DE2742150C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Serumalbuminfraktion gemäß dem Oberbegriff des Hauptan­ spruchs.

Albumin stellt die größte Blutplasmafraktion dar und findet in der medizinischen Therapie vielfältige Anwendung, zum Beispiel bei der Schockbehandlung und als Plasmaexpander.

Die Blutfraktionierung mittels verschiedener Verfahren zur Gewinnung von Albumin und anderer abgetrennter Komponenten ist allgemein gebräuchlich. Eine wichtige handelsübliche Albuminfraktion, bekannt als normales Serumalbumin, ist eine osmotisch stabile Lösung einer stark gereinigten Plas­ mafraktion, die mindestens 96% Albumin enthält. Seine Ge­ winnung wurde weitgehend durch die Arbeit von Cohn und sei­ nen Mitarbeitern an der Havard Medical School möglich ge­ macht und seine Herstellung ist in den US-PS 23 90 074 und 24 69 193, in J. Amer. Chem. Soc. 68, 469-475 (1946) und Kirk-Othmer, Encycl. of Chem. Techn. 3, 584-588 (2. Auflage 1964) beschrieben. In den USA wird für die Herstel­ lung von normalem Serumalbumin zur Zeit vorzugsweise die sogenannte Methode 6 nach Cohn angewandt.

Eine weitere wichtige handelsübliche Albuminfraktion ist die sogenannte Plasmaproteinfraktion (PPF); sie ist eine Lösung einer Plasmafraktion, die mindestens 83% Albumin zusammen mit einem Gemisch von höchstens 17% a- und β-Glo­ bulinen enthält. Die derzeit in den USA bevorzugte Methode zur Herstellung von PPF ist das in der US-PS 29 58 628 und in Vox Sang. 2, 174 (1957) beschriebene Verfahren nach Hink.

Bei diesen Verfahren zur Gewinnung des höherkonzentrierten normalen Serumalbumins und des weniger konzentrierten PPF wird als Fällungmittel in den Auftrennungsverfahren kal­ tes Ethanol verwendet. In verschiedenen anderen bekannten Verfahren für die Herstellung von Albuminfraktionen werden andere Fällungsmittel, wie Ether, Methanol oder Ammonium­ sulfatsalz verwendet, oder eine Adsorption an Gel oder Io­ nenaustauschchromatographie angewandt.

Ein Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten Serumalbumins verwendet die selektive Denaturierung von Serumglobulinen ohne Denaturierung des Serumalbumins durch Erhitzen in Ge­ genwart von Caprylat oder anderen Fettsäureanionenstabili­ satoren, wie dies in den US-PS 27 05 230 und 27 65 299, J. Biol. Chem. 162, 181-198 (1946) und Blut 30, 121-134 (1975) beschrieben ist. Dieses Verfahren ist zwar für die Herstellung von Albuminfraktionen des PPF-Typs brauchbar, es ist jedoch nicht allgemein für die Herstellung des stär­ ker gereinigten Serumalbumins in hoher Ausbeute, und ohne daß die wertvollen Gammaglobuline zerstört werden, geeig­ net. Es wird im allgemeinen als Pasteurisationsstufe zur Erzeugung eines virusfreien Albuminprodukts ausgeführt.

In letzter Zeit wurden für die Blutfraktionierung ein­ schließlich der Abtrennung von Albumin, verschiedene po­ lymere Stoffe entwickelt, z. B. Polyethylenglykol gemäß US-PS 34 15 804 und Mischpolymere aus Ethylenoxid und Po­ lyoxypropylenpolymer gemäß US-PS 38 50 903 und DE-OS 24 03 065. Bestimmte besondere Polyelektrolyte wie vernetz­ te Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Derivate wurden in US-PS 35 54 985 und US-PS 35 55 001 beschrieben. Aus der DE-OS 27 32 998 ist ein Verfahren bekannt, das die Abtrennung von Albumin aus Plasma und anderen albuminhaltigen Blut­ fraktionen mittels den obengenannten Polyelektrolyten offenbart, die anhängende funktionelle Dimethylaminopro­ pylgruppen enthalten. Diese Polymere können bei Zimmertem­ peratur verwendet werden, während für das Cohn'sche Etha­ nolfraktionierungsverfahren die Einhaltung niedriger Tem­ peraturen dringend notwendig ist.

Die Verwendung von DEAE-Sephadex für die chromatographische Trennung menschlichen Blutserums in die entsprechenden Al­ buminfraktionen wurde in Chemical Abstracts 81, 75.586b (1974) beschrieben.

In der DE-PS 26 45 466 wird ein zweistufiges Verfahren be­ schrieben, in dem die Abtrennung des Albumins aus einer Blutplasmafraktion mittels Ionenaustauschern, wie die Auf­ trennung auf einem Anionenaustauscher und anschließend auf einem Kationenaustauscher, erfolgt. Es handelt sich hierbei um ein aufwendiges Verfahren sowohl in zeitlicher als auch in apparativer Hinsicht, da neben der Vorberei­ tung der Säuren weiterhin zwei verschiedene Puffer für die Elution hergestellt werden müssen.

Schließlich ist in der DE-OS 25 37 123 ein Verfahren zur Abtrennung einer Albumin enthaltenden Fraktion aus Blut­ plasma offenbart, in dem das Blutplasma über ein anioni­ sches Ionenaustauscherharz gegeben wird und der albumin­ haltigen Fraktion ein Stabilisierungsmittel, wie Natrium­ octanoat, zugegeben wird, um die Proteinlösung vor der nachfolgenden Hitzedenaturierung zu schützen. Nach der Wärmebehandlung werden die denaturierten Proteine durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren abgetrennt, während sich das Albumin im Überstand befindet. Auch dieses Ver­ fahren ist in seiner Durchführung sehr zeitaufwendig, da es aus zwei Stufen besteht, wobei nach der ersten die Nichtalbumin-Proteine noch nicht quantitativ entfernt sind. Weiterhin ist die Temperatureinstellung bei der zweiten Stufe, der Denaturierung, schwierig zu handhaben, da eine bestimmte Temperatur erreicht werden muß, um alle anderen Blutproteine ausfallen zu lassen. Überschreitet man diese Temperatur nur geringfügig, so fallen ebenfalls gewisse Mengen Albumin aus, eine Tatsache, die sich auf die zu er­ haltende Albuminausbeute empfindlich auswirkt.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, in dem Albumin durch Behandlung mit einem Polymerharz in einem einfachen Verfahren in großer Ausbeute und in hoher Reinheit isoliert wird.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem die Behand­ lung der Blutplasmafraktion mit dem Polymerharz ein bis vier Stunden lang bei einem pH von 5,0 bis 5,5 und einer Temperatur von 65 bis 72°C erfolgt und wonach das Gemisch auf einen pH von 3,5 bis 4,5 eingestellt wird, um das ge­ wünschte Albumin selektiv daraus auszuwaschen.

Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den Unteransprüchen zum Ausdruck gebracht.

Die im Rahmen dieser Erfindung verwendeten Polymerharze sind mit Di-Niedrigalkylaminoniedrigalkyl substituierte, vernetzte Dextranpolymere. Kombiniert man bei diesen Dex­ tranpolymeren die Wärmebehandlung und die Schritte der Ad­ sorption und Auswaschung, dann erhält man ein Albuminpro­ dukt mit wesentlich höherer Reinheit und Ausbeute, als man sie getrennt bei Anwendung entweder der Wärmebehand­ lung oder der Adsorptions-Auswaschungsschritte enthält. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann Albumin mit mehr als 90% Ausbeut eund 94% Reinheit gewonnen werden.

Das erfindungsgemäß hergestellte Serumalbumin kann aus Voll­ blut, Blutplasma und Serum oder deren albuminhaltigen Frak­ tionen gewonnen werden. Da die hier angewandte Wärmebehand­ lung dazu tendiert, die in dem behandelten Material vorhan­ denen Globuline zu denaturieren, ist es häufig angezeigt, zu­ nächst bestimmte erwünschte Globulinfraktionen, wie z. B. die Gammaglobuline, vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu isolieren. Auch andere wertvolle Blutfraktio­ nen, wie z. B. Gerinnungsfaktoren, AHF und Prothrombinkomplex, können von dem Plasmaausgangsmaterial abgetrennt werden, be­ vor das erfindungsgemäße Verfahren begonnen wird. Diese Frak­ tionen können mit den üblichen bekannten Verfahren abge­ trennt werden.

Die in dieser Erfindung verwendeten mit Di-Niedrigalkyl­ aminoniedrigalkyl substituierten, vernetzten Dextranpolymere sind in der US-PS 32 27 025 beschrieben. Diese Stoffe werden hergestellt, indem man eine geeignete funktionelle Di-Nie­ drigalkylaminoniedrigalkylgruppe, wie z. B. die funktionelle Diäthylaminoäthylgruppe (DEAE) in das vernetzte Dextran ein­ führt. Der Begriff Niedrigalkyl bedeutet eine Alkylgruppe mit einem bis etwa vier Kohlenstoffatomen.

Das vernetzte Dextran, im Handel als Sephadex erhältlich, ist ein hydrophiles Mischpolymerisationsprodukt mit hohem Molekulargewicht, das man durch Umsetzung von Dextranen mit bifunktionellen organischen Stoffen, die mit der Hydroxyl­ gruppe der Dextrane reagieren können, erhält. Dies ist in der US-PS 30 42 667 beschrieben. Die Vernetzung der Dextran­ kette ergibt ein dreidimensionales Polysaccharidnetz, an das die DEAE-Gruppe oder eine andere funktionelle Gruppe durch Ätherbrücken an die Glukoseeinheiten der Dextrankette ange­ hängt werden. Das vernetzte DEAE-Dextran ist im Handel als DEAE-Sephadex A-25 und A-50 erhältlich. A-25 ist stärker als A-50 vernetzt und hat deshalb eine geringere Porosität. Diese Stoffe wurden bisher bei der chromatographischen Ab­ trennung von Albumin aus menschlichem Blutserum (Experientia, 30 (6), 608-610 (1974)) und bei der Gewinnung anderer Blut­ proteine, wie z. B. der Immunglobuline verwendet, wie dies in Arch. Biochem. Biophys. 108, 514-522 (1964), 134, 279-284 (1969); Vox Sang. 23 (4), 279-290 (1972) und der US-PS 38 69 436 beschrieben ist, ferner bei der Gewinnung von Prothrombin gemäß Vox Sang. 25 (2), 113-123 (1973) und US-PS 39 20 625.

In einer neueren Belgischen Patentschrift 8 32 527 wird DEAR-Dextran als brauchbar bei der Herstellung einer sehr reinen Albuminfraktion beschrieben. In dem beschriebenen Verfahren wird das Blutplasma mit dem Harz in Kontakt ge­ bracht, darauf folgt Auswaschen und Wärmebehandlung der ausgewaschenen Lösung in Gegenwart von Acetyltryptophan oder von Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge. Das Verfah­ ren ist brauchbar, es hat jedoch nicht den Vorteil, daß die denaturierten Globuline von dem Albumin abgetrennt werden, was durch die Wärmebehandlung des Harz-Proteingemisches in dem erfindungsgemäßen Verfahren erleichtert wird.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die obenbeschriebenen Harz-Dextranpolymere mit Blutplasma oder Serum oder albuminhaltigen Blutfraktionen vermischt, und zwar vorzugsweise in einer Konzentration von 1% bis 5% Polymer. Durch Einstellen des pH des Harz-Proteinge­ misches auf verschiedene Werte können ausgewählte Proteine zuerst entfernt werden. Bei einem pH von 5,5 bis 7,5 wer­ den Albumin, α- und β -Globuline und Fibrinogen von dem Harz adsorbiert, während ein größerer Teil der Gammaglobuline nicht adsorbiert wird und aus dem Überstand für therapeuti­ sche Zwecke gewonnen werden kann. Diese anfänglche Abtren­ nung von Gammaglobulin wird vorzugsweise bei einem pH von etwa 6 durchgeführt. Ein Teil der adsorbierten α- und β- Globuline und des Fibrinogens kann dann durch Einstellen des pH des Harz-Proteingemisches auf 4,7 und Sammeln des desorbierten Überstandes gewonnen werden.

Das Harz-Proteingemisch wird dann auf einen pH von 5,0 bis 5,5 eingestellt und eine bis vier Stunden auf 65°C bis 72°C erhitzt. Vorzugsweise wird der pH auf 5,2 bis 5,3 eingestellt und das Harz-Proteinge­ misch 1 Stunde auf 70°C erhitzt.

Während der Wärmebehandlung werden die restlichen Globuline, und zwar hauptsächlich die α- und β-Globuline, denaturiert, während das Albumin nicht denaturiert wird und leicht gewon­ nen werden kann.

Anschließend an die Wärmebehandlung wird der pH auf 3,5 bis 4,5 eingestellt, so daß man das gewünschte Albumin aus dem Harz-Proteingemisch auswaschen kann. Vorzugsweise wird das Harz-Proteingemisch vor der pH-Einstellung gekühlt und der pH wird dann auf 4 eingestellt.

Die Albumingewinnung kann mit einer Reihe von Trennverfahren erfolgen, so z. B. durch Sedimentierung, Filtrierung oder Zentrifugierung, vorzugsweise jedoch durch Filtrieren des pH-eingestellten Harz-Proteingemisches, Waschen des Filter­ kuchens und Sammeln des Filtrats in Form der stark gereinig­ ten Albuminfraktion.

Die Einstellung des pH auf den gewünschten Wert während des beschriebenen Verfahrens kann durch Behandlung mit sauren oder alkalischen Puffern, die klinisch verträglich sind, erfolgen, z. B. mit Natriumacetat-Essigsäurepuffer oder Zitronensäure zur Ansäuerung, oder mit Natriumcarbonat oder Natriumhydroxid zur Erhöhung der Alkalität.

Vorzugsweise weden auch bekannte Albuminstabilisatoren wie Natriumacetyltryptophanat und Natriumcaprylat während der Wärmebehandlung in das Harz-Proteingemisch aufgenommen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wurde als Polymerharz DEAE-Sephadex A-50 verwendet, das ein im Handel erhältliches, mit Diäthylamino­ äthyl substituriertes vernetztes Dextranpolymer ist. Zunächst wurde das Polymerharz in 0,04 mol/l NaCl gewaschen. Plasma aus konserviertem menschlichen Blut wurde mit 3 Teilen Was­ ser auf 1 Teil Plasma verdünnt und dann mit 2 Gew.-% des ge­ waschenen Harzes (2 g/100 ml) vermischt. Das Harz-Plasmage­ misch wurde auf den pH 6 eingestellt, 30 Minuten gemischt, filtriert und dann mit 0,002 mol/l NaCl gewaschen. Das Filtrat, das vorwiegend aus Gammaglobulinen, β-Globulinen, Fibrinogen und assoziierten Blutfaktoren bestand, wurde von dem verbleibenden Harz-Proteinfilterkuchen abgetrennt. Die­ ser Harz-Proteinfilterkuchen, der das adsorbierte Albumin enthielt, wurde auf den pH 5,2 angesäuert. Dem vom Harz ad­ sorbierten Protein wurde soviel Natriumcaprylatstabilisator zugemischt, daß eine 0,012 mol/l Konzentration entstand, ferner wurde NaCl bis zu einer 0,002 mol/l Konzentration zugegeben. Das vom Harz adsorbierte Protein wurde dann 1 Stunde auf 70°C erhitzt. Die Suspension wurde auf Raum­ temperatur abgekühlt, anschließend wurde das Material fil­ triert und das Filtrat beseitigt. Das Albumin wurde aus dem verbliebenen Harz-Proteinfilterkuchen mit durch Zitronensäure auf pH 4,0 angesäuerte mit 0,002 mol/l wäßrige NaCl-Lösung durch halbstündiges Mischen und Abfiltrieren ausgewaschen. Das Filtrat bestand aus der gewünschten Albuminfraktion, die Ausbeute betrug 91,5% (bezogen auf die Albuminkonzen­ tration im Originalplasma), die Reinheit lag bei 95,2%. Die Reinheit des Albumins des aus dem Harz ausgewaschenen Pro­ dukts wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese in einem Veronal-Puffer bei pH 8,6 mit einem Corning ACI Elektropho­ reseapparat bestimmt. Bei dieser Bestimmung wurde ein Coomassie Brilliant Blue R 250 (C.I. 42 660) Färbeverfahren praktisch in Übereinstimmung mit dem von Fazekas de St. Groth et al. in Biochem. Biophys. Acta 71, 377-391 (1963) be­ schriebenen Verfahren angewandt, und für die Ablesungen wurde ein Gelman ACD-15 Densitometer bei 600 nm verwendet. Coomassie Brilliant Blue R 250 ist ein Proteinfärbemittel mit großer Sensitivität, das sich bis zu 20 µg/cm Cuvetten­ breite nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz verhält und bis 0,5 µg/cm Cuvettenbreite empfindlich ist. Aufgrund dieser Empfindlichkeit kann man mit Coomassie Brilliant Blue R 250 Proteinverunreinigungen in dem Albuminprodukt in einem hohen Maß feststellen und die durchgeführte Messung bestätigt die Herstellung eines Albuminproduktes von großer Reinheit.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde als Ausgangsplasma ein von AHF befreites Plasma verwendet. Ausbeute und Reinheit des Albuminproduktes waren praktisch die gleichen wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde nach dem ersen Filtrieren und vor der Wärmebehandlung eine Zwischenstufe zur Entfernung von weiteren Globulinen und von Fibrinogen aus dem Plasma eingefügt. In dieser Zwischen­ stufe wurde der Harz-Proteinfilterkuchen aus der ersten Filtrierung mit Zitronensäure auf einen pH von 4,7 in 0,002 mol/l NaCl eingestellt und 30 Minuten gemischt. Das Gemisch wurde filtriert, gewaschen und anschließend der Wärmebehandlung und den nachfolgenden Schritten von Beispiel 1 unterzogen. Das Filtrat aus der Behandlung bei pH 4,7 ent­ hielt α- und β-Globuline sowie Fibrinogen, die für ver­ schiedene bekannte therapeutische oder diagnostische Zwec­ ke zurückbehalten werden können. Ausbeute und Reinheit des endgültigen Albuminproduktes waren praktisch die gleichen wie in Beispiel 1.

Anschließend an die erfindungsgemäße Gewinnung des gereinig­ ten Albuminproduktes kann das Albumin bis zu einem gewünsch­ ten Grad konzentriert und das konzentrierte Produkt kann auf einen physiologisch verträglichen pH und Elektrolytgehalt eingestellt werden; ferner kann es zur Viruszerstörung er­ hitzt und durch Filtrieren oder ähnliche Verfahren geklärt werden, so daß es klinisch brauchbar ist. Beispiele für brauchbare Konzentrationsverfahren, die verwendet werden können, sind

• 1. Lyophilisierung, mit nachfolgender Wie­ derauflösung bis zu einem gewünschten Grad, wie 5% oder 25%, und
  2. Ultrafiltration.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung einer Serumalbuminfraktion mit hoher Ausbeute und großem Reinheitsgrad aus einem Ge­ misch mit anderen Blutproteinkomponenten, wobei das Albu­ min-Protein-Gemisch mit einem Polymerharz, das aus der Gruppe der mit Di-Niedrigalkylaminoniedrigalkyl substitu­ ierten, vernetzten Dextranpolymere gewählt wird, in Kon­ takt gebracht wird und eine Hitzebehandlung durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit dem Polymerharz ein bis vier Stunden lang bei einem pH von 5,0 bis 5,5 und einer Temperatur von 65°C bis 72°C erfolgt, wonach das Gemisch auf einen pH von 3,5 bis 4,5 eingestellt wird, um das gewünschte Al­ bumin selektiv daraus auszuwaschen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Polymerharz in einer Kon­ zentration von 1 bis 5 Gew.-% des Albumin-Protein-Gemisches verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der pH während der Wärmebe­ handlung bei 5,2 bis 5,3 und während des Auswaschens bei 4,0 liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Wärmebehandlung bei ei­ ner Temperatur von 70°C durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Di-Niedrigalkylamino­ niedrigalkyl Diäthylaminoäthyl ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Albumin-Protein-Gemisch Blutplasma ist, das zuvor zur Entfernung von Gammaglobulin fraktioniert worden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß bei der anfänglichen Frak­ tionierung zur Entfernung von Gammaglobulin das Albumin- Protein-Gemisch mit dem Polymerharz bei einem pH von 5,5 bis 7,5 in Kontakt gebracht und das nicht adsorbierte Ma­ terial daraus als Gammaglobulinfraktion abgetrennt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die anfänglche Fraktionie­ rung bei einem pH von 6,0 durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in einem weiteren Schritt α- und β-Globuline entfernt werden, wobei das harzadsor­ bierte Albumin-Protein-Gemisch auf einen pH von 4,7 ein­ gestellt und der desorbierte Überstand davon abgetrennt wird.