DE69024105T2

DE69024105T2 - Verfahren zur Herstellung von gereinigten Albuminlösungen

Info

Publication number: DE69024105T2
Application number: DE69024105T
Authority: DE
Inventors: Thierry Burnouf; Dominique Dernis
Original assignee: CENTRE REGIONAL DE TRANSFUSION
Current assignee: CENTRE REGIONAL DE TRANSFUSION
Priority date: 1989-06-08
Filing date: 1990-05-31
Publication date: 1996-07-25
Anticipated expiration: 2010-06-01
Also published as: ES2081952T3; HUT54382A; YU48084B; HU903524D0; AU633925B2; NO902499L; FI902843A0; FR2648048B1; DD296842A5; HRP920769A2; DK0402205T3; EP0402205A1; ATE131490T1; NO902499D0; DE69024105D1; HRP920769B1; CA2018511C; HU204282B; CA2018511A1; ZA904315B

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung gereinigter Albumin-Lösungen, ausgehend von einer physiologischen Lösung humanen oder tierischen Ursprungs, insbesondere durch Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie.
Man kennt seit vielen Jahren verschiedene Arten von Verfahren zur Herstellung von injizierbaren Albuminlösungen, ausgehend vom normalen Serum. Diese umfassen die Ausfällung mit Ethanol nach den klassischen Methoden von Cohn oder von Kistler und Nitschmann und verschiedene Reinigungsschemata, die mehrere Typen von chromatographischen Kolonnen einschließen. Das Ausgangsmaterial kann sein ein frisches oder gefrorenes Plasma oder ein Kryopräzipitat-Überstand oder eine Fraktion, die bereits frei ist von bestimmten Proteinen.
Die Erstellung eines sehr leistungsfähigen Reinigungsschemas wurde von Curling, Berglöf, Lindquist und Eriksson beschrieben (Vox Sanguinis 33, 1977, 97-107 und in dem Patent US 4 086 222). Diese Technologie, entwickelt insbesondere von der Firma Pharmacia (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden), welche die verschiedenen Typen chromatographischer Harze liefert, wird weithin in verschiedenen Bluttransfusionszentren angewandt (in Europa, Kanada, Australien, ...).
Diese Reinigungsverfahren garantieren jedoch nicht die vollständige Entfernung gewisser verunreinigender Moleküle mit Lipoprotein-Natur, insbesondere der α-Lipoproteine, und zwar wegen ihrer biochemischen Ähnlichkeiten mit dem Albumin.
Diese Moleküle erweisen sich bei der Erwärmung als instabil und scheinen nach Denaturierung dafür verantwortlich zu sein, daß im Verlauf der Pasteurisierung entweder Partikel oder eine gewisse Trübung in den Albuminlösungen auftreten, was diese für die klinische Verwendung ungeeignet macht. Diese Verunreinigungen sind mit klassischen Methoden, die auf Unterschieden in der Ladung oder der Masse der Moleküle beruhen, schwierig zu entfernen.
Aus diesem Grund hat die Anmelderin ein Verfahren zur Extraktion und Elimination dieser Lipoprotein-Verunreinigungen erstellt, das wirksamer ist als die in der bisherigen Technik beschriebenen zusätzlichen chromatographischen Schritte. Dieses Verfahren umfaßt einen Schritt der Lipidentfernung aus der Albuminlösung, der vorzugsweise ein nicht denaturierendes anionisches Detergens verwendet.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung umfaßt ebenfalls bevorzugt zwei Schritte der Trennung durch Chromatographie auf Ionenaustauscherharz und Elution des adsorbierten Albumins, wobei der erste Schritt eine klassische Abtrennung des Albumins garantiert, während der zweite es erlaubt, das Detergens und die aus der Lipidentfernung stammenden Produkte zu entfernen und eine hochgereinigte Albuminlösung zu erhalten. Diese hat den Vorteil, daß sie bei der Pasteurisierung und bei der Aufbewahrung stabil ist.
Ein spezielles Verfahren der Extraktion der Lipoproteine mit geräuchertem Siliciumdioxid, anwendbar auf den "Cohnschen Überstand", war bereits in dem Patent US 4 228 154 beschrieben worden.
Die lipidentfernende Behandlung der vorliegenden Erfindung besteht in einem längeren Kontakt der aus der ersten chromatographischen Kolonne eluierten Albuminlösung mit einem anionischen Detergens. Dieses Detergens kann unter den Detergentien vom Typ Tween oder Triton gewählt werden. Insbesondere wurden sehr gute Ergebnisse nit Tween 80 erzielt, wenn seine Konzentration zwischen 0,05 und 0,25 g pro g Proteine liegt und auf 1 Volumen Tween 80 für 8 Volumina Albuminlösung eingestellt ist.
Diese lipidentfernende Behandlung kann ausgeführt werden durch einen genügend langen Kontakt, insbesondere länger als 5 Stunden, bei 25ºC oder aber durch einen kürzeren Kontakt bei erhöhter Temperatur, insbesondere einen Kontakt von 1 Stunde bei 60ºC. Im letzteren Fall ist es notwendig, einen Stabilisator für Albumin wie Natriumcaprylat hinzuzufügen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ausgeführt werden mit einer beliebigen physiologischen Lösung humaner oder tierischer Herkunft, die Albumin enthält, wie ein frisches oder gefrorenes Gesamtplasma oder ein Kryopräzipitat- Überstand; verwenden kann man auch einen Überstand nach Ausfällung des Plasmas mit Ethanol gemäß den Methoden von Cohn oder von Kistler und Nitschmann oder schließlich sonst eine Plasmafraktion, von der man bereits andere nutzbare Proteine entfernt hat. Das Ausgangsmaterial kann auch von der Placenta abgeleitet sein.
Die das Albumin enthaltende Ausgangslösung wird eingestellt, bevor sie auf die erste chromatographische Kolonne gegeben wird: auf einen Proteingehalt zwischen 15 und 18 g/l, mit Natriumacetat auf eine Leitfähigkeit von 1,5 bis 2 mS (Millisiemens) und mit Essigsäure oder Natronlauge auf einen pH zwischen 5,0 und 8,0.
Die so eingestellte Albuminlösung wird auf eine erste chromatographische Kolonne auf Ionenaustauscherharz gegeben. Eine gute selektive Adsorption des Albumins erhält man mit DEAE-Sepharose, beispielswiese auf einer Kolonne von "DEAE- Sepharose CL-6B fast flow", geliefert von Pharmacia.
Das auf der chromatographischen Kolonne absorbierte Albumin wird eluiert durch ein Absenken des pH-Wertes des Puffers auf einen Wert, der zumindest unter pHi (isoelektrischer Punkt ungefähr gleich 4,7) und insbesondere zwischen 4,0 und 4,7 liegt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt nach der lipidentfernenden Behandlung eine Trennung auf einer zweiten chromatographischen Kolonne von gleicher Art und in gleichen Bedingungen wie die erste.
Diese zweite Chromatographie erlaubt eine Beseitigung des Tween und der Lipoprotein-Verunreinigungen. Um ihre vollständige Entfernung sicherzustellen, erhält die Kolonne, die das adsorbierte Albumin trägt, mehrere aufeinanderfolgende Waschungen, bevor das Albumin, wie weiter oben beschrieben, durch Absenken des pH auf einen Wert von 4 bis 4,7 eluiert wird.
Die eluierte Albuminlösung wird dann eingestellt auf eine Endkonzentration zwischen 4 und 25%, unter physiologischen Bedingungen, die mit einer therapeutischen Verwendung verträglich sind, und insbesondere auf einen pH zwischen 6,5 und 7, und auf eine Osmolarität von 80 bis 350 mosM.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung umfaßt danach eine Pasteurisierung der Albuminlösung, die vorher durch Zugabe von Natriumcaprylat in einer Konzentration von 0,012 bis 0,015 g pro g Albumin stabilisiert wurde. Diese Pasteurisierung erfolgt durch eine Erwärmung auf über 60ºC während mindestens 10 Stunden. Nach dieser Behandlung bleiben die Lösungen völlig klar und sind bei der Aufbewahrung stabil.
Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung erhält die Albuminlösung keine Pasteurisierung und wird nicht mit Natriumcaprylat versetzt; in diesem Fall erhält sie eine Virus- Inaktivierungsbehandlung nach klassischen Methoden mit Solvens-Detergens.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Lösungen von Albumin, das durch das weiter oben beschriebene Verfahren gereinigt wurde, wobei genannte Lösungen besonders an eine therapeutische Verwendung angepaßt sind.
Die nicht pasteurisierten Lösungen von gereinigtem Albumin können ebenfalls mit Vorteil für in-vitro-Kulturen eukaryontischer Zellen verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne jedoch ihre Reichweite zu begrenzen.
Die Fig. 1 erläutert diese Beispiele und zeigt Immunelektrophoresen der Albuminlösung vor und nach der lipidentfernenden Behandlung.

BEISPIEL 1:

Das Ausgangsmaterial ist beispielsweise ein Überstand I + II + III von Cohn (nach Ausfällung des Plasmas mit Ethanol gemäß der klassischen Methode von Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68, 1946, 459-475) oder das entsprechende Äquivalent A + I nach der klassischen Methode von Kistler und Nitschmann (Vox Sanguinis 7, 1962, 414-424). Dieses Material wird gegen destilliertes, einer Osmose unterzogenes Wasser (von der Quaität "Präparat zur Injektion") dialysiert.
Die Lösung wird auf eine Proteinkonzentration von 15 bis 18 g/l eingestellt.
Mit Essigsäure oder Natronlauge wird der pH auf 6,0 oder auf einen Wert zwischen 5,0 und 8,0 eingestellt, in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial. Die Leitfähigkeit der Lösung wird mit Natriumacetat auf 1,8 mS oder auf einen Wert zwischen 1,5 und 2,0 mS eingestellt.

a Chromatographie

Die Lösung wird einem ersten Schritt der Chromatographie auf einer Kolonne DEAE-Sepharose CL6B fast flow (Pharmacia) unterzogen. Die chromatographische Kolonne wird mit einem Natriumacetatpuffer bei pH 6,0 äquilibriert. Die Äquilibrierung des Gels ist erreicht, wenn der Puffer, der aus der Kolonne fließt, eine Leitfähigkeit von 1,8 ± 0,1 mS und einen pH von 6,0 ± 0,1 hat.
Die Probe wird in einem Verhältnis von 465 g Proteine auf 20 l Gel injiziert. Der Durchsatz wird auf ungefähr 100 l/h eingestellt. Nach dem Durchlauf der Probe wird die Rückkehr zur Grundlinie durch den Ägquilibrierungspuffer sichergestellt.
Anschließend erlaubt ein Absenken des pH auf 5,25 die Desorption und die Elution des Transferrins.
Das Albumin wird dann aus der Kolonne durch Absenken des pH auf einen Wert, der zumindest unter seinem pHi (4,7) liegt, eluiert; der Acetatpuffer wird auf einen pH von 4,5 und eine Leitfähigkeit von 1,8 mS eingestellt.
Die eluierte Albuminlösung wird auf ungefähr 100 bis 150 g/l konzentriert und dann gegen Wasser dialysiert, um das Acetat zu entfernen.
Die Albuminlösung wird dann auf einen pH von 7,0 und eine Osmolarität von 250 bis 350 mosM eingestellt; ihre Konzentration wird auf 4 oder 5% bzw. auf 20 oder 25% eingestellt.

b Lipidentfernende Behandlung

Die Albuminlösung wird mit Natriumcaprylat im Verhältnis von 0,015 g Caprylat pro g Proteine versetzt, das als Stabilisierungsmittel für die nachfolgende Erwärmung und Pasteurisierung dient. (Wenn diese Operationen nicht ausgeführt werden müssen, gibt man kein Caprylat zu.) Die Lösung wird durch einen sterilisierenden Filter geschickt.
Das Tween 80 wird in heißem sterilem Wasser auf 10% verdünnt, um der Albuminlösung im Verhältnis 0,5% (V/V) für eine 4%-ige Albuminlösung oder im Verhältnis 2,5% (V/V) für eine 20%-ige Albuminlösung zugesetzt zu werden. (Die Volumenverhältnisse V/V sind ausgedrückt als: Volumen des reinen Tween/Volumen der Albuminlösung.)
Dann wird die Mischung
- entweder auf 60ºC während mindestens einer Stunde erwärmt
- oder bei 25ºC unter leichtem Rühren während mindestens 5 Stunden im Kontakt gelassen.

c Chromatographie

Man verwendet eine Kolonne DEAE-Sepharose CL6B unter identischen Bedingungen wie im ersten chromatographischen Schritt.
Das Albumin wird auf der Kolonne adsorbiert, und das Tween 80 wird in das Filtrat eliminiert, gleichzeitig mit den lipidartigen Verbindungen wie das α-Lipoprotein.
Die Kolonne wird mit dem Zehnfachen ihres Füllvolumens an Puffer gespült, um die vollständige Entfernung des Tween 80 sicherzustellen.
Das Albumin wird unter den gleichen Bedingungen wie vorher durch Absenken des pH des Puffers auf 4,5 eluiert.
Die eluierte Albuminlösung wire dann auf physiologische Bedingungen, d.h. auf einen pH von 6,5 bis 7,0 und auf eine Osmolarität von 80 bis 350 mosM, eingestellt. Die Lösung wird filtriert, auf Fläschchen verteilt und durch Erwärmung auf über 60ºC während mindestens 10 Stunden (entsprechend den durch die Pharmakopöen festgesetzten Regeln) sterilisiert.
Diese Pasteurisierung kann durch eine klassische Virus- Inaktivierungsbehandlung mit Solvens-Detergens ersetzt werden.

BEISPIEL 2: Nachweis der Wirksamkeit des Verfahrens durch Analyse mit Immunelektrophorese

Die Qualität der fertigen Albuminlösung wird mit der der aus der ersten chromatographische Kolonne hervorgehenden Lösung verglichen. Das Ergebnis ist in Fig. 1 dargestellt.
Fig. 1 zeigt 3 Immunelektrophoresen von Albuminlösungen (im oberen Teil) parallel zu einem Referenzplasma (im unteren Teil).
1A: Immunelektrophorese in Gegenwart eines Antiserums anti-Humangesamtplasma vor Behandlung der Albuminlösung mit Tween 80.
1B: Immunelektrophorese in Gegenwart eines Antiserums anti-Humangesamtplasma nach Behandlung der Albuminlösung mit Tween 80.
1C: Gleiche Elektrophorese wie in A in Gegenwart eines spezifischen Immunserums anti-ApoA.
Fig. 1C ist mit Fig. 1A zu vergleichen und erlaubt, den Bogen von α-Lipoprotein zu identifizieren.
Fig. 1B zeigt das Verschwinden des α-Lipoprotein-Bogens in der Lösung nach Behandlung mit Tween 80.

Claims

1. Verfahren für die Herstellung von Albumin, gereinigt aus einer dieses enthaltenden physiologischen Lösung von Mensch oder Tier, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Lipidentfernende Behandlung umfaßt, die mit einem anionischen, nicht-denaturierenden Detergens bewerkstelligt wird, und daß die besagte Behandlung mit Albumin durchgeführt wird, das in einer ersten Chromatographie über Ionenaustauschharz eluiert wurde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen zweiten Trennungsschritt durch Chromatographie über ein Ionenaustauschharz und eine Elution des adsorbierten Albumins umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipid-entfernende Behandlung aus einem mehr als 5-stündigen Kontakt mit dem Detergens bei 25ºC besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipid-entfernende Behandlung aus einem Kontakt von ungefähr 1 Stunde mit dem Detergens bei 60ºC und der Gegenwart von Natriumcaprylat als Stabilisator besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens Tween 80 in einer Konzentration zwischen 0,05 g und 0,25 g pro g Protein umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Tween 80 eingestellt wird auf ein Verhältnis von 1 Volumen Tween 80 auf 8 Volumina Albumin.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die physiologische Ausgangslösung Gesamtplasma oder eine Plasmafraktlon eines Kryopräzipitationsüberstands oder ein Überstand nach einer Ethanolpräzipitation oder jede andere Albumin-enthaltende Plasmafraktion ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangslösung auf eine Proteinmenge zwischen 15 und 18 g/l eingestellt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangslösung mit Natriumacetat auf eine Leitfähigkeit zwischen 1,5 und 2 mS und mit Essigsäure auf einen pH zwischen 5,0 und 8,0 eingestellt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangslösung auf eine erste Chromatographiesäule mit einem Ionenaustauschharz vom Typ DEAE-Sepharose, die Albumin adsorbiert, aufgetragen wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das während der chromatographie adsorbierte Albumin durch Absenken des Puffer-pH auf einen Wert zwischen 4 und 4,7 eluiert wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Albuminlösung, die der Lipid-entfernenden Behandlung gemäß den Ansprüchen 3 bis 6 unterzogen wurde, auf eine zweite Chromatographiesäule mit Ionenaustauschharz vom Typ DEAE-Sepharose, die Albumin adsorbiert und Tween und die sich aus der Lipid-entfernenden Behandlung ergebenden Produkte entfernt, aufgetragen wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die vollständige Entfernung von Tween und der sich aus der Lipidentfernung ergebenden Produkte durch eine Reihe aufeinanderfolgender Chromatographie-Waschschritte mit Puffer sichergestellt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das während der chromatographie adsorbierte Albumin durch ein Absenken des Puffer-pH auf einen Wert zwischen 4 und 4,7 eluiert wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die eluierte Albuminlösung auf eine Endkonzentration zwischen 4 und 25% unter physiologischen Bedingungen, die mit einem therapeutischen Gebrauch verträglich sind, eingestellt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Albuminlösung auf einen pH zwischen 6,5 und 7,0 und eine Osmolarität von 80 bis 350 mosM eingestellt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Albuminlösung Natriumcaprylat zu einer Konzentration von 0,012 bis 0,015 g/g Albumin als Stabilisator für die Pasteurisierung zugegeben wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Albuminlösung einer Pasteurisierung durch eine Erhitzung auf mehr als 60ºC während mindestens 10 Stunden ausgesetzt wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Albuminlösung einer Behandlung zur Virusinaktivierung durch ein Lösungsmitteldetergens unterworfen und keiner Pasteurisierung unterzogen wird.