DE4108464C1

DE4108464C1 - Nutrient medium for cell culture - contg. activated human blood plasma contg. increased amt. of albumin, reduced amt. of gamma globulin and cell growth inhibiting substances

Info

Publication number: DE4108464C1
Application number: DE19914108464
Authority: DE
Inventors: Leo Dr. Moskau/Moskva Su Igudin; Boris Dr. 1000 Berlin De Ostrovsky
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-03-13
Filing date: 1991-03-13
Publication date: 1992-06-04
Anticipated expiration: 2011-03-14

Abstract

Nutrient medium contains activated human blood plasma, pref. in amt. up to 10 vol.%. Pref. the blood plasma contains increased amt. of albumin and a reduced amt. of gamma globulin and substance inhibiting cell growth; the protein is pref. 50-70% albumin, 20-40% alpha and beta globulins and less than 10% gamma globulin. The nutrient pref. contains a hydrolysate of lactalbumin, RPM1-1640 or nutrient medium 199. The blood plasma is pref. activated by treatment with polyethylene glycol. USE/ADVANTAGE - For cell culture for diagnosis and prophylaxis of virus infections for virology and research. (Dwg.0/0)

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 7 angegebene Nährmedium für Zellkulturen und ein Verfahren zu dessen Herstellung nach den Ansprüchen 8 bis 15.The invention relates to the nutrient medium for cell cultures specified in claims 1 to 7 and a method for its production according to the Claims 8 to 15.

Für das Wachstum derartiger primärer oder mehrfach kultivierter Zellkulturen, die beispielsweise erforderlich sind zur Herstellung von Präparaten für die Diagnostik und Prophylaxe von Virusinfektionen, für die praktische Virologie und für wissenschaftliche Forschung, werden geeignete Nährmedien benötigt.For the growth of such primary or multiple cultured cell cultures, for example are required for the preparation of preparations for the diagnosis and prophylaxis of viral infections, for practical virology and suitable for scientific research Culture media needed.

Es ist bekannt, als einen wichtigen Bestandteil von Nährmedien, die für die Herstellung von Impfstoffen gegen Viruserkrankungen benötigt werden, ein aus dem Blut verschiedener Tiere erhaltenes Serum zu verwenden (US-PS 40 38 139; Adams, Cell Culture for Biochemists, 1980). It is known to be an important component of nutrient media used for the production of vaccines against viral diseases are needed one obtained from the blood of various animals Use serum (U.S. Patent 40 38 139; Adams, Cell Culture for Biochemists, 1980).

Die Verwendung eines derartigen Serums hat jedoch bedeutende Nachteile. Es besteht die Gefahr, daß ein heterologisches tierisches Eiweiß in das Präparat bzw. den Impfstoff gelangt und als Folge hiervon können die behandelten Menschen eine unerwünschte Reaktion, zum Beispiel eine allergische Reaktion nach der Impfung zeigen. Weiterhin kann Serum aus tierischem Blut oft eine Quelle für eine Kontamination der Zellkulturen und Präparate durch Mycoplasmen oder Viren sein.However, the use of such a serum has significant disadvantages. There is a risk that a heterological animal protein in that Preparation or vaccine arrives and as a result of these, the people treated can have one undesirable reaction, for example a show allergic reaction after vaccination. Furthermore, animal blood serum can often a source of contamination of cell cultures and mycoplasma or virus preparations.

Aus menschlichem Blut gewonnenes Serum steht dagegen nur im begrenzten Umfang zur Verfügung und seine hohen Kosten verhindern eine Verwendung in größerem Ausmaß.Serum obtained from human blood stands however only available to a limited extent and its high cost prevent use to a greater extent.

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Nährmedium für die Zellkulturen zu schaffen, bei dem einerseits die hieraus hergestellten Präparate nicht die Gefahr allergischer Reaktionen hervorrufen und auch keine Kontamination der Präparate befürchtet werden muß, und das andererseits relativ kostengünstig und in größerem Umfang zur Verfügung steht.It is therefore the object of the present invention to create a nutrient medium for the cell cultures on the one hand the preparations made from it do not create a risk of allergic reactions and also no contamination of the preparations must be feared, and on the other hand relatively available inexpensively and on a larger scale stands.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch das im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebene Merkmal. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Nährmediums und ein bevorzugtes Verfahren zu dessen Herstellung ergeben sich aus den Unteransprüchen. According to the invention, this object is achieved by that specified in the characterizing part of claim 1 Feature. Advantageous further training of the nutrient medium according to the invention and a preferred one Process for its production itself from the subclaims.

Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß das Nährmedium für das Zellwachstum aktiviertes menschliches Blutplasma enthält. Dieses ist vorzugsweise in einer Menge bis zu 10 Vol.-% im Nährmedium vorhanden.The invention is characterized in that Human growth medium activated for cell growth Contains blood plasma. This is preferably in an amount of up to 10% by volume is present in the nutrient medium.

Menschliches Blutplasma wird in erheblicher Menge zur Behandlung und Vorbeugung gegen Krankheiten verwendet sowie zur Plasmapherese, Plasmafiltrierung und so weiter eingesetzt. Das gebrauchte Blutplasma wird üblicherweise als Abfall entsorgt. Die Erfindung schafft nun eine Möglichkeit einer wirtschaftlichen Verwertung dieses Abfallplasmas.Human blood plasma is used in significant quantities Treatment and disease prevention used and for plasmapheresis, plasma filtration and so on further used. The used blood plasma will usually disposed of as waste. The invention now creates an opportunity of an economic Use of this waste plasma.

Blutplasma hat im Gegensatz zu Blutserum jedoch keine biologische Aktivität als Bestandteil eines Nährmediums und ist daher in der Biotechnologie und in der Virologie von Zellen nicht zu gebrauchen. Als Ursache für diese biologische Inaktivität werden nicht näher identifizierte Substanzen im Blutplasma angesehen, die eine das Zellwachstum behindernde Wirkung haben. Das Blutplasms ist daher für das Zellwachstum zu aktivieren, um als geeigneter Bestandteil eines Nährmediums für Zellkulturen zu dienen.In contrast to blood serum, blood plasma does not have any biological activity as part of a nutrient medium and is therefore in biotechnology and in Virology of cells useless. As the cause for this biological inactivity will not be closer viewed identified substances in the blood plasma, which have an effect on cell growth. The blood plasma must therefore be activated for cell growth, order as a suitable component of a nutrient medium to serve for cell cultures.

Das aktivierte Blutplasma hat vorzugsweise einen gegenüber normalem Blutplasma erhöhten Albumingehalt und einen verringerten Gehalt von γ-Globulin und das Zellwachstum behindernden Substanzen. Albumin wird als ein biologisch aktiver und das Zellwachstum fördernder Stoff angesehen, während γ-Globulin offensichtlich diese Eigenschaft nicht hat. The activated blood plasma preferably has one opposite normal blood plasma increased albumin and a reduced level of γ-globulin and that Substances that inhibit cell growth. Albumin will as a biologically active and promoting cell growth Substance viewed while γ-globulin is evident does not have this property.

Zur Aktivierung des Blutplasmas wird dieses vorteilhaft mit Polyethylenglykol behandelt, wobei eine zweifache derartige Behandlung besonders zweckmäßig ist. Polyethylenglykol hat die Eigenschaft, das Wasser im Blutplasma von den Eiweißstoffen zu trennen, wobei diese Trennung für die verschiedenen Eiweißstoffe offensichtlich unterschiedlich erfolgt. Zur Beschleunigung des Absetzens der Feststoffe wird die Mischung aus Blutplasma und Polyethylenglykol zentrifugiert.This is advantageous for activating the blood plasma treated with polyethylene glycol, whereby a double such treatment especially is appropriate. Polyethylene glycol has the property the water in the blood plasma from the protein substances to separate, this separation for the different proteins obviously different he follows. To accelerate the The solids settle out of the mixture Centrifuged blood plasma and polyethylene glycol.

Es werden im folgenden drei Beispiele für die Herstellung eines Nährmediums beschrieben.The following are three examples of the Preparation of a nutrient medium described.

example 1

Dieses betrifft die Kultivierung von Zellen (Fibroplast) von Kükenembryonen (FEK) in einem Nährmedium mit Hydrolisat von Lactalbumin und aktiviertem menschlichem Blutplasma. Zur Bildung des aktivierten Blutplasmas werden 1000 ml normalen Plasmas aus menschlichem Blut nach einer Plasmapherese und 90 bis 100 g Polyethylenglykol mit einer Molmasse von 4000 bis 6000 Dalton gemischt. Die hierbei erhaltene Suspension wird nach einer Standzeit von 20 bis 30 min für etwa 10 bis 15 min mit einer Geschwindigkeit von 1000 bis 2000 U/min zentrifugiert. Es werden dann 1000 ml der abgesonderten Flüssigkeit, d. h. ohne das hierbei abgesetzte Sediment, mit einem pH-Wert von 5,2 bis 5,6 mit weiteren 170 bis 180 g Polyethylenglykol mit einer Molmasse von 4000 bis 6000 Dalton zusammengefügt. Diese Flüssigkeit wird für 20 bis 30 min stehengelassen und dann ebenfalls etwa 10 bis 15 min mit einer Geschwindigkeit von 1000 bis 2000 U/min zentrifugiert. Die hierbei abgesonderte Flüssigkeit wird entfernt und das abgesetzte Sediment wird zur Bildung des aktivierten Blutplasmas in einer Natriumchloridlösung bei einem pH-Wert von 9,0 bis 11,0 gelöst, wobei die Konzentration des Porteins hierin etwa 50 bis 70 g/l beträgt.This concerns the cultivation of cells (Fibroplast) of chick embryos (FEK) in a nutrient medium with hydrolyzate of lactalbumin and activated human blood plasma. To Formation of the activated blood plasma 1000 ml of normal plasma from human blood a plasmapheresis and 90 to 100 g of polyethylene glycol with a molecular weight of 4000 to 6000 daltons mixed. The suspension obtained is after a standing time of 20 to 30 min for about 10 to 15 min at a rate of Centrifuged at 1000 to 2000 rpm. Then there will be 1000 ml of the secreted liquid, d. H. without the sediment deposited here, with a pH from 5.2 to 5.6 with a further 170 to 180 g Polyethylene glycol with a molecular weight of 4000 to 6000 daltons put together. This liquid will Let stand for 20 to 30 min and then likewise about 10 to 15 minutes at a rate centrifuged from 1000 to 2000 rpm. The any liquid that is separated off is removed and the sediment that is deposited becomes formation of the activated blood plasma in a sodium chloride solution at a pH of 9.0 to 11.0 solved, the concentration of the protein is about 50 to 70 g / l.

In einem flaschenförmigen Behälter befindlichem Hydrolisat von Lactalbumin wird das in vorstehender Weise gewonnene aktivierte Blutplasma mit einem Volumenanteil von 1% hinzugefügt. Die Suspension der zu kultivierenden Zellen wird durch Auflösung ihres Verbundes mittels Tripsin von 9 bis 10 Tage alten Kükenembryonen erhalten und in einer Konzentration von 200 bis 300×10³ Zellen/ml zugemischt. Die Kultivierung erfolgt in flachen Flaschen bei einer Temperatur von 37°C. Monoschichten von Zellen mit typischer Morphologhie bilden sich nach 2 bis 3 Tagen. Der Index der Proliferation, d. h. das Verhältnis der Menge der gewachsenen Zellen zur Menge der Keimzellen beträgt 1,1.In a bottle-shaped container The hydrolyzate of lactalbumin is shown in the above Activated blood plasma obtained with a Volume share of 1% added. The suspension of the cells to be cultured is by dissolution of their association with Tripsin from 9 to 10 days old chick embryos preserved and in one Concentration from 200 to 300 × 10³ cells / ml added. The cultivation takes place in flat Bottles at a temperature of 37 ° C. Monolayers of cells with typical morphology form after 2 to 3 days. The index of the Proliferation, d. H. the ratio of the amount of grown cells to the amount of germ cells is 1.1.

Example 2

Ein Nährmedium RPMl-1640 enthält 10 Vol.-% aktiviertes Plasma, das aus gesundem menschlichem Blut gewonnen wurde. Die Aktivierung des Plasmas erfolgt wie im Beispiel 1. Menschliche Lymphoblastzellen werden im Medium mit einer Konzentration bis zu 200 bis 300×10³ Zellen/ml suspendiert. Die in dieser Konzentration vorhandenen Keimzellen werden in sechs Durchgängen mit jeweils 3-4-Tage-Zyklen kultiviert. Nach Durchführung der sechs Durchgänge beträgt der Proliferationsindex am dritten Tag 2,4.A nutrient medium RPMl-1640 contains 10 vol .-% activated Plasma made from healthy human Blood was obtained. Activation of the plasma takes place as in example 1. Human lymphoblast cells are in the medium with a concentration suspended up to 200 to 300 × 10³ cells / ml. The germ cells present in this concentration are in six runs, each with 3-4 day cycles cultured. After completing the six Passes is the proliferation index on the third day 2.4.

Example 3

Ein Nährmedium 199 enthält 5 Vol.-% aktiviertes Plasma, das nach Plasmafiltration wie im Beispiel 1 erhalten wurde. Heteroploide Zellen L werden im Medium bis zu einer Konzentration von 100 bis 150×10³ Zellen/ml suspendiert. Die Keimzellen werden in fünf Durchgängen bei einer Temperatur von 37°C mit 3-4-Tage-Zyklen kultiviert. Monoschichten von Zellen mit typischer Morphologie bilden sich nach einer Kultivierungszeit von 3-4 Tagen; der Proliferationsindex der Zellen beträgt zur gleichen Zeit 4,5.A nutrient medium 199 contains 5% by volume of activated Plasma generated after plasma filtration as in Example 1 was obtained. Heteroploid cells L. in the medium up to a concentration of 100 to 150 × 10³ cells / ml suspended. The germ cells are in five passes at one temperature cultivated at 37 ° C with 3-4 day cycles. Monolayers of cells with typical morphology form after a cultivation period of 3-4 days; the proliferation index of the cells is 4.5 at the same time.

Die folgende Tabelle I zeigt einen Vergleich der Eiweißzusammensetzung im normalen Plasma, d. h. vor der Aktivierung und im in vorbeschriebener Weise aktivierten Plasma. Es zeigt sich ein deutlicher Anstieg des Albumingehalts und eine noch deutlichere Senkung des γ-Globulins. Ebenso ist davon auszugehen, daß auch die nicht näher identifizierten Substanzen, die das Zellwachstum behindern, bei der ersten Behandlung mit Polyethylenglykol weitgehend entfernt wurden.The following Table I shows a comparison the protein composition in normal plasma, d. H. before activation and in the above Way activated plasma. It shows up significant increase in albumine content and a even clearer lowering of the γ-globulin. It can also be assumed that neither identified substances that the Impede cell growth when first treated were largely removed with polyethylene glycol.

Die Tabelle II zeigt die Wirksamkeit des aktivierten menschlichen Blutplasmas beim Zellwachstum im Vergleich zu nicht aktiviertem Plasma sowie zu tierischen Blutseren. Von den zu kultivierenden Zellen bedeuten FEK Zellen von Kükenembryonen (Beispiel 1), L tierische Lungenzellen (Beispiel 3), VERO tierische Nierenzellen und Namalva menschliche Zellen. Während das nicht aktivierte menschliche Blutplasma keine Stimulationswirkung für das Zellwachstum besitzt, steht die des aktivierten Blutplasmas gegenüber der von tierischen Blutseren nicht zurück. Table II shows the effectiveness of the activated human blood plasma during cell growth in Comparison to non-activated plasma as well animal blood sera. Of those to be cultivated Cells mean FEK cells from chick embryos (Example 1), L animal lung cells (Example 3), VERO animal kidney cells and Namalva human cells. While not activated human blood plasma has no stimulating effect for cell growth, is compared to that of the activated blood plasma that of animal blood sera does not return.

Tabelle I Table I

Tabelle II Table II

Claims

1. nutrient medium for cell cultures, characterized in that it contains activated human blood plasma for cell growth.

2. nutrient medium according to claim 1, characterized in that it activated human Blood plasma in an amount up to 10 vol .-% contains.

3. Nutrient medium according to claim 1 or 2, characterized characterized that the activated blood plasma one increased compared to normal blood plasma Albumine content and a reduced content of γ-globulin and cell growth Has substances.

4. nutrient medium according to claim 3, characterized in that the activated blood plasma has the following protein composition: 50-70% albumin, 20-40% α- and β-globulin and less than 10% γ-globulin.

5. nutrient medium according to one of claims 1 to 4, characterized in that it hydrolyzate of lactalbumin contains.

6. nutrient medium according to one of claims 1 to 4, characterized in that it contains RPMI-1640.

7. nutrient medium according to one of claims 1 to 4, characterized in that it is a nutrient medium 199 contains.

8. Process for the preparation of a nutrient medium according to one of claims 1 to 7, characterized characterized in that the blood plasma through Treatment with polyethylene glycol activated becomes.

9. The method according to claim 8, characterized in that the blood plasma and the polyethylene glycol mixed and the settling Sediment are removed.

10. The method according to claim 9, characterized in that sediment settling is accelerated by centrifugation.

11. The method according to any one of claims 8 or 9, characterized in that the sediment freed liquid part of the blood plasma one second treatment with polyethylene glycol is subjected.

12. The method according to claim 11, characterized in that the one freed from the sediment liquid part of the blood plasma and the polyethylene glycol mixed and that from it sediment as activated blood plasma is used.

13. The method according to claim 12, characterized in that that sediment settling through Centrifugation is accelerated.

14. The method according to any one of claims 8 to 13, characterized in that polyethylene glycol with a molecular weight of 4000 to 6000 daltons is used.

15. The method according to any one of claims 8 to 14, characterized in that already for Plasmapheresis or Plasma filtration used human Blood plasma is used.