NO780217L - Fremgangsmaate til utvinning av renset albumin fra blodplasma - Google Patents

Description

"Fremgangsmåte til utvinning av

ren set albumin fra blodplasma"

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til-utvinning av renset albumin ved fraksjonert felning av blodplasma.

Albumin er tidligere isolert fra blodplasma ved. fraksjonert felning med alkoholer, så som etanol, ved lave temperaturer, samt ved. feining i saltoppløsninger, f.eks. ved trinnvis tilsetning av ammoniumsulfat. Disse kjente metoder har forskjellige ulemper. Således vil feininger med etanol medføre en tilbøyelighet til denaturering av proteinet, hvorved utbyttet nedsettes, og saltfeininger gir urene produkter da det ikke oppnås noen skarp adskill.else.

Fra beskrivelsen til US-patent nr. 3.415.804 er det kjent en fremgangsmåte til fraksjonert felning av proteinstoffblandinger

i nærvær av polyetylenglykol (PEG), idet polyetylenglykol hemmer dispergerbarheten av proteinstoffene. Anvendt til fraksjonering av human blodplasma har.man ved denne fremgangsmåte oppnådd flere fraksjoner, herunder en albuminfraksjon, som imidlertid var for-urenset med beta-globulin og andre proteinstoffer. Ved denne kjente metode har man således ikke kunnet oppnå et tilfredsstillende renset albumin til terapeutisk anvendelse.'

Fra dansk patentansøkning nr. 1252/75 er det kjent

å isolere albumin fra blod og.lignende produkter ved oppvarmning

av den albuminholdige væske i nærvær av en alkohol og albumin-stabiliserende substanser. Som eksempler på stabiliserende substanser til dette formål er bl. a. nevnt k-apronater. Man har' imidlertid ikke derved helt kunnet unngå ulempene ved etanolens .eller lignende alkoholers tilbøyelighet til å- denaturere proteiner.

Videre er det fra dansk utlegningsskrift nr. 134.425 kjent å fremstille albumin ved å underkaste en albuminoppløsning,

..så som fra placenta eller human blodplasma, en termokoagulering

i nærvær av kaprylsyreioner ved temperaturer mellom.52 og 64°C ! og en pH-verdi mellom 4,8 og 5,25..Ved termokoaguleringen utfelles hemoglobin, denaturert albumin og fremmede proteiner,. Det rensede albumin forblir i oppløsning, hvorfra det kan utvinnes.

Ved denne kjente prosess fås dog et nokså urent produkt.

Renheten kan forbedres ved at det før termokoaguleringen foretas en fraksjonert felning, f.eks. med trikloreddiksyre og etanol, men et for terapeutiske formål egnet rent produkt kan dog ikke oppnås på denne måte. .En termokoagulering er også kjent fra britisk patent-■ skrift nr. 739.024, men ikke i forbindelse med en forutgående PEG-felning.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den erkjennelse, at det er mulig på enkel måtedg uten tilsetning av alkoholer,

å kombinere en fraksjonert felning av albumin i nærvær av PEG med en. varmebehandling i nærvær av kaprylsyre som stabilisator, hvorved

•det skjer en koagulering av■de urenheter som ellers ville felles .

ut sammen med albuminet. Det oppnås således et høyt utbytte av albumin med høy renhet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen karakteriseres således ved at blodplasma iblandes polyetylenglykol (PEG) og innstilles på en pH-verdi på 6-7 til utfelling av fibrinogen og globuliner, at væsken på toppen med et innhold av 150-300 g PEG, fortrinnsvis 180-200 g.PEG pr. liter væske innstilles på en pH-verdi på 4,5-5,3 for utfelning av albumin, at albuminet med medført.PEG gjenoppløses

.i-et vandig medium, at den dannede albuminoppløsning underkastes

en termokoagulering ved 50-65°C og pH 4,6-5,0 i nærvær av en.

stabiliserende mengde kaprylsyre, og at det rensede albumin isoleres fra oppløsningen ved utfelning.'Ved foreliggende frem-' gangsmåte benyttes stabilisert blodplasma,.hvortil det settes PEG

i en mengde som passer for utfelningén, f.eks. 150-300 g pr. liter, PEG 4000 er velegnet, men høyere eller lavere moiekyIvekter,

så som 1000-50.0000 kan anvendes. Den foretrukne mengde er 180-200 g PEG pr. liter væske.

Utfelningén av den globulinholdige fraksjon utføres som nevnt ved innstilling av pH-verdien til 6-7, men den optimale

pH-verdi er ca. 6,7. Bunnfallet fraskilles hensiktsmessig ved sentrifugering, og den frasentrifugerte albuminholdige oppløsning

innstilles derefter på en'.på en pH-verdi på 4,5-5,3, fortrinnsvis 4,9, hvorved en albumlnholdig fraks jon utfelles. Denne fraksjon inneholder en del proteiner, urenheter, samt PEG. Dette bunnfall oppløses pånytt i vann, f.eks. i en konsentrasjon på ca. 80 g/l.. Derefter tilsettes kaprylsyre, hensiktsmessig i en mengde på

2-3 g/l, f.eks. 2,5 g/l. Oppløsningen innstilles på en pH-verdi på 4,6-5,0, hensiktsmessig 4,8, og det oppvarmes til.50-65°C, fortrinnsvis ca. 6Q°C, idet oppvarmningstiden passende kan være ca. 30 minutter.

Ved denne varmebehandling utkoagulerer hovedparten av

de énnu tilstedeværende proteinstoff-urenhéter. Hvis en slik varmebehandling ble utført over ca.55°C uten.tilsetning av kaprylsyre, ville albuminet nedbrytes,' og utbyttet ville bli utilfredsstillende lavt.

'Efter varmebehandlingen avkjøles produktet og koagulatet. fraskilles ved sentrifugering eller filtrering. Fra den sentrifugerte eller filtrerte oppløsning isoleres det rensede albumin ve.d utfelning på i og for seg kjent måte. Således kan det.tilsettes ■ etanol, fortrinnsvis 40%, og ved innstilling av pH-verdien på 4,8 og avkjøling til . en temperatur under 0°C, utfelles renset albumin.. Dette oppsamles f.eks. ved sentrifugering, og tørres ved fryse-tørring.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har den fordel at .man på en enkel måte kan fremstille et meget rent albuminprodukt i høyt utbytte. Videre utmerker foreliggende fremgangsmåte seg ved at den kan benyttes i industriell målestokk.. Ved prosessen unngår man også å denaturere globulinene slik at fraksjonene som inneholder disse proteiner,.kan opparbeides for å oppnå verdi-fulle globuliner i høyt utbytte og i ren tilstand.

Selv om PEG-felninger og termokoaguleringer hver for seg har vært.kjent, har man ikke tidligere, tenkt på å kombinere disse rensningsmetoder. Ved en. slik kombinasjon unngår man å denaturere albuminet, hvilket utvilsomt ér forklaringen på det høye utbytte. Det har..dog ikke kunnet fprutsees at man samtidig oppnår en vesentlig forbedret renhet av produktet.

Enda en fordel ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen består i at man benytter blodplasma som utgangsmateriale. Dette.er mulig

fordi globulinene som nevnt ikke denatureres, slik at man kan opp-arbeide disse i høyt utbytte.

Fremgangsmåten ifølge- oppfinnelsen skal i det følgende

) illustreres nærmere ved hjelp av et eksempel. ■

<>>Eksempel

100 1 citrat-stabilisert humant plasma blandes med 137 1 33 vekt%ig vandig oppløsning av polyetylenglykol. 3000 for å oppnå

19% PEG i sluttoppløsningen. pH-verdien innstilles; på 6,7 ± 0,1. Efter henstand, i 45 minutter sentrifugeres blandingen. Bunnfallet består av fibrinogen og globulin.. Væsken på toppen inneholder albuminet. Den albuminholdige væske iblandes eddiksyre til pH 5,0-4,8.

Det dannede bunnfall som består av albumin, frasentri-' fugeres. Albuminet gjenoppløses i 80 1 destillert vann ved ca.-. 40°C, og det tilsettes 200 ml kaprylsyre. Ph-verdien innstilles på 4,8 ± 0,1 med IM NaOH-oppløsning M vann. Oppløsningen oppvarmes til 60 ± 0,5 °C i 30 minutter. Det dannede bunnfall frasentrifugeres. Den sentrifugerte oppløsning felles med kald etanol (40% etanol, -5°C, pH = 4,8).

Det utfelte albumin frasentrifugeres og frysetørres.

Efter gjenoppløsning i . des-tillert vann, tilsetning av 0,04 M kaprylsyre og'pH-innstilling på 7,0 ± 0,4 tappes oppløsningen så på flasker som varmebehandles ved 60°C i 10 timer for derefter å anvendes til terapeutisk bruk. Makrostoffinnholdet, dvs. fraksjonen med molekylvekt større enn 200.000 g/mol, er mindre enn 0,1% av den totale proteinmengde. Utbyttet av albumin er ca. 90% av albuminet til stede i plasmaet.'

Ved scan.ning av albuminet ved hjelp av farvet polyakryl-amidelektroforese påvises en renhet på minst 99,5%.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte til utvinning av renset albumin ved fraksjonert felning av blodplasma for. å oppnå en albuminholdig. fraksjon som gjenoppløses i vann og underkastes en termokoagulering i vandig oppløsning i nærvær av en stabiliserende mengde kaprylsyre, karakterisert ved at blodplasma iblandes polyétylenglykol (PEG) og innstilles på en pH-verdi på 6-7 for utfelning av fibrinogen og globuliner, at væsken på toppen med et innhold av 150-300 g PEG, fortrinnsvis 180-200 g PEG, pr. liter væske innstilles på en pH-verdi på 4,5-5,3 for utfelning av albumin, at albuminet med medført PEG gjenoppløses i et vandig.medium, at den dannede albuminopplø sning underkastes en termokoagulering ved 50-65°C og en pH-verdi på 4,6-5,0'i nærvær av en stabiliserende mengde kaprylsyre, og at det rensede albumin isoleres fra opplø sningen ved utfelning.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kaprylsyren anvendes i en mengde på 2-3 g kaprylsyre pr. liter albuminoppløsning under termokoaguleringen..

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at albuminoppløsningen efter termokoaguleringen og fjernelse av koagulatet og avkjølingen, iblandes en lavere alkanol., fortrinnsvis etanol for utfelning av det rensede albumin.