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Orgotein ist der offizielle Name, den das United States Adopted Name Council Mitgliedern einer Familie von artgleichen wasserlöslichen Proteinen. in weitgehend reiner, injizierbarer Form, d. h. im wesentlichen frei von andern Proteinen, die mit ihnen in den Quellen vermischt oder verbunden sind, verliehen hat. In der US-PS Nr. 3, 758, 682 sind Orgotein enthaltende, pharmazeutische Präparate beschrieben.
Diese Proteine besitzen eine charakteristische Kombination von physikalischen, chemischen, biologischen und pharmakodynamischen Eigenschaften, und kompakte globulare Konfiguration sind in wässeriger Pufferlösung und Wasser löslich und hitzeempfindlich, aber gegen
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pH-Wertenthält höchstens zwei der Proteinaminosäuren nicht, eine geringe Menge an Kohlehydraten, keine Lipide, 0, 1 bis 1, 0% Metalle, u. zw. 1 bis 5 g-At je Mol eines oder mehrerer chelatgebundener, 2wertiger Metalle mit einem Ionenradius von 0,06 bis 0, 1 nm und im wesentlichen keine lwertigen Metalle oder Zellgifte darstellende Metalle.
Das Aminosäureprofil der Orgotein-Artgenossen ist, unabhängig von der Quelle, aus der sie isoliert wurden, bemerkenswert gleichbleibend. Tabelle I zeigt für ein Molekulargewicht von 32500 dieses Aminosäureprofil mehrerer Artgenossen des Orgoteins.
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Tabelle I Aminosäuren-Zusammensetzung verschiedener Orgotein-Artgenossen (Reste pro Mol ; MG = 32500)
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<tb>
<tb> Aminosäuren <SEP> Leber, <SEP> Rote <SEP> Blutzellen
<tb> Rind <SEP> Rind <SEP> Schaf <SEP> Pferd <SEP> Schwein <SEP> Hund <SEP> Kaninchen <SEP> Ratte <SEP> Meerschweinchen <SEP> Huhn <SEP> Mensch <SEP> Bereich
<tb> Alanin <SEP> 19 <SEP> 19 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 16 <SEP> 19 <SEP> 22 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 22 <SEP> 16-23
<tb> Arginin <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 6-10
<tb> Asparagin- <SEP> 37 <SEP> 36 <SEP> 35 <SEP> 35 <SEP> 31 <SEP> 29 <SEP> 34 <SEP> 30 <SEP> 34 <SEP> 36 <SEP> 37 <SEP> 29-37
<tb> säure
<tb> Cystin-1/2 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 4-10
<tb> Glutaminsäure <SEP> 21 <SEP> 23 <SEP> 22 <SEP> 30 <SEP> 28
<SEP> 30 <SEP> 25 <SEP> 38 <SEP> 29 <SEP> 26 <SEP> 28 <SEP> 21-38
<tb> Glycin <SEP> 53 <SEP> 52 <SEP> 52 <SEP> 51 <SEP> 52 <SEP> 53 <SEP> 54 <SEP> 54 <SEP> 53 <SEP> 56 <SEP> 51 <SEP> 51-56
<tb> Histidin <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 14 <SEP> 20 <SEP> 16 <SEP> 15 <SEP> 17 <SEP> 20 <SEP> 15 <SEP> 17 <SEP> 14 <SEP> 14-20
<tb> Isoleucin <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 14 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> 15 <SEP> 17 <SEP> 14-18
<tb> Leucin <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 19 <SEP> 12 <SEP> 17 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 12-20
<tb> Lysin <SEP> 22 <SEP> 21 <SEP> 23 <SEP> 26 <SEP> 23 <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 18 <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 23 <SEP> 18-26
<tb> Methionin <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 6 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 1-6
<tb> Phenylalanin <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP>
8 <SEP> 8 <SEP> 6-9
<tb> Prolin <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 15 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 12 <SEP> 10-15
<tb>
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Tabelle I (Fortsetzung) :
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<tb>
<tb> Aminosäuren <SEP> Leber, <SEP> Rote <SEP> Blutzellen
<tb> Rind <SEP> Rind <SEP> Schaf <SEP> Pferd <SEP> Schwein <SEP> Hund <SEP> Kaninchen <SEP> Ratte <SEP> Meerschweinchen <SEP> Huhn <SEP> Mensch <SEP> Bereich
<tb> Serin <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 14 <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 20 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 15 <SEP> 19 <SEP> 13-20
<tb> Threonin <SEP> 26 <SEP> 25 <SEP> 20 <SEP> 16 <SEP> 27 <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 16-27
<tb> Tryptophan <SEP> 1 <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 0-2
<tb> Tyrosin2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> Nil <SEP> 4 <SEP> 2
<SEP> Nil <SEP> 2 <SEP> Nil <SEP> 2 <SEP> Nil <SEP> 0-4
<tb> Valin <SEP> 33 <SEP> 32 <SEP> 31 <SEP> 29 <SEP> 29 <SEP> 34 <SEP> 31 <SEP> 35 <SEP> 32 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 29-35
<tb> Gesamtzahl <SEP> 317 <SEP> 315 <SEP> 306 <SEP> 304 <SEP> 307 <SEP> 311 <SEP> 315 <SEP> 315 <SEP> 309 <SEP> 317 <SEP> 318 <SEP> 304-318
<tb>
1 Colorimetrische Bestimmung 2Mittelwert aus Aminosäureanalyse und spektrophotometrischer
Bestimmung
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Wie Tabelle I zeigt, besitzen Orgotein-Artgenossen 18 bis 26 und gewöhnlich 20 bis 23 Lysinreste, von denen alle bis auf 1 bis 3 mit Trinitrobenzolsulfonsäure titrierbare e-Aminogruppen aufweisen. Aus Tabelle I ist ebenso ersichtlich, dass Orgotein-Artgenossen 29 bis 37 Asparaginsäurereste und 21 bis 38 Glutaminsäurereste besitzen.
Orgotein besitzt unter anderem entzündungshemmende Wirkung (vgl. US-PS Nr. 3, 758, 682) und eine ungewöhnlich hohe Superoxyddismutasewirkung [vgl. Mc. Cord u. Fridovich, J. Biol. Chem., Bd. 244, 6. S. 176, (1970) ; ibid, Bd. 246, 2, S. 875 (1971)]. Es wurde nun gefunden, dass die Lagerbeständigkeit des Orgoteins unter weitgehender Beibehaltung seiner entzündungshemmenden Wirkung und eines wesentlichen Teils seiner Superoxyddismutasewirkung durch Carbamoylieren erhöht werden kann.
Dementsprechend bezieht sich die Erfindung auf. ein Verfahren zum Herstellen von injizierbaren Orgoteinderivaten mit entzündungshemmender Wirkung und dieses Verfahren ist gemäss der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass man Orgotein mit zumindest einem Carbamoylierungsmittel zum entsprechenden N-carbamoylierten Orgotein umsetzt und gewünschtenfalls das so hergestellte N-carbamoylierte Orgotein mit Orgotein oder mit einem andern N-carbamoylierten Orgotein hybridisiert.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens wird vorzugsweise Rinderorgotein eingesetzt, obzwar aus Organen oder dem Blut von Menschen, Schafen, Pferden, Schweirien, Hunden, Kaninchen, Meerschweinchen und Hühnern gewonnenes Orgotein oder ein Orgotein andern Ursprungs eingesetzt werden kann.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Orgotein mit dem Carbamoylierungsmittel so lange umgesetzt, bis mindestens 2, vorzugsweise 6 bis 10 c-Aminogruppen im Orgotein carbamoyliert sind. Hiebei wird als Carbamoylierungsmittel zweckmässig ein Alkalimetallcyanat, Alkylisöcyanat, Alkylisothiocyanat, Arylisocyanat oder Arylisothiocyanat eingesetzt. Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens als Carbamoylierungsmittel eingesetzte Alkylisocyanate bzw. Alkylisothiocyanat enthalten vorzugsweise 1 bis 12, insbesondere 1 bis 8 Kohlenstoffatome im Alkylrest.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens werden vor allem die e-Aminogruppen der Lysinreste des Orgoteins carbamoyliert. Die Carbamoylierung des Orgoteins hat keinen Einfluss auf die dichte räumliche Konfiguration des Orgoteinmoleküls und führt zu einem sehr stabilen Orgotein-
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kann direkt durch einen Wechsel der elektrophoretischen Gesamtladung und im Auftauchen neuer Banden bei der Elektrophorese verfolgt werden.
Der im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens erzielte Carbamoylierungsgrad kann durch Vergleich der Wanderungsgeschwindigkeit eines nicht carbamoylierten Orgoteins mit der Wanderunggeschwindigkeit eines carbamoylierten Orgoteins bei der Elektrophorese verwendet werden.
Da das Orgoteinmolekül aus zwei identischen Peptidketten (Untereinheiten) aufgebaut ist, die unter mässigen Temperaturbedingungen und bei mässigen pH-Werten fest aber nicht kovalent miteinander verbunden sind, liegt die Hälfte der im Orgoteinmolekül enthaltenen 18 bis 26 Lysinreste in jeder dieser Untereinheiten vor, wobei selbst mit Trinitrobenzolsulfosäure (TNBS) nicht titrierbare e-Aminogruppen mit starken Carbamoylierungsmitteln alkyliert werden können.
Beim Carbamoylieren von Aminogruppen des Orgoteins tritt nun eine Änderung der Ladung des Orgoteinmoleküls auf, die bei der Elektrophorese bei gegebener Feldstärke und bei gegebener Zusammensetzung der Lösung des Orgoteins eine andere Wanderungsgeschwindigkeit des carbamoylierten Orgoteins ergibt als sie das nicht carbamoylierte Orgotein besitzt [vgl. C. Tanford"Physical Chemistry of Macromolecules", Wiley, New York (1966) ].
Das native, also nicht carbamoylierte Orgotein zeigt bei der Elektrophorese eine Hauptbande (Bande 1) und weniger ausgeprägte Banden (Banden +2, +3, usw. ), die auf schneller in Richtung zur Anode wandernde Orgoteinmoleküle zurückzuführen sind, in welchen das Verhältnis von - COOH-Gruppen zu-NH :-Gruppen grösser ist als im die Hauptbande (Bande 1) bildenden Orgoteinmolekül.
Wenn nun im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens das Orgotein an-NH :-Gruppen alky- liert wird und damit die freien -COOH-Gruppen des Orgoteinmoleküls einen immer stärkeren Bei-
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trag zur Wanderungsgeschwindigkeit des Orgoteins bei der Elektrophorese liefern, treten statt der Bande 1 die nahezu mit gleichem Abstand voneinander getrennten und stärker zur Anode hin verschobenen Banden (+2, +3, usw.) als Hauptbanden auf, je nachdem ob es sich bei den in die jeweilige Bande eingehenden Orgoteinmolekülen um solche handelt, in denen, in der angegebenen Reihenfolge, 1, 2, usw. Aminogruppen carbamoyliert sind.
Um den Alkylierungsgrad durch Elektrophorese genau zu bestimmen, ist es erforderlich, ein Elektrophorogramm einer ein Orgotein unbekannten Carbamoylierungsgrades n enthaltenden Probe mit einem unter identischen Bedingungen erhaltenem Elektrophorogramm einer Orgotein und Orgoteine mit dem Alkylierungsgrad 1 bis mindestens n enthaltenden Probe zu vergleichen, da aus dem Abstand zweier benachbarter Banden, beispielsweise dem Abstand der Bande 2 von der Bande 1, nicht verlässlich genug auf die Nummer weiter entfernt liegender Banden geschlossen werden kann.
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Rind, Schaf, Pferd, Schwein, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Huhn und Mensch wobei mindestens eine, beispielsweise 1, 2,3, 4,5 bis sämtliche (etwa 18 bis 26) der titrierbaren Aminogruppen carbamoyliert sind, d.
h. eine gegebenenfalls substituierte-CONH-oder-CSNH-Gruppe enthalten.
Die carbamoylierten Aminogruppen besitzen folgende Formel
EMI5.2
in der X Sauerstoff oder Schwefel bedeutet und R die Reste CH 3, C H s, n-C 3 H,, iso-C 3 H,, n-C 8 H 17 oder weitere Alkylgruppen bis zu 12 Kohlenstoffatomen, einen gegebenenfalls mit 1 bis 3 einfachen Substituenten substituierten Phenylrest oder, wenn X Sauerstoff bedeutet, auch Wasserstoff darstellt, wobei als Substituenten des Phenylrests beispielsweise Chlor oder Brom, die Methyl-, die Nitro-, eine Amid-, die Methoxy-, die Carbomethoxy- oder die Carbäthoxy-Gruppe in Frage kommen, wie dies beispielsweise für die p-Tolyl-, sym.-Xylyl-, p-Amidophenyl-, m-Chlorphenyl- und die p-Methoxyphenylgruppe gilt.
Derartige Orgoteine besitzen die Formel
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10, bedeutet und die Summe von m und n die Gesamtzahl der titrierbaren freien Aminogruppen in dem nicht modifizierten Orgotein ist, X Sauerstoff oder Schwefel bedeutet, R die vorstehend angegebene Bedeutung hat, vorzugsweise das Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet, und"Perdesarnino-Org"der Rest des Orgotein-Moleküls ist.
Besonders bevorzugte carbamoylierte Orgoteine sind Alkylcarbamoyl- und AlkylthiocarbamoylOrgoteine, in denen die Alkylgruppe eine nicht substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, beispielsweise die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-und/oder die Octylgruppe, ist.
Da die genaue chemische Natur der Carbamoylgruppe, soweit sie im Orgotein-Molekül nicht physiologisch toxisch ist und an den Lysin-c-Aminogruppen gebildet werden kann, nicht kritisch ist, kommen als in Betracht zu ziehende Äquivalente der bevorzugten, vorstehend beschriebenen Alkylcarbamoyl-Orgoteine, die ebenfalls der vorstehenden Formel entsprechenden Orgoteine in Frage, in denen R die Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Menthyl-u. ähnl. Cycloalkylgruppen, die Cyclohexylmethyl-, ss-Cyclopentylpropyl-u. ähnl. Cyoloalkylalkylgruppen, die Benzyl-, p-Xylyl-und Phenäthyl- u, ähnl. Aralkylgruppen bedeutet.
Ebenso in Betracht zu ziehende Äquivalente sind diejenigen, in denen R eine Alkylgruppe von 1 bis 8, vorzugsweise 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere die Methyl- oder Äthylgruppe bedeutet, die einen oder mehrere, vorzugsweise einen, weiteren Substituenten, beispielsweise die Fluoresceinylgruppe, besitzen.
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Zusätzlich zu dem N-carbamoylierten IIRinder"-Orgotein der nachstehend angeführten Beispiele gehören zu weiteren Beispielen der erfindungsgemässen N-CarbamoyI7Rinder-Orgoteine das entsprechende N-Carbamoyl-Qrgotein, N-Propyl-Carbamoyl-Orgotein, N-Äthylcarbamoyl-Orgotein und das N-Me- thylthiocarbamoyl-Orgotein, in denen in jedem Fall 9 derartige Carbamoylgruppen in jeder der zwei Untereinheiten des Orgotein-Moleküls vorliegen, bzw. die entsprechenden Orgoteine, wobei ein Mittelwert von 1, 6 oder 10 derartiger Carbamoylgruppen in jeder derartigen Untereinheit vorliegt, sowie jeweils von ihnen die entsprechenden Artgenossen von Mensch, Schaf, Pferd, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen, Huhn und Ratte.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens ist es nicht erforderlich, Orgotein unter Verwendung eines einzigen Carbamoylierungsmittels an-NH-Gruppen zu carbamoylieren, vielmehr besteht die Möglichkeit, Orgotein stufenweise mit unterschiedlichen Carbamoylierungsmitteln umzusetzen, um ein gemischt carbamoyliertes Orgotein zu erhalten.
Beispielsweise kann ein Teil der mit TBNS titrierbaren e-Aminogruppen der Lysinreste mit einem in mässiger Konzentration vorliegenden Carbamoylierungsrnittel und der Rest der umsetzbaren Aminogruppen mit einem in hoher Konzentration vorliegenden weiteren Carbamoylierungsmittel carbamoyliert werden.
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der bereits erwähnten Hybridisierung eines carbar. loylierten Orgoteins mit einem andersartig carbamoylierten Orgotein, die beispielsweise dadurch bewerkstelligt werden kann, dass eine Lösung der beiden verschieden carbamoylierten Orgoteine etwa 4 h auf 50.
C erwärmt wird, wobei diese beiden verschieden carbamoylierten Orgoteine nach dem Reaktionsschema
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in welchem A eine Untereinheit eines der beiden carbamoylierten Orgoteine und B eine Untereinheit des andern der beiden carbamoylierten Orgoteine darstellt, in eine Gleichgewichtsreaktion eintreten.
Die in erfindungsgemässer Weise carbamoylierten Orgoteine besitzen im wesentlichen die gleiche Konfiguration wie das eingesetzte Orgotein und enthalten im wesentlichen die gleiche Menge an chelatgebundenen Cu und Zn wie das eingesetzte Orgotein.
Die erfindungsgemäss hergestellten Orgoteinderivate können aus dem Reaktionsgemisch, vorzugsweise nach einer Dialyse zum Entfernen von Frerndionen, durch herkömmliches Gefriertrocknen, beispielsweise gemäss der US-PS Nr. 3,658, 682, isoliert werden. Gegebenenfalls kann das erhaltene Orgoteinderivat durch Ionenaustauschharzchrornatographie, Elektrophorese und/oder Gelfiltration unter Verwendung eines als Molekularsieb wirkenden Polymeren gereinigt werden.
Filtrieren einer Lösung des Orgoteinderivats durch ein Mikroporenfilter der Porengrösse 0, 01 bis 0,22 pm in aseptischer Weise in sterile Fläschchen, gegebenenfalls nach Einstellung der Ionenstärke mit NaCl und/oder Natriumphosphat auf beispielsweise isotonischen Zustand, liefert eine bakteriell und viral oder bakteriell sterile Lösung, die für Injektionen geeignet ist. Die Filtration durch ein Porenfilter mit 0, 1 pm grossen Poren vermindert oder beseitigt auch pyrogene Stoffe in der Lösung.
Die erfindungsgemäss hergestellten Orgoteinderivate sind ebenso wie Orgotein ein wirksames Mittel zur Behandlung einer Vielzahl von Entzündungszuständen einschliesslich solcher, bei denen synthetische entzündungshemmende Produkte, beispielsweise wegen toxischer Nebeneffekte bei längerem Gebrauch, nur beschränkt verwendet werden können. Insbesondere heilen diese Orgoteinderivate Entzündungen und schwächen deren Folgen, beispielsweise irn Harntrakt und in den Gelenken von verschiedenen Säugetieren. Sie mildern die Symptome, die bei rheumatoiden Erkrankungen, Osteoarthritis und posttraumatischer Arthritis sowie bei Bursitis, Tendonitis usw., auftreten.
Erfindungsgemäss herstellbare Orgoteinderivate werden gewöhnlich durch Einträufeln oder Injektionen, z. B. intramuskulär, subkutan, intravenös oder intradermal, verabreicht, wobei der intramuskuläre Weg ausser in Fällen von Schock, in welchen manchmal die intravenöse Verabreichung eine schnellere Wirkung erbringt, und bei bestimmten lokalen Schäden, wie Strahlungsschäden und Zystitis, bei welchen eine lokale Injektion, Infusion und/oder Einträufelung häufig wirksamer ist, bevorzugt ist. Die individuelle Dosis liegt gewöhnlich zwischen 0,5 bis 20 mg und die bevorzugte
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Dosis für den Menschen beträgt etwa 0, 5 bis 8 mg, für das Pferd 5, 0 bis 10, 0 mg. Die exakte Dosis richtet sich nach Art und Schwere der Krankheit.
Verfahren zur Gewinnung der als Ausgangsmaterial erwendeten Orgoteine und Angaben über die Verwendungsmöglichkeit der erfindungsgemäss hergestellten Orgoteinderiate einschliesslich Vorschlägen über die Verabreichung, Dosierungsformen, Dosierungseinheit und Entzündungszustände und weitere Zustände, die für die Behandlung mit dem veresterten Orgotein empfänglich sind, finden sich in der US-PS Nr. 3,758, 682.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 : Nicht substituiertes carbamoyliertes Orgotein
Eine Lösung von 3, 7 mg Rinderorgotein und 14 mg KNCO in 2 ml 0, 025 m Natriumphosphat-Puffer vom pH-Wert 7,5 wird bei 40C inkubiert. Die Elektrophorese gleicher Probenteile über 54 Tage zeigte das Auftauchen einer Reihe von SOD-aktien Banden, die stärker anodisch als das native Orgoteine sind. Die mittlere Ladungsveränderung entlang des Bereiches der aktiven Banden auf jeder Seite des Mittelwertes für die Proben ist nachstehend angegeben.
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<tb>
<tb>
Zeit <SEP> (d) <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP> 27 <SEP> 54
<tb> umgesetzt <SEP> Lasingruppen <SEP> : <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
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die mittlere Ladungsveränderung in der Elektrophorese, wie nachstehend gezeigt, bestimmt.
Mittlere Ladungsveränderung
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<tb>
<tb> +2 <SEP> ut <SEP>
<tb> Reagenz <SEP> 2 <SEP> min <SEP> 2 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> Tag <SEP> 2 <SEP> Tage <SEP> Isocyanat
<tb> Propylisocyanat/
<tb> Trispuffer <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 10
<tb> Propylisocyanat/
<tb> Phosphatpuffer <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> keine <SEP> zusätzliche <SEP> > 15
<tb> Veränderung
<tb> Octylisocyanat/
<tb> Trispuffer <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 1. <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 6
<tb> Octylisocyanat/
<tb> Phosphatpuffer <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP>
<tb>
Beispiel 3 : Alkyl-carbamoyliertes Orgotein Das Verfahren gemäss Beispiel 2 wird unter Verwendung von 10 mg Orgotein in 1 ml
0, 1 m Phosphatpuffer von PH = 7, 6 und 1 ml Propyl- oder Octylisocyanat wiederholt. Die Lösungen werden 4 h bei 250C gehalten und anschliessend elektrophoretisch geprüft.
Danach wird jeweils zusätzlich 1 ml Isocyanat zugesetzt. ; fach der Inkubation bei 40C über Nacht werden die Lösun- gen wieder elektrophoretisch geprüft und dialysiert. Die carbampylierten Proteine sind in ent- salztem Vlasser weniger löslich und fallen bei der Dialyse teilweise aus. Sie sind jedoch in
0, 15 m Kochsalzlösung löslich. Die Zahl der carbamoylierten Lysingruppen ist nachstehend ange- geben.
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<tb>
<tb>
GAPM
<tb> Isocyanat <SEP> umgesetzte <SEP> Lysingr, <SEP> Metallgeh. <SEP> % <SEP> der <SEP> ursprüngl.
<tb>
4 <SEP> h <SEP> U. <SEP> Nacht <SEP> Cu++ <SEP> Zn++ <SEP> SOD-Aktivität
<tb> Propyl <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 4 <SEP> > 15 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> etwa <SEP> 50%
<tb> Octyl <SEP> 3¯3 <SEP> 6¯5 <SEP> 2,1 <SEP> 1,8 <SEP> etwa <SEP> 25%
<tb>
Beispiel 4 : N-Methyl-thiocarbamoyl-Orgotein
Eine Lösung von 5 mg Orgotein in 4 ml 0,075 Na2 B4 O7 vom PH-Wert 9 wird mit 10 pl CH, NCS versetzt, und das Gemisch wird 1 min bis zum Lösen des CHNCS geschüttelt. In bestimmten Zeitabständen werden 50 pl-Proben entnommen, und mit 0,4 ml 0, 1 m Natriumacetat-Puffer vom
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seinen Verbrennungsgeruch und seine Löslichkeit in es 2) tritt zwischen 6 und 22 h auf.
Nach 22 h bei Raumtemperatur wird das restliche Reaktionsgemisch mit 0,5 ml 1 m Acetatpuffer vom PH-Wert 5, 3 abgeschreckt und unter häufigem Wechseln von Nasser 2 Tage dialysiert. Die dialysierte Lösung wird kurz zur Entfernung der weissen wolkigen Trübung in der Lösung zentrifugiert.
Die Elektrophorese von aus der Lösung entnommenen Proben zeigt die Herstellung einer Reihe von anwachsend anodisch stärkeren SOD-aktiven Banden. Die Analyse der Proben nach dem Cytochrom C-Test bei einem PH-Wert von 7, 8 vgl. tAlcCord u. Fridovich, J. Biol. Chem. S. 6049-6055 (1969) zeigt einen Abfall der SOD-Aktivität bei etwas mehr umfassender Modifizierung.
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<tb>
<tb>
Zeit <SEP> (h) <SEP> Mittlere <SEP> Ladungsveränderung <SEP> SOD-Aktivität
<tb> 0 <SEP> (0) <SEP> (100%)
<tb> 0, <SEP> 08 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 111
<tb> 0, <SEP> 25 <SEP> 1 <SEP> 118
<tb> 0, <SEP> 75 <SEP> 2 <SEP> 91
<tb> 1, <SEP> 9 <SEP> 4 <SEP> 86
<tb> 6 <SEP> 9, <SEP> 5 <SEP> 43
<tb> 22 <SEP> 16 <SEP> 20
<tb>
Das 22 h dialysierte Reaktionsprodukt tritt bei der Elektrophorese als eine sich schnell bewegende anodische Bande auf, enthält 18% der SOD-Aktivität des nativen Orgotein-Proteins und pro Mol 2, 06 g-At Zn ++ und 1, 76 g At Cu (verglichen mit 2, 26 g-At Zn ++ und 2, 08 g At Cu++ im nicht modifizierten Orgotein). Sämtliche Produkte sind löslich, enthalten chelatgebundenes Cu ++ und Zn ++ und besitzen mindestens einen Teil der Superoxyddismutasewirkung des nicht modi- fizierten Proteins.
Beispiel 5 : N-Fluoresceinylthiocarbamoyl-Orgotein
Eine Lösung von 100 mg Orgotein (Rinder-Artgenosse) und 6 mg Fluoresceinisothiocyanat in 10 ml 0, 14 m-Phosphatpuffer vom PH-Wert 8, 5 wird 18 h bei 4 C gehalten. Das Reaktionsgemisch wird auf eine chromatographische Säule von mikroporösem vernetztem Dextran (Sephadex G-50, Pharmacia, Upsala, Schweden) gegeben und mit 0, 15 m-Kochsalzlösung, die mit Boratpuffer vom pH-Wert 8 gepuffert ist, eluiert. Die eluierten gelben Proteinfraktionen werden gegen Wasser dialysiert. Das ausgefällte dialysierte Protein (20 mg) ist intensiv gelb, fluoresziert und ist in Kochsalzlösung, die mit Boratpuffer vom PH-Wert 8 gepuffert ist, leicht löslich.
Die Elektrophorese zeigt, dass 96 mg lösliches Protein etwa zur Hälfte monocarbamoyliertes Orgotein Ladungsveränderung-3) in Verbindung mit etwas zweifach und dreifach carbamoyliertem Orgotein (Ladungsver- änderung-6 und-9) sowie nicht umgesetztes Orgotein sind. Der wieder gelöste Niederschlag scheint umfassender modifiziertes Protein zu sein, da die Elektrophorese einen schnellen anodischen Fleck zeigt.
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Das lösliche Protein wird auf einer schwachbasischen Ionenaustauschsäule (DEAE-Cellulose) bei einem PH-Wert von 6 mit einem linearen 0, 01 bis 0, 2 m Phosphatpuffergradienten chromatographiert. Die monocarbamoylierten und die dicarbamoyiierten Orgoteine werden isoliert, dialysiert und lyophilisiert.
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SOD-aktiv. Nach dem Cytochrom C-Rest beim PH-Wert von 7,5 besitzt es 48% der SOD-Aktivität des nativen Orgoteins. Im Ungar-Biotest zeigt das Protein etwa 50% der Aktivität des nativen Orgoteins.
Eine Lösung des monocarbamoylierten Orgoteins, das 2 Wochen bei 4 C aufbewahrt wurde, verändert sich zu einem Gemisch vvon Orgotein, monocarbamoyliertem Orgotein und dicarbamoyliertem Orgotein (offensichtlich das Ergebnis der Hybridisierung) und etwas fluoreszierender nicht proteinartiger Verbindung (offensichtlich das Ergebnis der Hydrolyse der Thioharnstoffgruppe des carbamoylierten Orgoteins unter Bildung von freiem Aminofluorescein).
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zum Herstellen von injizierbaren Orgoteinderivaten, dadurch gekennzeichnet, dass man Orgotein mit zumindest einem Carbamoylierungsmittel zum entsprechenden N-carbamoylierten Orgotein umsetzt und gewünschtenfalls das so hergestellte N-carbamoylierte Orgotein mit Orgotein oder einem andern N-carbamoylierten Orgotein hybridisiert.