DE2645466C2 - Verfahren zum Isolieren von Albumin aus Plasmaprodukten - Google Patents
Verfahren zum Isolieren von Albumin aus PlasmaproduktenInfo
- Publication number
- DE2645466C2 DE2645466C2 DE2645466A DE2645466A DE2645466C2 DE 2645466 C2 DE2645466 C2 DE 2645466C2 DE 2645466 A DE2645466 A DE 2645466A DE 2645466 A DE2645466 A DE 2645466A DE 2645466 C2 DE2645466 C2 DE 2645466C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- albumin
- separation
- ionic strength
- buffer
- exchanger
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Isolieren von Albumin aus Plasmaprodukten.
Die bislang zur Isolierung von Plasmaproteinen aus Blutprodukten bekannten Methoden sind fast ausschließlich
auf der Fraktionierungsmethode nach Cohn aufgebaut, bei der kaltes Äthanol verwendet wird. Diese
Methode wurde schon früh in den 1940er Jahren entwickelt (vgl. z. B. Cohn et al. »J. Am. Chem. Soc.« 68
(1946), Seiten 459 bis 475).Trotz der weiten Anwendung
dieser Methode besitzt sie immer noch mehrere Nachteile und Einschränkungen. So trägt z. B. die &o
Verwendung von Äthanol zur Denaturierung und Inaktivierung von vielen wertvollen, biologisch aktiven
Plasmaproteinen bei. Dazu kommt noch, daß das Verfahren komplex und zeitaufwendig ist, da es viele
Behandlungsstufen umfaßt und nur absatzweise durch- <"
geführt werden kann. Bei der Anwendung des Cohn-Verfahrens zum Isolieren von Albumin, das
hauptsächlich als Plasmaexpander/Ersatzstoff verwendet wird, betragen "die Mengen nur etwa 55 bis 60% (vgl.
»Proc. Roy. Soc. Edinburgh (B)«,71 (Suppl.), 1972, Seite
31).
In der DE-PS 10 42 594 wird ein Verfahren zur Reindarstellung von wasserlöslichen Eiweißstoffen
beschrieben, die mit bestimmten Säuren in Wasser schwer- bzw. unlösliche Anlagerungsverbindungen
bilden. Nach dieser Patentschrift ist eine Entsalzungsstufe vorgesehen, in der kleine Ionen eliminiert werden.
Hierzu werden die Eiweißstoffe mit Ionenaustauscherharzen zum Zwecke der Abtrennung von wasserlöslichen
Salzen und zum Zwecke der Aufspaltung der Eiweiß-Säure-Anlagerungsverbindung behandelt
Der Bedarf an hochgereinigtem Albumin ist größer als die lieferbaren Mengen, und es besteht daher ein
dringendes Bedürfnis nach einem neuen und verbesserten Verfahren, um Albumin aus Plasmaprodukten zu
isolieren. Dabei ist es insbesondere von Wichtigkeit, die Ausbeute zu erhöhen, da die verfügbaren ivlengen des
Rohmaterials begrenzt sind.
Durch die Erfindung wird nun diesem Erfordernis Gegnüge getan und ein neues Verfahren zum Isolieren
von Albumin zur Verfügung gestellt Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Plasmafraktion, die Albumin in gelöster Form enthält und die im wesentlichen von den Koagulationsfaktoren I, II, VII, VIII, IX und X und auch von dem
Hauptteil des IgG frei ist, auf einen pH-Wert von 5 bis 7^ einstellt in beliebiger Reihenfolge einerseits auf
einem Anionenaustauscher und andererseits auf einem Kationenaustauscher auftrennt, wobei man das Albumin
von dem Anioenaustauscher mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 44 bis 4,9 und einer Ionenstärke
von 0,025 bis 0,1 abtrennt und das Albumin von dem Kationenaustauscher mit einem wäßrigen Puffer mit
einem pH-Wert von 5,2 bis 64 und einer Ionenstärke
von 0,05 bis 0,1 abtrennt, und wobei man als Ionenaustauscher Matrizen von hydrophilen organischen
Polymeren verwendet, die wasserunlöslich, jedoch mit Wasser quellbar sind und die mit
lonenaustauschergruppen substituiert sind, und wobei man die albuminreichen Fraktionen nach jeder Auftrennung
sammelt und die albuminreiche Fraktion von der zweiten chromatographischen Stufe entsalzt und in
bekannter Weise aufarbeitet.
Im Gegensatz zu dem Verfahren gemäß der DE-PS 10 42 594 erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
die Isolierung von Albumin aus Plasmaprodukten, d. h., es wird eine Abtrennung des Albumins von
anderen Proteinen mit sehr ähnlichen physikalischen Eigenschaften durchgeführt. Hierdurch gelingt es, das
Albumin mit extremer Reinheit und mit sehr hohen Ausbeuten zu »rhalten.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können nämlich erheblich höhere Gesamtausbeuten — in der
Gegend von 90% oder mehr — erhalten werden als bei den bislang bekannten Fraktionierungsmethoden und
das dabei erhaltene Albuminprodukt hat mindestens den gleichen Reinheitsgrad wie die Produkte, die nach
den bekannten Fraktionierungsmethoden erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt nur weniger Behandlungsstufen. Es werden keine Lösungsmittel,
wie Äthanol, die das Protein zerstören, verwendet, sondern lediglich wäßrige Lösungen. Weiterhin
kann das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise als kontinuierlicher und automatisierter Prozeß
gestaltet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren baut sich auf einer zweistufigen chromatographischen Ionenaustauscherabtrennung
einer spezifischen Plasmafraktion, die im wesentlichen von den Koagulationsfaktoren I, II, VII,
VIII, IX und X und auch von dem Hauptteil von IgG. frei 5 ist, auf. Solche Plasmafraktionen können in an sich
bekannter Weise aus menschlichen und nicht-menschlichen Blutprodukten hergestellt werden, z. B. aus
Blutplasma, Blutserum, Placentablutserum oder Placentaextrakt
Die fraglichen Koagulationsfaktoren werden durch herkömmliche Methoden, z. B. durch Cryoausfällung
(Faktoren I und VIII, vgl. z. B. Pool, J. G. Thromb »Diath. Haemorrhag«, SuppL 35, (1967), Seiten 35 bis 40)
und Adsorption, beispielsweise auf Anionenaustauscherpolymeren (Faktoren II, VII, IX und X, vgL z.B. H
J. Heysteck et al »Vox Sang.« 25 (1973), Seiten 113 bis
123 und 29 (1975), Seiten 177 bis 183), eliminiert Der Hauptteil von IgG wird (zusammen mit unter anderen
Lipoproteinen, Makroglobulinen und restlichem Fibrinogen)
vorzugsweise durch Ausfällung mit beispielsweise Polyäthylenglycol (PEG) eliminiert (vgL z. B. A. Poison
et al, »Vox Sing.« 23 (1972), Seiten 107 bis 118). Das
Ausfäiiungsprodukt dieses Ausfäüungsschrittes, d. h, die
albuminarme Fraktion, kann zur Gewinnung von IgG und anderen Plasmaproteinen gesammelt werden,
während die albuminreiche Fraktion als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet
wird. Es ist zu betonen, daß das frfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Anwendung von Plasmaausgangsmaterialien
begrenzt ist, die in irgendeiner » besonderen Weise hergestellt worden sind. Vielmehr
können alle beliebigen Plasmafraktionen, die den oben angegebenen Erfordernissen genügen, z. B. auch die
Fraktionen V, IV + V oder IV de,* Cohn-Prozesses,
verwendet werden. «
Bei dem erfindungsgemäßen Verfsrhren wird der pH-Wert des oben definierten Ausgangsmaterials auf
ewta 5 bis 7,5, beispielsweise 6,5 bis 7 eingestellt. Diese Albuminlösung wird sodann zwei verschiedenen chromatographischen
Auftrennungen mittels Ionenaustauschern, beispielsweise einer Auftrennung auf einem
Anionenaustauscher und einer anderen auf einem Kationenaustauscher, unterworfen. Die zwei Ionenaustauschertrennungen
können in willkürlicher Reihenfolge durchgeführt werden, wobei jedoch bevorzugt wird, 4>
mit der Auftrennung auf dem Anionenaustauscher zu beginnen und sodann mit der Auftrennung auf dem
Kationenaustauscher fortzuschreiten. Bei den zwei chromatographischen Auftrennungsstufen werden wäßrige
Puffersysteme verwendet, nämlich ein Puffer mit >" einem pH-Wert von 4,5 bis 4,9 und einer Ionenstärke
von 0,025 bis 0,1 für die Auftrennung auf dem Anionenaustauscher und ein Puffer mit einem pH-Wert
von 5,2 bis 6,5 und einer Ionenstärke von 0,05 bis 0,1 für die Auftrennung auf dem Kationenaustauscher. Beide "
Auftrennungen werden vorzugsweise als herkömmliche Säulenchromatographie Vorgänge durchgeführt. Jedoch
können im Prinzip auch eine oder beide dieser Stufen auch absatzweise durchgeführt werden, indem beispielsweise
eine Suspension des Ionenaustauschers, des <>o
Albumin enthaltenden Ausgangsmaterials und des jeweiligen Puffers gerührt werden, obgleich dieses
Vorgehen vom praktischen Standpunkt aus gesehen weniger gut geeignet ist. Bei den oben angegebenen
Bedingungen werden Verunreinigungen, jedoch nicht b5
das Albumin auf dem Ionenaustauscher adsorbiert.
Somit liegt bei jeder der zwei Auftrennungsstufen das Albumin in dem Eluat (wenn lonenaustauschersäulen
verwendet werden) oder in dem Filtrat, nachdem der Ionenaustauscher abgefiltert worden ist (bei absatzweiser
Durchführung des Verfahrens) vor. Die Ausbeute des Albumins über die zwei chromatographischen
Ionenaustauschertrennstufen ist praktisch quantitativ (und beträgt im allgemeinen
>99%) und die erhaltene Aibuminlösung ist sehr rein (reiner als 96%).
Bei der Ausführungsform bei der die erste Trennungsstufe auf einem Anionenaustauscher und die zweite
Trennungssture auf einem Kationenaustauscher durchgeführt wird, wird es bevorzugt die Trennung auf dem
Anionenaustauscher mit einer Einführungswaschstufe zu beginnen, bei der ein Puffer mit einem pH-Wert von 5
bis 5,5 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 verwendet wird. Hierdurch werden unter anderem möglicherweise
vorhandenes Hämoglobin und restliches IgG in dem Eluai eliminiert, das verworfen oder gewünschtenfalls
zur Isolierung beispielsweise dieser Komponenten weiterbehandelt wird. Das Albumin wird sodann mittels
des oben angegebenen Puffers mit einem pH-Wert von 4,5 bis 43 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 eluiert
Das albuminreiche Eluat wird zur nachfolgenden Behandlung auf dem Kaiionenaustauseher gesammelt
Das albuminreiche Eluat von der Behandlung des Anionenaustauschers wird auf einen pH-Wert von 5,2
bis 6,5 vorzugsweise 5,2 bis 5,7, und eine Ionenstärke von
0,05 bis 0,1 eingestellt und sodann auf dem Kationenaustauscher mittels eines Puffers mit dem gleichen
pH-Wert und der gleichen Ionenstärke herauseluiert Das erhaltene Eluat, das hochgereinigtes Albumin
enthält, wird sodann in an sich bekannter Weise aufgearbeitet
Wie oben bereits ausgeführt wurde, können die zwei Ionenaustauscher-Trennungsstufen in umgekehrter Reihenfolge
durchgeführt werden, d. h., man behandelt zunächst die wie oben definierte Ausgangsfraktion auf
dem Kationenaustauscher und man behandelt sodann die bei dieser Trennung erhaltenen albuminreichen
Fraktionen auf dem Anionenaustauscher. Auch in diesem Falle wird die Albuminfraktion auf dem
Kationenaustauscher mittels eines wäßi igen Puffers mit
einem pH-Wert von 5,2 bis 6,5, vorzugsweise 5,2 bis 5,7, und einer Ionenstärke von 0,05 bis 0,1 eluiert. Bei dieser
Ausführungsform ist es jedoch bei der nachfolgenden Behandlung auf dem Anionenaustauscher nicht erforderlich,
eine Einführungswaschstufe mit einem pH-Wert von 5 bis 5,5 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1
vorzunehmen. Es ist jedoch möglich, das Albumin direkt mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 4,9 und
einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 zu eluieren, wobei das Eluat hochgereinigtes Albumin enthält, das zur
Aufarbeitung fertigt ist.
Nachdem die Ionenaustaucher bei dem erfindungsgemäßer. Verfahren verwendet worden sind, können sie
zur Wiederverwendung bei dem Verfahren regeneriert werden. Die Regenerierung wird in an sich bekannter
Weise, insbesondere durch Waschen mit dem gleichen Typ des Puffersystems, durchgeführt, das für die
Trennungsbehandlung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet wird. Die Eluate der Regenerierungswaschstufe
enthalten einige Blutkomponenten, die gewünschtenfalls isoliert werden können.
Die albuminreiche Fraktion, die bei der zweistufigen chromatographischen Trennung auf dem Anionenaustauscher
und dem Kationenaustauscher erhalten wird (und die z. B. einen Albumingehalt in der Größenordnung
von 2% hat), wird in herkömmlicher Weise aufgearbeitet, d. h. im wesentlichen durch eine Entsal-
zung (z.B. durch Gel- oder Membranfiltration),
Einengung auf die gewünschte Konzentration, ζ. Β. auf eine 5-, 20- oder 25%ige Lösung, sterile Filtration und
Wärmebehandlung gegen möglicherweise zurückgebliebene Hepatitisviren. Diese Aufarbeitungsstufen sind ί
bekannt (vgl. z. B. J. Porath et aL, »Nature« 183 (1959),
Seite 1657, und »Britisch Pharmacopaeia (1973), Seite 60). Sie bilden keine besonders kennzeichnenden
Merkmale für das erfindungsgemäße Verfahren. Vielmehr ist das Hauptmerkmal des erfindungsgemäßen i<
> Verfahrens in der Kombination der oben beschriebenen zweistufigen Trennung auf Anionen- und Kationenaustauschern
zu sehen, die auf das oben definierte besondereAusgangsmaterial angewendet wird.
Bei den verschiedenen chromatographischen Trennvorgängen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann
jedes bebliebige wäßrige Puffersystem verwendet werden, das den gewünschten pH-Wert und die
gewünschte lonenstärke liefert und das gegenüber den vorhandenen Proteinkomponenten, insbesondere dem
Albumin, beständig ist. Das gleiche Puffersystem wird vorzugsweise sowohl für die Trennung auf dem
ionenaustauscher als auch auf dem Kationcnaustauscher
verwendet Die bevorzugten Puiiersysteme sind
Acetatpuffer, Citratpuffer und dergleichen-
Die Auswahl des Anionen- und Kationenaustauschers ist nicht kritisch. Vielmehr kann im Prinzip jeder
beliebige Typ eines Ionenaustauschers verwendet werden, der auf das Albumin nicht denaturierend wirkt.
Es ist bereits eine große Anzahl von solchen Ionenaustauschern bekannt und im Handel erhältlich.
Solche Ionenaustauscher sind aus einer Matrix eines hydrophilen organischen Polymeren aufgebaut, welches
zwar unlöslich ist, aber dazu imstande ist, in Wasser aufzuquellen, und das chemisch gebundene Ionenaustauschergruppen
enthält. Die Matrix ist beispielsweise ein Polymeres auf der Grundlage eines Polysaccharids, z. B.
ein vernetztes Dextran, Agarose, eine vernetzte Agarose, Cellulose und eine vernetzte Cellulose.
Die Auswahl der spezifischen Ionenaustauschergrup- «
pen der Matrix ist ebenfalls nicht sehr kritisch. Vielmehr können im Prinzip alle Arten von bekannten Ionenaustauschergruppen
verwendet werden. Die Anionenaustauschergruppen können z. B. aromatische oder aliphatische
Aminogruppen, insbesondere Dialkylaminoalkyl- « gruppen, z. B. Diäthylaminoäthylgruppen, oder quaternäre
Aminoalkylgruppen, z. B. Triäthanolamino- oder Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylgruppen, sein.
Die Kationenaustauschergruppen können z. B. Sulfonat-,
Sulfat-, Phosphono-, Carboxyl- oder phenolische Hydroxylgruppen, insbesondere Carboxymethylgruppen
oder Sulfoalkylgruppen, wie z. B. Sulfoäthyl- und Solfopropylgruppen, sein.
Die obengenannten Alkylgruppen enthalten bis zu 6 Kohlenstoffatome und insbesondere 1 bis 4 Kohlen-Stoffatome.
Die Ionenaustauschergruppen können an die Matrix mittels beispielsweise Äther-, Ester- oder
Glycerylbindungen angeheftet sein. Die Herstellung der gelbildenden Matrizen und ihre Substitution mit
Ionenaustauschergruppen sind bekannte Techniken, vgl. ω
ζ. B. US-PS 32 75 576, 32 77 025 und 36 29 230, GB-PS 1013 585 und E. A. Peterson »Cellulosic ion exchangers«,North
Holland Publishing Co. Amsterdam, London, 1970.
Besonders gut geeignete Anionenaustauscher sind <"
DEAE-Sephadex und DEAE-Sepharose.
Diese bestehen aus diäthylaminoäthylsubstituiertem vernetzten Dextran bzw. Agarose. SP-Sephadex, ein
sulfopropylsubstituiertes vernetztes Dextran, stellt einen besondesrs gut geeigneten Kationenaustauscher
dar, wie z. B. auch sulfopropylsubstituierte vernetzte
Agarose.
Die Kapazität der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Ionenaustauscher kann innerhalb
ziemlich breiter Grenzen variieren. Die Anionenaustauscher haben eine Ionenaustauschkapazität von 0,1
bis 4,0 mÄq/g (Trockengewicht), während die Kapazität der Kationenaustauscher 0,2 bis 5,0 mÄq/g (Trockengewicht)
beträgt
Beispielsweise kann ein Anionenaustauscher vom Typ einer vernetzten, insbesondere DEAE-substituierten
Agarose verwendet werden, und das Albumin wird mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4,7
bis 43 und einer lonenstärke von 0,025 bis 0,05, vorzugsweise nach dem Waschen mit einem Puffer mit
einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 5,2 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,05, eluiert Weiterhin kann
beispielsweise ein Anionenaustauscher vom Typ vernetztes, insbesondere DEAE-substituiertes Dextran
verwendet werden und das ^"bumin wird mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 4,7 und
einer lonenstärke von 0,05 bis 0,1, vorzugsweise nach dem Waschen mit einem Puffer mit einem pH-Wert von
5,0 bis 5,5 und einer lonenstärke von 0,05 bis 0,1, eluiert
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert Diese beschreiben einige spezielle Ausführungsformen des
erfindungsgemäßen Verfahrens zum Isolieren von Albumin.
a) Abtrennung der Faktoren I und VIII
400 ml menschliches Blut wurden in 60 ml ACD-Lösung (22,0 g Trinatriumcitrat, 8,0 g Zitronensäure und
24,5 g Dextrose pro 1 Lösung) gesammelt. Nach 30minütigem Zentrifugieren bei 1350 g und bei einer
Temperatur von +40C wurde das Plasma von der Zellsuspension abgetrennt. Das Plasma wurde bei
—300C eingefroren und bei +4°C aufgetaut. Das
Cryofällungsprodukt, welches Fibrinogen (Faktor I) und Faktor VIII enthielt, wurde durch 30minütiges Zentrifugieren
bei 1350 g und +40C entfernt.
b) Abtrennung der Faktoren II, VII1 Ϊ.Χ und X
0,15 g (Trockengewicht) DEAE-Sephadex A-50 (DEAE-substituiertes vernetztes Dextran) wurden in
einer 0,075 M-NaCl-Lösung quellen gelassen und dreimal dekantiert. Der gequollene Ionenaustauscher
wurde 0,5 h bei 1210C im Autoklaven behandelt, mit
1 M-NaCI gewaschen und in 0,075 M-NaCl suspendiert. Er wurde zu 100 ml des Überstands der Stufe a)
gegeben. Die Suspension wurde 45 min lang gerührt. Sodann wurde das Gel mit den adsorbierten Faktoren II,
VU, IX und X abfiltriert, während das Filtrat eingefroren und bei — 200C gelagert wurde.
c) Abtrennung von IgG
Die gefrorene Plasmafraktion der Stufe b) wurde bei +40C aufgetaut und der pH-Wert wurde mit 0,5 N-NaOH-Lösui.g
auf 8,0 eingestellt. 12,0 g Polyäthylenglycol (MG 3000 bis 3700) wurden zu 100 ml der auf den
pH-Wert eingestellten Plasmafraktion gegeben. Nach 30minütigem Rühren bei +40C wurde das gamma-G-Globulin
enthaltende Ausfällungsprodukt durch lOminütiges Zentrifugieren bei 1800 g und +40C entfernt.
Der Überstand wurde mit 0,5 M-HCl von +40C auf
einen pH-Wert von 4,8 eingestellt. Sodann wurde eine
weitere Menge von Polyäthylenglycol 4000 zugesetzt, bis eine Endkonzentration von 22% (Gewicht/Volumen)
erhalten wurde. Das Gemisch wurde 30 min lang bei +40C gerührt und das Albumin enthaltende
Ausfällungsprodukt wurde durch lOminütiges Zentrifugieren bei 1800g und +4°C gesammelt. Das Ausfällungsprodukt
wurde bei +4°C in destilliertem Wasser aufgelöst und der pH-Wert wurde mit 0,5 M-NaOH auf
7,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung (Lösung P1)
enthielt 75 mg Albumin pro ml.
d) Reinigung auf dem Anionenaustauscher
1.5 g DEAE-Sephadex A-50 wurden in I M-Natriumacetatlösung
gequollen und in einen 0,05 M-Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 5,2
und einer lonenstärke (I) von 0,05 eingegeben. Das Ganze wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von
26 mm zu einer Betthöhe von 87 mm und zu einem Gesamtvolumen V, von 46 ml eingepackt. Die Säule
pH-Wert von 5,2 und I = 0,05 gewaschen. 20 ml der in
der Stufe c) erhaltenen Lösung Pi (enthaltend 75 mg
Albumin/ml) wurden sodann auf die Säule gegeben, die hierauf mit 100 ml Natriumacetatpuffer mit einem
pH-Wert von 5,2 und I = 0,05 gewaschen wurde. Die Säule wurde hierauf mit einem Natriumacetat/Essigsäure-Puffer
mit einem pH-Wert von 4,7 und I = 0,1 bei einem Eluierungsverhältnis von 100 ml/h, was 19 cm/h
entspricht, eluiert. Die Albumin enthaltende Fraktion (Fraktion DE 2) — 50 ml — wurde gesammelt.
Der pH-Wert wurde mit 0,5 M-NaOH auf 5,2 eingestellt. Die Leitfähigkeit wurde durch Verdünnung
mit destilliertem Wasser auf den ursprünglichen Wert der DE 2-Fraktion eingestellt.
Die Säule wurde regeneriert, indem sie mit Natriumacetat/Essigsäure-Puffer
mit einem pH-Wert von 4,0 und 1 = 0.15 zur Eluierung von restlichem Proteinmaterial
und sodann mit dem Ausgangspuffer Natriumacetat/Essigsäure mit einem pH-Wert von 52- und I = 0,05
gewaschen wurde.
e) Reinigung auf dem Kationenaustauscher
ljg SP-Sephadex C-50 (sulfopropylsubstituiertes
vernetztes Dextrangel) wurden in einem 0,1 M-Natriumacetat/Essigsäure-Puffer
mit einem pH-Wert von 5,2 und I = 0,1 quellen gelassen und in eine Säule mit einem
Durchmesser von 26 mm zu einer Höhe von 70 mm und einem Gesamtvolumen V, von 37 ml eingepackt. Die
Säule wurde mit 2 ■ V, des Quellungspuffers gewaschen. 50 ml der DE 2-Fraktion von der Stufe (d) (pH-Wert 5,2,
I = 0,1) wurden auf die Säule aufgegeben. Die Albumin enthaltende Fraktion wurde sofort mit dem gleichen
Puffer (pH-Wert 52, I = 0,1) mit einer Eluierungsgeschwindigkeit
von 100 ml/h, was 19 cm/h entspricht,
eluiert Es wurden 85 ml gesammelt Die Säule wurde regeneriert, indem sie mit Natriumacetat/Essigsäure-Puffer,
pH-Wert 8,0, I = 0,4, zur Eluierung von restlichem Protein und sodann mit dem Ausgangspuffer,
Natriumacetat/Essigsäure-Puffer, pH-Wert 5,2,1 = 0,1,
gewaschen wurde.
f) Aufarbeitung
110 g Sephadex G-25 Fine (vernetztes Dextrangel)
wurden in destilliertem Wasser quellen gelassen und in eine Säule mit einem Durchmesser von 50 mm zu einer
Betthöhe von 25 cm und einem Gesamtvolumen von 495 ml eingepackt 50 ml der gereinigten Albumin
enthaltenden Fraktion der Stufe e) wurden auf die Säule aufgegeben und mit destilliertem Wasser mit einer
Geschwindigkeit von 495 ml/h, was 25 cm/h entspricht, eluiert. Das salzfreie Albumin wurde gesammelt —
95 ml — und lyophilisiert.
■> Das lyophilisierte Albumin wurde zu einer Konzentration
von 20% (Gewicht/Volumen) in physiologischer Kochsalzlösung, die 0,004 M-Natriumcaprylat enthielt,
aufgelöst Der pH-Wert wurde mit Natriumbicarbonat auf 6,8 eingestellt. Das Endprodukt wurde durch sterile
Filtration durch ein 0,22 m μ-Filter und lOstündige
Wärmebehandlung bei 60 ± 0,50C erhalten. Die Reinheit
und die Identität des Endprodukts wurden durch Gradientenelektrophorese auf Polyacrylamidgel. gekreuzte
Immunoelektrophorese, Immunodiffusion und
''» Gelfiltration auf Sephadex G-150 (vernetztet™ Dextrangel)
überprüft. Es stellte sich heraus, daß das Produkt mehr als 90% menschliches Plasmaalbumin bei einer
Albuminpolymerkonzentration von weniger als 3,5% enthielt. Die Gesamtausbeute war größer als 90%. Die
·"' AusDetiie an ΛίοΐίίΤΐίΓ· uBcr ciic /»".ionen υπα ivatiOncnaustaustauscherstufen
(d und e) war größer als 99%.
120 ml einer sedimentierten Suspension von DEAE-Sepharose (DEAE-substituiertes vernetztes Agarosegel)
wurden mit 300 ml 1 M-Natriumacetat gewaschen und in einen Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit
pH-Wert 5,0 und I = 0,025 überführt. Das Gemisch wurde in ei & Säule mit einem Durchmesser von 50 mm
zu einer Betthöhe von 60 mm und einem Gesamtvolumen (V) von 120 ml eingepackt. Die Säule wurde mit
2 · V, (Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,0 und 1 = 0,025 gewaschen. Es wurden 30 ml Albuminlösung
der Stufe c) des Beispiels 1 aufgegeben (Lösung P2,
J> 75 mg Albumin/ml). Hierauf wurde die Säule mit dem
Ausgangspuffer (pH-Wert 5.0, I = 0,025) gewaschen. Die Waschfraktionen wurden verworfen. Sodann wurde
die Albumin enthaltende Fraktion mit Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,9 und I = 0,05 eluiert
(Eluierungsgeschwindigkeit 25 cm/h) und 90 ml wurden gesammelt.
Die lonenstärke der erhaltenen Lösung wurde auf 0,1 erhöht und der pH-Wert wurde durch Zugabe von
Natriumacetat auf 52 eingestellt. Diese Fraktion wurde
4"' auf einer SP-Sephadex-Säule behandelt und wie im
Beispiel 1, Stufen e) bzw. f), aufgearbeitet. Das Endprodukt war rein und es wurde mit der gleich hohen
Ausbeute wie im Beispiel 1 erhalten.
Die DEAE-Sepharose-Säule wurde regeneriert, in-
·" dem sie mit Natriumacetat/Essigsäure-Puffer mit einem
pH-Wert von 4,0 und I = 0,05 zur Eluierung von restlichem Protein und sodann mit 2 · V, Natriumacetat/Essigsäure-Puffer
mit einem pH-Wert von 5,0 und I = 0,025 gewaschen wurde.
1,0 g (CM-Sephadex C-50 (carboxymethylsubstituiertes vernetztes Dextrangel) wurden im Natriumacetat/
Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 62 und I = 0,1 quellen gelassen. Das Gemisch wurde in eine
Säule mit einem Durchmesser von 16 mm zu einer Betthöhe von 17,5 cm und einem Gesamtvolumen (Vi)
von 35 ml eingepackt Die Säule wurde mit 2 · Vt
Ausgangspuffer mit einem pH-Wert von 62 und I = 0,1
gewaschen. 20 ml Albumin enthaltende Lösung von der Stufe c) des Beispiels 1 (Lösung Pi, 75 mg Albumin/ml)
wurden auf die Säule aufgegeben. Die Albumin enthaltende Fraktion wurde mit dem gleichen Puffer mit
9 IO
einem pH-Wert von 6,2 und I = 0,1 eluiert (Eluierungs- Fraktion wurde weiter auf DEAli-Sephadex in Analogie
geschwindigkeit 19 cm/h) und es wurden 32 ml gesam- zur Stufe d) des Beispiels 1 (Eluierung bei einem
melt. pH-Wert von 4,7 und I =0,1) gereinigt und wie in Stufe
Der pH-Wert dieser Fraktion wurde — ohne f) des Beispiels 1 aufgearbeitet. Das Endprodukt war
Veränderung der lonenstärke — durch Zugabe von . genauso rein wie dasjenige des Beispiels 1 und es wurde
I M-Essigsäure auf einen Wert von 4,7 verringert. Die mit der gleich hohen Ausbeute erhalten.
Claims (5)
1. Verfahren zum Isolieren von Albumin aus Plasmaprodukten, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Plasmafraktion, die Albumin in gelöster Form enthält und die im wesentlichen von
den Koagulationsfaktoren I, H. VII, VIII, IX und X und auch von dem Hauptteil des IgG frei ist, auf
einen pH-Wert von 5 bis 74 einstellt, in beliebiger Reihenfolge einerseits auf einem Anionenaustauscher
und andererseits auf einem Kationenaustauscher auftrennt wobei man das Albumin von dem
Anionenaustauscher mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 4$ und einer Ionenstärke
von 0,025 bis 0,1 abtrennt und das Albumin von dem Kationenaustauscher mit einem wäßrigen Puffer mit
einem pH-Wert von 5,2 bis 64 und einer Ionenstärke von 0,05 bis 0,1 abtrennt, und wobei man als
Ionenaustauscher Matrizen von hydrophilen organischen Polymeren verwendet, die wasserunlöslich,
jedoch mit Wasser quellbar sind und die mit lonenaustauschersgruppen substituiert sind, und
wobei man die albuminreichen Fraktionen nach jeder Auftre.inung sammelt und die albuminreiche
Fraktion von der zweiten chromatographischen Stufe entsalzt und in bekannter Weise aufarbeitet
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Auftrennung durch Säulenchromatographie
durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch so gekennzeichnet, daß man für die Auftrennung auf
dem Kationenaustauscher einen wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 5,2 bis 5,7 verwendet
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Auftrennung
auf dem Anionenaustauscher vor der Auftrennung auf dem Kationenaustauscher vornimmt und daß
man ein Waschen mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH-Wert von 5 bis 5,5 und einer Ionenstärke
von 0,025 bis 0,1 durchführt, bevor man die -to
albuminreiche Fraktion bei einem pH-Wert von 43 bis 4,9 und einer Ionenstärke von 0,025 bis 0,1 eluiert.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß man Acetat- oder
Citratpuffer als wäßrige Puffersysteme verwendet. -»5
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7511295A SE405549B (sv) | 1975-10-09 | 1975-10-09 | Forfarande for isolering av albumin ur plasmaprodukter genom kromatografisk fraktionering |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2645466A1 DE2645466A1 (de) | 1977-04-21 |
| DE2645466C2 true DE2645466C2 (de) | 1983-08-11 |
Family
ID=20325752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2645466A Expired DE2645466C2 (de) | 1975-10-09 | 1976-10-08 | Verfahren zum Isolieren von Albumin aus Plasmaprodukten |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4086222A (de) |
| JP (1) | JPS5247915A (de) |
| DE (1) | DE2645466C2 (de) |
| FR (1) | FR2327256A1 (de) |
| GB (1) | GB1554592A (de) |
| SE (1) | SE405549B (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2742150A1 (de) * | 1976-09-20 | 1978-03-23 | Monsanto Co | Verfahren zur herstellung von serumalbumin |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4228154A (en) * | 1979-02-26 | 1980-10-14 | Armour Pharmaceutical Company | Purification of plasma albumin by ion exchange chromatography |
| US4364861A (en) * | 1980-05-27 | 1982-12-21 | Cutter Laboratories, Inc. | Blood-coagulation-promoting products and methods of preparing them |
| DE3172210D1 (en) * | 1980-05-27 | 1985-10-17 | Miles Lab | Blood coagulation promoting product and process of preparing same |
| FR2543448A1 (fr) * | 1983-04-01 | 1984-10-05 | Rhone Poulenc Spec Chim | Procede de fractionnement du plasma |
| US4513173A (en) * | 1983-06-07 | 1985-04-23 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Intumescent fire protective sheaths |
| FR2548670B1 (fr) * | 1983-07-07 | 1985-10-25 | Merieux Inst | Procede de preparation des principales proteines du sang hemolyse sous forme non denaturee |
| US4629705A (en) * | 1984-05-31 | 1986-12-16 | The Dow Chemical Company | Indirect-photometric chromatography done in and with a variable capacity weakly basic or acidic ion exchange column |
| US4664806A (en) * | 1985-01-22 | 1987-05-12 | Ciba-Geigy Corporation | Anionically modified polysaccharides chromatography agents |
| US4721572A (en) * | 1985-07-12 | 1988-01-26 | Miles Laboratories, Inc. | Purfication of blood clotting factors and other blood proteins on non-carbohydrate sulfated matrices |
| US4740306A (en) * | 1986-03-17 | 1988-04-26 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Chromatographic column |
| JPS63102118U (de) * | 1986-12-23 | 1988-07-02 | ||
| NL8701915A (nl) * | 1987-08-14 | 1989-03-01 | Waander Riethorst | Adsorbensmateriaal en toepassing daarvan voor het isoleren van stollingsfaktoren. |
| IL88326A (en) * | 1987-11-18 | 1993-03-15 | Gist Brocades Nv | Purification of serum albumin |
| US4990447A (en) * | 1988-06-24 | 1991-02-05 | Gist-Brocades Nv | Process for the purification of serum albumin |
| JP3554796B2 (ja) * | 1988-10-31 | 2004-08-18 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | アルブミン製剤及びその製造方法 |
| US5277818A (en) * | 1988-10-31 | 1994-01-11 | The Green Cross Corporation | Albumin preparation and process for preparing the same |
| FR2648048B1 (fr) * | 1989-06-08 | 1994-06-03 | Lille Transfusion Sanguine | Procede de preparation de solutions d'albumine purifiee |
| JPH0768137B2 (ja) * | 1989-06-15 | 1995-07-26 | 株式会社ミドリ十字 | アルブミン製剤及びその製法 |
| CA2022165C (en) * | 1989-10-05 | 1999-11-23 | Chong E. Chang | Albumin purification |
| US5250662A (en) * | 1989-10-05 | 1993-10-05 | Alpha Therapeutic Corporation | Albumin purification |
| FR2672604B1 (fr) * | 1991-02-07 | 1995-05-05 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede pour isoler de l'albumine humaine a partir du surnageant iv, notamment iv-4, ou de la fraction v de cohn ou d'un surnageant ou fraction analogue. |
| US5849874A (en) * | 1991-07-12 | 1998-12-15 | Gist-Brocades, N.V. | Process for the purification of serum albumin |
| DK0524681T3 (da) * | 1991-07-12 | 2000-04-10 | Dsm Nv | Fremgangsmåde til oprensning af serumalbumin |
| FR2686620B1 (fr) * | 1992-01-27 | 1995-06-23 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Serum-albumine humaine, preparation et utilisation. |
| JPH07102147B2 (ja) * | 1992-03-16 | 1995-11-08 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 |
| US5728553A (en) * | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
| AUPM388494A0 (en) * | 1994-02-16 | 1994-03-10 | Csl Limited | Process for removing endotoxins |
| JP3702474B2 (ja) * | 1994-06-01 | 2005-10-05 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | 血清アルブミン製剤の製造方法 |
| DE19538625C2 (de) * | 1995-10-17 | 1999-08-12 | Sartorius Gmbh | Verfahren zur Abtrennung von Albumin aus Serum durch Membranionenaustauschchromatographie |
| ES2103236B1 (es) * | 1996-01-30 | 1998-04-16 | Grifols Grupo Sa | Albumina humana terapeutica con baja capacidad para la fijacion de aluminio. |
| US5936003A (en) * | 1997-03-03 | 1999-08-10 | Dionex Corporation | Hydrolytically stable resins for use in anion-exchange chromatography |
| GB9902000D0 (en) * | 1999-01-30 | 1999-03-17 | Delta Biotechnology Ltd | Process |
| US6693173B2 (en) | 2000-12-26 | 2004-02-17 | Alpha Therapeutic Corporation | Method to remove citrate and aluminum from proteins |
| US7365173B2 (en) * | 2002-02-04 | 2008-04-29 | American National Red Cross | Method for the production of pure virally inactivated butyrylcholinesterase |
| AU2010215959A1 (en) | 2009-02-20 | 2011-08-04 | Ventria Bioscience | Cell culture media containing combinations of proteins |
| CN102816230B (zh) * | 2012-08-27 | 2014-02-12 | 同路生物制药股份有限公司 | 人血白蛋白的制备方法 |
| CN110878120B (zh) * | 2019-10-31 | 2023-06-13 | 华兰生物工程重庆有限公司 | 一种从组分ii上清液中回收白蛋白的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3657116A (en) * | 1971-05-05 | 1972-04-18 | Wolfgang Haller | Process for the separation of blood components |
| US3959128A (en) * | 1974-12-27 | 1976-05-25 | Preventive Systems, Inc | Process for removing endotoxin from biological fluids |
-
1975
- 1975-10-09 SE SE7511295A patent/SE405549B/xx not_active IP Right Cessation
-
1976
- 1976-09-28 US US05/727,611 patent/US4086222A/en not_active Expired - Lifetime
- 1976-10-07 FR FR7630174A patent/FR2327256A1/fr active Granted
- 1976-10-08 DE DE2645466A patent/DE2645466C2/de not_active Expired
- 1976-10-08 JP JP51121170A patent/JPS5247915A/ja active Granted
- 1976-10-08 GB GB41995/76A patent/GB1554592A/en not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2742150A1 (de) * | 1976-09-20 | 1978-03-23 | Monsanto Co | Verfahren zur herstellung von serumalbumin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE7511295L (sv) | 1977-04-10 |
| US4086222A (en) | 1978-04-25 |
| DE2645466A1 (de) | 1977-04-21 |
| GB1554592A (en) | 1979-10-24 |
| FR2327256B1 (de) | 1978-12-22 |
| SE405549B (sv) | 1978-12-18 |
| JPS5247915A (en) | 1977-04-16 |
| FR2327256A1 (fr) | 1977-05-06 |
| JPS5632317B2 (de) | 1981-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE2645466C2 (de) | Verfahren zum Isolieren von Albumin aus Plasmaprodukten | |
| CH634334A5 (de) | Neues glycoprotein und verfahren zu dessen herstellung. | |
| DE2854381A1 (de) | Verfahren zur gewinnung des antihaemophilen faktors viii aus blut, blutplasma oder blutplasma-fraktionen | |
| DE3039566A1 (de) | Verfahren zur reinigung von interferon | |
| DE69128088T2 (de) | Trennung der proteine und farbstoffe | |
| DE2127159C2 (de) | IgG-Immunglobulinfraktion und ihre Herstellung | |
| DE3043409C2 (de) | ||
| DE69835957T2 (de) | Methoden zur isolation von proteinaseinhibitor proteinen von kartoffel knollen | |
| EP0033000B1 (de) | Neues Protein PP15, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung | |
| DE2323981C3 (de) | Verfahren zur Isolierung des thrombinartig wirkenden Bestandteils aus dem Gift der Otter Agkistrodon rhodostoma | |
| DE2640387A1 (de) | Gewebespezifisches protein und verfahren zu dessen herstellung | |
| DE2742150C2 (de) | ||
| DE69303941T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von hochreinem Fibrinogen | |
| DE2259405C2 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Orgotein aus roten Blutzellen | |
| DE2732587C2 (de) | ||
| DE2715748C3 (de) | Gereinigte aktive Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs und ihre Verwendung | |
| DE69030414T2 (de) | Reinigung von Albumin | |
| DE3044773C2 (de) | ||
| DE2428955A1 (de) | Verfahren zur extraktion von bestandteilen mit in vivo antikoagulierender wirkung aus schlangengiften und daraus erhaltene produkte | |
| CH575433A5 (en) | Treatment of post-traumatic arthritis - with orgotein | |
| DE2815853A1 (de) | Gereinigte urokinasepraeparate und verfahren zu ihrer herstellung | |
| DE69409390T2 (de) | Verfahren zur Extraktion und Reinigung von Alpha-1-Antitrypsin (alpha 1-pI) aus Cohnischer Fraktion IV-1 | |
| DE2635894A1 (de) | Verfahren zur herstellung eines antihaemophiles globulin a enthaltenden konzentrats | |
| DE2424118B2 (de) | Verfahren zur herstellung von hochreinem kallikrein | |
| DE2733923A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von humanalbumin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OD | Request for examination | ||
| 8181 | Inventor (new situation) |
Free format text: LINDQUIST, LARS OLOF EDVARD BERGLOEF, JAN HAAKAN CURLING, JOHN MALCOLM, UPPSALA, SE |
|
| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |