CN102076712A - 新型低芥酸菜子蛋白质分离物 - Google Patents

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Abstract

一种新型低芥酸菜子蛋白质分离物，其主要由2S低芥酸菜子蛋白质组成，并且在水性介质中具有相等到更好的溶解性和提高的透明性，该分离物具有提高比例的2S低芥酸菜子蛋白质和降低比例的7S低芥酸菜子蛋白质。该新型低芥酸菜子蛋白质分离物是如下来形成的：对来自低芥酸菜子蛋白质胶束形成和沉淀的水性上清液进行等电位沉淀，来进行7S蛋白质的沉淀，将该7S蛋白质进行沉降和除去。

Description

新型低芥酸菜子蛋白质分离物
相关申请的引用
本申请是2009年6月20日提交的US专利申请No.12/213499的部分连续申请。
发明领域
本发明涉及新型低芥酸菜子蛋白质分离物的生产及其在包括软饮料和运动饮料的水溶液中的用途。
背景技术
蛋白质含量为至少100wt%(Nx6.25)的低芥酸菜子油籽蛋白质分离物可以由油籽粉，通过下面的转让给这里的受让人的文献中所述的方法来形成：2002年5月3日提交的共同未决的US专利申请No.10/137391(US专利申请公开No.2003-0125526和WO02/089597)和2004年6月9日提交的US专利申请No.10/476230(US专利申请公开No.2004-0254353)，并且其公开内容在此引入作为参考。所述工序包括多步方法，包括：使用盐的水溶液提取低芥酸菜子油籽粉，从残留的油籽粉中分离所得到的蛋白质水溶液，将该水溶液的蛋白质浓度提高到至少大约200g/L，同时通过使用选择性膜技术来保持离子强度基本恒定，将所得到的浓缩蛋白质溶液稀释到冷水中，以引起蛋白质胶束的形成，使该蛋白质胶束沉降来形成无定形的，发粘的，凝胶状的类似谷蛋白的蛋白质胶束物质(PMM)，和从蛋白质含量为至少大约100wt%(Nx6.25)的上清液中回收蛋白质胶束物质。如文中使用的，蛋白质含量是基于干重来测量的。回收的PMM可以是干燥的。
在所述方法的一种实施方案中，对来自PMM沉降步骤的上清液进行加工，来从该上清液中回收低芥酸菜子蛋白质分离物。该工序可以如下来进行：最初使用超滤膜浓缩该上清液，并且干燥该浓缩物。所得到的低芥酸菜子蛋白质分离物的蛋白质含量为至少大约90wt%，优选至少大约100wt%(Nx6.25)。
US专利申请No.10/137391和10/476230中所述的方法基本是分批方法，在2002年11月19日提交的共同待决US专利申请No.10/298678(US专利申请公开No.2004-0039174和WO03/043439)中(其转让给这里的受让人，并且其公开内容在此引入作为参考)，描述了一种用于制备低芥酸菜子蛋白质分离物的连续方法。根据其内容，将低芥酸菜子油籽粉与盐的水溶液连续混合，将该混合物通过管道传送，同时从低芥酸菜子油籽粉中提取蛋白质，来形成蛋白质水溶液，将该蛋白质水溶液通过选择性膜操作连续传送，来将该蛋白质水溶液的蛋白质含量提高到至少大约50g/L，同时保持离子强度基本恒定，将所得到的浓缩蛋白质溶液与冷水连续混合，来引起蛋白质胶束的形成，并且使得该蛋白质胶束连续沉降，同时使上清液连续溢流，直到在沉降容器中已经积累了期望量的PMM为止。PMM从沉降容器中回收，并且可以干燥。该PMM的蛋白质含量是至少大约90wt%(Nx6.25)，优选至少大约100wt%。溢流的上清液可以加工，来从其中回收低芥酸菜子蛋白质分离物，如上所述。
已知的是低芥酸菜子籽包含大约10 wt%-大约30wt%的蛋白质，并且已经确认了几种不同的蛋白质成分。这些蛋白质包括12S球蛋白(也称作十字花科蛋白)，7S蛋白质和2S贮藏蛋白(也称作清蛋白)。如同下面的文献中所述，上述的工序包括将浓缩的蛋白质水溶液进行稀释，来形成PMM，并且加工该上清液来回收另外的蛋白质，导致不同蛋白质剖析图的分离物的回收：2003年4月15日提交的共同待决US专利申请No.10/413371(US专利申请公开No.2004-0034200和WO03/088760)和2005年4月29日提交的US专利申请No.10/510766(US专利申请公开No.2005-0249828)，转让给这里的受让人，并且其公开内容在此引入作为参考。
在这点上，PMM来源的低芥酸菜子蛋白质分离物具有下面的蛋白质成分含量：大约60 wt%-大约98wt%的7S蛋白质，大约1 wt%-大约15wt%的12S蛋白质和0-大约25wt%的2S蛋白质。该上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物具有下面的蛋白质成分含量：大约60 wt%-大约95wt%的2S蛋白质，大约5 wt%-大约40wt%的7S蛋白质和0-大约5wt%的12S蛋白质。因此，该PMM来源的低芥酸菜子蛋白质分离物主要是7S蛋白质，该上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物主要是2S蛋白质。如前述的US专利申请No.10/413371和10/510766中所述，该2S蛋白质的分子量是大约14000道尔顿，7S蛋白质的分子量是大约145000道尔顿，12S蛋白质的分子量是大约290000道尔顿。
Krzyzaniak等人此前在Nahrung(42)1998，Nr.3/4，第201-204页中描述了将来自于油菜籽的2S贮藏蛋白清蛋白净化到均一性和该蛋白质的第二结构和构造稳定性的表征。用缓冲液A(50mM NaH2PO4，pH7.0，1mM EDTA)从油菜籽中分离清蛋白，随后使用(NH4)2SO4进行沉淀，将所得到的小粒溶解在缓冲液A中，对相同的缓冲液渗析以及通过使用Sephadex G-50色谱柱的凝胶色谱法脱盐。收集含有清蛋白提取物的部分，并且用(NH4)2SO4重新沉淀。将所得到的粗清蛋白溶解到缓冲液B(pH7.4的缓冲液A)中，对它渗析，然后填充到CM-Sephadex C-50色谱柱上，并且用0.15-0.35M NaCl的梯度在缓冲液B中洗脱。将含有清蛋白的部分进行汇集，用(NH4)2SO4沉淀，重新溶解到缓冲液A中并渗析。清蛋白通过阳离子交换HPLC，使用高达1 M NaCl的梯度，在pH5.0进行进一步的净化。收集λ最大=280nm的部分，浓缩和分析。
本申请人知道下面的另外的参考文献，其描述了实验室制备2S低芥酸菜子蛋白质的样品，净化到均一性：
Berot，S.,Compoint,J.P.,Larre,C,Malabat,C.和Gueguen,J.2005.Large scale purification of rapeseed Proteins(Brassica napus L).J.Chromatography B,818：35-42;
Bhatty,R.S.,McKenzie,S.L.和Finlayson,A.J.1968。The proteins of rapeseed(Brassica napus L.)soluble in salt solutions.Can.J.Biochem.,46：1191-1197;
Gehrig,P.M.,Krzyzaniak,A.,Barciszewski,J.和Biemann,K.1996.Mass spectrometric amino acid sequencing of a mixture of seed storage proteins(napin) from Brassica napus,products of a multigene family.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93：3647-3652;
Monsalve,R.I.和Rodriguez,R.1990.Purification and characterization of proteins from the 2S fraction from seeds of the Brassicaceae family.J.Exper.Bot,41(222)：89-94;
Muren,E.,Ek,B.,Bjork,I.和Rask,L.1996.Structural comparison of the precursor and the mature form of napin,the 2S storage protein in Brassica napus.Eur.J.Biochem.,242：214-219。
这里提供的新型低芥酸菜子蛋白质分离物与这类公开内容的不同之处在于这里提供的2S为主的低芥酸菜子蛋白质分离物总是包含少量的7S蛋白质。
低芥酸菜子也称作油菜籽或者油菜。
发明内容
现在已经令人惊讶的发现了一种新型低芥酸菜子蛋白质分离物，其具有提高比例的2S蛋白质，优选含有至少大约85wt%的2S蛋白质，并且具有降低比例的7S蛋白质，该分离物在水溶液中表现出比按照前述US专利申请No.10/137391和10/476230的工序所制备的上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物更优的性能。
除了在不同的pH值时相同的或者更大的溶解性之外，这里提供的新型低芥酸菜子蛋白质分离物能够在具有软饮料和运动饮料的溶液中提供提高的透明度，提供透明的蛋白质强化饮料。此外，该新型低芥酸菜子蛋白质分离物在pH为大约3.5的大约0.1M氯化钠溶液中表现出比上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物更大的溶解性。
在本发明的一方面，提供了一种低芥酸菜子蛋白质分离物，其主要由2S低芥酸菜子蛋白质组成，其基于干重(d.b.)的蛋白质含量为至少大约90wt%(Nx6.25)，优选至少大约100wt%，并且当与主要由2S低芥酸菜子蛋白质组成，并且衍生自低芥酸菜子蛋白质胶束形成和沉淀的水性上清液的低芥酸菜子蛋白质分离物相比，该蛋白质分离物具有提高比例的2S低芥酸菜子蛋白质和降低比例的7S低芥酸菜子蛋白质。所述的低芥酸菜子蛋白质分离物衍生自所述上清液的7S蛋白质的等电位沉淀。
本发明的新型低芥酸菜子蛋白质分离物和组合物具有多种独特的性能，不同于上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物的性能，包括溶解性、透明度、热稳定性、在280nm的吸光度、表面疏水性和氨基酸剖析图。这些性能在下面描述，支持这种讨论的数据在下面的实施例中给出。
溶解性：
与上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物相比，该新型低芥酸菜子蛋白质分离物在宽pH范围和大约1%w/v的蛋白质浓度下在水中以及在碳酸和非碳酸软饮料和运动饮料中表现出相同的或者提高的溶解度。
另外，该新型低芥酸菜子蛋白质分离物在宽pH范围和大约1%w/v的蛋白质浓度时在水中表现出相同的或者提高的溶解性，其中，在形成溶液或者分散体之后，该样品离心分离来沉降不溶性材料和产生透明的上清液。
此外，与上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物相比，该新型低芥酸菜子蛋白质分离物在pH3.5的0.1M氯化钠溶液中表现出更大的溶解性。
透明度：
该新型低芥酸菜子蛋白质分离物可以混入到多种饮料中，包括碳酸和非碳酸软饮料以及果汁，潘趣酒和鸡尾酒，来为这类饮料提供蛋白质强化。这类饮料具有宽范围的pH值，从大约2.5-大约5，并且通常包装成12液体盎司的量。该新型低芥酸菜子蛋白质分离物可以以任何方便的量加入来为饮料提供蛋白质强化，例如，至少大约5g新型低芥酸菜子蛋白质分离物/12液体盎司量。
所加入的新型低芥酸菜子蛋白质分离物溶解在饮料中，并且不削弱该饮料的透明度。在蛋白质浓度为2wt%的透明饮料中，当通过测量600nm的可见光的吸光度来测定时，透明度小于大约0.5。在蛋白质浓度为1wt%的水中时，当通过测量600nm的可见光的吸光度来测定时，在大约2-大约7的pH范围中，该透明度小于大约1.0。
热稳定性：
本发明的新型低芥酸菜子蛋白质分离物在pH6和7时均具有比上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物提高的热稳定性。在来自上清液的7S蛋白质的等电位沉淀之后，如下面详细描述的那样，该热处理过的上清液在加热时抗另外的蛋白质沉积。
在280nm的吸光度：
本发明的新型低芥酸菜子蛋白质具有比上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物更低的在280nm的吸光度。这个结果表明与上清液来源的低芥酸菜子蛋白质相比，本发明的新型低芥酸菜子蛋白质分离物包含了较少的酪氨酸和色氨酸(其在280nm具有强的吸收)。
表面疏水性：
与上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物相比，本发明的新型低芥酸菜子蛋白质分离物具有更低的表面疏水性，这可能归因于该新型低芥酸菜子蛋白质分离物具有比上清液来源的低芥酸菜子蛋白质分离物更低的球蛋白含量。
该新型低芥酸菜子蛋白质分离物的表面疏水性通常小于大约25，优选小于大约20。
本发明的新型低芥酸菜子蛋白质分离物是按照US专利申请No.10/137391和10/476230中所述的方法，从浓缩的上清液中等电位沉淀7S蛋白质来制备的，目的是降低该浓缩的上清液中的7S蛋白质的比例，并因此提高2S蛋白质的比例。或者，该处理可以在浓缩之前或者在上清液部分浓缩之后在上清液上进行。因此，在本发明的另一方面，提供一种制备具有提高比例的2S低芥酸菜子蛋白质的低芥酸菜子蛋白质分离物的方法，其包括：(a)提供主要由2S蛋白质组成的2S和7S蛋白质的水溶液，(b)从该水溶液中等电位沉淀7S低芥酸菜子蛋白质，(c)从该水溶液中除去沉淀的7S蛋白质，和(d)回收低芥酸菜子蛋白质分离物，该分离物的蛋白质含量为至少大约90wt%(Nx6.25)d.b.，并且与2S和7S蛋白质的水溶液相比，该分离物具有提高比例的2S低芥酸菜子蛋白质。
附图说明
图1是一种蛋白质分离物回收方法的示意图；和
图2是一种工序的示意图，其用于根据图1所示的PMM形成方法，由上清液来生产本发明的新型低芥酸菜子蛋白质分离物。
发明的一般说明
本文提供的新型低芥酸菜子蛋白质分离物的蛋白质含量是至少大约90wt%(Nx6.25)，优选至少大约100wt%，并且可以通过分批方法，或者连续方法或者半连续方法从低芥酸菜子油籽粉中分离出来。
本文提供的新型低芥酸菜子蛋白质分离物主要由2S蛋白质组成，并且当与主要由2S蛋白质组成，并且衍生自低芥酸菜子蛋白质胶束形成和沉淀的上清液和在相同制备试验条件下制备的低芥酸菜子蛋白质分离物相比，该蛋白质分离物具有提高比例的2S低芥酸菜子蛋白质和降低比例的7S低芥酸菜子蛋白质。如前所述，本发明的新型低芥酸菜子蛋白质分离物，虽然具有降低比例的7S蛋白质和提高比例的2S蛋白质，但是总是存在着少量残留的7S蛋白质。该低芥酸菜子蛋白质分离物是通过7S蛋白质从上清液中等电位沉淀而衍生的。
该新型低芥酸菜子蛋白质分离物包含至少大约85wt%的2S低芥酸菜子蛋白质和小于大约15wt%的7S低芥酸菜子蛋白质，优选至少大约90wt%的2S低芥酸菜子蛋白质和小于大约10wt%的7S低芥酸菜子蛋白质，更优选尽可能大的比例的2S蛋白质。如上所述，这样的低芥酸菜子蛋白质分离物可以通过处理上清液、部分浓缩的上清液和浓缩的上清液来获得，如下面更详细描述的那样。该上清液，部分浓缩的上清液和浓缩的上清液的处理引起了7S蛋白质的沉淀，该7S蛋白质的沉淀可以通过任何方便的手段例如离心分离或者过滤来从该处理过的上清液中除去。2S蛋白质不受该处理的影响，因此该处理通过降低7S蛋白质的比例，来提高所存在的2S蛋白质的比例。
该新型低芥酸菜子蛋白质分离物可溶于处于宽pH值范围的水溶液中，通常是大约 pH2-大约 pH7.5，优选大约2-大约4，通常其溶解性等于或者大于主要由2S蛋白质组成，并且衍生自在相同制备试验条件下的低芥酸菜子蛋白质胶束形成和沉淀的上清液的低芥酸菜子蛋白质分离物的溶解性。另外，该新型低芥酸菜子蛋白质分离物在软饮料(包括碳酸和非碳酸软饮料二者)和运动饮料(包括碳酸和非碳酸运动能量饮料二者，例如市售的这些饮料)中的水溶液具有比由如下的低芥酸菜子蛋白质分离物(该分离物主要由2S蛋白质组成，并且衍生自在相同的制备条件下来自低芥酸菜子蛋白质胶束形成和沉淀的上清液)所生产的这类水溶液更大的透明度。
低芥酸菜子蛋白质分离物在水溶液中的浓度(包括在软饮料和运动饮料中的溶液中)可以根据该溶液的目标用途而变化。通常，该蛋白质的浓度可以是大约0.1 wt%-大约30wt%，优选大约1 wt%-大约5wt%。
因此，本发明包括此处提供的新型低芥酸菜子蛋白质分离物的水溶液，不仅包括上述的这些，而且还包括其他饮料，例如果汁，酒精饮料，咖啡基饮料和乳制饮料。
提供低芥酸菜子蛋白质分离物的方法的初始步骤包括增溶来自低芥酸菜子油籽粉的蛋白质材料。回收自低芥酸菜子籽粉的该蛋白质材料可以是天然存在于低芥酸菜子籽中的蛋白质，或者该蛋白质材料可以是通过基因操纵改性的，但是具有天然蛋白质特有的疏水性和极性的蛋白质。该低芥酸菜子粉可以是通过从低芥酸菜子油籽中除去低芥酸菜子油而形成的任意低芥酸菜子粉，具有不同含量的非变性蛋白质，例如是由热己烷萃取或者冷油挤出方法形成的。从低芥酸菜子油籽中除去低芥酸菜子油通常是作为与这里所述的蛋白质分离物回收工序分开的操作来进行的。
蛋白质增溶最有效是通过使用食品级盐溶液来进行的，因为盐的存在提高了可溶性蛋白质从油籽粉中的除去率。在该低芥酸菜子蛋白质分离物打算用于非食品用途的情况中，可以使用非食品级化学品。所述的盐通常是氯化钠，但是也可以使用其他的盐例如氯化钾。该盐溶液的离子强度是至少大约0.05，优选至少大约0.10，以使得能够对显著量的蛋白质进行增溶。随着该盐溶液离子强度的升高，油籽粉中的蛋白质的增溶度初始时升高，直到达到一个最大值为止。离子强度随后的任何升高都不增加总的增溶的蛋白质。食品级盐溶液的离子强度(其引起了最大的蛋白质增溶度)是根据所涉及的盐和所选择的油籽粉而变化的。
由于随着离子强度的增加，蛋白质沉淀需要更大的稀释度，因此通常优选的是使用小于大约0.8的离子强度值，和更优选大约0.1-大约0.15的值。
在分批方法中，蛋白质的盐增溶是在大约5℃-大约75℃的温度进行的，优选伴随着搅拌，来减少增溶时间，增溶时间通常是大约10-大约60分钟。优选的是进行增溶，来从油籽粉中充分提取尽可能多的蛋白质，目的是提供整体高的产率。
选择大约5℃的温度下限，因为增溶在低于该温度时不切实际得慢，而所选择的优选的温度上限是大约75℃，这归因于所存在的一些蛋白质的变性温度。
在连续方法中，从低芥酸菜子油籽粉中提取蛋白质是以与从低芥酸菜子油籽粉中进行蛋白质的连续提取相一致的任何方式来进行的。在一种实施方案中，将低芥酸菜子油籽粉与食品级盐溶液连续混合，将该混合物通过具有一定长度的管子或者管道并且以一定的流速进行传送，达按照此处所述的参数进行期望的提取的停留时间。在这样的连续工序中，盐增溶步骤是在高达大约10分钟的时间内快速进行的，优选进行增溶来从低芥酸菜子油籽粉中充分提取尽可能多的蛋白质。连续工序中的增溶是在大约5℃-大约75℃，优选大约15℃-大约35℃的温度进行的。
该食品级盐的水溶液通常的pH是大约5-大约6.8，优选大约5.3-大约6.2，通过使用任何方便的酸(通常是盐酸)或者碱(通常是氢氧化钠)，该盐溶液的pH可以根据需要调整到提取步骤中所用的大约5-大约6.8范围内的任何期望值。
在增溶步骤过程中，该食品级盐溶液中的油籽粉的浓度可以广泛地变化。典型的浓度值是大约5%-大约15%w/v。
使用盐的水溶液的蛋白质提取步骤具有增溶脂肪的另外的作用，该脂肪可以存在于低芥酸菜子粉中，这因此产生了存在于水相中的脂肪。
由该提取步骤所产生的蛋白质溶液通常的蛋白质浓度是大约5-大约40g/L，优选大约10-大约30g/L。
该盐的水溶液可以包含抗氧化剂。抗氧化剂可以是任何常规的抗氧化剂，例如亚硫酸钠或者抗坏血酸。抗氧化剂的用量可以是溶液的大约0.01 wt%到大约1wt%，优选的是大约0.05wt%。抗氧化剂用于抑制蛋白质溶液中的酚类的氧化。
由提取步骤所形成的水相然后可以通过任何方便的方式来与残留的低芥酸菜子粉分离，例如使用沉降式离心机，随后使用盘式离心分离和/或过滤来除去残留的粉。分离的残留粉可以干燥处置。
最终的低芥酸菜子蛋白质分离物的颜色可以如下在浅色和不太深的黄色方面进行改善：将粉末化的活性炭或者其他颜料吸附剂与该分离的蛋白质水溶液混合，随后除去该吸附剂，方便的是通过过滤来除去，以提供蛋白质溶液。还可以使用渗滤来除去颜料。
这样的颜料除去步骤可以在任何方便的条件下，通常在分离的蛋白质水溶液的环境温度下，使用任何合适的颜料吸附剂来进行。对于粉末化的活性炭来说，用量是大约0.025%-大约5%w/v，优选大约0.05%-大约2%w/v。
在低芥酸菜子籽粉包含显著量的脂肪的情况中(如US专利No.5844086和6005076中所述，其转让给这里的受让人，并且其公开内容在此引入作为参考)，则可以在分离的蛋白质水溶液和下面所讨论的浓缩的蛋白质水溶液上进行其中所述的脱脂步骤。当进行颜色改善步骤时，该步骤可以在第一脱脂步骤之后进行。
作为用盐的水溶液来提取油籽粉的一个变化方案，这样的提取可以单独使用水来进行，虽然单独使用水往往从油籽粉中提取比盐的水溶液更少的蛋白质。在使用这样的变化方案的情况中，则在与残留的油籽粉分离之后，处于上述浓度中的盐可以加入到该蛋白质溶液中，目的是在下述的浓缩步骤过程中将该蛋白质保持在溶液中。当进行第一脂肪除去步骤时，盐通常是在这样的操作完成之后加入的。
另外一种可选择的工序是用处于下面的相对高的pH值的食品级盐溶液来提取该油籽粉：高于大约6.8，通常高达大约9.9。该食品级盐溶液的pH可以通过使用任何方便的食品级碱(例如氢氧化钠水溶液)调整到期望的碱值。或者，该油籽粉可以用处于下面的相对低的pH的盐溶液来提取：低于大约 pH5，通常低至大约 pH3。在使用这样的变化方案的情况中，然后将油籽粉提取步骤所形成的水相与残留的低芥酸菜子粉通过任何方便的方式进行分离，例如通过使用沉降式离心机，然后使用盘式离心分离和/或过滤来除去残留的粉。分离的残留粉可以干燥处置。
由高或者低pH提取步骤所形成的该蛋白质水溶液然后在下面所述的进一步加工之前，如上所述将pH调整到大约5-大约6.8，优选大约5.3-大约6.2。这样的pH调整可以使用任何方便的酸(例如盐酸)或者碱(例如氢氧化钠)来适当进行。
浓缩该蛋白质水溶液来提高其蛋白质浓度，同时保持其离子强度基本恒定。通常进行这样的浓缩来提供浓缩的蛋白质溶液，该溶液的蛋白质浓度为至少大约50g/L，优选至少大约200g/L，更优选至少大约250g/L。
该浓缩步骤可以通过与分批或者连续操作相一致的任何方便的方式来进行，例如通过使用任何方便的选择性膜技术，例如超滤或者渗滤，使用膜，例如空心纤维膜或者螺旋缠绕的膜，针对不同的膜材料和构造具有合适的截留分子量，例如大约3000-大约100000道尔顿，优选大约5000-大约10000道尔顿膜，并且对于连续操作来说，确定尺寸来使得当蛋白质水溶液通过膜时，实现期望的浓缩度。
作为公知的，超滤和类似的选择性膜技术允许低分子量物质通过膜，同时阻止较高分子量的物质通过。该低分子量物质不仅包括食品级盐的离子性物质，而且还包括从源材料中提取的低分子量材料，例如碳水化合物、颜料和抗营养因子，以及任何低分子量形式的蛋白质。通常对膜的截留分子量进行选择，来保证显著比例的蛋白质在溶液中的保持，同时针对不同的膜材料和构造允许污染物通过。
该浓缩的蛋白质溶液然后可以使用与提取溶液具有相同摩尔浓度和pH的盐的水溶液，来进行渗滤步骤。这样的渗滤可以使用大约2-大约20体积的渗滤溶液，优选大约5-大约10体积的渗滤溶液来进行。在该渗滤操作中，通过使渗透物穿过所述膜，而从蛋白质水溶液中除去另外量的污染物。可以进行该渗滤操作，直到在渗透物中没有明显的另外量的污染物和可见的颜色存在为止。这样的渗滤可以使用与浓缩步骤相同的膜来进行。但是，如果期望的话，该渗滤步骤可以使用具有不同的截留分子量的单独膜来进行，例如截留分子量针对不同的膜材料和构造为大约3000-大约100000道尔顿，优选大约5000-大约10000道尔顿的膜来进行。
在至少部分的渗滤步骤过程中，抗氧化剂可以存在于渗滤介质中。该抗氧化剂可以是任何方便的抗氧化剂，例如亚硫酸钠或者抗坏血酸。在渗滤介质中所用的抗氧化剂的量取决于所用的材料，并且可以为大约0.01 wt%到大约1wt%，优选是大约0.05wt%。抗氧化剂用于抑制浓缩的低芥酸菜子蛋白质分离物溶液中所存在的酚类的氧化。
该浓缩步骤和渗滤步骤可以在任何方便的温度下，通常是大约20°-大约60℃，优选大约20-大约30℃进行，并且进行一定的时间来实现期望的浓缩度。所用的温度和其他条件一定程度上取决于用于实现所述浓缩的膜装置和所述溶液的期望的蛋白质浓度。
如果需要，该浓缩的和任选的渗滤的蛋白质溶液可以进行另外的脱脂操作，如US专利No.5844086和6005076所述。
该浓缩的和任选的渗滤的蛋白质溶液可以进行脱色操作，作为上述的脱色操作的一个变化方案。粉末化的活性炭以及粒状活性炭(GAC)可以用于此。另外一种能够用作颜色吸附剂的材料是聚乙烯吡咯烷酮。
该颜色吸附剂处理步骤可以在任何方便的条件下进行，通常在低芥酸菜子蛋白质溶液的环境温度进行。对于粉末化的活性炭来说，用量可以是大约0.025%-大约5%w/v，优选大约0.05%-大约2%w/v。在使用聚乙烯吡咯烷酮作为颜色吸附剂的情况中，用量可以是大约0.5%-大约5%w/v，优选大约2%-大约3%w/v。该颜色吸附剂可以通过任何方便的手段(例如通过过滤)来从该低芥酸菜子蛋白质溶液中除去。
由任选的脱色步骤所形成的该浓缩的和任选渗滤的蛋白质溶液可以进行巴氏杀菌，来杀灭任何细菌，该细菌可能因为存储等原因而存在于初始的粉中和在提取步骤从该粉中提取到低芥酸菜子蛋白质溶液中。这样的巴氏杀菌可以在任何期望的巴氏杀菌条件下进行。通常，将该浓缩的和任选渗滤的蛋白质溶液加热到大约55°-大约70℃，优选大约60°-大约65℃的温度保持大约10-大约15分钟，优选大约10分钟。该巴氏杀菌过的浓缩蛋白质溶液然后可以冷却来用于下述的进一步的加工，优选冷却到大约25°-大约40℃的温度。
取决于在浓缩步骤和任选的渗滤步骤中所用的温度以及是否进行了巴氏杀菌步骤，该浓缩的蛋白质溶液可以升温到至少大约20°，和高达大约60℃，优选大约25°-大约40℃，来降低该浓缩的蛋白质溶液的粘度，以便于随后的稀释步骤和胶束形成的性能。该浓缩的蛋白质溶液不应当加热超过这样的温度，高于该温度时，用冷水稀释时不形成胶束。
由浓缩步骤，和任选的渗滤步骤，任选的脱色步骤，任选的巴氏杀菌步骤和任选的脱脂步骤所形成的该浓缩的蛋白质溶液然后如下稀释，来实现胶束形成：将该浓缩的蛋白质溶液与冷水混合，该冷水具有实现期望的稀释度所需的体积。取决于通过胶束路线所获得的期望的低芥酸菜子蛋白质的比例和来自上清液的比例，该浓缩的蛋白质溶液的稀释度可以变化。通常，稀释程度越低，保持在水相中的低芥酸菜子蛋白质的比例就越大。
当期望通过胶束路线来提供最大比例的蛋白质时，将该浓缩的蛋白质溶液稀释大约5倍-大约25倍，优选大约10倍-大约20倍。
与浓缩的蛋白质溶液进行混合的冷水的温度小于大约15℃，通常是大约1°-大约15℃，优选小于大约10℃，这是因为在所用的稀释因数时，使用这些较冷的温度获得了蛋白质胶束物质形式的蛋白质分离物的产率的提高。
在分批操作中，将批量的该浓缩的蛋白质溶液加入到具有期望体积的静态冷水体中，如上所述。该浓缩的蛋白质溶液的稀释和因此产生的离子强度的降低导致形成了高度相关的蛋白质分子的云状物质，其处于胶束形式中的离散蛋白质滴的形式。在该分批工序中，使该蛋白质胶束沉降到冷水体中，来形成团聚的、聚结的、致密的、无定形的粘稠谷蛋白状蛋白质胶束物质(PMM)。该沉降可以例如通过离心法来帮助。这样的诱导沉降降低了蛋白质胶束物质的液体含量，由此将含水量从通常总胶束质量的大约70重量%-大约95重量%降低到通常为大约50重量%-大约80重量%的值。以此方式降低胶束物质的含水量还降低了该胶束物质的吸留的盐的含量，并因此降低了干燥的分离物的盐含量。
或者，该稀释操作可以如下来连续进行：使得该浓缩的蛋白质溶液连续通过T形管的一个入口，同时将稀释水供给到该T形管的另一入口，使得其在该管中混合。该稀释水是以足以实现浓缩的蛋白质溶液期望的稀释度的速度供给到T形管中。
该浓缩的蛋白质溶液和稀释水在管道中的混合引起了蛋白质胶束的形成，并且该混合物从T形管的出口连续供给到沉降容器中，当该容器充满时，使上清液从该容器中溢流。该混合物优选以使得所述液体中的紊流最小的方式供给到沉降容器中的液体中。
在该连续工序中，使得蛋白质胶束在沉降容器中沉降，来形成团聚的、聚结的、致密的、无定形的粘稠谷蛋白状蛋白质胶束物质(PMM)，并且继续该工序，直到期望量的PMM已经聚集在该沉降容器的底部为止，在这里将该聚集的PMM从该沉降容器中除去。在通过沉淀进行沉降的场合中，该PMM可以通过离心法来连续分离。
与使用在前述US专利申请中所讨论的任何已知的现有技术的蛋白质分离物形成工序所达到的产率相比，将蛋白质溶液浓缩到至少大约200g/L的优选的蛋白质含量的加工参数与使用大约10-大约20的稀释因数的组合，产生了更高的产率，经常是明显更高的产率，该产率表现在从初始的粉提取物中回收蛋白质胶束物质形式的蛋白质方面，和表现在蛋白质含量方面纯得多的分离物方面。
与分批方法相比，通过使用连续方法来回收低芥酸菜子蛋白质分离物，对相同的蛋白质提取程度来说，初始的蛋白质提取步骤的时间可以显著缩短，并且在该提取步骤中可以使用显著更高的温度。此外，在连续操作中，存在着比分批方法更少的污染机会，这产生了更高的产品品质，并且该方法可以在更紧凑的装置中进行。
该沉降的分离物是如下来与残留的水相或者上清液分离的：例如通过将该残留的水相从沉降物中滗析或者通过离心分离。该PMM可以以湿的形式使用，或者可以通过任何方便的技术进行干燥，例如喷雾干燥或者冻干，成为干燥形式。该干燥的PMM具有高的蛋白质含量，超过大约90wt%蛋白质，优选至少大约100wt%蛋白质(作为凯氏法计算Nx6.25)，并且基本上是未变性的(通过差示扫描量热法来测量)。从脂肪油籽粉中分离的干燥PMM还具有低的残留脂肪含量，当必需使用US专利5844086和6005076的工序时，其可以是大约1wt%以下。
如前述的US专利申请No.10/413371和10/510766所述，该PMM主要由7S低芥酸菜子蛋白质组成，其蛋白质成分含量为大约60-98wt%的7S蛋白质，大约1-大约15wt%的12S蛋白质和0-大约25wt%的2S蛋白质。
来自PMM形成和沉降步骤的上清液包含显著量的低芥酸菜子蛋白质，其没有在稀释步骤中沉淀，并且加工以从其中回收低芥酸菜子蛋白质分离物。如前述US专利申请No.10/413371和10/510766中所述，来源于上清液的低芥酸菜子蛋白质分离物主要由2S低芥酸菜子蛋白质组成，具有下面的蛋白质成分含量：大约60-大约95wt%的2S蛋白质，大约5-大约40wt%的7S蛋白质和0-大约5wt%的12S蛋白质。
将来自稀释步骤的上清液，在除去PMM之后，进行浓缩来提高其蛋白质浓度。这样的浓缩是使用任何方便的选择性膜技术例如超滤，使用膜来实现的，该膜具有合适的截留分子量，来允许低分子量物质(包括盐和提取自蛋白质源材料的其他非蛋白质的低分子量材料)通过该膜，同时将低芥酸菜子蛋白质保持在溶液中。可以使用这样的超滤膜，其针对不同的膜材料和构造具有大约3000-100000道尔顿，优选大约5000-大约10000道尔顿的截留分子量。以此方式浓缩该上清液还减少了干燥来回收蛋白质所需的液体的体积。在干燥之前，通常将该上清液浓缩到下面的蛋白质浓度：至少大约50g/L，优选大约100-大约300g/L，更优选大约200-大约300g/L。这样的浓缩操作可以以分批模式或者以连续操作来进行，如上面所述的蛋白质溶液浓缩步骤那样。
该浓缩的上清液然后可以使用水，盐水或者酸化的水来进行渗滤步骤。这样的渗滤可以使用大约2-大约20体积的渗滤溶液，优选大约5-大约10体积的渗滤溶液来进行。在该渗滤操作中，通过使渗透物穿过所述膜，而从含水上清液中除去了另外量的污染物。可以进行该渗滤操作，直到在渗透物中没有明显的另外量的污染物和可见的颜色存在为止。这样的渗滤可以使用与浓缩步骤相同的膜来进行。但是，如果期望的话，该渗滤可以使用单独的膜来进行，例如截留分子量针对不同的膜材料和构造为大约3000-大约100000道尔顿，优选大约5000-大约10000道尔顿的膜来进行。
在至少部分的渗滤步骤过程中，抗氧化剂可以存在于渗滤介质中。该抗氧化剂可以是任何方便的抗氧化剂，例如亚硫酸钠或者抗坏血酸。在渗滤介质中所用的抗氧化剂的量取决于所用的材料，并且可以为大约0.01 wt%到大约1wt%变化，优选是大约0.05wt%。抗氧化剂用于抑制浓缩的低芥酸菜子蛋白质分离物溶液中所存在的酚类的氧化。
该浓缩的和任选的渗滤的蛋白质溶液可以进行脱色操作，作为上述的脱色操作的一个变化方案。粉末化的活性炭以及粒状活性炭(GAC)可以用于此。另外一种能够用作颜色吸附剂的材料是聚乙烯吡咯烷酮。
该颜色吸附剂处理步骤可以在任何方便的条件下进行，通常在低芥酸菜子蛋白质溶液的环境温度进行。对于粉末化的活性炭来说，用量可以是大约0.025%-大约5%w/v，优选大约0.05%-大约2%w/v。在使用聚乙烯吡咯烷酮作为颜色吸附剂的情况中，用量可以是大约0.5%-大约5%w/v，优选大约2%-大约3%w/v。该颜色吸附剂可以通过任何方便的手段(例如通过过滤)来从该低芥酸菜子蛋白质溶液中除去。
根据本发明，该浓缩的和任选的渗滤的上清液，在任选的脱色操作之后，进行处理，通过等电位沉淀降低存在于该溶液中的7S蛋白质的量，和除去该7S蛋白质，由此提高浓缩的上清液中所存在的低芥酸菜子蛋白质中的2S蛋白质的比例。
这样的处理可以在这样的pH和盐条件下进行，该条件足以降低浓缩的上清液中存在的7S的比例，优选将7S蛋白质的比例降低到明显的程度。通常，通过所述处理，该上清液中的7S蛋白质含量降低至少大约50wt%，优选至少大约75wt%。沉淀的7S蛋白质可以通过任何方便的方式除去，例如离心法或者过滤或者其组合。
在等电位处理工序中，盐(通常是氯化钠，虽然也可以使用其他的盐例如氯化钾)首先加入到该上清液，部分浓缩的上清液或者浓缩的上清液中，来提供具有下面的电导率的盐化溶液：至少大约0.3mS，优选大约10-大约20mS。
将该盐化的上清液的pH调整到一定的值，来引起7S蛋白质的等电位沉淀，通常调整为大约2.0-大约4.0，优选大约3.0-大约3.5的pH。7S蛋白质的等电位沉淀可以在宽的温度范围进行，通常是大约5℃-大约70℃，优选大约10℃-大约40℃。该沉淀的7S蛋白质是通过任何方便的手段来从等电位沉淀的上清液中除去的，例如离心法或者过滤或者其组合。
该等电位沉淀的上清液，如果还没有浓缩，则在干燥该浓缩的和渗滤的上清液来形成本发明的低芥酸菜子蛋白质分离物之前，如上所述进行浓缩和渗滤来除去所述的盐。该浓缩的、渗滤的和等电位沉淀的上清液可以过滤来除去残留的微粒，并且进行任选的脱色步骤，如上所述，然后通过任何方便的技术例如喷雾干燥或者冻干来进行干燥，成为干燥的形式，来提供本发明的低芥酸菜子蛋白质分离物。这样的低芥酸菜子蛋白质分离物具有高的蛋白质含量，超过大约90wt%，优选至少大约100wt%蛋白质(Nx6.25)。
在干燥之前，可以将该浓缩的，渗滤的和等电位沉淀的上清液的pH调整到对应于干燥的分离物的目标用途的pH，通常的pH是大约2-大约5，优选大约2.5-大约4。
这样新型低芥酸菜子蛋白质分离物包含高比例的2S蛋白质，优选占分离物中的低芥酸菜子蛋白质的至少90wt%和最优选至少大约95wt%。该分离物中还有一定比例的7S蛋白质。
或者，在上述的浓缩和渗滤步骤之前，等电位处理该上清液来沉淀7S蛋白质可以在该上清液上进行。在除去沉积7S蛋白质之后，该上清液然后浓缩，任选的渗滤，任选的进行脱色操作，并且干燥来提供本发明的低芥酸菜子蛋白质分离物。
作为另外一种变化方案，该上清液首先可以部分浓缩到任何方便的程度。该部分浓缩的上清液然后进行等电位处理来沉淀7S蛋白质。在除去沉淀的7S蛋白质之后，将该上清液进一步浓缩，通常到大约50-大约300g/L，优选大约200-大约300g/L的浓度，任选的渗滤，任选的进行脱色操作，和干燥来提供本发明的低芥酸菜子蛋白质分离物。
沉淀的7S蛋白质是通过任何方便的手段来从上清液，部分浓缩的上清液或者浓缩的上清液中除去的，例如离心法或者过滤或者其组合。
在除去沉淀的7S蛋白质之后，该等电位处理的上清液或者部分浓缩的，等电位处理的上清液可以在浓缩或者渗滤之中或者之后的任何时间点进行pH调整，如上所述。
具体实施方式
参考图1，在其中表示了双膜方法，与通过胶束路线形成低芥酸菜子蛋白质分离物(CPI)进行对比。
从中可见，来自第一超滤阶段(超滤#1，其可以包括超滤和渗滤步骤)的滞留物是以两种方式之一来加工的。在双膜方法中，将该滞留物喷雾干燥来提供低芥酸菜子蛋白质分离物，该分离物主要由7S低芥酸菜子蛋白质组成。
在前述US专利申请No.10/137321和10/476230的工序中，将该滞留物送到稀释步骤，在其中低芥酸菜子蛋白质分离物是作为蛋白质胶束物质而沉淀的。将该蛋白质胶束物质喷雾干燥来提供低芥酸菜子蛋白质分离物，该分离物主要由7S低芥酸菜子蛋白质组成。
在该双膜实施方案中，来自第一超滤步骤的渗透物进行第二超滤步骤(超滤#2-A)，其可以包括超滤和渗滤。将来自第二超滤步骤的滞留物喷雾干燥，来提供主要由2S蛋白质组成的低芥酸菜子蛋白质分离物。
在US10/137321和US10/476230的工序中，将来自蛋白质胶束物质沉淀的上清液进行超滤步骤(超滤#2-B)，其可以包括超滤和渗滤。对来自该超滤步骤的滞留物进行7S蛋白质的等电位沉淀，然后喷雾干燥，来提供主要由2S蛋白质组成的低芥酸菜子蛋白质分离物。
参考图2，其中表示了用于加工来自胶束方法的上清液的工序，来产生本发明的新型低芥酸菜子蛋白质分离物，其中该上清液的等电位沉淀是在浓缩(超滤 #2)之后(右手流向)或者浓缩之前(左手流向)进行的。
实施例
实施例1：
该实施例描述了一种工序，用于生产新型低芥酸菜子蛋白质分离物。
将“a”kg的低芥酸菜子粉加入到环境温度的“b”L的0.1 M NaCl溶液中，并且搅拌30分钟来提供蛋白质水溶液。除去该残留的低芥酸菜子粉，并且将所得到的蛋白质溶液通过离心法和过滤进行澄清化，来产生“c”L的过滤的蛋白质溶液，该溶液的蛋白质含量是“d”重量%。
如下来将“e”L的等份部分的该蛋白质提取溶液的体积降低到“f”L：在截留分子量为5000道尔顿的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上浓缩，然后在相同的膜上用“g”L的0.1M NaCl溶液进行渗滤。然后将该渗滤的滞留物在60℃巴氏杀菌10分钟。所得到的巴氏杀菌过的浓缩的蛋白质溶液的蛋白质含量为“h”重量%。
将该“i”℃的浓缩溶液稀释“j”，成为温度“k”℃的冷RO水。立即形成了白雾，并且使其沉降。除去上面的稀水，从容器底部回收沉淀的，粘稠的，发粘物质(PMM)，产率为过滤的蛋白质溶液的“l”wt%。发现该干燥的PMM来源的蛋白质的蛋白质含量为“m”%(N x6.25)d.b.。该产物命名为“n”C300。
用于两个过程的参数“a”-“n”在下表I中列出：
表I
Figure 542537DEST_PATH_IMAGE001
。
如下来将除去的上清液的体积降低到“o”L：使用截留分子量为10000道尔顿的聚醚砜(PES)膜进行超滤，然后将该浓缩物在相同的膜上用“p”L的水进行渗滤。该渗滤的浓缩物然后在60℃巴氏杀菌10分钟。该巴氏杀菌的浓缩物包含“q”重量%的蛋白质。使用从上清液回收的另外的蛋白质时，该过滤的蛋白质溶液整体的蛋白质回收率是“r”wt%。将该巴氏杀菌过的浓缩物分成两个相等的部分。一部分喷雾干燥，来形成命名为“n”C200的最终产物，该产物的蛋白质含量是“s”%(Nx6.25)d.b.。
用于两个过程的参数“n”-“s”在下表II中列出：
表II
Figure 485086DEST_PATH_IMAGE002
。
将另一部分的巴氏杀菌过的浓缩上清液加热到85℃保持10分钟，然后离心分离除去沉淀的蛋白质。所形成的浓缩物然后喷雾干燥，来形成命名为“n”C200H的最终产物，该产物的蛋白质含量为“t”%(N x6.25)。用于两个过程的参数“n”和“t”在下表III中列出：
表III
Figure 860703DEST_PATH_IMAGE003
。
实施例2：
这种实施例描述了一种可选择的工序，用于生产新型低芥酸菜子蛋白质分离物。
将低芥酸菜子粉加入到环境温度的氯化钠溶液中，并且搅拌30分钟来提供蛋白质水溶液。除去该残留的低芥酸菜子粉，并且将所得到的蛋白质通过离心法和过滤进行澄清化。
如下来将等份部分的该蛋白质提取溶液的体积降低：在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上浓缩，然后在相同的膜上用氯化钠溶液任选的进行渗滤。然后将该滞留物在60℃巴氏杀菌10分钟。
将该浓缩的溶液稀释到冷RO水中。立即形成了白雾，并且使其沉降。除去上面的稀水，通过滗析或者离心分离来回收沉淀的、粘稠的、发粘物质(PMM)。将该PMM喷雾干燥来形成最终的产物。
然后在所除去的稀水(称作上清液)，部分浓缩的上清液或者浓缩的上清液上进行热处理。
在热处理是在浓缩的上清液上进行的情况中，如下来将“a”L上清液的体积降低到“b”L：使用截留分子量为“c”道尔顿的聚醚砜(PES)膜进行超滤，然后将该浓缩物在相同的膜上用“d”L的水进行渗滤。该渗滤的浓缩物然后在60℃巴氏杀菌10分钟。该巴氏杀菌的浓缩物包含“e”重量%的蛋白质。使用从上清液回收的另外的蛋白质时，该过滤的蛋白质溶液整体的蛋白质回收率是“f”wt%。将该巴氏杀菌过的浓缩物分成两个相等的部分。一部分“g” L喷雾干燥，来形成命名为“h” C200的最终产物，该产物的蛋白质含量是“i”%(Nx6.25)d.b.。
用于六个过程的参数“a”-“i”在下表IV中列出：
表IV
Figure 281320DEST_PATH_IMAGE004
。
将另一部分“j”L的巴氏杀菌的浓缩上清液加热到85℃保持10分钟，然后离心分离来除去沉淀的蛋白质。所得到的浓缩物然后喷雾干燥，来形成命名为“h”C200H的最终产物，该产物的蛋白质含量为“k”%(Nx6.25)d.b.。用于六个过程的参数“h”，“j”和“k”在下表V中列出：
表V
Figure 753890DEST_PATH_IMAGE005
。
在热处理是在上清液或者部分浓缩的上清液上进行的情况中，如下来将“l”L上清液的体积降低到“m”L：使用截留分子量为“n”道尔顿的聚醚砜(PES)膜进行超滤。然后将该上清液或者部分浓缩的上清液加热到85℃保持10分钟，然后离心分离来除去沉淀的蛋白质。当需要时，过滤除去残留的沉淀蛋白质。该澄清化的样品然后通过使用截留分子量为“p”道尔顿的聚醚砜(PES)膜进行超滤，来将体积降低到“o”L。该浓缩物包含了“q”重量%的蛋白质。使用从上清液回收的另外的蛋白质时，该过滤的蛋白质溶液整体的蛋白质回收率是“r”wt%。将该浓缩物喷雾干燥，来形成命名为‘h’C200HS的最终产物，该产物的蛋白质含量是“s”%(N x6.25)d.b.。用于六个过程的参数“h”和“l”-“s”在下表VI中列出：
表VI
。
实施例3：
这个实施例描述了根据本发明一种实施方案，来生产新型低芥酸菜子蛋白质分离物。
将低芥酸菜子粉加入到环境温度的氯化钠溶液中，并且搅拌30分钟来提供蛋白质水溶液。除去该残留的低芥酸菜子粉，并且将所得到的蛋白质溶液通过离心法和过滤进行澄清化。
将等份部分的该蛋白质提取溶液的体积通过在聚醚砜(PES)膜上浓缩来降低。该滞留物然后在60℃巴氏杀菌1分钟。
将该浓缩的溶液稀释到冷RO水中。立即形成了白雾。通过离心分离来从上清液中分离沉淀的、粘稠的、发粘物质(PMM)。将该PMM喷雾干燥来形成最终的产物。
将“a”L上清液与“b”kg氯化钠合并，来将盐浓度调整为大约0.1 M。在加入盐之后，加入稀盐酸来将pH调整为3.5。样品的电导率是14.03mS。出现蛋白质沉淀时，将该样品静置10分钟。
通过离心分离来从该酸化的上清液中除去沉淀的蛋白质。将该沉淀的蛋白质喷雾干燥，来形成最终的产物。
加入稀盐酸来将该酸化的上清液的pH降低到3。然后如下来将“c”L 酸化的上清液的体积降低到大约“d”L：使用截留分子量为“e”道尔顿的聚醚砜(PES)膜进行超滤，然后在同样的膜上用“f”L酸化的水对浓缩物进行渗滤。过滤该渗滤的浓缩物，来除去任何残留的沉淀蛋白质。将等分部分的“g”kg喷雾干燥，来形成命名为“h”C200IS的最终产物，其蛋白质含量为“i”wt%(N x6.25)d.b.。
参数“a”-“i”在下表VIII中列出：
表VIII
Figure 982451DEST_PATH_IMAGE007
。
实施例4：
这个实施例包含了对实施例2和3所生产的喷雾干燥的低芥酸菜子蛋白质分离物的溶解性的评价。
通过实施例2的工序所生产的喷雾干燥浓缩的上清液(C200)和改性产物(C200H和C200HS)和通过实施例3的工序所生产的等电位沉淀的上清液(C200IS)的溶解性，是使用Morr等人，J.Food.Sci.50：1715-1718中的工序的改进版来测量的。
将提供0.5g蛋白质的足够的蛋白质粉称重到烧杯中，然后加入少量反渗透(RO)净化水，并搅拌该混合物，直到形成光滑的糊为止。然后加入另外的水，达到大约45ml的体积。然后使用磁力搅拌器将该烧杯的内容物缓慢搅拌60分钟。在分散蛋白质之后立即测量pH，并且用NaOH或者HCl调整到适当的水平(2、3、4、5、6或者7)。还在自然的pH 制备了样品。对于pH调整的样品来说，在60分钟搅拌过程中测量和校正pH两次。在60分钟的搅拌之后，用RO水将该样品补足到50ml的总体积，产生1%w/v的蛋白质分散体。保留一等分部分的该蛋白质分散体，用于使用Leco FA28氮测量计，通过Leco分析来测量蛋白质的含量。将另一部分的样品在8000g离心分离10分钟。这沉降了任何未溶解的材料和产生了透明的上清液。然后通过Leco分析来测量该上清液的蛋白质含量。
溶解度(%)=(上清液蛋白质浓度/初始分散的蛋白质浓度)x100
所获得的结果在下表IX中列出：
表IX
从表IX的结果可见，与来自实施例1所制备的浓缩的上清液(C200)的干燥的分离物相比，来自改性的浓缩的上清液(C200H)，热处理然后浓缩的上清液(C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的干燥的分离物在不同pH值的水中的溶解度明显更大。
实施例5
这个实施例包含了对于实施例2和3所生产的喷雾干燥的低芥酸菜子蛋白质分离物在软饮料和运动饮料中的溶解性的评价。
通过实施例2的工序所生产的喷雾干燥的浓缩上清液(C200)和改性的产物(C200H和C200HS)和通过实施例3的工序生产的等电位沉淀的上清液(C200IS)在软饮料(Sprite)或者运动饮料(Orange Gatorade)中的溶解性，是使用Morr等人，J.Food.Sci.50：1715-1718中的工序的改进版来测量的，如上面的实施例4中所述，但是使用软饮料或者运动饮料代替水，蛋白质浓度是2%w/v，没有进行pH调整。
所获得的结果在下表X中列出：
表X
Figure 205939DEST_PATH_IMAGE009
从表X中的结果可见，与来自浓缩的上清液(C200)的干燥的分离物相比，来自改性的浓缩上清液(C200H)，热处理然后浓缩的上清液(C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的干燥的分离物在软饮料和运动饮料中的溶解度明显更大。
实施例6：
这个实施例包含了对实施例2和3所生产的喷雾干燥低芥酸菜子蛋白质分离物溶解在不同pH值的水中的溶液的透明度的评价。
将提供0.5g蛋白质的足够的蛋白质粉称重到烧杯中，然后加入少量反渗透(RO)净化水，并搅拌该混合物，直到形成光滑的糊为止。然后加入另外的水，达到大约45ml的体积。然后使用磁力搅拌器将该烧杯的内容物缓慢搅拌60分钟。在分散蛋白质之后立即测量pH，并且用NaOH或者HCl调整到适当的水平(2、3、4、5、6或者7)。还在自然的pH 制备了样品。对于pH调整的样品来说，在60分钟搅拌过程中测量和校正pH两次。在60分钟的搅拌之后，用RO水将该样品补足到50ml的总体积，产生1%w/v的蛋白质分散体。该溶液的透明度是通过测量在600nm的吸光度来测量的，并且使用纯水来作为分光光度计的空白对照。吸光度读数越低，透明度越大。
所获得的结果在下表XI中列出：
表XI
Figure 490289DEST_PATH_IMAGE010
从表XI中的结果可见，与来自浓缩的上清液(C200)的干燥的分离物相比，来自改性的浓缩上清液(C200H)，热处理然后浓缩的上清液(C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的干燥的分离物产生的溶液在不同pH值的水中具有的透明度明显更大。在低pH值时差异最明显。
实施例7：
这个实施例包含了对实施例2和3所生产的喷雾干燥分离物溶解在软饮料或者运动饮料的溶液的透明度的评价。
透明度是如下来评估的：通过测量2%w/v的蛋白质在无色透明的市售碳酸软饮料(Sprite)或者有色的市售非碳酸运动饮料(Orange Gatorade)中的溶液在600nm可见光的吸光度。在测量含有蛋白质的样品的透明度之前，用适当的饮料的纯样品来作为分光光度计的空白测量。吸光度读数越低，透射的光越好，该溶液的透明度越好。
所获得的结果在下表XII中列出：
表XII
Figure 89767DEST_PATH_IMAGE011
从表XII中的结果可见，与由喷雾干燥浓缩的上清液(C200)所制备的溶液相比，由来自改性的浓缩上清液(C200H)，热处理然后浓缩的上清液(C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的干燥分离物所制备的溶液的透明度要远远更优越。
实施例8：
这个实施例包含了普通饮料的pH值。
 普通饮料的pH值是通过pH计来测量的，所获得结果在下表XIII中列出：
表XIII –普通饮料的pH值
饮料 pH
可口可乐传统型 2.68
健怡可乐 3.41
七喜 3.60
雪碧 3.24
私酿之威士忌酒 3.10
Canada Dry   Ginger Ale 2.85
冰茶(茶味饮料) 3.19
Snapple   Peach冰茶(含天然茶) 2.96
苏打水 4.61
Orange   Gatorade 2.98
Fruit Punch   Gatorade 3.05
Lemon Lime   Gatorade 2.97
 Green   Tea SoBe 2.72
苹果汁(未浓缩) 3.62
橙汁(浓缩) 3.91
葡萄汁(浓缩) 3.20
热带水果混合汁(苹果、橙子、菠萝、西番莲、芒果)(浓缩) 3.77
苹果、橙子、西番莲混合果汁(浓缩) 3.69
水果潘趣 2.93
酸果蔓调和汁 2.77
实施例9：
这个实施例包含了对通过实施例1、2和3的工序生产的喷雾干燥浓缩上清液(C200)，改性产物(C200H和C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的溶解性的另外评价。
将提供0.5g蛋白质的足够的蛋白质粉称重到烧杯中，然后加入少量反渗透(RO)净化水，并搅拌该混合物，直到形成光滑的糊为止。然后加入另外的水，达到大约45ml的体积。然后使用磁力搅拌器将该烧杯的内容物缓慢搅拌60分钟。在分散蛋白质之后立即测量pH，并且用NaOH或者HCl调整到适当的水平(2、3、4、5、6或者7)。还在自然的pH 制备了样品。对于pH调整的样品来说，在60分钟搅拌过程中测量和校正pH两次。在60分钟的搅拌之后，用RO水将该样品补足到50ml的总体积，产生1%w/v的蛋白质分散体。然后将该分散体的样品(20ml)转移到预先称重的离心管中，该管已经在105℃的炉子中干燥了30分钟，然后在干燥器中冷却，盖上所述的管。将该样品在7800g离心分离10分钟，其沉降了不溶材料，并且产生了透明的上清液。倒掉该上清液和所述管的盖子，并且将粒料在设定在55℃的炉子中干燥过夜。第二天早上，将该管转移到干燥器中，并且使其冷却。记录干粒料的重量。初始蛋白质粉的干重是通过用所用的粉末的重量乘以因数((100 –粉末的含水量(%))/100)来计算的。然后如下来计算产物的溶解度：
溶解度(%)=(1-(干燥不溶性粒料的重量/(2/5 x干燥蛋白质粉末的初始重量)))x100
所获得的结果在下表XIV中列出：
表XIV
从表XIV中的结果可见，与来自浓缩上清液(C200)的干燥的分离物相比，来自改性浓缩上清液(C200H)，热处理然后浓缩的上清液(C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的干燥分离物在不同pH值的水中具有明显更大的溶解性。
实施例10：
这个实施例包含了对由实施例1、2和3的工序所生产的喷雾干燥浓缩的上清液(C200)，改性产物(C200H)和等电位沉淀的上清液(C200IS) 在pH7下的热稳定性的评价。
将提供1.6g蛋白质的足够的蛋白质粉称重到烧杯中，然后加入大约15g的反渗透(RO)净化水，并使用磁力搅拌器搅拌该混合物总共60分钟。当需要时，在磁搅拌进行时，该产物还可以用搅拌棒手工分散。在搅拌30分钟后，测量样品的pH，并且根据需要使用NaOH或者HCl调整到7。该样品然后搅拌另外30分钟。在搅拌60分钟后，检查pH，并且如果需要重新调整到7，然后用RO水将该样品补足到20g总重量，产生8%w/w的蛋白质分散体。将该分散体转移到预先称重的离心管中，该管已经在105℃的炉子中干燥了30分钟，然后在干燥器中冷却。记录该管中的分散体的重量，然后将样品盖上，将它们放在90℃的水浴热处理30分钟。在整个加热过程中将水的水平保持在高于样品液的水平。在热处理后，将样品放入冰水浴中来立即冷却它们。然后将该样品放入冰箱过夜。第二天早上，将样品离心分离3次，每次在7800g进行10分钟。将上清液从所述管中滗析(注：在没有获得完全压实的粒料的情况中，对于某些样品来说，观察到粒料的某些少量损失)，并且除去管盖。将该粒料放入在55℃炉子中的开口管中干燥过夜。第二天早上，将样品转移到干燥器中，使其冷却。测量该干燥粒料的重量。初始蛋白质粉的干重是通过用所用的粉末的重量乘以因数((100 –粉末的含水量(%))/100)来计算的。然后如下来计算热处理对于产物溶解度的影响：
热处理后不溶粉末的%=(干燥的不溶粒料的重量/离心管中的分散体的重量/20)x干燥蛋白质粉末的初始重量))x100。
所获得的结果在下表XV中列出：
表XV
样品 热处理后初始不溶粉末的%
SA034-J12-04A   C200 22.8
SA034-J12-04A   C200H 12.3
SA035-J14-04A   C200 18.6
SA035-J14-04A   C200H 12.7
SA033-E10-04A   C200 42.2
SD061-K07-05A   C200H 14.6
SA077-K07-07A   C200IS 5.8
从表XV中的结果可见，与由喷雾干燥浓缩的上清液(C200)所制备的溶液相比，由来自改性的浓缩上清液(C200H)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的喷雾干燥分离物所制备的溶液的热稳定性要更优越。
实施例11：
这个实施例包含了对通过实施例1、2和3的工序所生产的喷雾干燥浓缩的上清液(C200)、改性的产物(C200H和C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS) 在pH6下的热稳定性的评价。
将用于提供0.3g蛋白质的足够的蛋白质粉称重到烧杯中，然后加入大约25g的反渗透(RO)净化水，并使用磁力搅拌器搅拌该混合物总共60分钟。在搅拌30分钟后，测量样品的pH，并且根据需要使用NaOH或者HCl调整到6。该样品然后搅拌另外30分钟。在搅拌60分钟后，检查pH，并且如果需要重新调整到6，然后用RO水将该样品补足到30g总重量，产生1%w/w的蛋白质分散体。将该分散体转移到预先称重的离心管中，该管已经在105℃的炉子中干燥了30分钟，然后在干燥器中冷却。记录该管中的分散体的重量，然后将样品盖上，将它们放在85℃的水浴热处理10分钟。在整个加热过程中将水的水平保持在高于样品液的水平。在热处理后，将样品放入冰水浴中来立即冷却它们。然后将该样品在7800g离心分离10分钟。将上清液从所述管中滗析，并且除去管盖。将该粒料放入在55℃炉子中的开口管中干燥过夜。第二天早上，将样品转移到干燥器中，使其冷却。测量该干燥粒料的重量。初始蛋白质粉的干重是通过用所用的粉末的重量乘以因数((100 –粉末的含水量(%))/100)来计算的。然后如下来计算热处理对于产物溶解度的影响：
热处理后不溶粉末的%=(干燥的不溶粒料的重量/((离心管中的分散体的重量/30)x干燥蛋白质粉末的初始重量))x100。
所获得的结果在下表XVI中列出：
表XVI
样品 热处理后初始不溶粉末的%
SA034-J12-04A   C200 19.6
SA034-J12-04A   C200H 9.0
SA035-J14-04A   C200 27.5
SA035-J14-04A   C200H 13.7
SA033-E10-04A   C200 30.4
SD061-I26-06A   C200HS 8.9
SA077-K07-07A   C200IS 4.5
从表XVI中的结果可见，与由喷雾干燥浓缩的上清液(C200)所制备的溶液相比，由来自改性的浓缩上清液(C200H)，热处理然后浓缩的上清液(C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的喷雾干燥分离物所制备的溶液的热稳定性要更优越。
实施例12：
这个实施例包含了对通过实施例1、2和3的工序所生产的喷雾干燥浓缩的上清液(C200)，改性的产物(C200H)和等电位沉淀的上清液(C200IS) 在pH3.5和0.10M NaCl的盐度下的溶解性评价。
将用于提供0.5g蛋白质的足够的蛋白质粉称重到烧杯中，然后加入大约45g的0.1M NaCl。使用磁力搅拌器将该烧杯的内容物搅拌30分钟。然后加入HCl将pH调整到3.5。该样品然后搅拌另外30分钟。此时检查pH，并且如果需要重新调整到3.5，然后用另外的0.1M NaCl将样品重量补足到50g，产生1%w/w蛋白质分散体。然后将该分散体的样品(大约30g)转移到预先称重的离心管中，该管已经在105℃的炉子中干燥了30分钟，然后在干燥器中冷却。记录该管中的分散体的重量，然后将管子盖上。将该样品在7800g离心分离10分钟，这沉降了不溶材料。将上清液从所述管中滗析(注：在没有获得完全压实的粒料的情况中，对于某些样品来说，观察到粒料的某些非常少量的损失)，并且除去管盖。将该粒料放入设置在55℃炉子中干燥过夜。第二天早上，将样品转移到干燥器中，使其冷却。测量该干燥粒料的重量。初始蛋白质粉的干重是通过用所用的粉末的重量乘以因数((100 –粉末的含水量(%))/100)来计算的。然后如下来计算pH和盐浓度对于产物溶解度的影响：
测试条件下的不溶粉末的%=(干燥的不溶粒料的重量/((离心管中的初始样品的重量/50)x干燥蛋白质粉末的初始重量))x100。
所获得的结果在下表XVII中给出：
表XVII
样品 在pH3.5和0.1M NaCl中初始不溶粉末的%
SA034-J12-04A   C200 4.1
SA034-J12-04A   C200H 1.4
SA035-J14-04A   C200 9.4
SA035-J14-04A   C200H 2.6
SA033-E10-04A   C200 19.1
SD061-K07-05A-C200H 1.6
SA077-K07-07A   C200IS 0.8
从表XVII的结果可见，来自改性的浓缩上清液(C200H)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的干燥分离物在pH3.5的盐水中的溶解度明显高于来自浓缩的上清液(C200)的干燥分离物。
实施例13：
这个实施例包含了对通过实施例1、2和3的工序所生产的喷雾干燥浓缩的上清液(C200)、改性的产物(C200H和C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的表面疏水性的评价。
不同的分离物的表面疏水性是使用表面疏水性(S0)测试，在室温进行的，该测试包括疏水染料：1–苯胺8-萘磺酸酯(ANS)。相对荧光强度是使用分光荧光计来测量的，并且蛋白质的疏水性(S0)是通过计算净相对荧光强度(RFI)斜率来测量的。S0越高，蛋白质的疏水性越大，这是因为染料被吸引到蛋白质分子的疏水位置上。
因为浓缩上清液来源的蛋白质(C200)包含了更高百分比的球蛋白(7S)，因此发现该分离物包含根据ANS测试的更大的疏水性。低芥酸菜子球蛋白被认为是相当疏水的，并且这也表明了这样的情况。改性产物产生了较低的值，这是与降低含量的球蛋白蛋白质的预期结果一致的。两种分离物的主要成分是白蛋白清蛋白。这种蛋白质是非常高极性的，产生了非常低的表面疏水性。
结果在下表XVIII中列出。将数据调整，来反映每种分离物的100%(N x6.25)蛋白质。
表XVIII
样品 %7S S0100%N   x6.25
SA033-E10-04A   C200 32.18% 78.1
SA034-J12-04A   C200 13.13% 32.6
SA035-J14-04A   C200 24.52% 58.1
SA034-J12-04A   C200H 3.55% 12
SA035-J14-04A   C200H 7.55% 14.9
SD061-I26-06A   C200HS 4.05% 12.1
SA077-K07-07A   C200IS 3.12% 17.6
从表XVIII的结果可见，来自改性的浓缩上清液(C200H)，热处理然后浓缩的上清液(C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的疏水性明显低于来自浓缩的上清液(C200)的干燥分离物。此外，该结果表明表面疏水性是与球蛋白含量线性相关的。
实施例14：
这个实施例包含了对通过实施例1、2和3的方法所生产的喷雾干燥浓缩的上清液(C200)，改性产物(C200H和C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)的1mg/ml蛋白质溶液在280nm的吸光度的评价。
将用于提供50mg蛋白质的足够的蛋白质粉称重到烧杯中，然后加入大约45ml的10mM磷酸盐缓冲液(pH6.66)，并使用磁力搅拌器搅拌该混合物总共60分钟。在搅拌60分钟后，将该样品用缓冲液补足到50ml总体积，产生1mg/ml的蛋白质浓度。将该样品通过在7800g离心分离10分钟进行澄清化，然后将上清液转移到石英试管中，使用磷酸盐缓冲液作为空白测量，来读取在280nm的吸光度。
所获得的结果在下表XIX中列出：
表XIX
样品 在280nm的吸光度
SA034-J12-04A   C200 0.694
SA034-J12-04A   C200H 0.656
SA035-J14-04A   C200 0.710
SA035-J14-04A   C200H 0.654
SA033-E10-04A   C200 0.700
SD061-I26-06A   C200HS 0.668
SA077-K07-07A   C200IS 0.611
从表XIX的结果可见，由喷雾干燥浓缩的上清液(C200)所制备的溶液在280nm的吸收比由改性的浓缩上清液(C200H)、热处理然后浓缩的上清液(C200HS)和等电位沉淀的上清液(C200IS)所制备的溶液更强。
发明概括
总之，本发明提供了一种新型低芥酸菜子蛋白质分离物，其具有提高含量的2S蛋白质和减少量的7S蛋白质，并且该分离物能够用于生产透明水溶液，特别是饮料。可以在本发明的范围内对其进行改动。

Claims (20)

1. 一种低芥酸菜子蛋白质分离物，其主要由2S低芥酸菜子蛋白质组成，其蛋白质含量基于干重(d.b.)为至少大约90wt%(Nx6.25)，并且当与主要由2S低芥酸菜子蛋白质组成，并且衍生自低芥酸菜子蛋白质胶束形成和沉淀的水性上清液的低芥酸菜子蛋白质分离物相比，所述蛋白质分离物具有提高比例的2S低芥酸菜子蛋白质和降低比例的7S低芥酸菜子蛋白质，所述低芥酸菜子蛋白质分离物是通过从所述上清液中等电位沉淀7S蛋白质衍生的。
2. 权利要求1的低芥酸菜子蛋白质分离物，其蛋白质含量至少是大约100wt%(Nx6.25)d.b.。
3. 权利要求1的低芥酸菜子蛋白质分离物，包含占存在于所述分离物中的低芥酸菜子蛋白质的至少大约85wt%的2S低芥酸菜子蛋白质和小于大约15wt%的7S低芥酸菜子蛋白质。
4. 权利要求3的低芥酸菜子蛋白质分离物，其中所述分离物包含占存在于所述分离物中的低芥酸菜子蛋白质的至少大约90wt%的2S低芥酸菜子蛋白质和小于大约10wt%的7S低芥酸菜子蛋白质。
5. 权利要求3的低芥酸菜子蛋白质分离物，其蛋白质含量为至少大约100wt%(Nx6.25)d.b.。
6. 一种制备具有提高比例的2S低芥酸菜子蛋白质的低芥酸菜子蛋白质分离物的方法，其包括：
(a)提供主要由2S蛋白质组成的2S和7S蛋白质的水溶液，
(b)从所述水溶液中等电位沉淀7S蛋白质，
(c)从所述水溶液中除去沉淀的7S蛋白质，和
(d)回收低芥酸菜子蛋白质分离物，所述分离物的蛋白质含量为至少大约90wt%(Nx6.25)d.b.，并且与2S和7S蛋白质水溶液相比，所述分离物具有提高比例的2S低芥酸菜子蛋白质。
7. 权利要求6的方法，其中所述等电位沉淀是在足以沉淀所述水溶液中存在的至少大约50wt%的7S低芥酸菜子蛋白质的pH和盐条件下进行的。
8. 权利要求7的方法，其中所述等电位沉淀是在足以沉淀所述水溶液中存在的至少大约75wt%的7S低芥酸菜子蛋白质的pH和盐条件下进行的。
9. 权利要求6的方法，其中所述等电位沉淀是如下来进行的：
(i)将所述水溶液盐化到电导率为至少大约0.3mS，和
(ii)将所述盐化水溶液的pH调整为大约2.0-大约4.0的值。
10. 权利要求9的方法，其中所述电导率是大约10-大约20mS，所述pH是大约3.0-大约3.5。
11. 权利要求6的方法，其中所述2S和7S低芥酸菜子蛋白质水溶液是来自低芥酸菜子蛋白质胶束形成和沉淀的上清液、部分浓缩的上清液或者浓缩的上清液。
12. 权利要求11的方法，其中所述低芥酸菜子蛋白质胶束形成是如下来进行的：
(a)在至少大约5℃的温度萃取低芥酸菜子油籽粉，以引起蛋白质在所述低芥酸菜子油籽粉中的増溶以及来形成蛋白质水溶液，
(b)从残留的油籽粉中分离所述蛋白质水溶液，
(c)将所述蛋白质水溶液的浓度升高到至少大约200g/L，同时通过选择性膜技术来保持离子强度基本恒定，以提供浓缩的蛋白质溶液，
(d)将所述浓缩的蛋白质溶液稀释到温度低于大约15℃的冷水中，来形成蛋白质胶束，和
(e)从所述沉降的蛋白质胶束物质中分离上清液。
13. 权利要求12的方法，其中在所述等电位沉淀之前，将所述上清液浓缩到蛋白质浓度为大约100-大约300g/L。
14. 权利要求13的方法，其中所述上清液被浓缩到蛋白质浓度为大约200-大约300g/L。
15. 权利要求13的方法，其中所述浓缩步骤是使用至少一种截留分子量为大约3000-大约100,000道尔顿的膜的超滤进行的。
16. 权利要求15的方法，其中在所述等电位沉淀之前，将超滤所产生的浓缩上清液进行渗滤。
17. 权利要求16的方法，其中所述渗滤步骤是使用大约2-大约20体积，优选大约5-大约10体积的水、盐水或者酸化的水，使用至少一种截留分子量为大约3000-大约100,000道尔顿的膜来进行的。
18. 权利要求6的方法，其进一步包括：
(e)将所述低芥酸菜子蛋白质分离物配制成含水饮料组合物。
19. 权利要求1的低芥酸菜子蛋白质分离物的水溶液。
20. 权利要求19的水溶液，其是低芥酸菜子蛋白质分离物强化的饮料。
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