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TECHNISCHES
GEBIET
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Diese
Erfindung ist allgemein auf Verfahren zur Isolierung von Protease-Inhibitor-Proteinen aus Pflanzengeweben
und ganz besonders auf die Isolierung von wärmebeständigen Protease-Inhibitor-Proteinen
aus Kartoffelknollen gerichtet.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Bei
Knollen von Nachtschattengewächsen wie
zum Beispiel der Kartoffel handelt es sich um eine reichliche Quelle
eines werten Bereichs von Klassen von Protease-Inhibitor-Proteinen. Viele dieser Proteine
hemmen die Aktivität
von Verdauungsproteasen, wie zum Beispiel Trypsin und Chymotrypsin,
die sowohl in Insekten als auch in Säugetieren natürlich vorkommen.
Durch Stören
des natürlichen Verdauungsvorgangs
bilden Protease-Inhibitoren einen Teil der natürlichen Verteidigung einer
Pflanze gegen Nahrungssuche durch Pflanzenfresser. Aus dem gleichen
Grund finden Protease-Inhibitoren
Anwendung in der Schädlingsbekämpfungsindustrie
zur Bekämpfung
von Insekten wie zum Beispiel Feuerameisen. Weil sie auch menschliche
Verdauungsproteasen hemmen, sind diese Inhibitoren zusätzlich in der
pharmazeutischen Industrie zur Kontrolle von Fettleibigkeit und
Diabetes von Wert.
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Kartoffelknollen
sind eine Hauptquelle für
die Untersuchung und Herstellung von Protease-Inhibitoren. Bei einigen
der in Kartoffelknollen vorliegenden Protease-Inhibitoren handelt
es sich um die wärmebeständige Art.
Unter diesen sind zwei Protease-Inhibitoren
des Kunitz-Typs mit einer Mr der Untereinheiten von etwa 20 und
20,5 kD, die sowohl Trypsin als auch Chymotrypsin hemmen (Walsh
und Twichell, Plant Physiol. 97: 15–18, 1991). Bei dem kleineren
Protein handelt es sich um einen starken Inhibitor von Chymotrypsin
und einen schwachen Inhibitor von Trypsin. Bei dem größeren Protein
handelt es sich um einen starken Inhibitor von Trypsin. Andere wärmebeständige Protease-Inhibitoren
schließen einen
mit einer Mr der Untereinheiten von etwa 9,5 kD (als Protease-Inhibitor
I bezeichnet), bei dem es sich um einen starken Inhibitor von Chymotrypsin handelt
(Melville und Ryan, J. Biol. Chem. 247: 3445–3453, 1972), und einen weiteren
mit einer Mr der Untereinheiten von etwa 10,5 kD (als Protease-Inhibitor
II bezeichnet) ein, bei dem es sich um einen starken Inhibitor von
sowohl Chymotrypsin als auch Trypsin handelt (Bryant, Green und
Ryan, Biochemistry 15: 3418–3424,
1976).
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Frühere Verfahren
zur Herstellung dieser wärmebeständigen Protease-Inhibitoren
haben zahlreiche Schritte einbezogen, einschließlich: Extraktion in Anwesenheit
von Dithionat, Wärme,
Ammoniumsulfat-Präzipitation
und Chromatographie (Walsh und Twichell, Plant Physiol. 97: 15–18, 1991;
Melville und Ryan, J. Biol. Chem. 247: 3445–3453, 1972; Bryant, Green
und Ryan, Biochemistry 15: 3418–3424,
1976; Ryan und Kassell, Methods in Enz. XIX: 883–889, 1970, Pearce und Ryan,
Anal. Biochem. 130: 223–225,
1983). Unglücklicherweise
sind diese Verfahren beschwerlich, mühsam, zeitraubend, teuer und
produzieren relativ niedrige Ausbeuten wärmebeständiger Protease-Inhibitoren. Ein
Hauptproblem ist, dass anfängliche
Extrakte ein zähflüssiges Homogenat
mit schlechten Fließmerkmalen
bilden, was zu Schwierigkeiten bei anschließenden Verfahrensschritten,
besonders Filtration, Ammoniumsulfat-Präzipitation und Resolubilisierung
führt.
Die zähflüssige Konsistenz
erfordert manchmal die Verwendung einer Filtration unter Druck,
besonders bei Extraktionen in größerem Maßstab (Ryan
und Kassell, 1970). Darüberhinaus
reduziert die zähflüssige Konsistenz die
Ausbeute wegen der Schwierigkeit, Material vollständig aus
der Paste zu gewinnen. Diese frühreren Verfahren
sind auch nachteilig, weil sie zum Ausführen Fachpersonal erfordern
und oft einige Tage zum Fertigstellen brauchen.
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Dementsprechend
gibt es auf dem Fachgebiet einen Bedarf für ein Verfahren zum Isolieren
von Protease-Inhibitoren aus Pflanzengewebe, besonders Kartoffelknollen,
welches das Problem des zähflüssigen Extrakts überwindet,
den Bedarf für
eine Ammoniumsulfat-Präzipitation
eliminiert, schnell, preiswert, einfach auszuführen und in jedem Maßstab vom
Labor bis zur großtechnischen
Fertigung leicht zu erreichen ist. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese
Bedürfnisse
und stellt andere damit zusammenhängende Vorteile bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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In
Kürze betrifft
diese Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, schnelle und
einfache Verfahren zum Isolieren wärmebeständiger Protease-Inhibitor-Proteine
aus Pflanzengeweben, die dasselbe enthalten, insbesondere Kartoffelknollen.
Das Verfahren umfasst drei Schritte. Als Erstes werden Proteine
aus Kartoffelknollen in löslicher
Form in ein wässriges/alkoholisches
Extraktionsmedium, wie zum Beispiel verdünnte Ameisensäure und
20% Ethanol, extrahiert. Die Anwesenheit von Ethanol im Extraktionsmedium
wandelt das sonst zähflüssige Homogenat zu
einem glatt fließenden
Alkoholextrakt um, der leicht handzuhaben und insbesondere leicht
zu filtrieren ist. Als Zweites wird der Alkohol auf eine erste Temperatur
erwärmt,
dann auf eine zweite Temperatur abgekühlt. Erwärmen in Anwesenheit von Alkohol denaturiert
die meisten unerwünschten
Proteine in dem Alkoholextrakt und anschließendes Abkühlen führt zur Bildung einer Präzipitatphase,
die aus Trümmern
besteht, und einer löslichen
Phase, welche die wärmebeständigen Protease-Inhibitor-Proteine
enthält.
Als Drittes werden die wärmebeständigen Protease-Inhibitor-Proteine
durch Dialyse gegen ein geeignetes Dialysemedium, wie zum Beispiel
verdünnte
Ameisensäure
oder Wasser, gefolgt von verdünnter
Ameisensäure,
aus der löslichen
Phase präzipitiert.
Bei den präzipitierten
Proteinen kann es sich entweder um ein einzelnes Inhibitor-Protein – Protease-Inhibitor
II – handeln,
oder um ein Gemisch von Protease-Inhibitor II und zwei Kunitz-Protease-Inhibitoren
(einer am aktivsten gegen Trypsin und der andere am aktivsten gegen
Chymotrypsin). Die präzipitierten
Protease-Inhibitor-Proteine sind von der Masse anderer Proteine
und anderer Bestandteile, die ursprünglich in der Knolle vorliegen,
frei.
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Ob
die präzipitierten
Proteine den einzelnen Inhibitor oder das Gemisch von Inhibitoren
ausmachen, wird durch eine einzige Modifikation bestimmt. Diese
Modifikation betrifft die für
den Denaturierungsschritt ausgewählte
Erwärmungstemperatur.
Der einzelne Inhibitor kann nach Erwärmen auf 70 °C, Kühlen auf
50 °C, gefolgt
von Dialyse gegen 0,22% Ameisensäure
erhalten werden. Das Inhibitor-Gemisch kann durch Erwärmen auf
50 °C, Abkühlen auf Raumtemperatur,
gefolgt von Dialyse gegen Wasser erhalten werden, wobei auf die
Wasserdialyse ferner die Zugabe von Ameisensäure auf 0,88% folgt.
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Außer der
Dialysezeit kann das ganze Verfahren in weniger als einer Stunde
durchgeführt
werden, verglichen mit den Tagen, die für das frühere Verfahren erforderlich
waren. Das Verfahren ist einfach, kann durch ungelerntes technisches
Personal durchgeführt
werden und ist einer Durchführung
in jedem Maßstab
zugänglich.
Es vermeidet die Verwendung von teurem Ammoniumsulfat und Chromatographieschritten
und sogar der Ethanol kann wiedergewonnen werden, was die Betriebskosten
des Verfahrens weiter reduziert. Das Verfahren kann 300 mg im Wesentlichen
reine Protease-Inhibitor-Proteine aus einem Pfund (pound) Kartoffeln
ergeben, was der Ausbeute von 150 mg weniger reinen Proteins aus
100 Pfund Kartoffeln unter Verwendung früherer Verfahren enorm überlegen
ist.
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Diese
und andere Aspekte der Erfindung sind nach Bezug auf die folgende
detaillierte Beschreibung und die Abbildungen offensichtlich.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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Bei 1 handelt
es sich um die HPLC-Analyse eines erfindungsgemäß hergestellten, repräsentativen,
wärmebehandelten,
wässrigen/alkoholischen
Extrakts vor der Dialyse.
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Bei 2 handelt
es sich um die HPLC-Analyse eines ersten erfindungsgemäß hergestellten
Protease-Inhibitor-Protein-Gemisches nach der Dialyse.
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3 veranschaulicht
die Gelelektrophorese-Analyse eines ersten erfindungsgemäß hergestellten
Protease-Inhibitor-Protein-Gemisches.
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4 veranschaulicht
die Protease-Inhibitor-Aktivität
eines ersten erfindungsgemäß hergestellten
Protease-Inhibitor-Protein-Gemisches.
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5 veranschaulicht
die Protease-Inhibitor-Aktivität
eines zweiten erfindungsgemäß hergestellten
Protease-Inhibitor-Protein-Gemisches.
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Bei 6 handelt
es sich um die HPLC-Analyse eines zweiten erfindungsgemäß hergestellten
Protease-Inhibitor-Protein-Gemisches.
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7 veranschaulicht
die Gelelektrophorese-Analyse eines zweiten erfindungsgemäß hergestellten
Protease-Inhibitor-Protein-Gemisches.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Wie
vorstehend erwähnt,
ist die vorliegende Erfindung auf die Isolierung von einem oder
mehreren wärmebeständigen Protease-Inhibitor-Proteinen aus
einem Pflanzengewebe gerichtet, die dasselbe enthalten. Kartoffelknollen,
von denen bekannt ist, dass sie mehrere Klassen wärmebeständiger Protease-Inhibitoren
reichlich enthalten, sind ein besonders gut untersuchtes Pflanzengewebe.
Deshalb wird in einer Ausführungsform
dieser Erfindung ein Verfahren zur Isolierung wärmebeständiger Protease-Inhibitor-Proteine
aus Kartoffelknollen offenbart. Es wird Fachleuten auch offensichtlich
sein, dass dieses Verfahren auf die Extraktion anderer Protease-Inhibitoren
aus anderen Pflanzengeweben angepasst werden kann, vorausgesetzt,
dass die Inhibitoren wärmebeständig und
in einer Lösung,
die Alkohol und Wasser umfasst, löslich sind. Zusätzlich zu
Kartoffelknollen können
repräsentative
Gewebe Knollen von Süßkartoffeln
oder Maniok, Blätter
und Früchte von
Kartoffeln, Tomaten und Leguminosen, Samen aller Pflanzenarten,
sowie gentechnisch veränderte Organismen,
die Protease-Inhibitor-Gene exprimieren, einschließen, sind
aber nicht darauf beschränkt.
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Bei
der Durchführung
dieser Erfindung schließt
das Verfahren zum Herstellen von Protease-Inhibitor-Proteinen aus
Pflanzengewebe drei Schritte ein.
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Im
ersten Schritt werden Proteine aus dem Gewebe in einem wässrigen/alkoholischen
Extraktionsmedium extrahiert, um einen Alkohol-Extrakt zu erhalten. „Extraktion" bedeutet, die zelluläre Struktur des
Pflanzengewebes zu zerstören,
um die zellulären
Inhalte in das Extraktionsmedium freizusetzen und zu solubilisieren.
Der anfängliche
Schritt der Extraktion ist im Fachgebiet allgemein als „Homogenisierung" bekannt, was einen
zerstörenden
mechanischen Vorgang wie zum Beispiel Zerbrechen, Mahlen, Mischen,
Beschallen oder eine andere Technik umfassen kann. Bei der vorliegenden
Erfindung besteht das Extraktionsmedium aus einer Lösung mit einem
wässrigen
Anteil und einem Alkoholanteil. Der wässrige Anteil sollte idealerweise
als einer ausgewählt
werden, der vorzugsweise Protease-Inhibitoren solubilisiert während er
gleichzeitig die Präzipitation unerwünschter
Proteine und anderer aus dem Gewebe freigesetzter Makromoleküle fördert. Saure
Lösungen
und Lösungen,
die eine hohe Salzkonzentration enthalten (mehr als 0,3 M) haben
eine Tendenz, viele Makromoleküle,
wie zum Beispiel Proteine und Nukleinsäuren, zu präzipitieren, während einige
Protease-Inhibitoren in denselben löslich sind. Deshalb verwendet
eine Ausführungsform
dieser Erfindung einen wässrigen
Anteil, der aus verdünnter
Ameisensäure
und hoher Salzkonzenration besteht. Alkohol hat auch eine Tendenz,
Makromoleküle
zu präzipitieren,
und diese Erfindung offenbart, dass manche Protease-Inhibitoren
in Lösungen,
die Alkohol enthalten, löslich
bleiben. Das Extraktionsmedium enthält deshalb auch einen Alkoholanteil.
Der Alkohol kann während
oder nach der Homogenisierung des Pflanzengewebes zum wässrigen
Anteil des Extraktionsmediums gegeben werden, ohne die Ergebnisse
wesentlich zu ändern.
In den hierin offenbarten Ausführungsformen
wird Alkohol während
des Homogenisierungsvorgangs zur wässrigen Lösung gegeben.
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Ethanol
wird in den hierin beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen
bei etwa 20% (Vol./Vol.) verwendet. Es kann jedoch durch andere Alkohole,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Methanol, Propanol oder Phenol sowie andere mit Wasser mischbare
organische Stoffe ersetzt werden. Ersatzalkohol(e) können durch
Extrahieren eines Pflanzengewebes unter Verwendung von Medien, die
eine Vielfalt von Alkoholen in einer Vielfalt von Konzentrationen
umfasst, ausgewertet werden. Nach dem Abzentrifugieren der Trümmer bestimmt
eine Messung der Proteinspiegel und der spezifischen Protease-Inhibitor-Aktivitäten im Überstand
einen Alkoholtyp und eine Konzentration, welche die höchste spezifische
Aktivität
ergeben.
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Das
anfängliche
Homogenat kann in einer Lösung
von verdünnter
Ameisensäure
und Salz hergestellt werden. Kartoffelknollen können zum Beispiel in einem
Medium mit einer Endkonzentration von etwa 0,2% Ameisensäure und
0,3 M NaCl in einem Mixer homogenisiert werden. Während des
Homogenisierungsvorgangs wird Ethanol zugegeben. Die Zugabe von
Ethanol auf diese Weise ist besonders für aus Kartoffelknollen hergestellte
Extrakte nützlich,
weil der Ethanol die Konsistenz des Homogenats von einer dicken
stärkehaltigen
Paste zu einem glatt fließenden
Alkoholextrakt ändert.
Dies erleichtert anschließende
Handhabungen des Alkoholextrakts, wie zum Beispiel das Entfernen
grober Trümmer.
In den hierin beschriebenen Ausführungsformen
werden Trümmer
durch Pressen des Alkoholextrakts durch ein Seihtuch entfernt. Andere
Wege, die Entfernung der Trümmer
zu erreichen, schließen Zentrifugation,
Filtration durch natürliche
Materialien wie Kieselerde, Filtration durch synthetische Filter, Extrusion
durch Siebnetze und andere Techniken ein, sind aber nicht darauf
beschränkt.
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Im
zweiten Schritt wird der Alkoholextrakt auf eine erste Temperatur
erwärmt,
dann auf eine zweite Temperatur abgekühlt. Dies verursacht Denaturierung
und Präzipitation
vieler unerwünschter,
im Extrakt vorliegender Proteine und bildet eine unlösliche Präzipitatphase
und eine lösliche
Phase. Denaturierung ist ein Vorgang, der sekundäre und tertiäre Strukturen
von Proteinen zerstört,
was verursacht, dass sie sich entfalten oder auf andere Weise ihre
nativen Merkmale verlieren. Denaturierung kann irreversibel sein,
wenn die Proteine nachher nicht dazu gebracht werden können, ihre
nativen Merkmale wiederzugewinnen. Alkohol fördert die Denaturierung vieler
Proteine, besonders in Anwesenheit von Wärme. Nach dem Abkühlen sind
denaturierte Proteine anfällig
zu aggregieren, um unlösliche
Präzipitate
zu bilden. Bei der Durchführung
dieser Erfindung werden einige Protease-Inhibitoren nicht irreversibel
denaturiert und bleiben löslich,
wenn sie in Anwesenheit von Alkohol erwärmt und abgekühlt werden,
während die
meisten anderen Proteine präzipitieren.
Insbesondere zeigen die hierin beschriebenen Ausführungsformen,
dass einige Protease-Inhibitoren aus Kartoffelknollen in einem Alkoholextrakt,
der 20% Ethanol enthält,
der auf eine erste Temperatur erwärmt und auf eine zweite Temperatur
abgekühlt worden
ist, aktiv und löslich
bleiben.
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Im
Allgemeinen sollte der Alkoholextrakt auf eine erste Temperatur
erwärmt
werden, die heiß genug
ist, um unerwünschte
Proteine zu denaturieren, aber nicht so heiß, dass sie die Protease-Inhibitoren irreversibel
denaturiert. Der Extrakt sollte dann auf eine zweite Temperatur
abgekühlt
werden, die niedrig genug ist, um die Aggregation eines Präzipitats
zu erleichtern. Nach dem Abkühlen
wird sich eine unlösliche
Präzipitatphase
entwickeln, die denaturierte Proteine und andere Trümmer enhält. Die
Präzipitatphase
kann von der verbleibenden löslichen
Phase durch Zentrifugation, Filtration oder ein anderes äquivalentes
Verfahren getrennt werden, um eine klare lösliche Phase zu erhalten. Die
lösliche
Phase enthält Protease-Inhibitor-Protein.
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Die
Auswahl der ersten und zweiten Temperaturen des Erwärmungsschrittes
kann den Typ des erhaltenen Inhibitors bestimmen, weil unterschiedliche
Protease-Inhibitoren
unterschiedliche Denaturierungs- und/oder Präzipitationseigenschaften haben. In
einer Ausführungsform
unter Verwendung von Alkoholextrakten von Kartoffelknollen handelt
es sich bei der ersten Temperatur um 70 °C und bei der zweiten Temperatur
handelt es sich um 50 °C.
Dies ergibt eine Herstellung, die Protease-Inhibitor II enthält. In einer
anderen Ausführungsform
unter Verwendung desselben Alkoholextrakts von Kartoffelknollen
handelt es sich bei der ersten Temperatur um 50 °C und bei der zweiten Temperatur
handelt es sich um Raumtemperatur. Dies ergibt ein Gemisch, das
drei unterschiedliche Inhibitoren enthält – Protease-Inhibitor II und
zwei Kunitz-Protease-Inihibitoren,
einer am aktivsten gegen Trypsin und der andere am aktivsten gegen
Chymotrypsin.
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Das
Verfahren erlaubt es, die Auswahl der ersten und zweiten Temperaturen
für den
Erwärmungsschritt
so zu modifizieren, wie es benötigt
wird, um die besten Ausbeuten bestimmter Typen von Protease-Inhibitor-Proteinen
und für
bestimmte Arten von Pflanzengewebe zu erhalten. Zum Beispiel können in
einer Ausführungsform
Alkoholextrakte aus einem bestimmten Pflanzengewebe mit einer Reihe unterschiedlicher
erster und zweiter Temperaturen behandelt werden. Nach dem Abzentrifugieren
der Trümmer
bestimmt eine Messung der Proteinspiegel und spezifischen Protease-Inhibitor-Aktivitäten im Überstand
die Wärmebehandlung,
welche die höchste
spezifische Aktivität
ergibt.
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Der
Alkohol kann nach der Wärmebehandlung
des Alkoholextrakts aus der löslichen
Phase wiedergewonnen werden. In einer Ausführungsform kann der Ethanol
durch Verdampfen bei der zweiten Temperatur, auf die der Alkoholextrakt
abgekühlt wurde,
wiedergewonnen werden. In einer anderen Ausführungsform muss der Alkohol
nicht wiedergewonnen werden. In beiden Fällen wird die Anwesenheit oder
Abwesenheit des Alkohols keine anschließenden Schritte im Verfahren
bewirken.
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Im
dritten Schritt des Verfahrens werden Protease-Inhibitoren aus der
löslichen
Phase durch Präzipitation
mittels Dialyse gegen ein Medium gewonnen, das die Präzipitation
der Inhibitoren fördert,
vorzugsweise eine saure Dialyselösung,
die eine protische Säure,
wie zum Beispiel eine organische Säure, und stärker bevorzugt Ameisensäure einsetzt.
Die Dialyse fördert
nicht nur die Präzipitation
zum Gewinnen der Proteine, sondern eliminiert auch kleinere Moleküle und andere
Moleküle,
die von früheren Schritten übertragen
wurden. Die Auswahl des Dialysemediums wird teilweise durch die
zu isolierenden Protease-Inhibitoren bestimmt. In einer Ausführungsform
wird verdünnte
Ameisensäure
bei etwa 0,22% verwendet, um den Protease-Inhibitor II aus Kartoffelknollen
zu gewinnen. In einer anderen Ausführungsform wird Leitungswasser
bevorzugt, um ein Gemisch von drei Protease-Inhibitoren aus Kartoffelknollen
zu gewinnen. Wenn Leitungswasser als Dialysemedium verwendet wird,
können
die Proteine durch die anschließende
Zugabe von Ameisensäure auf
etwa 0,88% gewonnen werden. In beiden Fällen findet die Dialyse über eine
Membran mit einem Molekulargewichtsausschluss von 12.000–14.000
Dalton statt. Indem Salz, restlicher Alkohol und andere kleine Moleküle, die
im löslichen
Extrakt vorliegen, entfernt werden, bildet sich ein weißes Präzipitat,
das die Protease-Inhibitoren enthält. In einer Ausführung im
Labormaßstab
sind zwölf
bis 24 Stunden Dialyse zur vollständigen Präzipitatbildung ausreichend.
Sie kann jedoch durch andere Dialyseverfahren, Austausch der gelösten Stoffe
oder Präzipitation,
die eine bessere oder schnellere Gewinnung der Protease-Inhibitoren
ergeben mögen,
ersetzt werden.
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Die
präzipitierten
Proteine können
durch Filtration, Zentrifugation oder andere Verfahren gewonnen
werden. Die präzipitierten
Proteine enthalten ein Gemisch von Protease-Inhibitor-Proteinen
in einer Vielfalt von Reinheitsgraden. Ein oder mehrere Protease-Inhibitor-Proteine
können > 90% des Gesamtproteins
im Präzipitat
ausmachen. Ein derartiges Präzipitat
kann als ein im Wesentlichen reines Gemisch von Protease-Inhibitor-Proteinen
betrachtet werden. Das Präzipitat
kann in einem für
eine beabsichtigte Verwendung oder anschließende Formulierung der Protease-Inhibitoren
geeigneten Lösungsmittel
aufgelöst
werden. In den hierin vorgelegten Ausführungsformen werden die Präzipitate
in 0,1 M Ammoniumbicarbonat gelöst,
das zur Solubilisierung und anschließenden Lyophilisierung – einem
bekannten Verfahren zur stabilen Lagerung von Protease-Inhibitoren – geeignet
ist.
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Die
allgemeine, hierin beschriebene Methodik ist für die Herstellung einer Vielfalt
von wärmebeständigen Protease-Inhibitor-Proteinen
aus einer Vielfalt von Pflanzengeweben geeignet, vorausgesetzt,
dass die Inhibitoren gegen irreversible Denaturierung in Anwesenheit
von Alkohol und Wärme
resistent sind. Dieses Verfahren ergibt Gemische von Protease-Inhibitor-Proteinen
mit verschiedenen Reinheitsgraden, je nach dem spezifischen verwendeten
Gewebe, den vorliegenden Protease-Inhibitoren und den besonderen
Alkoholen, Temperaturen und dem Dialysemedium, die für das Verfahren
eingesetzt werden. Wenn sie für
ein gegebenes Gewebe optimiert sind, können hohe Ausbeuten im Wesentlichen
reiner Zusammensetzungen von Protease-Inhibitoren erhalten werden,
wie durch die nachstehend beschriebenen Beispiele für Kartoffelknollen-Protease-Inhibitoren
gezeigt wird. Zu diesem Zweck werden die folgenden Beispiele zu
Zwecken der Veranschaulichung, nicht der Beschränkung, vorgelegt.
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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HERSTELLUNG VON KARTOFFEL-PROTEASE-INHIBITOR
II
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Ein
Pfund (Ib.) Russet-Burbank-Kartoffeln wurde in Anwesenheit von 100
ml 0,88% Ameisensäure
und 1,5 M NaCl 2 Minuten lang in einem Mixer homogenisiert. Während des
Mischens wurden 125 ml 95% Ethanol langsam zu dem Homogenat gegeben,
um die Endkonzentration an Alkohol auf etwa 20% zu bringen. Dies änderte das
Homogenat von einer Paste zu einem flüssigen Gemisch, was die Filtration erleichtert.
Grobe unlösliche
Trümmer
wurden durch Pressen der Flüssigkeit
durch 8 Lagen Seihtuch entfernt. Das flüssige Filtrat wurde als Alkoholextrakt
gesammelt.
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Der
Alkoholextrakt wude in einen Abdampfkolben übertragen und durch Tauchen
des Kolbens in ein kochendes Wasserbad unter Rühren erwärmt, bis die Temperatur 70 °C erreichte.
An diesem Punkt wurde der Kolben an einen Entspannungsverdampfer
mit einer Badtemperatur von 50 °C
angeschlossen. Der Verdampfer wurde verwendet, um den Ethanol zurückzugewinnen,
es war jedoch nicht nötig,
den Ethanol zu entfernen, um mit dem Verfahren fortzufahren. Die
so erhaltene Flüssigkeit
wurde bei 4000 × g
zentrifugiert, um überschüssige Stärke und
die präzipitierte
unlösliche
Phase, die sich bildete, zu entfernen, der klare Überstand,
der die lösliche
Phase darstellt, wurde gesammelt.
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Die
lösliche
Phase wurde in einen Dialyseschlauch mit Molekulargewichtsausschluss
bei 12.000–14.000
gegeben und gegen 10 Liter 0,22% Ameisensäure mindestens 12 Stunden lang
mit mehrfachem Wechseln der Ameisensäurelösung dialysiert. Zu diesem
Zeitpunkt bildete sich in dem Beutel ein weißes Präzipitat. Bei dem Präzipitat
handelte es sich um reinen Protease-Inhibitor II, der durch 5 Minuten
lange Zentrifugation bei 4000 × g
gewonnen wurde. Das Präzipitat
wurde in 0,1 M Ammoniumbicarbonat gelöst und lyophilisiert. Die Ausbeute
betrug ungefähr
57 mg Inhibitor pro Pfund (Ib.) Kartoffeln. Bessere Ausbeuten können durch
Starten mit frisch ausgegrabenen Kartoffeln oder Kartoffelsorten mit
höheren
Spiegeln von Protease-Inhibitor II erreicht werden.
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Die 1 und 2 zeigen
HPLC-Analysen der Materialien, die aus diesem Verfahren gewonnen
werden. Beide Abbildungen zeigen die spektrophotometrische Absorption
bei 280 nm von Materialien, die von einer semipräparativen C18-Säule (Vydac,
Katalog # 218TP510, 5, 10 × 250
mm) eluiert wurden, die bei 2 ml/min über 45 Minuten hinweg mit einem
linearen Gradienten von 20% Lösungsmittel
A (0,1% Trifluoressigsäure)
bis 50% Lösungsmittel
B (0,1% Trifluoressigsäure/Azetonitril)
entwickelt wurde. 1 zeigt das lösliche Material,
das in der klaren löslichen
Phase vorlag, die nach Wärmedenaturierung
des Alkoholextrakts in Schritt 2 vor der Dialyse gewonnen wurde. 2 zeigt
das in dem Präzipitat
vorliegende Material, das nach der Dialyse in Schritt 3 gebildet
wurde. Das Präzipitat
wurde zur Analyse in Lösungsmittel
A aufgelöst.
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3 zeigt
eine Gelelektrophorese-Analyse des Materials in Peak #1 aus der
HPLC-Analyse von 2. Bei Spur 1 handelt es sich
um eine Probe des anfänglichen
Kartoffelhomogenats vor der Zugabe von Ethanol. Bei den Spuren 2,
3 und 4 handelt es sich um Proben der vorderen, mittleren bzw. hinteren Fraktionen
von Peak #1. Peak 1 wurde ferner immunologischen Analysen unterworfen,
die das Material als Kartoffel-Protease-Inhibitor II identifizierten.
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4 zeigt
die Protease-Inhibitor-II-Aktivität des Peaks #1 aus 2.
Es wurde gezeigt, dass es sich bei dem Material um einen starken
Inhibitor von sowohl Trypsin (T) als auch Chymotrypsin (C) handelte.
Für die
Trypsininhibition hemmten 4,0 μg Material
2 μg Trypsin.
Für die
Chymotrypsininhibition hemmten 1,4 μg 1,5 μg Chymotrypsin. Diese Inhibitor-Aktivität mit zwei
aktiven Zentren (double-headed) ist für Protease-Inhibitor II charakteristisch.
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BEISPIEL 2
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HERSTELLUNG
EINES GEMISCHES VON KARTOFFEL-PROTEASE-INHIBITOREN AUS KARTOFFELN
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Ein
Alkoholextrakt wurde wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Der Alkoholextrakt wurde durch Tauchen des Kolbens in ein kochendes
Wasserbad unter Rühren
erwärmt,
bis die Temperatur 50 °C
erreichte. An diesem Punkt wurde der Kolben in ein Bad mit kaltem,
fließendem
Wasser getaucht, so dass die Temperatur auf Raumtemperatur reduziert
wurde. Die so erhaltene Flüssigkeit
wurde bei 4000 × g
zentrifugiert, um überschüssige Stärke und
die präzipitierte
unlösliche
Phase, die sich bildete, zu entfernen, der klare Überstand,
der die lösliche
Phase darstellt, wurde gesammelt.
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Die
lösliche
Phase wurde in einen Dialyseschlauch mit Molekulargewichtsausschluss
bei 12.000–14.000
gegeben und 24 Stunden lang gegen fließendes Leitungswasser dialysiert.
Nach dieser Zeit wurde entweder die Lösung im Beutel auf 0,88% Ameisensäure eingestellt
oder alternativ dazu wurde die Dialyselösung auf 0,88% Ameisensäure eingestellt
und die Dialyse über
4 zusätzliche
Stunden lang fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt bildete sich ein weißes Präzipitat
in dem Beutel. Das Präzipitat
enthielt ein Gemisch von Protease-Inhibitor II und zwei Protease-Inhibitoren
der Kunitz-Familie,
wie nachstehend in den 5 und 6 gezeigt
wird. Das Präzipitat
wurde wie in Beispiel 1 gewonnen, aufgelöst und lyophilisiert. Die Ausbeute
betrug ungefähr 300
mg Inhibitoren pro Pfund (Ib.) Kartoffeln. Wieder können bessere
Ausbeuten durch Starten mit frisch ausgegrabenen Kartoffeln oder
Kartoffelsorten mit höheren
Spiegeln von Protease-Inhibitor II möglich sein.
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5 zeigt
die Protease-Inhibitor-Aktivität des
gewonnenen präzipitierten
Gemisches. Es wurde festgestellt, dass das Material sowohl Trypsin
(T) als auch Chymotrypsin (C) stark hemmte. Für die Trypsininhibition hemmten
3,2 μg Material
2,0 μg Trypsin.
Für die
Chymotrypsininhibition hemmten 2,2 μg 1,5 μg Chymotrypsin.
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6 zeigt
eine HPLC-Analyse des präzipitierten
Endmaterials, das aus diesem Verfahren gewonnen wurde. Die Bedingungen
waren dieselben, wie sie in 2 beschrieben
wurden. Die drei identifizierten Peaks wurden einer Gelelektrophorese-Analyse
unterworfen, wie in 7 gezeigt wird. Bei den Spuren
1, 2 und 3 handelt es sich um die Materialien aus den Peaks #1,
#2 bzw. #3 von 6. Wie vorher identifizierten
immunologische Analysen das Material in Peak #1 als Kartoffel-Protease-Inhibitor
II. Die Materialien aus den Peaks 2 und 3 wurden einer Aminosäuresequenzanalyse
unterworfen. Die Analyse identifizierte Peak 2 als einen Inhibitor
der Kunitz-Familie mit einer starken Chymotrypsin-inhibitorischen
Akitivät
und einem schwachen Trypsin-Inhibitor. Peak 3 wurde als Inhibitor
der Kunitz-Familie mit einer starken Trypsin-Inhibitor-Aktivität identifiziert.