CH637831A5

CH637831A5 - Procede de preparation d'interferon et preparation le contenant.

Info

Publication number: CH637831A5
Application number: CH54179A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto; Shokichi Yuen
Original assignee: Hayashibara Ken; Ashida Shin
Priority date: 1978-01-22
Filing date: 1979-01-19
Publication date: 1983-08-31
Also published as: CA1135186A; DK153848B; NO152976C; NO152976B; FI66428C; NL7900476A; SE436969B; FR2414920B1; GB2016015B; IT1116493B; NL192086C; AU4334579A; NL192086B; US4276282A; SE7900493L; NO790195L; DE2902136C2; IT7947712A0; DK25579A; DK153848C

Description

La présente invention concerne la production d'interféron et de compositions en renfermant, ainsi que leur utilisation pour le traitement ou la prévention de certaines maladies.

Comme décrit par Shigeyasu Kobayashi («Interferone», publié par Kodansha, Ltd, Tokyo, 1975), par D.A.J. Tyrrell («Interferone and its clinical potential», publié par William Heinemann Medicai Books, Ltd, Londres, 1976), et dans «Protein, Nucleic Acid and Enzyme», vol. 21, N° 4 (1976), publié par Kyoritsu Shuppan Co., Ltd, Tokyo, interféron est un terme utilisé pour définir une substance protéinique suscitée extracellulairement ou intracellulairement par des cellules vivantes, lors de leur exposition à des inducteurs tels que virus, bactéries, protozoaires, rickettsies, acide nucléique, endo-toxine ou Polysaccharide, et qui se révèle active pour inhiber, de manière non spécifique, la multiplication de différents virus dans les cellules. Depuis sa découverte, l'interféron est considéré comme un agent thérapeutique et préventif prometteur pour le traitement des maladies virales.

Ces dernières années, on lui a reconnu une activité antitumorale à la fois sur les tumeurs virales et non virales.

Comme l'interféron est spécifique de l'espèce considérée, seul l'interféron provenant de cellules humaines, vivantes, se révèle efficace pour la prévention et le traitement des maladies de l'homme.

De manière classique, on utilise le leucocyte comme cellule vivante pour la préparation d'interféron humain. Ce leucocyte est obtenu par séparation à partir de sang frais, mais sa conservation et son alimentation, en grande quantité et à faible coût, sont très difficiles.

On a essayé d'utiliser, pour la production d'interféron, des cellules vivantes, obtenues par ensemencement de cellules humaines établies sur des milieux de culture, suivi par une culture in vitro. Toutefois, les procédés in vitro ne sont pas utilisables sur une large échelle et à faible coût, car ils ont l'inconvénient de nécessiter une grande quantité de sérum humain, et de donner une multiplication instable, une faible vitesse de multiplication et une faible concentration cellulaire.

Etant donné ce qui précède, il n'était pas possible jusqu'ici d'avoir une production industrielle d'interféron suffisante pour la prévention et le traitement des maladies chez l'homme.

La présente invention permet d'éviter ces inconvénients de l'art antérieur et d'obtenir une producticm industrielle facilement réalisable d'interféron, utilisable pour la prévention et le traitement de certaines maladies.

Le nouveau procédé selon l'invention consiste à transplanter des cellules humaines, classées, c'est-à-dire établies, à des animaux à sang chaud, ou à ensemencer ces cellules dans une chambre de diffusion où elles se multiplient, tandis que l'animal les alimente au moyen de ses fluides du corps nutritifs et à exposer les cellules résultantes, in vitro ou in vivo, à l'action d'un inducteur d'interféron. L'interféron ainsi obtenu se révèle être bien plus efficace que celui de l'art antérieur pour la prévention ou le traitement de certaines maladies.

Comparé aux procédés classiques de l'art antérieur, utilisés pour la multiplication des cellules in vitro, le procédé selon l'invention présente l'avantage de ne pas exiger, ou d'exiger beaucoup moins de milieu nutritif complété avec du sérum humain coûteux; il présente également l'avantage d'un maintien beaucoup plus facile de la multiplication des cellules établies et d'une activité bien supérieure de l'interféron obtenu. Plus particulièrement, les cellules humaines établies peuvent se multiplier facilement dans les corps d'autres animaux à sang chaud, soit par transplantation directe des cellules dans ceux-là, ou bien par introduction d'une chambre de diffusion contenant ces cellules dans un animal alimenté de manière habituelle, qui alimente à son tour ces cellules avec son fluide de corps nutritifs. De plus, comparé aux procédés classiques in vitro, le procédé selon l'invention présente les caractéristiques supplémentaires d'une multiplication plus rapide et plus stable des cellules humaines établies, et de la possibilité d'obtenir une production plus forte de cellules et un rendement supérieur en interféron.

On peut utiliser toutes les cellules humaines établies susceptibles de se multiplier facilement une fois transplantées dans le corps d'autres animaux à sang chaud. Par exemple, on peut utiliser conformément à l'invention des cellules humaines établies normales, telles que cellule OUMS 20, cellule OUMS 25, cellule HEF, cellule HUF-2 et cellule WI-38, décrites dans «Protein, Nucleic Acid and Enzyme» vol. 20, N° 6, pp. 616-643 (1975), publié par Kyoritsu Shuppan Co., Ltd, Tokyo, et des cellules établies dérivées de cellules de tumeurs humaines telles que cellule Namalva décrite dans «Journal of Clinical Microbiology», vol. 1, pp. 116-117 (1975), cellule BALL-1, cellule TALL-1 et cellule NALL-1 décrites par Isao Miyoshi [«Nature», vol. 267, pp. 843-844 (1977)], et cellule JBL décrite par Isao Miyoshi [«Cancer», vol. 40, N° 6 (1977)].

On peut se servir, conformément à l'invention, de tout animal à sang chaud, pourvu que les cellules humaines, établies, puissent s'y multiplier facilement; ces animaux sont par exemple de la volaille comme poulet ou pigeon, et des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, bovin, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris normale et souris nue.

Comme les animaux sont susceptibles de présenter des immuno-réactions indésirables lors de la transplantation chez eux des cellules humaines établies, il est de beaucoup préférable d'utiliser des animaux sous la forme la plus prématurée possible, savoir œuf, embryon, fœtus, animal jeune ou nouveau-né, pour exploiter l'immunoparalysie. Préalablement à la transplantation des cellules, l'animal peut être prétraité par irradiation aux rayons X ou y à 200-600 rem, ou bien avec un antisérum ou un agent immunosuppres-seur qui diminue les immunoréactions.

La souris nue est souhaitable comme animal à sang chaud, car elle présente peu ou pas d'immunoréaction, et on peut y transplanter sans prétraitement des cellules humaines établies, qui s'y multiplient

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rapidement. La multiplication des cellules humaines établies peut être, de plus, stabilisée par une première transplantation chez le hamster, suivie d'une transplantation dans la souris nue, où est provoquée la formation d'interféron à activité accrue. Dans ce cas, les cellules multipliées sont à nouveau transplantables du corps d'un animal à sang chaud au corps d'un autre animal de même espèce, genre, classe ou division, saufl'homme. Les cellules humaines établies peuvent être transplantées à toute partie du corps de l'animal, si elles s'y multiplient facilement; par exemple dans les veines, le péritoine, sous la peau et dans la cavité allantoïque.

Au lieu de les faire se multiplier directement dans les corps des animaux, on peut ensemencer les cellules humaines établies dans une chambre de diffusion, de forme et de dimension variables, munie d'une membrane filtrante dont les pores mesurent environ 10"7 à 10"5 m de diamètre, par exemple membrane-filtre, ultrafiltre ou fibre creuse, et placer cette chambre dans le corps d'un animal, par exemple dans le péritoine, afin de permettre l'alimentation des cellules au moyen des fluides nutritifs du corps de l'animal.

Eventuellement, la multiplication des cellules humaines établies peut être réalisée dans la chambre de diffusion avec circulation du fluide nutritif du corps de l'animal à sang chaud, à l'intérieur et à l'extérieur du milieu nutritif de la chambre. Dans ce cas, si la chambre est située sur le corps de l'animal, on peut observer, au travers de la paroi de la chambre, où en est la multiplication, et le nombre de cellules par animal peut être encore accru, sans sacrifier sans nécessité l'animal, par l'enlèvement de la chambre, ensemencement des cellules dans une autre chambre contenant un milieu nutritif et mise en place de cette dernière sur le même animal.

Le procédé avec chambre de diffusion permet d'utiliser tout animal à sang chaud, saufl'homme, pour la multiplication des cellules humaines établies, sans nécessité d'un prétraitement pour déprimer les immunoréactions; de plus, dans ce cas, les cellules multipliées dans la chambre peuvent être récoltées facilement sans contamination par les cellules de l'animal, puisqu'il n'y a pas de contact direct entre elles, et il n'y a pas de danger de réactions indésirables.

Après la transplantation des cellules humaines, l'animal est alimenté selon le procédé habituel, sans traitement spécial.

La durée de la multiplication des cellules humaines établies est ordinairement de 1 à 20 semaines. Lorsque les cellules établies, transplantées, proviennent de leucocytes humains, normaux ou tumoraux, la vitesse de multiplication cellulaire est si rapide qu'elle peut s'achever habituellement en 1 à 5 semaines. On trouve que le nombre des cellules humaines multipliées est de l'ordre de 107 à 1012 ou plus par animal.

Autrement dit, les procédés selon l'invention sont très avantageux pour la production d'interféron, car le nombre de cellules transplantées ou ensemencées dans l'animal est multiplié par 102 à 107 environ; il est environ 10 à 106 fois le nombre obtenu par les procédés antérieurs, in vitro, de multiplication des mêmes cellules en milieu nutritif.

Les cellules humaines vivantes, multipliées, peuvent être amorcées par tout procédé connu pour produire l'interféron. La partie du corps de l'animal où les cellules se multiplient peut être exposée à l'action d'un agent de formation d'interféron. Par exemple, l'interféron peut être obtenu par exposition directe à l'agent de production d'interféron des cellules humaines en cours de multiplication, en suspension dans la cavité péritonéale, ou des cellules humaines tumorales, formées sous la peau, suivie de la collecte et de la purification de l'interféron ainsi obtenu.

La formation d'interféron peut également s'effectuer par récupération des cellules humaines multipliées à partir du corps de l'animal, suivie par leur exposition in vitro à l'action des agents de production d'interféron. Par exemple, les cellules humaines, obtenues par collecte dans la cavité intrapéritonéale après multiplication, ou celles que l'on obtient par dissociation de tumeurs massives, humaines, isolées, qui se forment sous la peau du corps de l'animal, sont mises en suspension dans un milieu nutritif maintenu aux alentours de 20 à 40° C, pour donner une concentration de l'ordre de 105

à 108 cellules/ml. Puis ces cellules sont exposées à l'action d'un agent de formation d'interféron, lequel est ensuite recueilli et purifié.

Lorsque les cellules se multiplient dans des chambres de diffusion, elles peuvent être exposées à l'action des agents de formation d'interféron dans ces chambres, ou après en avoir été extraites. Lors de la formation de l'interféron, la production de celui-ci peut être encore accrue par des procédés connus tels que l'amorçage utilisant de l'interféron, et le procédé de superinduction au moyen d'un inhibiteur métabolique.

La production d'interféron par animal peut être en outre augmentée par les procédés suivants: a) un procédé au cours duquel le nombre de cellules vivantes par animal peut être augmenté, sans sacrifice inutile de l'animal, par enlèvement de la chambre, suivi de l'ensemencement de ses cellules dans une autre chambre contenant un milieu nutritif frais, que l'on place ensuite sur le même animal; b) un procédé au cours duquel les cellules humaines, après multiplication dans le corps d'un animal, sont exposées à l'action d'un agent de formation d'interféron in vivo et/ou in vitro, les mêmes cellules étant utilisées une ou plusieurs fois. Conviennent par exemple, comme agents de formation d'interféron, virus, bactérie, protozoaire, rickettsie, acide nucléique, endotoxine et Polysaccharide.

L'interféron obtenu peut être facilement purifié par des procédés de purification connus, par exemple par relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyophilisation. Eventuellement, la préparation ainsi obtenue d'interféron peut être à nouveau purifiée par des procédés connus tels qu'adsorption et désorption avec un échangeur d'ions, filtration sur gel, Chromatographie d'affinité, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse.

L'activité de l'interféron est déterminée par la méthode de réduction de plaque avec des cellules FL provenant de l'amnios humain, décrite dans «Protein, Nucleic Acid and Enzyme», vol. 20, N° 6, pp. 616 à 643 (1975).

Le titre en hémoagglutinines est déterminé selon le procédé décrit par J.E. Salk, «Journal of Immunology», vol. 49, p. 87 (1944).

Les exemples A suivants constituent une illustration non limitative de la production d'interféron selon l'invention.

Exemple A-l

On transplante par voie sous-cutanée à des souris sans poils,

nues (atrichie), adultes, des cellules BALL-1 établies, de provenance humaine, et on les alimente de manière habituelle pendant 3 semaines. 10 g environ de tumeur massive, par animal, formée sous la peau, sont isolés, coupés finement, mis en suspension dans une solution saline contenant de la trypsine, pour dissocier la tumeur en cellules, et les cellules sont recueillies par centrifugation. Elles sont lavées avec un milieu essentiel, minimal, de Eagle, à pH 7,2 et 37° C, contenant 5% en volume par volume de sérum humain, et remises en suspension pour donner une concentration de l'ordre de 5 x 10e cellules/ml. On ajoute au mélange obtenu environ 100 unités/ml d'interféron partiellement purifié, spécifique de l'espèce humaine, et on fait incuber pendant 2 h environ, puis on ajoute comme agent de production d'interféron du virus de Sendai titrant 300 hémoagglutinines/ml, et l'on fait incuber pendant 20 h supplémentaires. La solution incubée est centrifugée à 1000 x g environ, et vers 4°C, pour enlever les précipités tels que cellules. La partie surnageante est dialysée contre une solution tampon 0,1 M, de pH 2, contenant de l'acide chlorhydrique et du chlorure de potassium, à 4° C pendant 48 h, puis contre une solution-tampon phosphate 0,01M, de pH 7,2, pendant 12 h; ensuite on filtre avec précaution à l'aide d'une membrane filtrante. Le filtrat est concentré et lyo-phylisé en une poudre d'interféron à activité élevée. L'activité en interféron est de l'ordre de 20 000 000 unités par souris nue.

Exemple A-2

On transplante dans le péritoine de souris nues adultes des cellules établies OUMS-20 de provenance humaine, et l'on nourrit les animaux de la manière habituelle pendant 5 semaines. On injecte alors à ces souris, par voie intrapéritonéale, du virus de la maladie

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de Newcastle, ayant initialement un titre en hémoagglutinines de l'ordre de 3000, mais presque complètement préinactivé au moyen de radiation ultraviolette; au bout de 24 h, on sacrifie les animaux et récolte le fluide ascitique. Ce fluide est centrifugé à environ 1000 x g, à 4 C, pour éliminer les produits qui précipitent, notamment cellules. La partie surnageante est dialysée contre une solution-tampon 0,1M, de pH 2 contenant de l'acide chlorhydrique et du chlorure de potassium, à 4" C pendant 48 h, puis contre une solution-tampon phosphate 0,01M de pH 7,2 pendant 15 h; ensuite, on filtre avec précaution au moyen d'une membrane. Le filtrat est concentré pour donner une solution d'interféron d'activité élevée, de l'ordre de 700 000 unités/10 souris nues.

Exemple A-3

On nourrit de manière habituelle pendant 4 semaines les hamsters nouveau-nés ayant reçu une injection intrapéritonéale de sérum connu de lapin antilymphocytaire contre le thymocyte du hamster, et une transplantation sous-cutanée de cellules établies JBL de provenance humaine. On isole alors et dissocie comme dans l'exemple A-l la tumeur massive de 30 g environ qui s'est formée sous la peau de chaque animal. Les cellules obtenues sont lavées avec le milieu RPMI 1640, à pH 7,4 et 37° C, contenant 10% en volume/ volume de sérum de veau, et remises en suspension pour donner une concentration de l'ordre de 2 x 107 cellules/ml. A cette solution on ajoute 200 unités/ml d'interféron partiellement purifié, spécifique de l'espèce humaine, et on laisse incuber pendant 1 h environ. Après addition de virus Sendai titrant environ 100 hémoagglutinines/ml, on fait incuber le mélange résultant pendant 16 h supplémentaires, pour produire de l'interféron. La solution obtenue est ultérieurement purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2, et donne une solution d'interféron très active. L'activité de l'interféron est de l'ordre de 15 millions d'unités par hamster.

Exemple A-4

Des rats nouveau-nés reçoivent une transplantation par voie intraveineuse de cellules Namalva établies, de provenance humaine, et sont nourris de manière habituelle pendant 4 semaines. Sur chaque rat on isole alors et dissocie comme dans l'exemple A-l une tumeur massive sous-cutanée de 50 g environ. Les cellules obtenues sont ensuite traitées comme dans l'exemple A-l pour produire l'interféron. La solution d'interféron obtenu est purifiée et lyophilisée comme dans l'exemple A-l, pour donner une poudre très active d'interféron, dont l'activité est de l'ordre de 30 millions d'unités par rat.

Exemple A-5

Des souris adultes sont soumises à une irradiation aux rayons X de l'ordre de 400 rem, afin d'affaiblir leurs immunoréactions, puis on leur plante sous la peau des cellules établies TALL-1 de provenance humaine, et on les nourrit comme d'habitude pendant 3 semaines. On isole et dissocie alors comme dans l'exemple A-l, chez chaque souris, une tumeur massive de 10 g environ qui s'est formée sous la peau. Les cellules obtenues sont traitées comme dans l'exemple A-3 pour produire de l'interféron. La solution d'interféron résultante est purifiée et concentrée comme celle de l'exemple A-2 et devient très active. L'activité de cet interféron correspond à 8 millions d'unités par souris.

Exemple A-6

Des cellules humaines établies OUMS-25 sont plantées sous la peau de hamsters, comme dans l'exemple A-3; au bout de 3 semaines, elles sont transplantées dans le péritoine de souris nues âgées de 10 d. Ces souris sont alimentées de manière habituelle pendant 5 semaines, puis anesthésiées, et on recueille leur fluide ascitique. Ce fluide est centrifugé pour rassembler les cellules multipliées, qui sont lavées pour permettre la production d'interféron comme dans l'exemple A-l. La solution résultante d'interféron est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2 pour donner une solution très active. L'activité de cet interféron correspond à 2 millions d'unités par souris.

Exemple A-7

Des cellules établies JBL, de provenance humaine, sont mises en suspension dans une solution saline, dans des chambres de diffusion cylindriques en matière plastique de 10 ml, équipées d'une membrane dont les pores ont environ 0,5 p. de diamètre. Ces chambres sont incorporées dans le péritoine de rats adultes, lesquels sont alimentés de manière habituelle pendant 4 semaines, après quoi les chambres sont enlevées. On constate que les concentrations en cellules dans ces chambres sont voisines de 5 x 109 cellules/ml, ce qui correspond à 103 fois environ de ce que l'on obtient in vitro dans un incubateur à COz sur milieu nutritif. Les cellules sont ensuite traitées comme dans l'exemple A-l pour la production d'interféron. La solution d'interféron obtenue est purifiée, concentrée et lyophilisée, et elle donne une poudre d'activité élevée. L'activité de cet interféron correspond à peu près à 30 millions d'unités par rat.

Exemple A-8

Dans les cavités allantoïques de blancs d'œufs fertiles, incubés pendant 5 d à 37° C, sont plantées des celules NALL-1 de provenance humaine, et l'on fait incuber ces œufs à 37° C pendant

1 semaine. Puis les œufs sont ouverts et les cellules multipliées recueillies. Ces cellules sont traitées comme dans l'exemple A-l en vue de la production d'interféron. La solution obtenue est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2; elle est alors très active. L'activité de cet interféron correspond à environ 400 000 unités/

10 blancs d'œufs fertiles.

Exemple A-9

La poudre d'interféron, préparée conformément au procédé de l'exemple A-l, est à nouveau purifiée par les procédés décrits par G. Bodo («Symposium on Préparation, Standardisation and Clinical Use of Interferon, 1 Ith International Immunobiological Symposium», 8-9 juin 1977, Zagreb), c'est-à-dire adsorption et désorption avec échangeur d'ions, fractionnement du poids moléculaire par filtration sur gel, concentration et filtration faite avec soin à l'aide d'une membrane. La solution ainsi obtenue a une activité de

2 x 106 unités/mg de protéine. L'interféron est récupéré à 40% environ.

L'interféron obtenu dans les exemples A-l à A-9 peut être utilisé avantageusement, seul ou en mélange avec une ou plusieurs autres substances, en usage externe ou interne, pour la prévention et le traitement de maladies humaines sensibles à l'interféron. L'invention est illustrée avec référence aux expérimentations suivantes.

Expérimentation 1:

Traitement de maladies à virus par l'interféron

(Essai d'inhibition de la multiplication du virus in vitro)

On ajoute à des couches monomoléculaires de cellules de poumon embryonnaire humain, formées par culture primaire dans des boîtes de Pétri de 6 cm de diamètre, respectivement 0,1, 10 et 100 unités d'interféron préparé par le procédé de l'exemple A-9; les mélanges obtenus sont mis à incuber à 37° C pendant 20 h, dans un incubateur à 5% en volume/volume de C02. Ces cellules sont additionnées de virus Varicella-zoster ou de Cytomegalovirus humain en quantité telle qu'il se forme environ 100 plaques dans le cas des cellules non additionnées d'interféron. Ces mélanges sont mis à incuber, et on compte le nombre de plaques formées. L'effet inhibiteur de l'interféron sur la multiplication du virus est déterminé au moyen de l'équation:

% de réduction du nombre de plaques = 100 (A—B): A dans laquelle A est le nombre de plaques existant sans addition d'interféron et B le nombre de plaques existant dans le cas d'addition d'interféron. Les résultats sont reportés dans le tableau 1.

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Tableau 1

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Tableau 3

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Virus Varicellazoster (%)

Cytomegalovirus humain (%)

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Il ressort clairement des résultats de ce tableau que l'interféron selon l'invention inhibe la multiplication de virus pathogènes. On ne constate pas d'anomalies dans les cellules humaines cultivées en présence d'interféron.

Expérimentation 2:

Traitement de maladies non virales par l'interféron 1 ) Essai d'inhibition de la multiplication in vitro de cellules tumorales

A un milieu RPMI 1640 complété avec 15% en volume/volume de sérum fœtal de veau est ajouté l'interféron préparé selon le procédé de l'exemple A-9, de façon à obtenir respectivement des concentrations de 30, 300 et 3000 unités/ml. Les produits résultants sont ajoutés à des cellules de tumeur humaine à raison de 5 x 105 cellules/ml et on fait incuber à 37° C pendant 5 d dans des incubateurs à 5% en volume/volume de C02. Puis l'on compte le nombre de cellules par millilitre de milieu. On opère de même avec des témoins préparés comme plus haut, à ceci près que l'interféron a été préalablement inactivé par chauffage à 100°C pendant 30 min. L'effet inhibiteur de l'interféron sur la multiplication des cellules est déterminé au moyen de l'équation suivante:

% d'inhibition de la multiplication des cellules =

dans laquelle A est le nombre de cellules dans le témoin, et B le nombre de cellules dans l'essai traité à l'interféron. Les résultats sont donnés dans le tableau 2.

Tableau 2

Concentration en interféron (unités/ml)

Cellules de tumeurs humaines

BALL-1 (%)

TALL-1 (%)

NALL-1 (%)

JBL

(%)

30

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+ 12

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+ 19

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+ 57

+61

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3000

+ 88

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+ 85

+ 91

Il ressort clairement de ce tableau que l'interféron inhibe fortement la multiplication des cellules de tumeurs BALL-1, TALL-1, NALL-1 et JBL, et qu'il est efficace à une concentration comprise entre 30 et 3000 unités/ml.

2) Essai d'inhibition de la multiplication de cellules de tumeur in vivo

L'essai est réalisé avec 8 souris nues, âgées de 2 mois environ. Chaque souris reçoit par voie sous-cutanée un transplant de 7,5 x 106 cellules TALL-1. A partir du troisième jour du transplant, 4 souris reçoivent, par voie intrapéritonéale, 20 dosages d'interféron préparé selon l'exemple A-3, à raison de 3 dosages par semaine, chacun de 10 000 unités. Pendant 48 d après la transplantation, les souris sont alimentées, puis on les sacrifie, et l'on prélève et pèse les tumeurs formées, humides. Les 4 souris restantes, utilisées comme témoins, sont nourries et sacrifiées dans les mêmes conditions et leurs tumeurs sont pesées. Les résultats figurent dans le tableau 3.

Témoin (g)

Essai avec traitement par l'interféron (g)

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0

4

7,5

0

Poids moyen

de la tumeur

6,6

0,7

3) Essai d'inhibition de la multiplication de cellules de tumeur in vivo

L'essai est réalisé avec 8 souris nues de 2 mois environ. On transplante chez chaque souris, par voie sous-cutanée, 107 cellules JBL (tumorales). A partir de la troisième semaine de la transplantation, 4 souris reçoivent par voie intrapéritonéale 8 dosages d'interféron préparé selon l'exemple A-2, à raison de 2 dosages par semaine de 1000 unités chacun. Après le transplant, les souris sont alimentées pendant 42 d, puis sacrifiées et leurs tumeurs sont pesées humides. Les 4 souris restantes, utilisées comme témoins, et ne recevant pas d'interféron, sont alimentées et sacrifiées dans les mêmes conditions, et leurs tumeurs pesées. Les résultats sont reportés dans le tableau 4.

Tableau 4

Témoin (g)

Essai avec traitement par l'interféron (g)

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1,4

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20,3

0,7

Poids moyen

de la tumeur

11,7

0,9

Il ressort clairement des résultats des tableaux 3 et 4 que l'interféron inhibe la formation de tumeur massive humaine chez la souris, et que, même s'il y a formation de tumeur, son poids est bien moindre que celui de la tumeur des témoins. De plus, les souris traités à l'interféron sont physiquement plus actives que les témoins et ont plus d'appétit.

Expérimentation 3:

Essai de toxicité aiguë

L'essai de toxicité aiguë est réalisé avec des souris de 20 d, auxquelles on injecte, par voie intrapéritonéale, la solution d'interféron préparée selon l'exemple A-9. La toxicité est très faible; DLS0 supérieure à 20 000 000 unités/kg.

Il ressort des expérimentations décrites plus haut que les maladies sensibles à l'interféron, mentionnées dans la présente description, sont celles qui peuvent être traitées ou prévenues au moyen de l'interféron selon l'invention, c'est-à-dire des maladies virales, telles que kératoconjonctivite épidémique, kératite herpétique, influenza, rubéole, hépatite sérique, et des maladies non virales comme leucémie et ostéosarcome.

On peut préparer les médicaments et agents thérapeutiques contenant de l'interféron sous différentes formes selon les utilisations envisagées, c'est-à-dire sous forme de préparations liquides telles que pulvérisation, collyre, gouttes nasales, gargarisme et injection, de pâtes telles qu'onguent, et de préparations solides comme poudre, granules et comprimés.

Ces préparations.sont suffisamment efficaces pour prévenir et traiter des maladies sensibles à l'action de l'interféron, si elles contiennent, en général, 1 à 10 millions d'unités d'interféron/g. Si néces-

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saire, ces préparations peuvent être mélangées avec une ou plusieurs autres substances, notamment agents thérapeutiques, véhicules, charges et stabilisants. Ainsi, comme l'interféron injecté dans une veine s'élimine du sang en environ 10 min, et est excrété du système, son administration peut être prolongée et l'action thérapeutique améliorée par l'installation de l'interféron incorporé à une solution de sucre. Quelques formes de réalisation non limitatives de préparations contenant de l'interféron sont décrites ci-après.

Exemple B-l:

Préparation liquide

On réalise une préparation liquide à l'aide de sérum physiologique et d'interféron obtenu par le procédé de l'exemple A-l, de façon à avoir une concentration en interféron de 500 unités/ml. Cette préparation convient en pulvérisation, comme collyre, gouttes nasales et gargarisme, pour la prévention et le traitement de maladies virales, en particulier la kératoconjonctivite épidémique et l'influenza.

Exemple B-2:

Solution injectable

On prépare une solution injectable à partir de sérum physiologique et d'interféron obtenu par le procédé de l'exemple A-9, de façon à avoir une concentration en interféron de 100 000 unités/ml. Cette solution injectable convient pour le traitement de toutes les maladies sensibles à l'action de l'interféron, telles que maladies virales ou tumorales.

Exemple B-3:

Une solution auxiliaire de sucre, pour injections intraveineuses, a été préparée par mélange de 1 million d'unités de la préparation d'interféron obtenue selon l'exemple A-5 et 10 mg de cyclo-phosphamides dans 500 ml d'une solution aqueuse de maltose à 10% en poids/volume. La solution ainsi obtenue convient à la perfu6

sion continue, intraveineuse pour le traitement préventif de maladies tumorales.

Exemple B-4:

5 Solution injectable

On prépare une solution injectable avec 100 ml de solution aqueuse à 10% en poids/volume de maltose, 500000 unités d'interféron préparé selon le procédé de l'exemple A-6 et 2 mg de mitomy-cine C. Cette solution injectable convient en particulier pour le trailo tement de maladies tumorales.

Exemple B-5:

Onguent

Un onguent est préparé de manière habituelle par mélange de 15 poudre d'interféron obtenue selon l'exemple A-4, avec de la vaseline et de l'huile de paraffine, de façon à avoir une activité de 10000 unités d'interféron/g. Cette préparation convient pour le traitement de maladies virales de la peau.

20 Exemple B-6:

Comprimés

On prépare des comprimés à la manière habituelle, à partir d'un mélange de poudre d'interféron produite d'après l'exemple A-7, 25 d'amidon et de maltose, de façon à avoir une activité de 1000 unités d'interféron/comprimés (100 mg). Ces comprimés conviennent pour prévenir et traiter des maladies virales du système digestif.

Exemple B-7:

30 Préparation liquide

Une préparation liquide pour administration orale est obtenue avec 10 ml de solution aqueuse à 10% en poids/volume de maltose, 200 000 unités d'interféron de l'exemple A-8 et 5 mg de métho-trexate. Cette préparation convient en particulier pour le traitement 35 des maladies tumorales.

R

Claims

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1. Procédé de production d'interféron à partir de cellules humaines, établies, caractérisé en ce que l'on transplante ces cellules, en vue de leur multiplication, dans le corps d'un animal à sang chaud, ou on les ensemence dans une chambre de diffusion placée dans l'animal, celui-ci les nourrissant avec son fluide corporel nutritif, après quoi les cellules multipliées sont soumises, in vivo ou in vitro, à l'action d'un inducteur d'interféron, celui-ci étant ensuite recueilli et purifié.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules établies sont des leucocytes, ou des cellules Namalva, TALL-1, BALL-1, NALL-1 ou JBL.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est un mammifère.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les pores de la membrane filtrante de la chambre de diffusion mesurent 10~7 à 10"5 m de diamètre.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la durée de multiplication des cellules est de 1 à 20 semaines.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la concentration en cellules multipliées du liquide soumis à l'action de l'inducteur d'interféron est de 105 à 108/ml.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la température d'exposition des cellules à l'action de l'inducteur est comprise entre 20 et 40° C.

8. Composition pour le traitement ou la prévention de maladies sensibles à l'action de l'interféron, caractérisée en ce qu'elle contient de l'interféron préparé conformément au procédé selon l'une des revendications précédentes.

9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle contient de 1 à 10 millions d'unités d'interféron par gramme.