de l'ordre de
20 000 000 unités par souris "nue".
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On transplante dans le péritoine de souris "nues" adultes des cel- <EMI ID=37.1>
animaux de la manière habituelle pendant 5 semaines. On injecte alors à ces souris, par voie intrapéritonéale, du virus de la maladie de New-Castle, ayant initialement un titre en hémoagglutinine de l'ordre de 3000, mais presque complètement préinactivé au moyen de radiation ultraviolette ; au bout de 24 heures on sacrifie les animaux et récolte le fluide ascitique. Ce fluide est centrifugé à
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notamment cellules. La partie surnageante est dialysée contre une solution tampon 0,1 M, de pH 2 contenant de l'acide chlorhydrique
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une solution tampon-phosphate à 0,01 M de pH 7,2 pendant 15 heures, ensuite on filtre avec précaution au moyen d'une membrane. Le filtrat est concentré pour donner une solution d'interferon d'activité élevée, de l'ordre de 700 000 unités/10 souries "nues". EXEMPLE A-3
On nourrit de manière habituelle pendant 4 semaines les hamsters nouveau-nés ayant reçu une injection intrapéritonéale de sérum
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et une transplantation sous-cutanée de cellules établies JBL de
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ple A-1, la tumeur massive de 30g environ qui s'est formée sous la peau de chaque animal. Les cellules obtenues sont lavées avec le
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de sérum de veau, et remises en suspension pour donner une concen-
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ajoute 200 unités/ml d'interfercn partiellement purifié, spécifique de l'espèce humaine, et on laisse incuber pendant 1 heure en-
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res supplémentaires, pour produire de l'interferon. La solution obtenue est ultérieurement purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2, et donne une solution d'interferon très active. L'activité de l'interferon est de ltordre de 15 000 000 unités par hamster.
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Des rats nouveau-nés reçoivent une transplantation par voie intraveineuse de cellules Namalva établies, de provenance humaine, et sont nourris de manière habituelle pendant 4 semaines. Sur chaque rat on isole alors et dissocie, /dans l'exemple A-1, une tumeur mas- <EMI ID=46.1>
sive sous-cutanée de 50g environ. Les cellules obtenues sont ensuite traitées comme dans l'exemple A-1, pour produire l'interferon. La solution d'interferon obtenu est purifiée et lyophilisée comme dans l'exemple A-1, pour donner une poudre très active d'interferon,
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EXEMPLE A-5
Des souris adultes sont soumises à une irradiation aux rayons X
de l'ordre de 400 rem, afin d'affaiblir leurs immuncréactions, puis
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ce humaine, et on les nourrit comme d'habitude pendant 3 semaines. On isole et dissocie alors, comme dans l'exemple A-1, chez chaque souris, une tumeur massive de 10g environ qui s'est formée sous la peau. Les cellules obtenues sont traitées comme dans l'exemple A-3 pour produire de l'interferon. La solution d'interferon résultante est purifiée et concentrée comme celle de l'exemple A-2 et devient très active. L'activité de cet interferon correspond à
8 000 000 unités par souris.
EXEMPLE A-6
Des cellules humaines établies OUMS-25 sont plantées sous la peau de hamsters, comme dans l'exemple A-3, et au bout de 3 semaines elles sont transplantées dans le péritoine de souris "nues" âgées de 10 jours. Ces souris sont alimentées de manière habituelle pendant 5 semaines, puis anesthésiées, et on recueille leur fluide ascitique. Ce fluide est centrifugé pour rassembler les cellules multipliées, qui sont lavées et laissées pour permettre la production d'interferon comme dans l'exemple A-1. La solution résultante d'interferon est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2 pour donner une solution très active. L'activité de cet interferon correspond à 2 OOD OCO unités par souris.
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Des cellules établies JBL, de provenance humaine, sont mises en suspension dans une solution saline, dans des chambres de diffusion cylindriques en matière plastique de 10 ml, équipées d'une membrane
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sont incorporées dans le péritoine de rats adultes, lesquels sont alimentés de manière habituelle pendant 4 semaines, après quoi les chambres sont enlevées. On constate que les concentrations en cellules dans ces chambres sont voisines de 5 x 109 cellules/ml, ce qui correspond à 10<3> fois environ ce que l'on obtient in vitro- dans
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traitées comme dans l'exemple A-1 pour la production d'interferon. La solution d'interferon obtenue est purifiée, concentrée et lyophilisée, et elle donne une poudre d'activité élevée. L'activité de cet interferon correspond à peu près à 30 000 000 unités par rat.
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Dans les cavités allantoiques de blancs d'oeufs fertiles, incubés pendant 5 jours à 37[deg.]C, sont plantées des cellules NALL-1 de provenance humaine, et l'on fait incuber ces oeufs à 37[deg.]C pendant 1 semaine. Puis les oeufs sont ouverts et les cellules multipliées recueillies. Ces cellules sont traitées comme dans l'exemple A-1 en vue de la production d'interferon. La solution obtenue est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2 ; elle est alors très active. L'activité de cet interferon correspond à environ 400 000 unités/10 blancs d'oeufs fertiles.
EXEMPLE A-9
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exemple A-1, est à nouveau purifiée par les procédés décrits par G.Bodo (Symposium on Préparation, Standardisation and Clinical
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8 & 9 Juin 1977 Zagreb) c'est-à-dire, adsorption et désorption avec échangeur d'ion, fractionnement du poids moléculaire par filtration sur gel, concentration et filtration faite avec soin à l'aide d'une membrane. La solution, ainsi obtenue, a une activité
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à 40% environ.
L'interferon obtenu dans les exemples A-1 à A-9 peut être utilisé avantageusement, seul ou en mélange avec une ou plusieurs autres substances, en usage externe ou interne, pour la prévention et le traitement de maladies humaines sensibles à l'interferon. L'invention est illustrée avec référence aux expérimentations suivantes.
EXPERIMENTATION 1
Traitement de maladies à virus par l'interferon
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On ajoute à des couches monomoléculaires de cellules de poumon embryonnaire humain, formées par culture primaire dans des boites de
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d'interferon préparé par le procédé de l'exemple A-9 ; les mélanges
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nées de virus Varicella-zoster ou de Cytomegalovirus humain en quantité telle qu'il se forme environ 100 plaques dans le cas des cellules non additionnées d'intarferon. Ces mélanges sont mis à incuber, et on compte le nombre de plaques formées. L'effet inhi-
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miné au moyen de l'équation
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dans laquelle A est le nombre de plaques existant sans addition d' interferon et B le nombre de plaques existant dans le cas d'addi-
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TABLEAU
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Il ressort clairement des résultats de ce)tableau que l'interferon selon l'invention inhibe la multiplication de virus pathogènes. On ne constate pas d'anomalies dans les cellules humaines, cultivées
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1) Essai d'inhibition de la multiplication in vitro de cellules
tumorales.
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foetal de veau, est ajouté l'interferon préparé selon le procédé de l'exemple A-9, de façon à obtenir respectivement des concentrations de 30, 300 et 3 000 unités/ml. Les produits résultants sont
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bre de cellules par ml de milieu. On opère de même avec des témoins préparés comme plus haut à cela près que l'interferon a été préalablement inactivé par chauffage à 1000C pendant 30 minutes.
L'effet inhibiteur de l'interféron sur la multiplication des cel-
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% d'inhibition de la multiplication des cellules
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dans laquelle A est le nombre de cellules dans le témoin, et B le nombre de cellules dans l'essai traité à l'interferon. Les résultats sont donnés dans le tableau 2.
TABLEAU 2
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ment la multiplication des cellules de tumeurs BALL-1, TALL-1, NALL-1 et JBL, et qu'il est efficace à une concentration comprise entre 30 et 3000 unités par ml.
2) Essai d'inhibition de la multiplication de cellules de tumeur
in vivo.
L'essai est réalisé avec 8 souris "nues", âgées da 2 mois environ. Chaque souris reçoit par voie sous-cutanée, un transplant de 7,5x10 cellules TALL-1. A partir du troisième jour du transplant,
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feron préparé selon l'exemple A-3, à raison de 3 dosages par semaine, chacun de 10 000 unités. Pendant 48 jours après la transplantation, les souris sont alimentées, puis on les sacrifie, et l'on prélève et pèse les tumeurs formées, humides. Les 4 souris restantes, utilisées comme témoins, sont nourries et sacrifiées dans les mêmes conditions et leurs tumeurs sont pesées. Les résultats figurent dans le tableau 3.
TABLEAU 3
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3) Essai d'inhibition de la multiplication de cellules de tumeur
in vivo.
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L'essai est réalisé avec 8 souris "nues" de 2 mois environ.
On transplante chez chaque souris par voie sous-cutanée, 107 cellules JBL (tumorales). A partir de la troisième semaine de la transplantation, 4 souris reçoivent par voie intrapéritonéale, 8 dosages d'interferon préparé selon l'exemple A-2, à raison de 2 dosages par semaine de 1000 unités chacun. Après le transplant, les souris sont alimentées pendant 42 jours, puis sacrifiées et leurs tumeurs sont pesées humides. Les 4 souris restantes, utilisées comme témoins, et ne recevant pas d'interferon, sont alimentées et sacrifiées dans les mêmes conditions, et leurs tumeurs pesées. Les résultats sont reportés dans le tableau 4.
TABLEAU 4
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Il ressort clairement des résultats des tableaux 3 et 4, que l'interferon inhibe la formation de tumeur massive humaine chez la souris, et que même s'il y a formation de tumeur, son poids est bien moindre que celui de la tumeur des témoins. De/plus, les souris traitées à l'interferon sont physiquement plus actives que les témoins et ont plus d'appétit,
EXPERIMENTATION 3
Essai de toxicité aiguë
L'essai de toxicité aigUe est réalisé avec des souris de 20 jours, auxquelles on injecte, par voie intrapéritonéale, la solution d'interferon préparée selon l'exemple A-9. La toxicité est très faible;
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Il ressort des expérimentations décrites plus haut que les maladies sensibles à l'interferon, mentionnées dans la présente description, sont celles qui peuvent être traitées ou prévenues au moyen de l'interferon selon l'invention, c'est-à-dire des maladies virales, telles que kérato-conjonctivite épidémique, kératite herpétique, influenza, rubéole, hépatite sérique, et des maladies non virales comme leucémie et ostéosarcome.
On peut préparer les médicaments et agents thérapeutiques conte- <EMI ID=79.1>
nant de l'interferon, sous différentes formes selon les utilisations envisagées, c'est-à-dire sous forme de préparations liquides telles que pulvérisation, collyre, gouttes nasales, gargarisme et injection, de pâtes telles que onguent, et de préparations solides comme poudre, granules et comprimés.
Ces préparations sont suffisamment efficaces pour prévenir et traiter des maladies sensibles à l'action de l'interferon, si elles contiennent, en général, 1 à 10 000 000 unités d'interferon/g. Si nécessaire, ces préparations peuvent être mélangées avec une ou plusieurs autres substances, notamment agents thérapeutiques, véhicules, charges et stabilisants. Quelques formes de réalisation non limitative de préparations contenant de l'interferon sont décrites ciaprès.
EXEMPLE B-1
Préparation liquide
On réalise une préparation liquide à l'aide de sérum physiologique
et d'interferon obtenu par le procédé de l'exemple A-1, de façon � avoir une concentration en interfercn de 500 unités /ni. Cette préparation convient en pulvérisation, comme collyre, gouttes nasales et gargarisme, pour la prévention et le traitement de maladies virales, en particulier la kératoconjonctivite épidémique et l'influenza.
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Solution injectable
On prépare une solution injectable à partir de sérum physiologique
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avoir une concentration en interferoc de 100 000 unités/ml.
Cette solution injectable convient pour le traitement de toutes les maladies sensibles à l'action de l'interferon, telles que maladies virales ou tumorales.
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Solution injectable
Une solution injectable est préparée avec 500 ml d'une solution
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feron préparé suivant l'exemple A-5, et 10 mg de cyclophosphamide. Cette solution injectable convient en particulier pour le traitement de maladies tumorales.
EXEMPLE B-4
Solution injectable
On prépare une solution injectable avec 100 ml de solution aqueuse.
à 10% en poids/volume de maltose, 500 000 unités d'interferon préparé selon le procédé de l'exemple A-6 et 2 mg de mitomycine C. Cette solution injectable convient en particulier pour le traitement de maladies tumorales.
EXEMPLE B-5 - Onguent
Un onguent est préparé de manière habituelle par mélange de poudre d'interfexon obtenue selon l'exemple A-4, avec de la vaseline et de l'huile de paraffine, de façon à avoir une activité de 10 000 unités d'interferon/g. Cette préparation convient pour'le traitement de maladies virales de la peau.
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Comprimés
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midon et de maltose, de façon à avoir une activité de 1000 unités d'interferon/comprimé (100 mg). Ces comprimés conviennent pour prévenir et/traiter des maladies virales du système digestif.
EXEMPLE B-7
Préparation liquide
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10 ml de solution aqueuse à 10% en poids/volume de maltose, 200 000 unités d' interferon d e l'exemple A-8 et 5 mg de methotrexate. Cette préparation convient en particulier pour le traitement des maladies tumorales.
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1. Procédé de production d'interferon à partir de cellules humaines,
établies, caractérisé en ce que l'on transplante ces cellules, en vue de leur multiplication, dans le corps d'un animal à sang chaud, ou on les ensemence dans une chambre de diffusion placée dans l'animal, celui-ci les nourrissant avec son fluide corporel
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étant ensuite recueilli et purifié.