DE2902136C2 - Verfahren zum Herstellen von Interferon - Google Patents

Verfahren zum Herstellen von Interferon

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    • Y10S435/811—Interferon

Description

a) Transplantation etablierter normaler menschlicher Zellen oder etablierter Zellen, die man aus menschlichen Tumorzellen gewonnen hat, auf den Körper eines anderen warmblütigen Tieres oder
b) Einimpfen etablierter normaler menschlicher Zellen oder etablierter Zellen, die man aus menschlichen Tumorzellen gewonnen hat, in eine Diffusionskammer und Vermehrung der Zellen, während man das Tier die Zellen mit seiner nährenden Körperflüssigkeit 1 bis 20 Wochen versorgen läßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die etablierten Zel'en TALL-I-Zellen, BALL-1-Zellen, NALL-1-Zellen oder JBL-Zellen sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das warmblütige Tier ein Säugetier oder Geflügel ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltenen Zellen in einer Konzentration von etwa 10s bis 108 Zellen/ml der Wirkung eines Interferonauslösers ausgesetzt worden sind.
Wie in »Interferon« (1975) Kodansha, Ltd, Tokyo (Shigeyasu Kobayashi), »Interferon and Its Clinical Potential« (1976) William Heinemann Medical Books, Ltd, London (D. A. J. Tyrrell) und in »Protein, Nucleic Acid und Enzyme«, Bd 21, Nr. 4 (1976) Kyoritsu Shuppan Co, Ltd, Tokyo beschrieben ist, ist »Interferon« ein Ausdruck, der eine Substanz bezeichnet, die eine eiweißartige Substanz ist und die intrazellulär oder extrazellulär in bzw. von lebenden Zellen induziert wird, wenn die Zellen Interferonauslösern aussetzt, wie z. B. einem Virus, einem Bakterium, Protozoen, Rickettzien, einer Nukleinsäure, einem Endotoxin oder Polysaccharid, und die eine Aktivität aufweist, unspezifisch die Vermehrung verschiedener Viren in den Zellen zu hemmen.
Weil Interferon artspezifisch ist, ist nui Interferon, das man aus lebenden menschlichen Zellen gewonnen hat, zur Vorbeugung und Therapie menschlicher Krankheiten wirksam.
Üblicherweise verwendete man Leukozyten als lebende menschliche Zellen zur Herstellung von Interferon. Leukozyten erhält man durch Abtrennung aus frischem Blut, aber ihre Erhaltung und ihr Nachschub in großer Menge und bei geringen Kosten sind außerordentlich schwierig.
Die Verwendung von lebenden Zellen, die man durch Einimpfen von etablierten menschlichen Zellen in Nährmedien und ihre Kultivierung in vitro erhalten hatte, wurde auch zur Herstellung von Interferon versucht.
Die Methoden in vitro sind jedoch im großen Maßstab und bei geringen Kosten undurchführbar, weil sie den Nachteil haben, daß sie eine große Menge menschliches Serum benötigen und eine unstabile Vermehrung, eine geringe Vermehrungsgeschwindigkeit und eine niedrige Zellkonzentration ergeben.
In »Zeil- und Gewebekulturen« von J. Paul; de Gruyter-Verlag Berlin 1980, S. 294 bis 304 ist die Züchtung von Zellen durch Transplantation beschrieben. Es wird
ίο jedoch nicht angegeben, welche Menge lebender Zellen unter welchen Bedingungen erhalten werden kann, welche Tiere und weiche Bereiche der Tiere sich für eine Transplantation eignen und wie lange vermehrt werden muß; ferner ob diese Methode auch für etablierte menschliche Leukozyten anwendbar ist und ob die durch Vermehrung erhaltenen Zellen eine Aktivität zur Interferonbildung genauso wie die Ausgangszellen besitzen. Ferner ist in der genannten Literal jrstelle eine Methode zur Zellzüchtung in Diffusionskammern beschrieben. Diese Diffusionskammern sind jedoch nicht zur Vermehrung von lebenden Zellen und Erzeugung von Interferon im technischen Maßstab geeignet
Daher wurde die technische Erzeugung von Interferon, das zur Vorbeugung und/oder Therapie menschlieher Krankheiten geeignet ist, bisher nicht verwirklicht Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Interferon, wobei etablierte menschliche Zellen in vivo oder in vitro der Wirkung eines Interferonauslösers ausgesetzt werden und Interferon nach Induktion gesammelt und gereinigt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die menschlichen Zellen erhält durch
a) Transplantation etablierter normaler menschlicher Zellen oder etablierter Zellen, die man aus menschlichen Tumorzellen gewonnen hat, auf den Körper eines anderen warmblütigen Tieres oder
b) Einimpfen etablierter normaler menschlicher Zellen oder etablierter Zellen, die man aus menschlichen Tumorzellen gewonnen hat, in eine Diffusionskammer und Vermehrung der Zellen, während man das Tier die Zellen mit seiner nährenden Körperflüssigkeit 1 bis 20 Wochen versorgen läßt.
In den Unteransprüchen werden Ausgestaltungen der Erfindung genannt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man leicht eine große Menge an Interferon erzeugen. Das so erhaltene Interferon ist eine wirksame Zubereitung zur Verhütung und Behandlung von Krankheiten, die auf Interferon ansprechen.
Im Vergleich zu üblichen Methoden, die man zur Vermehrung von Zellen in vitro anwendet, hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß es kein oder viel weniger Nährmedium erfordert, das mit teurem menschlichem Serum ergänzt werden muß, daß die Vermehrung der etablierten Zellen leichter aufrecht erhalten werden kann, und daß man eine höhere Interferon-Aktivität erzielen kann.
Im Vergleich zu den üblichen Methoden in vitro weist die Erfindung ferner den zusätzlichen Vorteil auf, daß etablierte menschliche Zellen sich stabiler und rascher vermehren, und daß man eine größere Erzeugung von Zellen und eine höhere Ausbeute an Interferon pro ZeI-Ie erzielen kann.
Ein weiterer Vorteil des erfinungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man nach der Transplantation der etablierten menschlichen Leukozyten das Tier auf
übüche Weise ohne Spezialbehandlung füttert, während es die Zellen mit seiner nährenden Körperflüssigkeit versorgt
Man kann beliebige etablierte menschliche Zellen verwenden, sofern sie sich leicht vermehren können, wenn man sie auf die Körper anderer warmblütiger Tiere transplantiert. Beispielsweise kann man etablierte normale menschliche Zellen, wie z. B. OUMS-20-ZelIen, OUMS-25-Zellen, HEF-Zellen, HUF-2-Zellen oder WI-38-Zellen (beschrieben in »Protein, Nucleic Acid and Enzyme«, Bd. 20, Nr. 6, S. 616 bis 643 (1975) von Kyoritsu Shuppan Co, Ltd, Tokyo) und etablierte Zellen, die man aus menschlichen Tumorzellen gewonnen hat, wie z. B. Namalva-Zellen (beschrieben in »Journal of Clinical Microbiology«, Bd. 1. S. 116 bis 117 (1975)), BALL-1-Zellen, TALL-1-Zellem, NALL-I-Zellen (beschrieben in »Nature«, Bd. 267, S. 843 bis 344 (1977) von Isao Miyoshi) und JBL-Zellen (beschrieben in »Cancer«, Bd. 40, Nr. 6 (1977) von Isao Miyoshi) erfindungsgemäß verwenden.
Vorzugsweise verwendet man als etablierte Zellen TALL-ί-Zeiien, BALL-i-Zellen, NALL-1-Zellen öder JBL-Zellen.
Erfindungsgemäß kann man ein beliebiges warmblütiges Tier verwenden, wenn etablierte menschliche Zellen sich darin leicht vermehren können; beispielsweise Geflügel, z.B. Küken oder Tauber, oder Säugetiere, z. B. Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, Rind, Pferd, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Hamster, gewöhnliche Maus und nackte Maus.
Weil die Tiere dazu neigen, unerwünschte Immunreaktionen zu bevjken, wenn man die etablierten menschlichen Zellen in sie transp'antiert, bevorzugt man insbesondere Tiere in möglichst unausgewachsener Form, nämlich als Ei, Embryo, Fetus c !,er neugeborenes oder junges Tier, und nützt die Immunparalysis aus.
Vor der Transplantation der Zeilen kann man das Tier vorbehandeln, und zwar entweder durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder Gamma-Strahlen bei 200 bis 600 rem, oder mit einem Antiserum oder einem immunsuppressiven Mittel, und die Immunreaktionen unterdrücken.
Nackte Mäuse sind als warmblütiges Tier vorteilhaft, weil sie keine oder wenige Immunreaktionen bewirken, und weil man etablierte menschliche Zellen in sie ohne Vorbehandlung transplantieren und in ihnen rasch vermehren kann.
Die Vermehrung etablierter menschlicher Zellen kann man ferner stabilisieren, indem man die Zellen zuerst im Hamster transplantiert und danach in nackte Mäuse transplantiert, wo man Interferon mit erhöhter Aktivität induziert.
In diesem Fall transplantiert man die vermehrten Zellen weiter von einem Körper eines warmblütigen Tiers auf den Körpers eines weiteren Tiers der gleichen Art, Gattung, Klasse oder Ordnung, mit Ausnahme des Menschen. Etablierte menschliche Zellen kann man auf einen beliebigen Teil eines Tierkörpers transplantieren. sofern sie sich leicht darin vermehren; beispielsweise intravenös, intraperitonal, subkutan oder in eine Allantoishöhlung.
Bei der Aufführungsform b) des erfindungsgemäßen Verfahrens impft man eine Diffusionskammer und bringt diese an einem tierischeil Körper, beispielsweise intraperitonal, an. Man kann etablierte menschliche Zellen in Diffusionskammern verschiedener Form und Größe einimpfen und darin vermehren, welche mit Filtermembranen (Poren mit ca. 10~7 bis 10-5m Durchmesser) versehen sind, beispielsweise Membranfiltern, Ultrafiltern oder Hohlfiltern.
Man läßt die nährende Körperflüssigkeit des warmblütigen Tiers in das und aus dem Nährmedium in der Kammer zirkulieren und die Zellen mit der Nährflüssigkeit versorgen. Wenn man die Kammer an einem Tierkörper anbringt, kann man den Vermehrungszustand der Zeilen durch die Kammerwand beobachten, und man kann die Anzahl der Zellen pro Tier weiter steigern, ohne unnötig die Tiere zu töten, indem man nacheinander die Kammer entfernt, die Zellen in eine weitere Kammer einimpft, weiche frisches Nährmedium enthält, und indem man die letztere Kammer an den gleichen Tieren befestigt
Die Methode der Diffusionskammer hat den zusätzlichen Vorteil, daß man beliebige warmblütige Tiere, mit Ausnahme des Menschen, zur Vermehrung der etablierten menschlichen Zellen verwenden kann, daß man keine Vorbehandlung zur Unterdrückung der Immunreaktionen benötigt, und daß man etablierte menschliche Zellen, die sich in der Kammer vermehrt haben, leicht ohne Verunreinigung durch tierische Zellen gewinnen kann, weil die menschlichen Zellen nicht direkt mit tierischen Zellen in Berührung treten, und keine Gefahr für unerwünschte Reaktionen besteht.
Der Vermehrungszeitraum etablierter Zellen beträgt üblicherweise 1 bis 20 Wochen. Wenn man als transplantierte etablierte 'Zellen verwendet, die man aus menschlichen normalen oder Tumorieukozyten gewonnen hat, ist die Geschwindigkeit der Zellvermehrung derart hoch, daß man die Vermehrung üblicherweise in einem Zeitraum von 1 bis 5 Wochen erzielen kann.
Die Anzahl der vermehrten menschlichen Zellen wurde gezählt und betrug etwa 107 bis 10'2 oder mehr pro Tier.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist demgemäß außerordentlich vorteilhaft zur Erzeu^un** ynn intf»rfprQn weil die Anzahl der Zellen, die man auf das Tier transplantiert hat bzw. in es eingeimpft hat um etwa das 102-bis lO'fache oder mehr durch das Verfahren ansteigt; das ist etwa das 101- bis Wfache oder mehr jener Zahl, die man durch Einimpfen und Vermehren derselben Zellen im Nährmedium in vitro erzielte.
In den vermehrten lebenden menschlichen Zellen kann man die Induktion auf eine beliebige Weise vornehmen und Interferon erzeugen. Man kann den Teil des Tierkörpers selbst, wo man die Zellen vermehrte, einem Interferonauslöser aussetzen. Beispielsweise kann man Interferon erhalten, indem man direkt die intraperitonal vermehrten suspendierten menschlichen Zellen oder die subkutan gebildeten menschlichen Tumorzellen einem Interferonauslöser aussetzt und Interferon induziert.
Interferon kann man ferner induzieren, indem man die vermehrten menschlichen Zellen aus den Tierkörpern gewinnt und die Zellen dem Interferonauslöser in vitro zusetzt. Beispielsweise kann man menschliche Zellen, die durch Sammeln suspendierter menschlicher Zellen erhalten wurden, die intraperitonal vermehrt wurden, oder solche Zellen, die durch Zerteilen von isoliertem menschlichen massiven Tumor erhalten wurden, der sich subkutan in Tierkörpern bildete, in einem Nährmedium suspendieren, das man bei etwa 20 bis 4O0C hält. Man kann so eine Konzentration von 105 bis 106 Zellen/ml erhalten.
Danach setzt man die Zellen bei dieser Temperatur dem Interferonauslöser aus und induziert Interferon. Das induzierte Interferon aus den so behandelten
menschlichen Zellen sammelt und reinigt man.
Wenn man menschliche Zellen in Diffusionskammern vermehrt, kann man die Zellen den Interferonauslösern in den Kammern aussetzen, oder nachdem man die Zellen aus den Kammern gewonnen hat.
Bei der Induktion von Interferon kann man die Erzeugung von Interferon durch bekannte Methoden weiter steigern, wie z. B. die Inkubationsmethode unter Verwendung von Interferon oder die Superinduktionsmethode unter Verwendung eines Stoffwechselinhibitors.
Die Interferonproduktion pro Tier kann man ferner mit den nachstehenden Methoden steigern:
a) Man kann die Anzahl der lebenden Zellen pro Tier weiter steigern, ohne das Tier unnötig zu töten, indem man nacheinander die Kammer entfernt, die Zellen in eine andere Kammer einimpft, die frisches Nährmedium enthält, und die letztere Kammer an dem gleichen Tier anbringt
b) Die menschlichen Zellen, die man in einem Tierkörper vermehrt hat, setzt man einem Interferonauslöser in vivo und/oder in vitro aus und induziert Interferon unter Verwendung der glichen Zellen einmal oder mehrmals.
chen artspezifiscb.en Interferons, inkubierte die Mischung etwa 2 h lang, gab danach eine Menge von etwa 300 Hämagglutinintiter je ml Sendal-Virus zu, inkubierte weitere 20 h und induzierte Interferon. Die Lösung der inkubierten Mischung zentrifugierte man bei etwa 1000 χ 9,8 ms-2 (1000 χ g) bei etwa 4°C und entfernte den Niederschlag, z. B. Zellen. Die übersteigende Flüssigkeit dialysierte man gegen eine Pufferlösung (0,1 Mol/l) mit einem pH-Wert von 2,0 und einem Gehalt an Salzsäure und Kaliumchlorid bei 4° C 48 h lang, dialysierte danach gegen eine phosphatgepufferte Salzlösung (0,01 Mol/l) mit einem pH-Wert von 7,2 12 h lang und filtrierte sorgfältig bzw. vorsichtig durch Membranfiltration. Das Filtrat engte man ein und lyophilisierte man zu einem Interferonpulver mit hoher Aktivität Die Interferon-Aktivität betrug etwa 20 000 000 Einheiten pro nackte Maus.
20
25 Herstellungsbeispiel 2:
In erwachsene nackte Mäuse transpiantierte man irstraperitonal etablierte OUMS-20-ZelIen des Menschen und fütterte die Tiere auf übliche Weise 5 Wochen lang. Den Mäusen spritzte man intraperitonal Newcasüe-Disease-Virus ein, der ursprünglich einen Hämagglutinintiter von etwa 3000 aufwies, aber vorher durch UV-Strahlung fast vollständig inaktiviert worden war, tötete die Tiere nach 24 h und gewann danach die aszitische Flüssigkeit. Die Flüssigkeit zentrifugierte man bei ca. 1000 χ 9,8 ms-2 (1000 χ g) bei 4° C und entfernte den Niederschlag, z. B. Zellen. Die überstehende Flüssigkeit dialysierte man gegen eine Pufferlösung (0,1 Mol/I) mit einem pH-Wert von 2,0 und einem Gehalt an Salzsäure
Man kann einen beliebigen Interferonauslöser, z. B. ein Virus, ein Bakterium, Protozoen, Rickettsien, eine Nukleinsäure, ein Endotoxin oder Polysaccharid nach freier Wahl verwenden.
Das gebildete Interferon kann man leicht mit bekann- 30 ten Reinigungsmethoden reinigen, beispielsweise durch Aussalzen, Dialyse, Filtrieren, Zentrifugieren, Einengen oder Lyophilisieren. Gegebenenfalls kann man die Zubereitung des erhaltenen Interferons weiter auf bekannte Weise reinigen, z. B. durch Adsorption und Desorp- 35 und Kaliumchlorid bei 4° C 48 h lang, dialysierte danach tion mit einem Ionen-Austauscher, Gel-Filtration, Affi- gegen eine phosphatgepufferte Salzlösung (0,01 Mol/l) nitätschromatographie. Fraktionieren am isoelektri- mit einem pH-Wert von 72 15 h lang und filtrierte sorgschen Punkt oder Elektrophorese. fältig durch Membranfiltration. Das Filtrat engte man
Die Interferon-Aktivität bestimmte man mit FL-ZeI- ein und erhielt eine Interferonlösung mit hoher Aktivilen, die man aus menschlichem Amnion gewonnen hat, 40 tat Die Interferon-Aktivität betrug etwa 700 000 Einwie in »Protein, Nucleic Acid and Enzyme«, Bd. 20, heiten/10 nackte Mäuse. Nr. 6, S. 616 bis 643 (1975) (Kyoritsu Shuppan Co, Ltd, Tokyo) beschrieben ist, gemäß der üblichsn Fleckenverminderungsmethode.
Den Hämagglutinintiter untersuchte man gemäß der Methode, die im »Journal of Immunology«, Bd. 49, S. 87 Herstellungsbeispiel 3:
(1944) (j. E. SaIk) beschrieben ist.
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.
50
Herstellungsbeispiel 1:
Erwachsenen nackten Mäusen transplantierte man subkutan etablierte BALL-I-Zellen des Menschen und fütterte die Tiere auf übliche Weise 3 Wochen lang. Etwa 10 g massiven Tumor pro nackte Maus, der sich subkutan gebildet hatte, isolierte man, zerschnitt ihn fein, suspendierte ihn in einer Salzlösung, die Trypsin enthielt, trennte so den Tumor in Zellen auf und sammelte die Zellen durch Zentrifugieren. Die Zellen wusch man mit einem Medium mit Minimalkonzentrationen aller essentiellen Stoffe mit einem pH-Wert von 7,2, einer Temperatur von 37°C und einem Gehalt von 5 Vol% menschlichem Serum, suspendierte sie wieder und erhielt eine Konzentration von etwa 5 χ 106 Zellen/ml. Zu der erhaltenen Mischung gab man etwa 100 Einheiten/ml eines teilweisen gereinigten menschli-Neugeborene Hamster, die eine intraperitonale Injektion von bekanntem Antilymphozytenserum von Kaninchen gegen Thymozyten von Hamstern und eine subkutane Transplantation etablierter JBL-Zellen des Menschen erhalten hatten, fütterte man auf übliche Weise 4 Wochen lang.
Etwa 30 g massiven Tumor pro Hamster, der sich subkutan gebildet hatte, isolierte man und trennte ihn wie im Herstellungsheispiel 1 auf. Die erhaltenen Zellen v.usch man mit RPMI-1640-Medium mit einem pH-Wert von 7,4, einer Temperatur von 37° C und einem Gehalt von 10 Vol% Kälberserum, susperdierte sie wieder und erhielt eine Konzentration von etwa 2 χ 107 Zellen/ml. Zu der erhaltenen Mischungslösung gab man 200 Einheiten/ml teilweise gereinigtes Interferon mit menschlicher Artspezifität und inkubierte die Mischung etwa 1 h. Dazu gab man eine Menge von etwa 100 Hämagglutinintiter je ml Sendai-Virus, inkubierte die erhaltene Mischung weitere 16 h lang und induzierte Interferon.
Danach reinigte man die erhaltene Lösung, engte sie wie im Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt eine !nterferonlösung mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität betrug etwa 15 000 000 Einheiten pro Hamster.
Herstellungsbeispiel 4:
Neugeborenen Ratten transplantierte man intravenös etabiierte Namaiva-Zeiien des Menschen ein und fütterte die Tiere auf übliche Weise 4 Wochen lang.
Etwa 50 g massiven Tumor pro Ratte, der sich subkutan gebildet hatte, isolierte man und trennte ihn wie im Herstellungsbeispiel 1 auf.
Danach behandelte man die erhaltenen Zellen wie im Herstellungsbeispiel 1 und induzierte Interferon. Die erhakene Interferonlösung reinigte man und lyophilisierte sie wie im Herstellungsbeispiel I zu einem lnterferonpuiver mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität betrug ca. 30 000 000 Einheiten pro Ratte.
Herst6l!ungsbeispiel 5:
Erwachsene Mäuse unterwarf man einer Bestrahlung mit Röntgenstrahlen bei etwa 4öö rem und schwächte ihr Immunreaktionen·, danach transplantierte man ihnen subkutan etablierte TALL-1-Zellen des Menschen ein und fütterte die Tiere auf übliche Weise 3 Wochen lang.
Etwa 10 g massiven Tumor, der sich subkutan pro Maus gebildet hatte, isolierte man und trennte ihn wie im Hersteilungsbeispiei 1 auf.
Die erhaltenen Zellen behandelte man wie im Herstellungsbeispiel 3 und induzierte Interferon. Die erhaltene Interferonlösung reinigte man und engte sie wie im Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt eine Interferonlösung mit hoher Aktivität Die Interferon-Aktivität betrug etwa 8 000 000 Einheiten pro Maus.
Herstellungsbeispiel 6:
Etablierte menschliche OUMS-25-ZelIen transplantierte man subkutan Hamstern wie im Herstellungsbei-
Spiel J !UP eincri ^.cilFaülll Vuu J nm.ucu cm uuvi ii CiIiO-
plantierte sie danach intraperitonal in 10 Tage alte nackte Mäuse. Die nackten Mäuse fütterte man auf übliche Weise 5 Wochen lang, betäubte sie und gewann die aszitische Flüssigkeit Die Flüssigkeit zentrifugierte man und gewann die vermehrten Zellen. Die Zellen wusch man und ließ darin Interferon induzieren wie im Herstellungsbeispiel 1. Die erhaltene Interferonlösung reingte man und engte sie wie im Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt eine Interferonlösung von hoher Aktivität Die Interferon-Aktivität betrug 2 000 000 Einheiten pro nackte Maus.
Herstellungsbeispiel 7:
sie zu einem Interferonpulver mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität betrug etwa 30 000 000 Einheiten pro Ratte.
Herstellungsbeispiel 8:
In die Allantoishöhlungen von befruchteten weißen Eiern, die man bei 37°C 5 d inkubiert hatte, transplantierte man NALL-1-Zellen des Menschen und inkubierte die Eier bei 37° Cl Wochenlang.
Die Eier öffnete man und sammelte die vermehrten Zellen. Die Zellen behandelte man wie im Herstellungsbeispiel 1 und induzierte Interferon. Die erhaltene Interferonlösung reinigte man, engte sie wie im Herstellungsbeispiel 2 ein und erhielt eine Interferonlösung mit hoher Aktivität. Die Interferon-Aktivität betrug etwa 400 000 Einheiten/10 befruchtete weiße Eier.
Herstellungsbeispiel 9:
20
30 Das Interferonpulver, das man wie im Herstellungsbeispiel 1 erhalten hatte, reinigte man weiter durch die Methoden, die von G. Bodo, (Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon, »11th International Immunobiological Symposium«, 8.+ 9. Juni 1977, Zagreb, Jugoslawien) beschrieben wurden, d. h. durch Adsorption und Desorption mit Ionen-Austauschern, Molekulargewichtsfraktionierung durch Gel-.-iltration, Einengen und sorgfältiges Filtrieren mit einem Membran-Filter. Die erhaltene Interferonlösung hatte eine Aktivität von 2XlO6 Einheiten/mg Protein. Die interferonaus'oeute betrug etwa 40%.
Das Interferon, das man gemäß den Hestellungsbeispielen 1 bis 9 hergestellt hatte, kann man vorteilhaft als solches oder in Mischungen mit einer oder mehreren Substanzen für Injektionen und Arzneimittet zur äußeren und innerer! Anwendung bei der Vorbeugung und Behandlung menschlicher Krankheiten verwenden, die auf Interferon ansprechen.
Test auf akute Toxizität
Den Test auf akute Toxizität führte man mit Mäusen mit einem Alter von 20 Tagen aus, indem man intraperitonal die Interferonlösung einspritzte, die man wie im Herstellungsbeispiel 9 erhalten hatte. Die Ergebnisse zeigten eine extrem geringe Toxizität:
LD50 > 20 000 000 Einheiten/kg bei intraperitonaler Injektion in Mäuse.
Etablierte JBL-Zellen des Menschen suspendierte man in einer Salzlösung in zylindrischen Diffusionskammern aus Kunststoff mit einem Volumen von 10 ml, die mit einer Membran mit Poren von etwa 04 μπι Durchmesser versehen waren. Die Kammern bettete man intraperitonal in erwachsene Ratten ein.
Die Ratten fütterte man auf übliche Weise 4 Wochen lang und entfernte die Kammern.
Die Konzentration der Zellen in den Kammern wurde festgestellt und betrug etwa 5 χ ΙΟ9 Zellen/ml; diese Menge war etwa 103mal höher als jene, die man in vitro in einem Nährmedium in einem CC>2-Inkubator erhalten hatte.
Die Zeilen behandelte man wie im Herstellungsbeispiel 1 und induzierte Interferon. Die erhaltene Interferonlösung reinigte man, engte sie ein und lyophilisierte

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Herstellen von Interferon, wobei etablierte menschliche Zellen in vivo oder in vitro der Wirkung eines Interferonauslösers ausgesetzt werden und Interferon nach Induktion gesammelt und gereinigt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die menschlichen Zellen erhalten werden durch
DE2902136A 1978-01-22 1979-01-19 Verfahren zum Herstellen von Interferon Expired DE2902136C2 (de)

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