CH633020A5 - Verfahren zum gewinnen gereinigten albumins aus blutplasma. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen gereinigten Albumins durch fraktioniertes Ausfällen aus Blutplasma.

Albumin ist früher durch fraktioniertes Ausfällen mit Alkoholen wie z.B. Äthanol bei niedrigen Temperaturen sowie durch Ausfällen in Salzlösungen, beispielsweise durch stufenweise Zugabe von Ammoniumsulfat, von Blutplasma isoliert worden. Diese bekannten Methoden haben verschiedene Nachteile. Somit werden Fällungen mit Äthanol zum Denaturieren des Proteins neigen, wodurch die Ausbeute herabgesetzt wird, und Salzfällungen ergeben unreine Produkte, weil keine scharfe Trennung erreicht wird.

Aus der US-Patentschrift Nr. 3415 804 ist ein Verfahren zum fraktionierten Ausfällen von Proteinstoffmischungen in Gegenwart von Polyäthylenglykol (PEG) bekannt, indem Polyäthylenglykol die Dispergierbarkeit der Proteinstoffe hemmt. Zum Fraktionieren humanen Blutplasmas benutzt hat man durch dieses Verfahren mehrere Fraktionen, dabei eine Albuminfraktion, erhalten, die aber mit Beta-Globulin und anderen Proteinstoffen verunreinigt waren. Durch diese bekannte Methode hat man somit kein befriedigend gereinigtes Albumin für therapeutische Verwendung erzielen können.

Aus der AT-PS 338 977 oder der dänischen Patentanmeldung Nr. 1252/75 ist es bekannt, durch Erwärmung der albuminhaltigen Flüssigkeit in Gegenwart eines Alkohols und albuminstabilisierender Substanzen Albumin von Blut und ähnlichen Produkten zu isolieren. Als Beispiele für stabilisierende Substanzen zu diesem Zweck seien u.a. Caprionate erwähnt. Dadurch hat man aber die Neigung des Äthanols oder ähnlicher Alkohole zum Denaturieren von Proteinen nicht ganz vermeiden können.

Weiterhin ist es aus der FR-PS 2190 437 oder der dänischen Auslegeschrift Nr. 134425 bekannt, Albumin dadurch herzustellen, dass eine Albuminlösung wie z.B. Plazenta oder humanes Blutplasma einem Thermokoaguliervorgang in Gegenwart von Caprylsäureionen bei Temperaturen zwischen 52 und 64°C und einem pH-Wert zwischen 4,8 und 5,25 unterzogen wird. Bei der Thermokoagulation. werden Hämoglobin, denaturiertes Albumin und fremde Proteine ausgefällt. Das gereinigte Albumin bleibt in Lösung, woraus es sich gewinnen lässt.

Durch diesen bekannten Vorgang wird jedoch ein recht unreines Produkt erhalten. Die Reinheit lässt sich dadurch verbessern, vor der Thermokoagulation ein fraktioniertes Ausfällen, beispielsweise mit Trichloressigsäure und Äthanol vorzunehmen; ein für therapeutische Zwecke geeignetes reines Produkt ist aber doch in dieser Weise nicht erhältlich.

Eine Thermokoagulation ist auch aus der britischen Patentschrift Nr. 739 024 bekannt, nicht aber in Verbindung mit einer vorhergehenden PEG-Fällung.

Die vorliegende Erfindung gründet sich auf die Erkenntnis, dass es möglich ist, in einfacher Weise und ohne Zugabe von Alkoholen ein fraktioniertes Ausfällen von Albumin in Gegenwart von PEG mit einer Wärmebehandlung in Gegenwart von Caprylsäure als Stabilisator zu kombinieren, wodurch ein Koagulieren derjenigen Unreinheiten erfolgt, die sonst zusammen mit dem Albumin ausgefällt werden würden. Es wird somit eine hohe Ausbeute von Albumin mit hoher Reinheit erreicht.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist somit dadurch gekennzeichnet, dass Blutplasma mit Polyäthylenglykol (PEG) vermischt und auf einen pH-Wert von 6 bis 7 zum Ausfällen von Fibrinogen und Globulinen eingestellt, dass der Supernatant mit einem Gehalt an 150 bis 300 g PEG pro Liter Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5,3 zum Ausfällen von Albumin eingestellt, dass das Albumin mit mitgerissenem PEG in einem wässrigen Medium wiedergelöst,

dass die gebildete Albuminlösung einem Thermokoaguliervorgang bei 50 bis 65°C und einem pH-Wert von 4,6 bis 5,0 in Gegenwart einer stabilisierenden Menge Caprylsäure unterzogen und dass das gereinigte Albumin durch Ausfällen von der Lösung isoliert wird. Bei dem erwähnten Verfahren wird zweckmässig stabilisiertes Blutplasma benutzt, dem PEG in einer zum Ausfällen geeigneten Menge, nämlich 150 bis 300 g pro Liter zugesetzt wird; PEG 4000 ist gut geeignet; höhere oder niedrigere Molekulargewichte wie z.B. 1000 bis 5000 sind aber anwendbar. Die bevorzugte Menge beträgt 180 bis 200 g PEG pro Liter Flüssigkeit.

Das Ausfällen der globulinhaltigen Fraktion wird wie erwähnt durch Einstellen des pH-Wertes auf 6 bis 7 durchgeführt; der optimale pH-Wert beträgt etwa 6,7. Der Niederschlag wird zweckmässig durch Zentrifugieren abgeschieden, und die abzentrifugierte albuminhaltige Lösung wird dann auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5,3, vorzugsweise 4,9, eingestellt, wodurch eine albuminhaltige Fraktion ausgefällt wird. Diese Fraktion enthält einige Proteine, Unreinheiten sowie PEG. Dieser Niederschlag wird zweckmässig in Wasser, beispielsweise in einer Konzentration von etwa 80 g/1, wiedergelöst. Dann wird Caprylsäure, zweckmässig in einer Menge von 2 bis 3 g/1, beispielsweise 2,5 g/1, zugesetzt. Die Lösung wird auf einen pH-Wert von 4,6 bis 5,0, zweckmässig 4,8, eingestellt, und es wird auf 50 bis 65°C, vorzugsweise etwa 60°C, erhitzt; die Erhitzungszeit kann mit Vorteil etwa 30 Minuten betragen.

Durch diese Wärmebehandlung koaguliert der grösste Teil der noch anwesenden Proteinstoff-Unreinheiten aus. Falls eine solche Wärmebehandlung über etwa 55°C ohne Zugabe von Caprylsäure durchgeführt worden wäre, würde das Albumin abgebaut und die Ausbeute unbefriedigend niedrig werden.

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Nach der Wärmebehandlung wird das Produkt in der Regel abgekühlt und das Koagulat, zweckmässig durch Zen-trifugieren oder Filtrieren, abgeschieden. Von der zentrifu-gierten oder filtrierten Lösung wird das gereinigte Albumin durch Ausfällen in an sich bekannter Weise isoliert. Somit lässt sich Äthanol, vorzugsweise 40%, zusetzen, und durch Einstellen des pH-Wertes auf 4,8 und Abkühlen auf eine Temperatur unter 0°C wird gereinigtes Albumin ausgefällt. Dieses wird, beispielsweise durch Zentrifugieren, aufgesammelt und durch Gefriertrocknen getrocknet.

Das erfindungsgemässe Verfahren hat den Vorteil, dass man in einfacher Weise ein überaus reines Albuminprodukt in hoher Ausbeute herstellen kann. Weiterhin zeichnet sich das erwähnte Verfahren dadurch aus, dass es in industriellem Masstab durchgeführt werden kann. Durch den Vorgang vermeidet man auch das Denaturieren der Globuline, so dass die diese Proteine enthaltenden Fraktionen zur Erzielung wertvoller Globuline in hoher Ausbeute und in reinem Zustand bearbeitet werden können.

Wenn PEG-Fällungen und Thermokoagulationen auch jede für sich bekannt gewesen sind, hat man nicht früher daran gedacht, diese Reinigungsmethoden zu kombinieren. Durch eine solche Kombination vermeidet man das Denaturieren des Albumins, was unzweifelhaft die Erklärung für die hohe Ausbeute ist. Es hat jedoch nicht vorausgesehen werden können, dass man gleichzeitig eine wesentlich verbesserte Reinheit des Produktes erreicht.

Noch ein Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man Blutplasma als Ausgangsmaterial benutzt. Dies ist möglich, weil die Globuline wie erwähnt nicht denaturiert werden, so dass man diese in hoher Ausbeute erzielen kann.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird nachstehend anhand eines Beispiels näher erläutert.

Beispiel

1001 citrat-stabilisiertes humanes Plasma wird mit 1371 s 33 Gew.-% wässriger Lösung von Plyäthylenglykol 3000 zur Erzielung von 19% PEG in der Endlösung vermicht. Der pH-Wert wird auf 6,7±0,1 eingestellt. Nach Verweilen 45 Minuten lang wird die Mischung zentrifugiert. Der Niederschlag besteht aus Fibrinogen und Globulin. Der Superna-lo tant enthält das Albumin. Dem albuminhaltigen Superna-tanten wird Essigsäure zu pH = 5,0 bis 4,8 beigemischt. Der sich ergebende, aus Albumin bestehende Niederschlag wird abzentrifugiert. Das Albumin wird bei etwa 40°C in 801 destilliertem Wasser wiedergelöst, und man setzt 200 ml 15 Caprylsäure zu. Der pH-Wert wird auf 4,8+0,1 mit IM NaOH-Lösung in Wasser eingestellt. Die Lösung wird 30 Minuten lang auf 60±0,5°C erhitzt. Der entstehende Niederschlag wird abzentrifugiert. Die zentrifugierte Lösung wird mit kaltem Äthanol (40% Äthanol, -5°C, pH = 4,8) gefällt. 20 Das ausgefällte Albumin wird abzentrifugiert und gefriergetrocknet. Nach Wiederlösung in destilliertem Wasser, Zugabe von 0,04M Caprylsäure und pH-Einstellung auf 7,0±0,4 wird die Lösung dann in Flaschen abgefüllt, die 10 Stunden lang einer Wärmebehandlung bei 60°C unterzogen 25 werden, um dann für therapeutische Zwecke Verwendung zu finden. Der Makrostoffgehalt, d.h. die Fraktion mit einem Molekulargewicht von mehr als 200000 g/Mol, beträgt weniger als 0,1% der gesamten Proteinmenge. Die Ausbeute des Albumins beträgt etwa 90% des im Plasma enthaltenen 30 Albumins.

Durch Scanning des Albumins mittels gefärbter Polyacryl-amidelektrophorese wird eine Reinheit von mindestens 99,5% nachgewiesen.

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Claims (4)

633020 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Gewinnen gereinigten Albumins durch fraktioniertes Ausfällen aus Blutplasma zur Erzielung einer albuminhaltigen Fraktion, die in Wasser wiedergelöst und einem Thermokoaguliervorgang in wässriger Lösung in Gegenwart einer stabilisierenden Menge Caprylsäure unterzogen wird, dadurch gekennzeichnet, dass Blutplasma mit Polyäthylenglykol (PEG) vermischt und auf einen pH-Wert von 6 bis 7 zum Ausfällen von Fibrinogen und Globulinen eingestellt, dass der Supernatant mit einem Gehalt von 150 bis 300 g PEG pro Liter Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5,3 zum Ausfällen von Albumin eingestellt, dass das Albumin mit mitgerissenem PEG in einem wässrigen Medium wiedergelöst, dass die gebildete Albuminlösung einem Thermokoaguliervorgang bei 50 bis 65°C und einem pH-Wert von 4,6 bis 5,0 in Gegenwart einer stabilisierenden Menge Caprylsäure unterzogen und dass das gereinigte Albumin durch Ausfällen von der Lösung isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Caprylsäure in einer Menge von 2 bis 3 g Caprylsäure pro Liter Albuminlösung während des Thermokoagu-liervorganges verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Albuminlösung nach der Thermokoagulation und Entfernen des Koagulats und Abkühlen ein niederes Alkanol, vorzugsweise Äthanol, zum Ausfällen des gereinigten Albumins beigemischt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zum Ausfällen von Albumin ein Supernatant mit einem Gehalt von 180 bis 200 g Polyäthylenglykol pro Liter Flüssigkeit verwendet wird.