JPH02193984A - 水溶性２―アミノフェノキサジン―３―オンおよびその誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、水溶性の２−アミノフェノキサジン−３−
オンおよびその誘導体の製造方法に関するものである。

従来の技術 細網肉腫などのリンパ球系腫瘍に対して強い抗腫瘍作用
を示すアクチノマイシンＤは、その基本骨格に２−アミ
ノフェノキサジン−３−オンをもつ。かかる２−アミノ
フェノキサジン−３−オンまたはその誘導体は、オルト
アミノフェノールまたはその誘導体を含む溶液とフェリ
シアン力りとを反応させることによって化学的に合成す
ることができる。しかし、このような化学合成によって
得られた２−アミノフェノキサジン−３−オンや、その
誘導体の抗腫瘍作用は微弱であり、水にきわめて溶けに
くいことから、臨床医学面で利用する場合、極度に制限
されたものとなる。

なお、オルトアミノフェノール誘導体とは、２−アミノ
−４−メチルフェノール、２−アミノ５−メチルフェノ
ール、２−アミノ−３−メチルフェノール、２−アミノ
−６−メチルフェノールおよび２−アミノ−６−メチル
−３−カルボキシフェノールを指し、これらのうちの一
つをフェリシアンカリと反応させることによって、その
２分子縮合体としての２−アミノフェノキサジン−３−
オン誘導体を比較的容易に化学合成することができる。

発明が解決しようとする課題 アクチノマイシンＤは強力な抗腫瘍作用を示す反面、生
体に対して種々の強い副作用を示す。そのうえ、水に対
して難溶であるから、臨床的応用分野が限定される。ま
た、化学的に合成した２アミノフェノキサジン−３−オ
ンやその誘導体は前述のように、抗腫瘍作用をほとんど
示さないのみならず水に難溶である。

したがって、この発明の課題の第１点は、水に可溶性の
２−アミノフェノキサジン−３−オンまたはその誘導体
を得ることにあり、課題の第２点は、それ自体が強い抗
腫瘍性を示し、しかも生体に対する副作用が軽微な２−
アミノフェノキサジン−３−オンまたはその誘導体を得
ることにある。

課題を解決するための手段 この発明の製造方法によると、赤血球等供液または赤血
球溶血液より得たヘモグロビン溶液等の、赤血球の少な
くともヘモグロビン成分を含む溶液に、オルトアミノフ
ェノールまたはその誘導体を含む溶液を添加してインキ
ュベート処理を施す。そして、前記ヘモグロビン成分を
除去して得られる溶液に凍結乾燥処理を施し、この凍結
乾燥処理により得られた粉末に脱塩処理を施す。

作用 このような構成によると、赤血球のヘモグロビン成分が
バイオリアクターとして作用することによって、水に易
溶性の２−アミノフェノキサジン−３−オンや、その誘
導体を大量に調製することができる。そのうえ、生成さ
れた２−アミノフェノキサジン−３−オンや、その誘導
体がリンパ系腫瘍等に対して強い抗腫瘍性を示すのみな
らず、生体に対する副作用が軽微であることが実験の結
果判明した。

実施例 つぎに、この発明の製造方法を実施例とともにさらに詳
しく説明する。

まず、ヒト血液より得たＡＣＤ保存血またはＣＰＤ保存
血を冷凍高速遠心分離機にかけて遠心分離処理（約８Ｋ
ｇ、１分間以内）を行い、血しょう、顆粒球および赤血
球に分離する。得られたヒト赤血球に５倍以上容量の０
．９％塩化ナトリウム溶液を添加する。そして、ふたた
び遠心分離処理（約８　ｋｇ、　１分間以内）を施して
洗浄ヒト赤血球を収得する。

この洗浄赤血球を等供液、たとえば、等張の塩化ナトリ
ウム（１４５ｍＭ）、リン酸ナトリウム（５ｍＭ）、塩
化カリウム（２ｍＭ）、塩化マグネシウム（１ｍＭ）お
よびグルコース（５ｍ　Ｍ　）を含むリンゲル液に、ヘ
マトクリット値が１０％以上となるように浮遊させ、赤
血球浮遊等供液をつくる。

つぎに、この赤血球浮遊等張液に最終濃度が１ｍＭ以上
のオルトアミノフェノール溶液またはオルトアミノフェ
ノール誘導体溶液を添加する。ただし、ここで添加する
オルトアミノフェノール溶液またはオルトアミノフェノ
ール誘導体溶液は下記の要領で調合したものである。す
なわち、０．２規定塩酸溶液を添加したリンゲル液にオ
ルトアミノフェノール（２−アミンフェノールともいう
）またはその誘導体（２−アミノ−４−メチルフェノー
ル、２−アミノ−５−メチルフェノール、２アミノ−３
−メチルフェノール、２−アミノ−６−メチルフェノー
ルまたは２−アミノ−６−メチル３−カルボキシフェノ
ール）を溶解させたものを、０．２規定カセイソーダを
添加したリンゲル液でもって中和させたものである。

かかるオルトアミノフェノール溶液またはその誘導体溶
液を前記赤血球浮遊等張液に添加したのち十分に撹拌す
る。本例では、リンゲル液に溶かした０、１規定カセイ
ソーダでもってＰＨ７，０１：ｌ：合わせた。

ついで、かかる赤血球浮遊リンゲル反応溶液にインキュ
ベート（ｉｉＩｌ？置）処理を施す。このインキュベー
ト処理は、約３７℃の保温温度下で少なくとも１２時間
放置することにより達成される。

赤血球は４８時間程度のインキュベート処理では溶血し
ないので、本例では反応開始後４８時間経過した時点で
インキュベート処理を終え、インキュベート処理後の赤
血球浮遊リンゲル液を冷凍高速遠心分離機で遠心分離処
理（約８　Ｋｇ、　１分間以内）を行い、上澄み液を採
取する。一方、沈殿赤血球層は同容の０．９％塩化ナト
リウム溶液に浮遊させ、十分に撹拌してから遠心分離処
理（約８　ｋｇ、　１分間以内）を行う。そして、その
上澄み液を採取し、これに前述の上澄み液を合併する。

このようにして得られた反応上澄み液は、さらに遠心分
離処理（１０ｋｇ、１５分間）を施し、沈殿赤血球膜を
除去する。採取した上澄み液には少量のヘモグロビンが
混入しているので、これを除去すべく当該溶液をＣＭセ
ファデックスＣ−５０（スエーデンのファルマシア社製
）を充填せしめたカラムに通してろ過する。

このようにして得られた２−アミノフェノキサジン−３
−オンまたはその誘導体は明らかに水溶性のものであり
、これを分光分析してみると、第１図ないし第３図に示
すような可視域および紫外域吸収スペクトル特性をもっ
ことが判明した。ただし、第１図はオルトアミノフェノ
ール２分子線合体（２−アミノフェノキサジン−３−オ
ン）の、第２図は２−アミノ−４−メチルフェノール２
分子線合体の、第３図は２−アミノ−５−メチルフェノ
ール２分子線合体の各吸収スペクトル特性を示すもので
、ａはリン酸溶液中でのもの、ｂはクロロフォルムおよ
びエタノール（１：　１）溶液中でのもの、Ｃは稀塩酸
溶液中でのもの、ｄはカセイソーダ溶液中でのものであ
る。

第１図に示す２−アミノフェノキサジン−３オンの吸収
スペクトル特性は、オルトアミノフェノールとフェリシ
アンカリとを反応させて化学合成した２−アミノフェノ
キサジン−３−オンの可視域および紫外域吸収スペクト
ル特性と合致する。しかし、第２図に示す２−アミノ−
４−メチルフェノール２分子線合体および第３図に示す
２−アミノ−５−メチルフェノール２分子線合体は、在
来の化学合成〈２−アミノ−４−メチルフェノールまた
は２−アミノ−５−メチルフェノールとフェシリシアン
カリとを反応）により得られる化合物の吸収スペクトル
と明らかに相違する。

前述のようにして得られた水溶性の２−アミノフェノキ
サジン−３−オンまたはその誘導体は、これをを放置し
ておくと析出により徐々に不溶性の２−アミノフェノキ
サジン−３−オンまたはその誘導体に変質していくので
、得られた２−アミノフェノキサジン−３−オンまたは
その誘導体溶液はただちに凍結乾燥処理を行う。この処
理は、市販の凍結乾燥機を用いて凍結および乾燥を同時
に行うのであるが、この処理によって得られた２−アミ
ンフエツキサジン−３−オンまたはその誘導体の粉末は
長期保存に耐え、急速かつ高濃度に水に溶ける性質を具
備する。

この凍結乾燥処理によって得られた粉末１ｇにジメチル
スルホキシド１００ｍ１を加えて十分に混合すると、塩
化ナトリウム等の塩分が沈殿するので、その上澄み液に
５倍容量のアセトンを加える。そうすると、２−アミノ
フェノキサジン−３−オンまたはその誘導体を沈殿物と
して得ることができる。この沈殿物にもう一度凍結乾燥
処理を施す。かくして、脱塩された高純度の水溶性２−
アミノフェノキサジン−３−オンまたはその誘導体が得
られる。

前述の実施例では、赤血球をリンゲル液に浮遊させたが
、その他の等供液、たとえば等張塩化ナトリウム液や等
張クエン酸等に浮遊させてもよい。また、ヘモグロビン
溶液を用いてもよく、つぎにその実施例を説明する。

この場合、前述の洗浄ヒト赤血球に対して４倍容量の蒸
留水を添加したのち、遠心分離処理（約１０Ｋｇ、１５
分間）を施す。赤血球膜は沈殿物として沈積するので、
赤血球膜が混入しないようにヘモグロビン溶液を採取す
る。このヘモグロビン溶液に最終濃度が１ｍＭ以上のオ
ルトアミノフェノール溶液またはオルトアミノフェノー
ル誘導体溶液を添加する。ただし、ここで添加する溶液
は以下の容量で調合したものである。すなわち、０．２
規定塩酸を添加した蒸留水にオルトアミノフェノールま
たは前述のようなオルトアミノフェノール誘導体を溶解
させたものを、０．２規定カセイソーダを添加した蒸留
水でもって中和させたものである。

かかるオルトアミノフェール溶液またはその誘導体溶液
を前記ヘモグロビン溶液に添加して十分に撹拌する。つ
いで、この混合溶液を約３７℃の保温温度下で少な（と
も４８時間放置する。本例では反応開始後８６時間経過
した時点でインキュベート処理を終え、処理後のヘモグ
ロビン溶液を冷凍高速遠心分離機で遠心分離処理（約１
０Ｋｇ、１５分間以内）する。沈査には変性したヘモグ
ロビンが混在するので、上澄み液のみを採取する。この
上澄み液には多量のヘモグロビンおよびタンパク質が混
入しているので、これらを除去すべく当該液をカラムに
通してろ過する。ここで用いたカラムはＣＭセファデッ
クスＣ−５０で、樹脂を１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｐ
Ｈ６，６）で平衡化せしめたものを充填している。さら
に、カラム溶出液をダイアフローろ過装置（ろ過膜は英
国アミコン社製Ａ　Ｅ　０３４０９Ｃ）でろ過して残留
タンパク質を除去する。

このようにして得られた２−アミノフェノキサジン−３
−オンまたはその誘導体は水にきわめて易溶性で、第１
図ないし第３図に示したと同様の吸収スペクトル特性を
有する。この反応生成物を含む溶液に対し、凍結乾燥処
理および脱塩処理を施す点は前述の実施例におけると同
様である。

いずれの実施例においても、インキュベート処理温度は
１０〜４０℃、好ましくは２５〜３８℃の範囲で選択で
きる。４０℃を越えると赤血球細胞がこわれ、１０℃未
満では反応に長時間を要する。インキュベート処理時間
は処理温度に依存して決まるが、１２時間以上を必要と
する。

前述のようにしてヒト赤血球をバイオリアクターとする
細胞培養で製造された２−アミノフェノキサジン−３−
オンおよびその誘導体は、実験によると、Ｌ５１７８Ｙ
リンフォブラストーマ（Ｌｙｉ＋ｐｈｏｂｌａｓｔｏｍ
ａ　）腫瘍細胞に対し、下表に示すような抗腫瘍効果を
示した。

木表でわかるように、とくにオルトアミノフェノール誘
導体として、２−アミノ−４−メチルフェノール、２−
アミノ−５−メチルフェノールおよび２−アミノ−６−
メチルフェノールを用いたものは顕著な増殖抑制効果を
示した。なお、本例ではヘモグロビン溶液を用い、９６
時間インキュベート処理によって得られた反応生成物を
使用した。

次表は、２−アミノ−４−メチルフェノールを原料とし
て生成された水溶性２−アミノフェノキサジン−３−オ
ン誘導体を担癌マウスすなわちＬ５１７８Ｙリンフォブ
ラストーマ移植マウスに投与（毎日１週間腹腔注射）し
た場合の抗腫瘍効果例を示すものである。試料Ａ、Ｂは
２−アミノ４−メチルフェノールとヘモグロビンとを９
６時間３７℃にてインキュベート処理して得られたもの
、試料Ｃはこれらに対し脱塩処理を施したもの、試料り
は対照としての抗癌剤マイトマイシンＣである。なお、
投与量はマウス１匹当たりの用量で、６０日、生存マウ
ス数が２７６とあるのは、６匹のうち２匹が生存したこ
とを意味する。

この実験は、Ｌ５１７８Ｙリンフォブラストーマ腫瘍細
胞をマウス（３６Ｄ２Ｆ＋　　　ＳＰＦの雄）の腹腔内
に移植したマウスの延命効果について検討したものであ
る。

前述の実施例ではヒト赤血球や、ヒト赤血球より得たヘ
モグロビン溶液を用いたが、これ代えてウシ、ウマ、ブ
タ、ヒツジなどの動物血液から採取した赤血球や、同赤
血球より得られるヘモグロビンを用いても、前述におけ
ると同様に水溶性２−アミノフェノキサジン−３−オン
またはその誘導体を大量に製造することができる。

発明の効果 この発明は前述のような反応過程で構成され、水に易溶
性で、しがち強力な抗腫瘍効果を示し、かつ、長期保存
が可能な水溶性の２−アミノフェノキサジン−３−オン
およびその誘導体を容易に大量生産することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の製造方法によって得られたオルトア
ミノフェノール２分子線合体（２−アミノフェノキサジ
ン−３−オン）の吸収スペクトル特性図、第２図は同製
造方法によって得られた２−アミノ−４−メチルフェノ
ール２分子線合体の吸収スペクトル特性図、第３図は同
製造方法によって得られた２−アミノ−５−メチルフェ
ノール２分子線合体の吸収スペクトル特性図である。 ただし、ａはリン酸溶液中でのもの、ｂはクロロフォル
ムおよびエタノール（１：　１）溶液中でのもの、Ｃは
稀塩酸溶液中でのもの、ｄはカセイソーダ溶液中でのも
のである。 ｉ１図 第２図 〉威　【　どｈ例ツ メ・碇・羨　（六ｍ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）赤血球の少なくともヘモグロビン成分を含む溶液
   に、オルトアミノフェノール溶液を添加してインキュベ
   ート処理を施す段階と、前記ヘモグロビン成分を除去し
   て得られる溶液に凍結乾燥処理を施す段階と、この凍結
   乾燥処理により得られた粉末に脱塩処理を施す段階とを
   備えることを特徴とする水溶性２−アミノフェノキサジ
   ン−３−オンの製造方法。
2. （２）赤血球の少なくともヘモグロビン成分を含む溶液
   に、オルトアミノフェノールを基本骨格とする誘導体を
   含む溶液を添加してインキュベート処理を施す段階と、
   前記ヘモグロビン成分を除去して得られる溶液に凍結乾
   燥処理を施す段階と、この凍結乾燥処理により得られた
   粉末に脱塩処理を施す段階とを備えることを特徴とする
   水溶性２−アミノフェノキサジン−３−オン誘導体の製
   造方法。