DE2801607A1

DE2801607A1 - Verfahren zum gewinnen von gereinigtem albumin aus blutplasma

Info

Publication number: DE2801607A1
Application number: DE19782801607
Authority: DE
Inventors: Joergen Frederik Hansen
Original assignee: Nordisk Insulinlaboratorium
Current assignee: Nordisk Insulinlaboratorium
Priority date: 1977-01-21
Filing date: 1978-01-14
Publication date: 1978-07-27
Also published as: IL53797A0; DK25877A; FR2378042B1; SE7800726L; FR2378042A1; IL53797A; AR216933A1; GB1587782A; FI60400B; NO780217L; ATA41878A; OA05862A; AU3259278A; FI780187A; AT371718B; FI60400C; IE46303B1; IE780083L; IT7819444A0; NL7800324A

Description

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Verfahren zum Gewinnen von gereinigtem Albumin aus Blutplasma

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen von gereinigtem Albumin aus Blutplasma durch fraktionierendes Ausfällen.

Es ist bekannt, Albumin durch fraktionierendes Ausfällen mit Alkoholen, beispielsweise Äthanol, bei niedrigen Temperaturen sowie durch Ausfällen in Salzlösungen, beispielsweise durch stufenweise Zugabe von Ammoniumsulfat, aus Blutplasma zu isolieren. Diese bekannten Methoden haben verschiedene Nachteile. Somit neigen Fällungen mit Äthanol zum Denaturieren des Proteins, wodurch die Ausbeute herabgesetzt wird, und Salzfällungen ergeben unreine Produkte, da keine scharfe Trennung zu erreichen ist.

Aus der US-PS 3 415 804 ist ein Verfahren zum fraktionierenden Ausfällen von Proteinstoffmischungen in Gegen-' wart von Polyäthylenglykol (PEG) bekannt, wobei Polyäthylenglykol die Dispergxerbarkext der Proteinstoffe hemmt. Beim Fraktionieren humanen Blutplasmas erhält man bei diesem Verfahren mehrere Fraktionen, u.a. eine Albuminfraktion, die aber mit Beta-Globulin und anderen Proteinstoffen verunreinigt waren. Durch dieses bekann- j te Verfahren konnte man somit kein befriedigend gerei- ι nigtes Albumin für therapeutische Verwendung erzielen. ·

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Aus der DK-Patentanneldung 1252/75 ist es bekannt, durch Erwärmen der albuminhaltigen Flüssigkeit in Gegenwart eines Alkohols und albuminstabilisierender Substanzen Albumin von Blut und ähnlichen Produkten zu isolieren. Als Beispiele für geeignete stabilisierende Substanzen sind u.a. Caprionate erwähnt. Die Neigung des Äthanols oder ähnlicher Alkohole, die Proteine zu denaturieren, hat man dadurch aber nicht ganz verhindern können.

Weiterhin ist es aus der DK-AS 134 425 bekannt, Albumin dadurch herzustellen, daß eine Albuminlösung, beispielsweise Plazenta oder humanes Blutplasma, einem Thermo-, koaguliervorgang bei Temperaturen zwischen 52 und 64⁰C und einem pH-Wert zwischen 4,8 und 5,25 in Gegenwart von Caprylsäureionen unterzieht. Bei der Thermokoagulation werden Hämoglobin, denaturiertes Albumin und fremde Proteine ausgefällt. Das gereinigte Albumin bleibt in Lösung und kann daraus gewonnen werden. Durch diesen bekannten Vorgang wird aber nur ein recht unreines Produkt erhalten. Die Reinheit läßt sich zwar dadurch verbessern, vor der Thermokoagulation ein fraktionierendes Ausfällen, beispielsweise mit Trichloressxgsaure und Äthanol vorzunehmen, doch ist ein für therapeutische Zwecke geeignetes reines Produkt auch auf diese Weise I nicht erhältlich.

Eine Thermokoagulation ist schließlich noch aus der GB-PS 739 024 bekannt, jedoch nicht in Verbindung mit ,

einer vorhergehenden Polyäthylenglykolfällung. |

Gemäß der Erfindung wurde nun festgestellt, daß es mög- I

lieh ist, in einfacher Weise und ohne Zugabe von Alkoholen ein fraktionierendes Ausfällen von Albumin in ^; Gegenwart von Polyäthylenglykol mit einer Wärmebehandlung in Gegenwart von Caprylsäure als Stabilisator zu ι

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kombinieren, wodurch die Unreinheiten koagulieren, die sonst zusammen mit dem Albumin ausgefällt würden, und somit eine hohe Ausbeute an Albumin hoher Reinheit erzielt wird.

Das Verfahren gemäß der Erfindung zum Gewinnen von gereinigtem Albumin durch fraktionierendes Ausfällen aus Blutplasma zur Erzielung einer albuminhaltigen Fraktion, die in Wasser wiedergelöst und einen Thermokoaguliervorgang in wäßriger Lösung in Gegenwart einer stabilisierenden Menge Caprylsäure unterzogen wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß man Blutplasma mit Polyäthylenglykol vermischt und zum Ausfällen von Fibrinogen und Globulinen auf einen pH-Wert von 6 bis 7 einstellt, den Überstand mit einem Gehalt an 150 bis 300 g Polyäthylenglykol pro Liter Flüssigkeit zum Ausfällen von Albumin auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5,3 einstellt, das Albumin zusammen mit mitgerissenem Polyäthylenglykol in einem wäßrigen Medium erneut löst, die gebildete Albuminlösung bei 50° bis 65°C und einem pH-Wert von 4,6 bis 5,0 in Gegenwart einer stabilisierenden Menge Caprylsäure einem Thermokoaguliervorgang unterzieht und das gereinigte Albumin durch Ausfällen aus der Lösung isoliert.

Bei diesem Verfahren wird stabilisiertes Blutplasma benutzt, dem Polyäthylenglykol in einer zum Ausfällen geeigneten Menge zugegeben wird. Ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4000 ist beispielsweise gut geeignet, doch können auch Polyäthylenglykole mit höheren oder niedrigeren Molekulargewichten von beispielsweise 1000 bis 5000 verwendet werden. Die bevorzugte Menge an Polyäthylenglykol beträgt 180 bis 200 g pro Liter Flüssigkeit.

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Das Ausfällen der globulinhaltigen Fraktion wird, wie erwähnt, durch Einstellen des pH-Wertes auf 6 bis 7 durchgeführt; der optimale pH-Wert beträgt dabei etwa 6,7. Der Niederschlag wird zweckmäßig durch Zentrifugieren abgeschieden, worauf die abgetrennte albuminhaltige Lösung auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5,3, vorzugsweise von 4,9, eingestellt und eine albuminhaltige Fraktion ausgefällt wird. Diese Fraktion enthält einige Proteine, Verunreinigungen sowie Polyathylenglykol.

Dieser Niederschlag wird in Wasser, beispielsweise in einer Konzentration von etwa 80 g/l, erneut gelöst. Dann wird Caprylsäure, zweckmäßig in einer Menge von 2 bis 3 g/l, beispielsweise von 2,5 g/l, zugesetzt. Die Lösung wird auf einen pH-Wert von 4,6 bis 5,0, zweckmäßig von

4,8, eingestellt und auf 50° bis 65 C, vorzugsweise auf etwa 60°C, erhitzt, wobei die Erhitzungszeit zweckmäßig etwa 30 Minuten betragen kann.

Durch diese Wärmebehandlung koaguliert der größte Teil der noch anwesenden Proteinverunreinigungen aus. Bei einer derartigen Wärmebehandlung über etwa 55 C ohne Zugabe von Caprylsäure würde das Albumin abgebaut und die Ausbeute unbefriedigend niedrig werden.

Nach der Wärmebehandlung wird das Produkt abgekühlt und das Koagulat durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgeschieden. Aus der zentrifugierten oder filtrierten Lösung wird das gereinigte Albumin durch Ausfällen in an sich bekannter Weise isoliert. Hierbei kann Äthanol, vorzugsweise 40%, zugegeben und das gereinigte Albumin durch Einstellen des pH-Wertes auf 4,8 und Abkühlen auf eine Temperatur unter 0 C ausgefällt werden. Das Albumin wird, beispielsweise durch Zentrifugieren, abgetrennt und durch Gefriertrocknen getrocknet.

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Das Verfahren gemäß der Erfindung hat den Vorteil, daß man in einfacher Weise ein außerordentlich reines Albumin in hoher Ausbeute gewinnen kann. Das Verfahren zeichnet sich weiterhin dadurch aus, daß es in industriellem Maßstab durchgeführt v/erden kann. Das Denaturieren der Globuline wird vermieden, so daß die diese Proteine enthaltenden Fraktionen zur Gewinnung wertvoller Globuline in hoher Ausbeute und in reinem Zustand verwertet werden können.

Obwohl Polyäthylenglykol-Fällungen und Thermokoagulationen jeweils für sich bekannt waren, ist bisher nicht daran gedacht worden, diese Reinigungsmethoden zu kombinieren. Durch eine solche Kombination wird das Denaturieren des Albumins vermieden, was zweifellos die hohe Ausbeute erklärt. Es konnte jedoch nicht vorausgesehen werden, daß gleichzeitig eine wesentlich verbesserte Reinheit des Produktes erzielt werden kann.

Ein weiterer Vorteil des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht darin, daß Blutplasma als Ausgangsmaterial ver- ; wendet werden kann. Dies ist möglich, weil die Globuline j

ι nicht denaturiert werden, so daß diese in hoher Ausbeu- ^:

te gewonnen werden können. ι

Das Verfahren wird nachstehend anhand eines Beispiels näher erläutert. ^;

Beispiel

100 1 citrat-stabilisiertes humanes Plasma wird mit 137 1 einer 33 Gew.-% Polyäthylenglykol 3000 enthalten- ^!

den wäßrigen Lösung zur Erzielung einer Konzentration ' von 19% Polyäthylenglykol in der Endlösung vermischt. Der pH-Wert wird auf 6,7 ± 0,1 eingestellt. Nach 45 Minu-i ten wird die Mischung zentrifugiert. Der Niederschlag j

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besteht aus Fibrinogen und Globulin. Die überstehende Flüssigkeit enthält das Albumin. Dieser Flüssigkeit wird Essigsäure bis zu einem pH-Wert von 5,0 bis 4,8 zugegeben. Der sich bildende, aus Albumin bestehende Niederschlag wird abzentrifugiert. Das Albumin wird bei etwa 4O°C in 80 1 destilliertem Wasser erneut gelöst, worauf 200 ml Caprylsäure zugegeben werden. Der pH-Wert wird dann auf 4,8 + 0,1 mit 1-molar NaOH-Lösung in Wasser eingestellt und die Lösung 30 Minuten lang auf 60 ί 0,5⁰C erhitzt. Der entstehende Niederschlag wird abzentrifugiert. Die zentrifugierte Lösung wird mit kaltem Äthanol (40% Äthanol, - 5°C, pH = 4,8) gefällt.

Das ausgefällte Albumin wird abzentrifugiert und gefriergetrocknet. Nach Wiederlösung in destilliertem Wasser, Zugabe von 0,04-molar Caprylsäure und pH-Einstellung auf 7,0 i 0,4 wird die Lösung dann in Flaschen abgefüllt und 10 Stunden einer Wärmebehandlung bei 60⁰C unterzogen, worauf sie für therapeutische Zwecke Verwendung finden kann. Der Makrostoffgehalt, d.h. die Fraktion mit einem Molekulargewicht von mehr als 200.000 g/Mol, beträgt weniger als 0,1% der gesamten Proteinmenge. Die Ausbeute an Albumin beträgt etwa 90% des im Plasma enthaltenen Albumins.

Durch Elektrophorese unter Verwendung gefärbten PoIyacrylamids wird eine Reinheit des Albumins von mindestens 99,5% ermittelt.

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Claims

VON KREISLER SCHÖNWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973 Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Seifing, Köln Ke/To. 5 KÖLN 1, 13. Januar 1978 DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF Nordisk Insulinlaboratorium, Ved Stadion 2, DK-2820 Gentofte (Dänemark) Patentansprüche

1. Verfahren zum Gewinnen von gereinigtem Albumin durch fraktionierendes Ausfällen aus Blutplasma zur Erzielung einer albuminhaltigen Fraktion, die in Wasser wiedergelöst und einem Thermokoaguliervorgang in wäßriger Lösung in Gegenwart einer stabilisierenden Menge Caprylsäure unterzogen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man Blutplasma mit Polyäthylenglykol vermischt und zum Ausfällen von Fibrinogen und Globulinen auf einen pH-Wert von 6 bis 7 einstellt, den Überstand mit einem Gehalt an 150 bis 300 g Polyäthylenglykol pro Liter Flüssigkeit zum Ausfällen von Albumin auf einen pH-Wert von 4,5 bis 5,3 einstellt, das Albumin zusammen mit mitgerissenem Polyäthylenglykol in einem wäßrigen Medium erneut löst, die gebildete Albuminlösung bei 50° bis 65°C und einem pH-Wert von 4,6 bis 5,0 in Gegenwart einer stabilisierenden Menge Caprylsäure einem Thermokoaguliervorgang unterzieht und das gereinigte Albumin durch Ausfällen aus der Lösung isoliert.

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Telefon: (0221) 23 4541 - 4 - Telex: 8882307 dopa d ■ Telegramm: Dompatent Köln

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Caprylsäure während des Thermokoaguliervorganges in einer Menge von 2 bis 3 g Caprylsäure pro Liter Albuminlösung verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Thermokoagulation und dem Entfernen des Koagulats der abgekühlten Albuminlösung niedere Alkanole, vorzugsweise Äthanol, beimischt.

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OP'GINAL INSPECTED