KR20110031920A - 신규 카놀라 단백질 분리물 - Google Patents

Abstract

주로 2S 카놀라 단백질로 구성되고 수용성 매체에서 더 좋은 용해성과 향상된 투명도를 가지는 신규 카놀라 단백질 분리물은 2S 카놀라 단백질의 증가된 비율과 7S 카놀라 단백질의 감소된 비율을 가진다. 신규 카놀라 단백질 분리물은 퇴적되고 제거되는 7S 단백질의 침전을 위해 카놀라 단백질 미셀 형성 및 침전으로부터 수용성 상청액의 등전 침전에 의해 형성된다.

Description

신규 카놀라 단백질 분리물{NOVEL CANOLA PROTEIN ISOLATE}

본 발명은 신규 카놀라 단백질 분리물의 제조, 및 청량 음료와 스포츠 음료를 포함하는 수용액에 사용하는 방법에 관한 것이다.

적어도 100중량%(N×6.25)의 단백질 함량을 가지는 카놀라 오일 시드 단백질 분리물(canola oil seed protein isolates)은 출원인에게 양도되고, 그 내용은 참조문헌으로서 본 명세서에 포함되는 2002년 5월 3일에 출원되어 동시 계류중인 미국특허출원 제10/137,391호(미국특허공개 제2003-0125526호 및 WO02/089597호), 및 2004년 6월 9일에 출원된 제10/476,230호(미국특허공개 제2004-0254353호)에 기재된 방법에 의해 오일 시드 밀(oil seed meal)로부터 형성될 수 있다. 그 공정은 염 수용액을 사용하여 카놀라 오일 시드 밀을 추출하는 것, 남은 오일 시드 밀로부터 얻어진 수성 단백질 용액을 분리하는 것, 선택적 막 기술을 사용하여 이온 강도를 실질적으로 일정하게 유지시키면서 수용액의 단백질 농도를 적어도 약 200g/l까지 증가시키는 것, 얻어진 농축된 단백질 용액을 차가운 물 내로 희석하여 단백질 미셀(micelles)의 형성을 유발하는 것, 단백질 미셀이 무정형, 점성, 젤라틴성 글루텐형 단백질 미셀 집합체(protein micellar mass, PMM)를 형성하도록 침전하는 것, 적어도 100 중량% 단백질 함량(N×6.25)을 갖는 상청액(supernatant)으로부터 단백질 미셀 집합체를 회수하는 것을 포함하는 다단계 공정을 수반한다. 여기서, 단백질 함량은 건조 중량 기준으로 결정된다. 회수된 PMM은 건조될 수 있다.

이 공정의 한 실시예에서, PMM 침전 단계로부터의 상청액을 처리하여 상청액으로부터 카놀라 단백질 분리물을 회수한다. 이 공정은 먼저 한외여과 막을 사용하여 상청액을 농축하고, 농축액을 건조하는 것에 의해 수행될 수 있다. 얻어진 카놀라 단백질 분리물은 최소한 약 90 중량% 단백질 (N×6.25), 바람직하게는 최소한 약 100 중량%의 단백질(N×6.25) 함량을 가진다.

미국특허출원번호 제10/137,391호 및 제10/476,230호에서 기술된 공정들은 본질적으로 배치(batch) 공정이다. 동일한 출원인에 의한, 본 명세서에 참고문헌으로 포함된, 2002년 11월 19일에 출원되어 동시계류 중인 미국특허 출원 번호 제 10/298,678호(미국특허공개 제2004-0039174호 및 국제공개공보 WO03/043439호)에는 카놀라 단백질 분리물을 제조하기 위한 연속 공정이 기술되어 있다. 이 방법에 따르면, 카놀라 오일 시드 밀은 염 용액과 연속적으로 혼합되고, 카놀라 오일 시드 밀로부터 단백질을 추출하여 수성 단백질 용액을 형성하면서 이 혼합물을 파이프를 통해 운반하고, 이 수성 단백질 용액은 연속적으로 운반되어 선택적 막 작업을 통해 이온 강도를 실질적으로 일정하게 유지시키면서 수성 단백질 용액의 단백질 함량을 최소 약 50g/l까지 증가시키고, 얻어진 농축된 단백질 용액을 차가운 물과 연속적으로 혼합하여 단백질 미셀의 형성을 유발하고, 상청액을 연속적으로 유출시키면서 소정량의 PMM이 침전 용기 내에 축적할 때까지 단백질 미셀을 계속적으로 침전시킨다. PMM은 침전 용기로부터 회수되어 건조될 수 있다. PMM은 최소 약 90중량%(N*6.25), 바람직하게는 최소 약 100중량%의 단백질 함량을 갖는다. 전술한 바와 같이 유출된 상청액을 처리하여 이로부터 카놀라 단백질 분리물을 회수할 수 있다.

카놀라 씨는 약 10 내지 약 30 중량% 단백질을 함유한 것으로 알려져 있고, 몇 가지 다른 단백질 구성성분이 확인되었다. 이들 단백질들은 크루시페린(cruciferin)으로 알려진 12S 글로불린, 나핀(napin)으로 알려진 2S 저장 단백질 및 7S 단백질을 포함한다. 동일한 출원인에 의한, 본 명세서에 참고문헌으로 포함된, 2003년 4월 15일에 출원된 동시계류중인 미국특허출원 번호 제10/413,371호(미국특허공개 제2004-0034200 및 WO 03/08876호) 및 2003년 4월 29일에 출원된 미국특허출원 번호 제10/510,766호(미국특허공개 제2005-0249828)에서, 전술한 공정들은 PMM을 형성하기 위해 농축된 수성 단백질 용액의 희석과 추가적인 단백질을 회수하기 위한 상청액의 처리를 포함하여, 다른 단백질 프로필(profiles)의 분리물의 회수를 유도한다.

이러한 관점에서, PMM-유래 카놀라 단백질 분리물은 약 60 내지 약 98 중량%의 7S 단백질, 약 1 내지 약 15 중량%의 12S 단백질 및 0 내지 약 25 중량%의 2S 단백질의 단백질 구성성분 함량을 가진다. 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물은 약 60 내지 약 95 중량%의 2S 단백질, 약 5 내지 약 40 중량%의 7S 단백질 및 0 내지 약 5 중량%의 12S 단백질의 단백질 구성성분 함량을 가진다. 따라서, PMM-유래 카놀라 단백질 분리물은 주로 7S 단백질이고, 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물은 주로 2S 단백질이다. 상기 미국특허출원 번호 제10/413,371호 및 제10/510,766호에 기술된 바와 같이 2S 단백질은 약 14,000 달톤의 분자크기를 가지고, 7S 단백질은 약 145,000달톤의 분자크기를 가지며, 12S 단백질은 약 290,000달톤의 분자크기를 가진다.

평지씨(rape seed)로부터 2S 저장 단백질 나핀(napin)의 균질로의 정제와, 2차적 구조의 특성화와 단백질의 형태 안정은 Krzyzaniak et al in Nahrung(42) 1998, Nr. 3/4, p.201-204에서 이전에 기술되었다. 평지씨로부터 완충용액 A(50mM, NaH₂PO₄, pH7.0, 1mM EDTA)로 추출, 이어서 (NH₄)₂SO₄를 이용한 침전, 완충용액 A에서 결과 펠릿(pellet)의 용해, 동일한 완충용액에 대한 투석(dialysis), 및 세파덱스(Sephadex) G-50 칼럼을 이용한 겔 크로마토그래피에 의한 탈염(desalting)에 의해 나핀이 분리되었다. 나핀 추출물을 함유하는 분획(fraction)들이 수집되고, (NH₄)₂SO₄로 재침천되었다. 그 결과 원 나핀(crude napin)은 완충용액 B(pH7.4에서의 완충용액 A)에서 용해되었고, 그에 대해 투석된(dialyzed) 다음 CM-세파덱스(Sephadex) C-50 칼럼에 적재되고, 완충용액 B에서 0.15 내지 0.35M Nacl의 변화율로 녹여서 분리되었다. 나핀을 함유한 분획(fraction)들은 모아지고, (NH₄)₂SO₄로 침전되며, 완충용액 A에서 재용해되고, 투석되었다. 나핀은 pH5.0에서 1M Nacl까지 변화율을 이용하여 양이온 교환 HPLC에 의해 더 정제되었다. λ_max=280nm를 가진 유분들이 수집되고 농축되어 분석되었다.

출원인들은 균질로 정제된 2S 카놀라 단백질 샘플의 실험실 준비를 기술한 다음과 같은 추가적인 참조 문헌을 인지하고 있다.

Berot, S., Compoint, J.P., Malabat, C. 와 Gueguen, J. 2005. 평지씨 단백질들(Brassica napus L.)의 대규모 정제. J. Chromatography B, 818:35-42

Bhatty, R.S., McKenzie, S.L. 와 Finlayson, A.J. 1968. 염용액에 용해가능한 평지씨 단백질들(Brassica napus L.). Can. J. Biochem., 46:1191-1197.

Gehrig, P.M., Krzyzaniak, A., Barciszewski, J. 와 Biemann, K. 1996. 브래시카 나푸스(Brassica napus)로부터 시드 저장 단백질(나핀)의 혼합물의 매스 분광계의 아미노산 시퀀싱(sequencing), products of a multigene family. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:3647-3652

Monsalve, R.I. 와 Rodriguez, R. 1990. 브래시카(Brassicaceae) 패밀리의 씨앗들로부터 2S 분획로부터의 단백질들의 특성화 및 정제. J. Exper. Bot., 41(22):89-94

Muren, E., Ek, B., Bjork, I. 와 Rask, L. 1996. 브래시카 나푸스에서 2S 저장 단백질, 나핀의 성숙한 형태 및 프리커서의 구조적 비교. Eur. J. Biochem., 242:214-219

여기에 제공된 신규 카놀라 단백질 분리물은 여기에 제공된 2S 지배 카놀라 단백질 분리물이 항상 소량의 7S 단백질을 포함한다는 점에서 그런 게시물들과는 구별된다.

카놀라는 또한 평지씨 또는 오일 시드 레이프(oil seed rape)로 알려져 있다.

본 발명은 수용성 매개체에서 더 좋은 용해도와 더 향상된 투명도를 가지는 신규 카놀라 단백질 분리물을 제공한다.

발명의 요약

바람직하게는 최소 약 85중량%의 2S단백질을 함유하여 2S단백질의 증가된 비율을 가지고, 7S단백질의 감소된 비율을 가지는 신규 카놀라 단백질 분리물이 이전에 기술된 미국 특허출원 번호 10/137,391호 및 10/476,230호의 과정을 따라 준비되는 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물에 비해 수용액에서 우월한 성질을 보인다는 것이 이제 놀랍게도 밝혀졌다.

다양한 pH수치에서 동일하거나 더 큰 용해도에 추가하여, 여기에 제공된 신규 카놀라 단백질 분리물은 명확한 단백질 강화 음료를 제공하면서 청량 음료 및 스포츠 음료로 용액에서 향상된 투명도(clarity)를 제공할 수 있다. 또한, 신규 카놀라 단백질 분리물은 약 0.1M 염화나트륨 용액에서 약 3.5의 pH에서 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물보다 더 큰 용해도를 보인다.

본 발명의 일측면에서, 건조중량 기준으로 최소 약 90중량%(N×6.25), 바람직하게는 최소 약 100중량%의 단백질 함량을 가지는 2S 카놀라 단백질을 주성분으로 포함하고, 2S 카놀라 단백질을 주성분으로 포함하고 카놀라 단백질 미셀(micelle) 형성 및 침전으로부터의 수성 상청액으로부터 유래되는 카놀라 단백질 분리물과 비교할 때 2S 카놀라 단백질의 증가된 비율을 가지고 7S 카놀라 단백질의 감소된 비율을 가지는 카놀라 단백질 분리물이 제공된다. 카놀라 단백질 분리물은 상청액으로부터 7S 단백질의 등전 침전(isoelectric precipitation)에 의해 유래된다.

신규 카놀라 단백질 분리물 및 본 발명의 조성은 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물과는 다른 다수의 독특한 성질을 가지고, 용해도, 투명도(clarity), 열 안정성, 280nm에서의 흡광도(absorbance), 표면 소수성(surface hydrophobicity) 및 아미노산 프로필(profile)을 포함한다. 이러한 성질들은 이하에서 기술되고, 자료에 근거한 논의가 이하 실시예에서 이루어진다.

용해도:

신규 카놀라 단백질 분리물은 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물과 비교하여 넓은 범위의 pH와 약 1%w/v 단백질 농도에서 물 및 탄산, 비탄산 청량음료와 스포츠 음료에서 동일하거나 증가된 용해도를 보인다.

또한, 신규 카놀라 단백질 분리물은 넓은 범위의 pH와 약 1%w/v 단백질 농도에서 물에서 동일하거나 증가된 용해도를 보이는데, 여기서 용액 또는 분산(dispersions)의 형성에 이어 샘플들은 원심분리되어 불용성 물질을 침전시키고 선명한 상청액을 생산한다.

또한, 신규 카놀라 단백질 분리물은 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물과 비교하여 pH 3.5에서 0.1M 염화나트륨 용액에서 더 큰 용해도를 보인다.

투명도( clarity ):

신규 카놀라 단백질 분리물은 쥬스, 펀치(punches), 및 칵테일 뿐만 아니라 탄산, 비탄산 청량음료를 포함하여 다양한 음료에 포함되어 그런 음료에 단백질 강화를 제공한다. 그런 음료들은 약 2.5 내지 약 5의 넓은 범위의 pH수치를 가지고, 종종 12 유체(fluid) 온스 양으로 포장된다. 신규 카놀라 단백질 분리물은 어떤 편안한 양으로 추가되어 예를 들어 12 유체 온스 양 마다 최소 약 5g의 신규 카놀라 단백질 분리물로 음료에 단백질 강화를 제공할 수 있다.

추가된 신규 카놀라 단백질 분리물은 음료에 용해되고, 음료의 투명도에 손상을 주지 않는다. 2중량%의 단백질 농도에서의 투명한 음료에서 투명도는 600nm에서 가시광선의 흡광도를 측정함으로써 결정될 때 약 0.5보다 작다. 1중량%의 단백질 농도에서의 물에서 투명도는 600nm에서 가시광선의 흡광도를 측정함으로써 결정될 때 약 2 내지 약 7까지의 pH범위에 대해 약 1.0보다 작다.

열 안정성( Heat stability ):

본 발명의 신규 카놀라 단백질 분리물은 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물과 비교하여 pH 6 및 7 둘다에서 향상된 열 안정성을 가진다. 이하에서 상세히 기술된 바와 같이 상청액으로부터 7S 단백질의 등전 침전에 이어, 열처리 상청액은 가열시 단백질 침전(deposition)에 더 견딘다.

280 nm 에서 흡광도( Absorbance ):

본 발명의 신규 카놀라 단백질은 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물보다 더 약한 280nm에서 흡광도를 가진다. 이 결과는 본 발명의 신규 카놀라 단백질 분리물이 상청액-유래 카놀라 단백질보다 280nm에서 강하게 흡수하는 티로신(tyrosine)과 트립토판(tryptophan)을 더 적게 함유한다는 것을 가리킨다.

표면 소수성( Surface Hydrophobicity ):

본 발명의 신규 카놀라 단백질 분리물은 아마도 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물과 비교하여 신규 카놀라 단백질 분리물의 더 적은 글로불린(globulin) 함량에서 기인하는데, 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물보다 더 낮은 표면 소수성을 가진다.

신규 카놀라 단백질 분리물의 표면 소수성은 일반적으로 약 25보다 적고, 바람직하게는 약 20보다 적다.

본 발명의 신규 카놀라 단백질 분리물은 농축된 상청액에서 7S 단백질의 비율을 감소시키고 따라서 2S 단백질의 비율을 증가시키기 위해 미국 특허출원 번호 10/137,391호 및 10/476,230호의 공정으로부터 농축된 상청액으로부터 7S 단백질의 등전 침전에 의해 준비된다. 대안적으로 상청액의 농축 또는 부분적 농축 이전에 상청액에 그 처리가 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 증가된 비율의 2S 카놀라 단백질을 가지는 카놀라 단백질 분리물의 제조공정이 제공되는데, 이는 (a) 주성분으로 2S 단백질을 포함하는 2S 및 7S 단백질의 수용액을 준비하는 단계, (b) 그 수용액으로부터 7S 카놀라 단백질을 등전 침전하는 단계, (c) 수용액으로부터 침전된 7S 단백질을 제거하는 단계, 및 (d) 건조중량 기준 최소 약 90중량%(N×6.25)의 단백질 함량을 가지고 2S 및 7S 단백질의 수용액과 비교하여 증가된 비율의 2S 카놀라 단백질을 가지는 카놀라 단백질 분리물을 회수하는 단계를 포함하여 이루어진다.

본 발명에 따른 신규 카놀라 단백질 분리물은 수용성 매개체에서 더 좋은 용해도와 더 향상된 투명도를 가진다.

도1은 단백질 분리물 회수공정의 모식도이고,
도2는 도1에서 도시된 PMM형성공정으로부터의 상청액으로부터 본 발명의 신규 카놀라 단백질 분리물을 생산하는데 사용되는 공정의 모식도이다.

여기에 제공된 신규 카놀라 단백질 분리물은 최소 약 90중량%(N×6.25), 바람직하게는 약 100중량%의 단백질 함량을 가지고, 배치공정 또는 연속공정 또는 반연속공정에 의해 카놀라 오일 시드 밀(canola oil seed meal)로부터 분리될 수 있다.

여기에 제공된 신규 카놀라 단백질 분리물은, 2S 단백질로 주로 구성되고 카놀라 단백질 미셀 형성 및 침전으로부터의 상청액으로부터 유래되며 제조의 동일한 실험 조건하에서 준비되는 카놀라 단백질 분리물과 비교할 때, 2S 단백질로 주로 구성되고, 2S 카놀라 단백질의 증가된 비율을 가지고 7S 카놀라 단백질의 감소된 비율을 가진다. 전술한 바와 같이 본 발명의 신규 카놀라 단백질 분리물은 감소된 비율의 7S 카놀라 단백질과 증가된 비율의 2S 카놀라 단백질을 가지면서 항상 소량의 잔류 7S 단백질이 존재한다. 카놀라 단백질 분리물은 상청액으로부터 7S 단백질의 등전 침전에 의해 유래된다.

신규 카놀라 단백질 분리물은 최소 약 85중량%의 2S 카놀라 단백질과 약 15중량%보다 적은 7S 카놀라 단백질, 바람직하게는 최소 약 90중량%의 2S 카놀라 단백질과 약 10중량%보다 적은 7S 카놀라 단백질, 보다 바람직하게는 가능한 한 큰 비율의 2S 단백질을 함유한다. 전술한 바와 같이, 이런 카놀라 단백질 분리물은 이하에서 더 상세히 기술되는 바와 같이 상청액, 부분적으로 농축된 상청액 및 농축된 상청액의 처리에 의해 얻어질 수 있다. 상청액, 부분적으로 농축된 상청액 및 농축된 상청액의 처리는 7S 단백질의 침전을 일으키고, 이는 원심분리 또는 여과와 같은 어떤 편안한 수단에 의해 처리된 상청액으로부터 제거될 수 있다. 2S 단백질은 이 처리에 의해 영향을 받지 않고, 따라서 이 처리는 7S 단백질의 비율을 감소시킴으로써 2S 단백질의 비율을 증가시킨다.

신규 카놀라 단백질 분리물은 넓은 범위의 pH수치들에 대해, 일반적으로 약 pH 2 내지 약 pH 7.5까지, 바람직하게는 약 2 내지 약 4까지 수용액에 용해될 수 있고, 동일한 실험 조건의 제조 하에서 카놀라 단백질 미셀 형성 및 침전으로부터 상청액으로부터 유래되고 주로 2S 단백질로 구성되는 카놀라 단백질 분리물보다 동일하거나 더 큰 용해도를 일반적으로 가진다. 또한, 탄산, 비탄산 음료을 포함하는 청량 음료 및 상업적으로 이용가능한 탄산, 비탄산 스포츠 에너지 음료를 포함하는 스포츠 음료에서 신규 카놀라 단백질 분리물의 수용액들은 동일한 조건의 제조 하에서 카놀라 단백질 미셀 형성 및 침전으로부터의 상청액으로부터 유래되고 주로 2S 단백질로 구성되는 카놀라 단백질 분리물로부터 생산되는 수용액들보다 더 큰 투명도를 가진다.

청량 음료 및 스포츠 음료에서 용액을 포함하는 수용액에서 카놀라 단백질 분리물의 농도는 용액의 의도된 사용에 따라 다를 수 있다. 일반적으로 단백질 농도는 약 0.1 내지 약 30 중량%, 바람직하게는 약 1 내지 약 5 중량%까지 달라질 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 언급 뿐만 아니라, 쥬스, 알콜 음료, 커피-기반 음료 및 유제품계 음료와 같은 다른 음료를 포함하여 여기에 제공된 신규 카놀라 단백질 분리물의 수용액들을 포함한다.

카놀라 단백질 분리물을 제공하는 공정의 초기 단계는 카놀라 오일 시드밀(seed meal)로부터 단백질 물질을 용해하는 단계를 포함한다. 카놀라 시드밀로부터 회수된 단백질 물질은 카놀라 시드에서 천연적으로 일어나는 단백질일 수도 있고, 또는 단백질 물질은 유전자 조작에 의해 변경되었지만 천연 단백질의 특징적인 소수성 및 극성을 가지는 단백질일 수 있다. 카놀라 밀(canola meal)은 예를 들어, 뜨거운 헥산 추출 또는 차가운 오일 분출법에 의해 다양한 레벨의 비-변성 단백질을 가진 카놀라 오일 시드로부터 카놀라 오일의 제거에 기인하는 어떠한 카놀라 밀일 수 있다. 보통 카놀라 오일 시드로부터 카놀라 오일의 제거는 여기에 기술된 단백질 분리물 회수 공정으로부터 분리된 공정으로서 도출된다.

단백질 용해(protein solubilization)는 염(salt)의 존재가 오일 시드밀로부터 용해가능한 단백질의 제거를 향상시키기 때문에 식용(food grade) 염용액을 사용함으로써 가장 효과적으로 이루어진다. 카놀라 단백질 분리물이 비식용 사용을 위한 것이라면, 비식용 화학물질이 사용될 수 있다. 염은 염화칼륨과 같은 다음 염들이 사용될 수도 있지만, 일반적으로 염화나트륨이다. 염용액은 영향을 받을 만큼 단백질의 양을 용해화시키기 위해 최소 약 0.05, 바람직하게는 약 0.10의 이온 강도를 가진다. 염용액의 이온 강도가 증가할수록 오일 시드밀내의 단백질의 용해 정도가 최대 수치가 얻어질 때까지 초기에는 증가한다. 이온 강도에서 이어지는 증가는 용해되는 총 단백질을 증가시키지 않는다. 최대 단백질 용해화를 야기시키는 식용 염용액의 이온 강도는 관련된 염과 선택된 오일 시드밀에 따라 다르다.

이온 강도의 증가와 함께 단백질 침전을 위해 요구되는 더 큰 정도의 희석(dilution)의 관점에서 약 0.8보다 작은, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.15의 이온 강도 수치를 활용하는 것이 일반적으로 바람직하다.

배치(batch) 공정에서 단백질의 염 용해화는 약 5℃ 내지 약 75℃의 온도에서 이루어지고, 바람직하게는 교반이 수반되어 용해화 시간을 감소시키며 이는 일반적으로 약 10분 내지 60분이다. 총합 높은 생산율을 제공하기 위해 실행가능한 한 오일 시드밀로부터 많은 단백질을 실질적으로 추출하기 위해 용해화를 이루는 것이 바람직하다.

약 5℃의 온도 하한이 선택되는데 이 온도 이하에서는 용해화가 실행불가능하게 느리기 때문이고, 잔존 단백질의 일부의 변성 온도로 인해 약 75℃의 바람직한 온도 상한이 선택된다.

연속적인 공정에서, 카놀라 오일 시드밀로부터 단백질의 추출은 카놀라 오일 시드밀로부터 단백질의 연속적인 추출과 일관된 방식으로 이루어진다. 한 실시예에서, 카놀라 오일 시드밀은 식용 염용액과 연속적으로 혼합되고, 그 혼합물은 여기에 기술된 파라미터에 따라 바람직한 추출을 이루기 충분한 잔류 시간 동안 이동율과 길이를 가지는 파이프 또는 도관을 통해 운반된다. 그런 연속적인 과정에서, 염 용해화 단계는 약 10분 정도에서 실행가능한 한 카놀라 오일 시드밀로부터 많은 단백질을 실질적으로 추출하기 위해 용해화를 수행하도록 급속하게 이루어진다. 연속적인 과정에서 용해화는 약 5℃ 내지 약 75℃ 사이 온도에서, 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 35℃ 사이 온도에서 이루어진다.

수용성 식용 염용액은 일반적으로 약 5 내지 6.8, 바람직하게는 약 5.3 내지 약 6.2 사이의 pH를 가지고, 염용액의 pH는 어떤 편안한 산, 일반적으로 염산, 또는 요구될 때 알칼리, 일반적으로 수산화나트륨의 사용으로 추출단계에서 사용을 위해 약 5 내지 약 6.8의 범위 내에서 바람직한 수치로 조정될 수 있다.

용해화 단계 중에서 식용 염용액에서 오일 시드밀의 농도는 널리 다를 수 있다. 전형적인 농도 수치는 약 5 내지 15% w/v이다.

수용성 염용액으로의 단백질 추출단계는 카놀라 밀에 존재하는 지방을 용해화하는 부가적인 효과를 가지고, 이는 지방을 수용성 상(aqueous phase)으로 존재하게 한다.

추출단계로부터의 단백질 용액은 일반적으로 약 5 내지 약 40g/L, 바람직하게는 약 10 내지 약 30g/L의 단백질 농도를 가진다.

수용성 염용액은 산화방지제(antioxidant)를 함유할 수 있다. 산화방지제는 아황산 나트륨 또는 아스코르브 산과 같은 어떤 편안한 산화방지제일 수 있다. 채택되는 산화방지제의 양은 그 용액의 약 0.01 내지 약 1 wt%까지 다를 수 있고 바람직하게는 약 0.05 wt%이다. 산화방지제는 단백질 용액에서 석탄산(phenolics)의 산화를 억제하는 역할을 한다.

추출단계로부터 기인하는 수용성 상(aqueous phase)은 디캔터(decanter) 원심분리, 이어서 수반되는 디스크 원심분리 및/또는 잔류 밀을 제거하기 위한 여과를 채용하는 것과 같은 어떤 편안한 방식으로 잔류 카놀라 밀로부터 분리될 수 있다. 분리된 잔류 밀(meal)은 처분을 위해 건조될 수 있다.

마지막 카놀라 단백질 분리물의 색깔은 분리된 수용성 단백질 용액과 가루로 된 활성탄 또는 다른 색소 흡착제와의 혼합에 의해 밝은 색깔과 덜 짙은 노랑으로 향상될 수 있고, 이어서 여과에 의해 편안하게 흡착제를 제거하여 단백질 용액을 제공한다. 디어필트레이션(diafiltration)도 색소 제거를 위해 사용될 수 있다.

그런 색소 제거단계는 어떤 편안한 조건하에서 수행될 수 있고, 일반적으로 분리된 수용성 단백질 용액의 주변 온도에서 적절한 색소 흡착제를 사용하여 수행될 수 있다. 가루로 된 활성탄의 경우 약 0.025% 내지 약 5% w/v, 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 2% w/v의 양이 사용된다.

카놀라 시드밀이 본 출원인에게 양도되고, 참조로 여기 포함된 미국특허번호 5,844,086 및 6,005,076에서 기술된 바와 같이 상당한 양의 지방을 함유하는 경우에 여기에 기술된 탈지(defatting)단계가 분리된 수용성 단백질 용액과 후술하는 농축된 수용성 단백질 용액에 수행될 수 있다. 색깔 향상단계가 수행될 때, 그런 단계가 첫번째 탈지 단계 후에 이루어질 수 있다.

수용성 염용액으로 오일 시드밀을 추출하는 대안으로서, 물만 사용하는 것은 수용성 염용액보다 오일 시드밀로부터 단백질을 덜 추출하는 경향이 있지만 물만 사용하여 그런 추출이 이루어질 수 있다. 이 대안이 사용되는 경우, 그러면 전술한 농도에서, 후술할 농축단계 중에 용액에서 단백질을 유지하기 위해 잔류 오일 시드밀로부터 분리 후에 단백질 용액에 염이 추가될 수 있다. 첫번째 탈지단계가 수행될 때 염은 일반적으로 이 작업 완료후에 추가된다.

또 다른 대안 과정은 약 6.8 이상, 일반적으로 약 9.9까지 비교적 높은 pH 수치에서 식용 염용액으로 오일 시드밀을 추출하는 것이다. 식용 염용액의 pH는 수용성 수산화나트륨 용액과 같은 어떤 편안한 식용 알칼리의 사용으로 원하는 알칼리 수치로 조정될 수 있다. 대안적으로, 오일 시드밀은 약 pH 5이하, 일반적으로 약 pH 3까지 비교적 낮은 pH에서 염용액으로 추출될 수 있다. 이 대안이 사용될 경우에 오일 시드밀 추출단계로부터 기인하는 수용성 상은 디캔터(decanter) 원심분리, 이어서 수반되는 디스크 원심분리 및/또는 잔류 밀을 제거하기 위한 여과를 채용하는 것과 같은 어떤 편안한 방식으로 잔류 카놀라 밀로부터 분리된다. 분리된 잔류 밀(meal)은 처분을 위해 건조될 수 있다.

높은 또는 낮은 pH 추출단계에서 기인하는 수용성 단백질 용액은 후술하는 추가적 처리 이전에, 약 5 내지 약 6.8, 바람직하게는 약 5.3 내지 약 6.2의 범위에서 조정된 pH이다. 이런 pH 조정은 염산과 같은 어떤 편안한 산, 또는 적절하다면 수산화나트륨과 같은 알칼리를 사용하여 이루어질 수 있다.

수용성 단백질 용액은 그 이온 강도를 실질적으로 일정하게 유지하면서 그 단백질 농도를 증가시키기 위해 농축된다. 이 농축은 일반적으로 최소 약 50g/L, 바람직하게는 최소 약 200g/L, 더 바람직하게는 최소 약 250g/L의 단백질 농도를 가지는 농축된 단백질 용액을 제공하기 위해 이루어진다.

중공-섬유(hollow-fibre) 막 또는 나선-권취(spiral-wound) 막과 같은 막을 사용하여 한외여과(ultrafiltration) 또는 정용여과(diafiltration)과 같은 어떤 편안한 선택적 막 기술을 사용함으로써, 농축단계는 배치 또는 연속적 작업과 일관된 편안한 방식으로 이루어질 수 있고, 막 물질과 구성을 달리하여 약 3,000 내지 약 100,000달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000달톤과 같은 적절한 분자량 절단(cut-off)을 가지고, 연속적인 작업을 위해 수용성 단백질 용액이 막을 통과할 때 바람직한 정도의 농축을 허용하기 위해 디멘션(dimensioned)된다.

잘 알려진 바와 같이, 한외여과 및 유사한 선택적 막 기술들은 분자량이 낮은 종류들을 막을 통해 통과시키도록 하고, 분자량이 더 높은 종류들은 그렇게 하는 것을 방지한다. 분자량이 낮은 종류들은 식용 염의 이온 종류뿐만 아니라, 탄수화물, 색소 및 반영양화 요소와 같은 근원 물질로부터 추출된 분자량이 낮은 물질들과, 분자량이 낮은 형태의 단백질을 포함한다. 막의 분자량 절단은 일반적으로 다른 막 물질과 구성에 대해 오염물질을 통과시키도록 허용함에 반해 용액에서 단백질의 상당한 비율의 잔류를 보장하기 위해 선택된다.

그 다음 농축된 단백질 용액은 추출 용액으로서 동일한 몰농도(molarity)와 pH의 수용성 염용액을 사용하여 정용여과(diafiltration) 단계를 거칠 수 있다. 이 정용여과는 약 2 내지 약 20 볼륨의 정용여과 용액, 바람직하게는 약 5 내지 약 10 볼륨의 정용여과 용액을 사용하여 이루어질 수 있다. 정용여과 작업에서, 추가적 양의 오염물질은 투과(the permeate)를 가지고 막 통과에 의해 수용성 단백질 용액으로부터 제거된다. 정용여과 작업은 어떤 심각한 양의 오염물질과 보이는 색깔이 투과(the permeate)에서 존재하지 않을 때까지 이루어질 수 있다. 이 정용여과는 농축단계에서와 같은 막을 사용하여 이루어질 수 있다. 그러나, 바람직하다면, 정용여과 단계는 다른 막 물질과 구성을 고려하여 약 3,000 내지 약 100,000달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000달톤의 범위에서 분자량 절단(cut-off)을 가지는 막과 같은 다른 분자량 절단을 가지는 별개의 막을 사용하여 이루어질 수 있다.

산화방지제(antioxidant)는 적어도 일부의 정용여과 단계 중에 정용여과 매개체에 존재할 수 있다. 산화방지제는 아황산나트륨(sodium sulfite), 또는 아스코르브 산과 같은 어떤 편안한 산화방지제일 수 있다. 정용여과 매개체에 사용되는 산화방지제의 양은 사용되는 물질에 의존하고, 약 0.01 내지 약 1wt%로 다를 수 있고, 바람직하게는 약 0.05wt%이다. 산화방지제는 농축 카놀라 단백질 분리물 용액에 존재하는 석탄산(phenolics)의 산화를 억제한다.

농축단계와 정용여과 단계는 어떤 편안한 온도에서 이루어질 수 있고, 일반적으로 약 20℃ 내지 약 60℃, 바람직하게는 약 20 내지 약 30℃이고, 바라는 정도의 농축을 이루기 위한 시간 동안 이루어질 수 있다. 시간과 어느 정도 사용되는 다른 조건들은 농도와,용액의 원하는 단백질 농도를 이루기 위해 사용되는 막 설비에 의존한다.

농축되고 선택적으로 정용여과된(diafiltered) 단백질 용액은 미국특허번호 5,844,086 및 6,005,076호에 기술된 바와 같이 요구된다면 추가적인 탈지 작업을 거칠 수 있다.

농축되고 선택적으로 정용여과된(diafiltered) 단백질 용액은 전술한 색깔 제거작업의 대안으로서 색깔 제거작업을 거칠 수 있다. 과립모양의 활성탄(GAC)뿐만 아니라 가루로 된 활성탄이 여기에서 사용될 수 있다. 색깔 흡수제로서 사용될 수 있는 또다른 물질은 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone)이다.

색깔 흡수제 처리단계는 어떤 편안한 조건, 일반적으로 카놀라 단백질 용액의 주변 온도에서 수행될 수 있다. 가루로 된 활성탄의 경우, 약 0.025% 내지 약 5% w/v, 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 2% w/v의 양이 사용될 수 있다. 폴리비닐 피롤리돈이 색깔 흡수제로 사용되는 경우, 약 0.5% 내지 약 5% w/v, 바람직하게는 약 2% 내지 약 3% w/v의 양이 사용될 수 있다. 색깔 흡수제는 여과와 같은 어떤 편한 수단에 의해 카놀라 단백질 용액으로부터 제거될 수 있다.

선택적 색깔 제거단계로부터 기인하는 농축되고 선택적으로 정용여과된 단백질 용액은 원래 밀(meal)로부터 보관의 결과로 존재할 수 있는, 그렇지 않다면 추출단계에서 밀로부터 카놀라 단백질 용액으로 추출될 수 있는 세균을 죽이기 위해 저온살균과정(pasteurization)을 거칠 수 있다. 이러한 저온 살균은 어떤 바라는 살균조건 하에서 이루어질 수 있다. 일반적으로 농축되고 선택적으로 정용여과된 단백질 용액은 약 55℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 60℃ 내지 약 65℃의 온도로, 약 10 내지 15분간, 바람직하게는 약 10분동안 가열된다. 저온살균되고 농축된 단백질 용액은 이하에서 기술하는 추가적인 처리를 위해 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도로 냉각될 수 있다.

농축단계 및 선택적 정용여과 단계에서 사용되는 온도에 따라, 그리고 저온살균 단계가 이루어지든 아니든, 농축된 단백질 용액은 이어지는 희석 단계와 미셀(micelle) 형성을 잘 하기 위해 농축된 단백질 용액의 점성을 감소시키기 위해 최소 약 20℃의 온도로, 그리고, 약 60℃까지, 바람직하게는 약 25℃ 내지 40℃의 온도로 데워질 수 있다. 농축된 단백질 용액은 냉각수에 의한 희석에서 미셀 형성이 일어나지 않는 온도 이상으로 가열되어서는 안된다.

농축단계와, 선택적 정용여과단계, 선택적 색깔 제거단계, 선택적 저온살균단계와 선택적 탈지단계로부터 기인하는 농축된 단백질 용액은 그 다음 농축된 단백질 용액을 원하는 희석의 정도를 얻기 위해 요구되는 부피를 가지는 냉각수와 혼합함으로써 미셀 형성을 이루기 위해 희석된다. 상청액으로부터 비율과 미셀 루트에 의해 얻어지기 위해 원하는 카놀라 단백질의 비율에 따라, 농축된 단백질 용액의 희석 정도가 달라질 수 있다. 더 낮은 희석 레벨에서 일반적으로 더 큰 비율의 카놀라 단백질이 수용성 상(aqueous phase)으로 남는다.

미셀 루트에 의해 가장 큰 비율의 단백질을 제공하기를 원할 때 농축된 단백질 용액은 약 5폴드(fold) 내지 약 25폴드, 바람직하게는 약 10폴드 내지 약 20폴드에 의해 희석된다.

농축된 단백질 용액이 혼합되는 냉각수는 약 15℃보다 작은 온도를 가지고, 일반적으로 약 1 내지 약 15℃이고, 바람직하게는 약 10℃보다 작은데, 단백질 미셀 매스형태에서 단백질 분리물의 향상된 생산은 사용되는 희석 인자(factor)에서 이러한 더 차가운 온도에서 달성되기 때문이다.

배치(batch) 작업에서, 농축된 단백질 용액의 배치(batch)는 전술한 바와 같이 원하는 부피를 가지는 냉각수의 정지된 몸체에 추가된다. 농축된 단백질 용액의 희석과 이온 강도에서 그에 따른 감소는 미셀 형태에서 떨어진 단백질 방울의 형태로 잘 결합된 단백질 분자들의 구름 같은 덩어리(mass)의 형성을 야기시킨다. 배치 과정에서, 단백질 미셀들은 집합된, 덩어리로 합쳐진, 밀집한, 무정형의 끈적끈적한 글루텐 같은 단백질 미셀 매스(PMM)를 형성하기 위해 냉각수의 몸체에서 정착하도록 허용된다. 정착한 원심분리에 의해 보조될 수 있다. 이렇게 유도된 정착은 단백질 미셀 매스의 액체 함량을 감소시키고, 이에 의해 수분 함량을 일반적으로 중량 70% 내지 약 95% 중량에서 총 미셀 매스(micellar mass)의 중량 약 50% 내지 약 80% 중량의 수치로 감소시킨다. 이러한 방식으로 미셀 매스의 수분 함량을 감소시키는 것은 또한 미셀 매스의 패쇄된(occluded) 염(salt) 함량을 감소시키고, 따라서 건조된 분리물의 염 함량을 감소시킨다.

대안으로, 희석 작업은 농축된 단백질 용액을 T자형 파이프의 입구에 연속적으로 통과시키고, 희석수(diluting water)를 T자형 파이프의 다른 입구로 공급하여 파이프에서 혼합시켜 연속적으로 수행될 수 있다. 희석수는 농축된 단백질 용액의 원하는 정도의 희석을 얻기 위해 충분한 비율로 T자형 파이프에 공급된다.

파이프에서 농축된 단백질 용액과 희석수의 혼합은 단백질 미셀의 형성을 시작하고 혼합물은 T자형 파이프의 출구로부터 정착 용기에 연속적으로 공급되고, 이로부터 다 채워지면 상청액이 넘치도록 허용된다. 바람직하게는 혼합물은 액체의 몸체 내에 난류(turbulence)를 최소화하는 방식으로 정착 용기에서 액체의 몸체에 공급된다.

연속적인 과정에서, 단백질 미셀은 집합된, 덩어리로 합쳐진, 밀집한, 무정형의 끈적끈적한 글루텐 같은 단백질 미셀 매스(PMM)를 형성하기 위해 정착 용기에서 정착되도록 허용되고, 이 과정은 원하는 양의 PMM이 정착 용기에 축적될 때까지 계속되고, 축적된 PMM은 정착용기로부터 제거된다. 퇴적에 의한 정착 대신에, PMM은 원심분리에 의해 연속적으로 분리될 수 있다.

약 10 내지 약 20의 희석 인자(factor)의 사용과 최소 약 200g/L의 바람직한 단백질 함량으로의 단백질 용액의 농축의 공정 파라미터들의 조합은 원래 밀(meal) 추출로부터 단백질 미셀 매스의 형태로 단백질의 회수 측면에서 더 높은 수득율(yields), 종종 상당히 높은 수득율을 가져오고 전술한 미국특허출원에서 기술된 알려진 종래 기술 단백질 분리물 형성 과정의 하나를 사용하여 얻어지는 것보다 단백질 함량 측면에서 훨씬 더 순수한 분리물을 가져온다.

배치 공정에 비해 카놀라 단백질 분리물의 회수를 위한 연속적인 공정을 사용함으로써, 초기 단백질 추출 단계는 같은 레벨의 단백질 추출을 위한 시간에서 현저히 감소될 수 있고, 현저히 더 높은 온도가 추출단계에서 사용될 수 있다. 또한, 연속적인 작업에서 배치 공정보다 오염의 기회가 더 적어 더 높은 생산 품질로 이어지고, 공정이 더 콤팩트한 설비에서 수행될 수 있다.

정착된 분리물은 잔류 수용성 상 또는 상청액으로부터 정착된 덩어리로부터 잔류 수용성 상을 기울려 따라서, 또는 원심분리에 의해 분리된다. PMM은 젖은 형태로 사용될 수 있고 또는 스프레이 건조나 냉동건조와 같은 어떤 편한 기법에 의해 건조된 형태로 건조될 수 있다. 건조된 PMM은 높은 단백질 함량, 약 90wt% 단백질을 초과하여, 바람직하게는 최소 약 100wt% 단백질(kjeldahl N×6.25로 계산된)을 가지고, 실질적으로 변성되지 않은 것이다(시차주사 열량계에 의해 결정된). 지방의 오일 시드밀로부터 분리된 건조 PMM 또한 낮은 잔류 지방 함량을 가지고, 미국특허번호 5,844,086 및 6,005,076호의 공정이 필요하다면 사용될 때는 약 1wt% 이하일 수 있다.

전술한 미국특허출원번호 10/413,371호 및 10/510,766호에 기술된 바와 같이, PMM은 약 60 내지 98wt%의 7S 단백질, 약 1 내지 약 15wt%의 12S 단백질 및 0 내지 약 25wt%의 2S 단백질의 단백질 구성 함량을 가져서 주로 7S 카놀라 단백질로 구성된다.

PMM 형성 및 정착단계로부터 상청액은 희석 단계에서 침전되지 않으며 상당한 양의 카놀라 단백질을 함유하고, 그로부터 카놀라 단백질 분리물이 회수되도록 처리된다. 전술한 미국특허출원 번호 10/413,371호 및 10/510,766호에 기술된 바와 같이 상청액으로부터 유도되는 카놀라 단백질 분리물은 약 60 내지 약 95wt%의 2S 단백질, 약 5 내지 약 40wt%의 7S 단백질 및 0 내지 약 5wt%의 12S 단백질의 단백질 구성 함량을 가져서 주로 2S 카놀라 단백질로 구성된다.

희석 단계로부터 상청액은 PMM의 제거를 따라 농축되어 그 단백질 농도를 증가시킨다. 이 농축은 염과 단백질 근원 물질로부터 추출되는 다른 비단백질의 저 분자량 물질을 포함하여 적절한 분자량-절단 허용 저 분자량 종류를 가지는 막을 사용하여, 한외여과와 같은 선택적 막 기법을 이용하여 용액내에 카놀라 단백질을 유지하면서 막을 통과시켜 이루어진다. 다른 막 물질과 구성에 대한 고려를 가져서, 약 3,000 내지 100,000달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000달톤의 분자량-절단을 가지는 한외여과 막들이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 상청액의 농축은 역시 단백질을 회수하기 위해 건조되기에 요구되는 액체의 부피를 감소시킨다. 상청액은 건조되기 전에 일반적으로 최소 약 50g/L, 바람직하게는 약 100 내지 약 300g/L, 더 바람직하게는 약 200 내지 약 300g/L의 단백질 농도로 농축된다. 이런 농축 작업은 단백질 용액 농축단계를 위해 전술한 바와 같이, 배치(batch) 모드 또는 연속 작업에서 수행될 수 있다.

농축된 상청액은 그 다음 물, 염분 또는 산성화된 물을 이용하여 정용여과(diafiltration) 단계를 거칠 수 있다. 이 정용여과는 약 2 내지 약 20 볼륨의 정용여과 용액, 바람직하게는 약 5 내지 약 10 볼륨의 정용여과 용액을 이용하여 이루어질 수 있다. 정용여과 작업에서, 추가적인 양의 오염물질이 투과(the permeate)를 가지고 막을 통과시킴에 의해 수용성 상청액으로부터 제거된다. 정용여과 작업은 어떤 상당한 양의 오염물질들과 보이는 색깔이 투과에서 없어질 때까지 이루어질 수 있다. 이런 정용여과는 농축단게에서와 같은 동일한 막들을 사용하여 이루어질 수 있다. 그러나, 바람직하다면, 정용여과는 다른 막 물질과 구성에 대한 고려를 가져서, 약 3,000 내지 약 100,000달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000달톤의 범위에서 분자량-절단을 가지는 막과 같은 별개의 막을 사용하여 이루어질 수 있다.

적어도 일부의 정용여과 단계 중에 산화방지제가 정용여과 매개체에 존재할 수 있다. 산화방지제는 아황산 나트륨 또는 아스코르브 산과 같은 어떤 편한 산화방지제일 수 있다. 정용여과 매개체에서 채용되는 산화방지제의 양은 채용되는 물질에 의존하고, 약 0.01 내지 약 1 wt%까지 다를 수 있고, 바람직하게는 약 0.05wt%이다. 산화방지제는 농축된 카놀라 단백질 분리물 용액에 존재하는 석탄산(phenolics)의 산화를 억제하는 역할을 한다.

농축되고 선택적으로 정용여과된 단백질 용액은 전술한 색깔 제거작업의 대안으로서 색깔 제거작업을 거칠 수 있다. 과립모양의 활성탄(GAC) 뿐만 아니라 가루로 된 활성탄이 여기에서 사용될 수 있다. 색깔 흡수제로서 사용될 수 있는 또다른 물질은 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone)이다.

색깔 흡수제 처리단계는 어떤 편한 조건, 일반적으로 카놀라 단백질 용액의 주변 온도에서 수행될 수 있다. 가루로 된 활성탄의 경우, 약 0.025% 내지 약 5% w/v, 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 2% w/v의 양이 사용될 수 있다. 폴리비닐 피롤리돈이 색깔 흡수제로 사용되는 경우, 약 0.5% 내지 약 5% w/v, 바람직하게는 약 2% 내지 약 3% w/v의 양이 사용될 수 있다. 색깔 흡수제는 여과와 같은 어떤 편한 수단에 의해 카놀라 단백질 용액으로부터 제거될 수 있다.

본 발명에 따르면, 농축되고 선택적으로 정용여과된 상청액은 선택적 색깔 제거작업을 따라 7S 단백질의 등전침전 및 제거에 의해 용액에서 7S 단백질의 양을 감소시키도록 처리되고, 이에 의해 농축된 상청액에 존재하는 카놀라 단백질에서 2S 단백질의 비율을 증가시킨다.

이런 처리는 농축된 상청액에 존재하는 7S의 비율을 감소시키기에 충분한, 바람직하게는 상당한 정도로 7S 단백질의 비율을 감소시키기에 충분한 pH와 염 조건들 하에서 이루어질 수 있다. 일반적으로, 상청액의 7S 단백질 함량은 처리에 의해 최소 약 50wt%, 바람직하게는 최소 약 75wt%에 의해 감소된다. 침전된 7S 단백질은 원심분리 또는 여과 또는 이의 조합과 같은 어떤 편한 방식으로 제거될 수 있다.

등전(isoelectric) 처리 과정에서, 염, 염화칼륨과 같은 다른 염들도 사용될 수 있지만, 일반적으로 염화나트륨이 상청액, 부분적으로 농축된 상청액 또는 농축된 상청액에 처음 추가되어 최소 약 0.3mS, 바람직하게는 약 10 내지 약 20mS의 전도율(conductivity)를 가지는 염분 용액(salinated solution)을 제공한다.

염분의(salinated) 상청액의 pH는 7S 단백질의 등전침전을 야기시키는 수치로, 일반적으로 약 2.0 내지 약 4.0, 바람직하게는 약 3.0 내지 약 3.5의 pH로 조정된다. 7S 단백질의 등전침전은 넓은 온도 범위에서 이루어질 수 있고, 일반적으로 약 5℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 40℃이다. 침전된 7S 단백질은 원심분리 또는 여과 또는 이의 조합과 같은 어떤 편한 수단에 의해 등전침전된 상청액으로부터 제거된다.

등전 침전된 상청액은, 벌써 농축되지 않았다면, 그 다음 전술한 바와 같이 농축되고, 농축되고 정용여과된 상청액을 건조시키기 전에 정용여과되어 염을 제거하여 본 발명의 카놀라 단백질 분리물을 형성한다. 농축되고, 정용여과되고 등전침전된 상청액은 잔류 입자들을 제거하기 위해 여과되고, 스프레이 건조 또는 냉동 건조와 같은 어떤 편한 기법에 의해 건조되기 이전에 전술한 바와 같은 색깔 제거작업을 거쳐서 본 발명에 따른 카놀라 단백질 분리물을 제공한다. 이 카놀라 단백질 분리물은 높은 단백질 함량을 가지고, 약 90wt%를 초과하며, 바람직하게는 최소 약 100wt% 단백질(N×6.25)이다.

농축되고 정용여과되며 등전침전된 상청액의 pH는 건조된 분리물의 의도된 용도에 맞는 pH로, 일반적으로 약 2 내지 약 5의 pH로, 바람직하게는 약 2.5 내지 약 4의 pH로 조정될 수 있다.

이 신규 카놀라 단백질 분리물은 높은 비율의 2S 단백질을 함유하고, 분리물에서 카놀라 단백질의 바람직하게는 최소 90wt%, 가장 바람직하게는 최소 약 95wt%의 2S 단백질을 함유한다. 또한 분리물에는 일부 비율의 7S 단백질이 있다.

대안으로서, 7S 단백질을 침전시키기 위한 상청액의 등전 처리는 전술한 농축과 정용여과 단계 이전에 상청액에서 이루어질 수 있다. 침전된 7S 단백질의 제거를 따라서, 그 다음 상청액은 농축되고, 선택적으로 정용여과되며, 선택적으로 색깔 제거작업을 거치고, 건조되어 본 발명에 따른 카놀라 단백질 분리물을 제공한다.

추가적인 대안으로서, 상청액은 처음 어떤 편한 레벨로 부분적으로 농축될 수 있다. 부분적으로 농축된 상청액은 그 다음 7S 단백질을 침전시키기 위해 등전처리를 거친다. 침전된 7S 단백질의 제거를 따라서, 상청액은 일반적으로 약 50 내지 약 300g/L, 바람직하게는 약 200 내지 약 300g/L의 농도로 추가적으로 농축되고, 선택적으로 정용여과되며, 선택적으로 색깔 제거작업을 거치고, 건조되어 본 발명에 따른 카놀라 단백질 분리물을 제공한다.

침전된 7S 단백질은 상청액, 부분적으로 농축된 상청액 또는 농축된 상청액으로부터 원심분리, 또는 여과 또는 이의 조합과 같은 어떤 편한 수단에 의해 제거된다.

침전된 7S 단백질의 제거를 따라서, 등전으로 처리된 상청액 또는 부분적으로 농축된 등전 처리된 상청액은 전술한 바와 같이 농축 또는 정용여과 중 또는 그 후에 어떤 지점으로 pH조정될 수 있다.

바람직한 실시예의 설명

도1을 참조하면, 미셀 루트에 의한 카놀라 단백질 분리물(CPIs)의 형성과 비교하여 두개의 막 공정이 여기에 도시된다.

도시된 바와 같이, 한외여과와 정용여과 단계를 포함하여 이루어질 수 있는 첫번째 한외여과 단계(한외여과 #1)로부터 보유물(retentate)은 두 가지 방법 중 하나에서 처리된다. 두개의 막 공정에서, 보유물은 스프레이 건조되어 주로 7S 카놀라 단백질로 구성되는 카놀라 단백질 분리물을 제공한다.

전술한 미국특허출원번호 10/137,321호 및 10/476,230호의 공정에서, 보유물은 카놀라 단백질 분리물이 단백질 미셀 매스로서 침전하는 희석 단계로 통과한다. 단백질 미셀 매스는 스프레이 건조되어 주로 7S 카놀라 단백질로 구성되는 카놀라 단백질 분리물을 제공한다.

두개의 막 실시예에서, 첫번째 한외여과 단계로부터 투과는 한외여과와 정용여과를 포함할 수 있는 두번째 한외여과 단계(한외여과 #2-A)를 거칠 수 있다. 두번째 한외여과 단계로부터 보유물은 스프레이 건조되어 주로 2S 단백질로 구성되는 카놀라 단백질 분리물을 제공한다.

미국특허출원번호 10/137,321호 및 10/476,230호의 공정에서, 단백질 미셀 매스의 침전으로부터 상청액은 한외여과와 정용여과를 포함하는 한외여과단계(한외여과 #2-B)를 거친다. 한외여과 단계로부터 보유물은 7S 단백질의 등전 침전을 거치고, 그 다음 스프레이 건조되어 주로 2S 단백질로 구성되는 카놀라 단백질 분리물을 제공한다.

도2를 참조하면, 농축에 이어서(한외여과 #2)(오른쪽 흐름), 또는 농축 이전에(왼쪽 흐름) 상청액의 등전 침전이 이루어져, 본 발명의 신규 카놀라 단백질 분리물을 제공하기 위한 미셀 공정으로부터 상청액의 처리를 위한 과정이 도시된다.

실시예들

실시예1

이 예는 신규 카놀라 단백질 분리물의 생산을 위한 하나의 공정을 설명한다.

'a'kg의 카놀라 밀(meal)이 주변 온도에서 'b'L의 0.1M Nacl 용액에 추가되었고 30분간 휘저어서 수용성 단백질 용액을 제공한다. 잔류 카놀라 밀은 제거되었고 결과적인 단백질 용액은 원심분리와 여과에 의해 투명하게 되어 중량 'd'% 의 단백질 함량을 가지는 'c'L의 여과된 단백질 용액을 생산한다.

'e'L 부분표본의 단백질 추출 용액은 5,000달톤의 분자량 절단을 가지는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 막에서 농축에 의해 'f'L의 부피로 감소되었고, 그 다음 동일한 막에서 'g'L의 0.1M Nacl로 정용여과되었다. 정용여과된 보유물(retentate)은 그 다음 60℃에서 10분간 저온살균되었다(pasteurized). 저온살균된 농축 단백질 용액은 중량 'h'%의 단백질 함량을 가졌다.

'i'℃에서 농축된 용액은 'k'℃ 온도를 가지는 차가운 RO 물로 'j' 희석되었다. 흰 구름이 즉시 형성되었고, 정착되도록 허용되었다. 상부 희석수가 제거되었고, 침전된, 점성의, 끈적한 덩어리(PMM)가 용기 바닥으로부터 'l'wt%의 여과된 단백질 용액의 수득율(yield)에서 회수되었다. 건조된 PMM 유래 단백질은 'm'%(N×6.25)d.b.의 단백질 함량을 가지는 것으로 발견되었다. 생산물은 명칭 'n'C300이 부여되었다.

두 실행(생산, run)을 위한 파라미터 'a' 내지 'n'은 다음 표1에서 설명된다.

표1

제거된 상청액은 10,000달톤의 분자량 절단을 가지는 폴리에테르술폰(polyethersulfone, PES) 막을 사용하여 한외여과에 의해 'o'L의 부피로 감소되었고, 그 다음 농축물은 'p'L의 물로 동일한 막에서 정용여과되었다. 정용여과된 농축물은 60℃에서 10분간 저온살균되었다(pasteurized). 저온살균된 농축물은 중량 'q'% 단백질을 함유하였다. 상청액으로부터 회수된 추가적인 단백질에서, 여과된 단백질 용액의 총 단백질 회수는 'r'wt%였다. 저온살균된 농축물은 두 개의 동등한 부분으로 나뉘어졌다. 한 부분(portion)은 스프레이 건조되어 명칭 'n'C200이 부여된 최종 생산물을 형성하였고 's'%(N×6.25)d.b.의 단백질 함량을 가졌다.

두 실행을 위한 파라미터 'n' 내지 's'는 다음 표2에서 설명된다.

표2

저온살균되고, 농축된 상청액의 나머지 부분은 10분간 85℃로 가열되었고, 그 다음 원심분리되어 침전된 단백질을 제거하였다. 그 결과 농축물은 스프레이 건조되어 명칭 'n'C200H가 부여된 최종 생산물을 형성하였고, 't'%(N×6.25)d.b.의 단백질 함량을 가졌다. 두 실행을 위한 파라미터 'n' 및 't'는 다음 표3에서 설명된다.

표3

실시예2

본 실시예는 신규 카놀라 단백질 분리물의 생산을 위한 대안 공정을 설명한다.

카놀라 밀(meal)은 주변 온도에서 염화나트륨 용액에 추가되었고 30분간 휘저어서 수용성 단백질 용액을 제공하였다. 잔류 카놀라 밀은 제거되었고 그 결과 단백질은 원심분리 및 여과에 의해 투명하게 되었다.

단백질 추출 용액의 부분표본은 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 막에서 농축에 의해 부피에서 감소되었고, 그 다음 동일한 막에서 염화나트륨 용액으로 선택적으로 정용여과되었다. 그 보유물(retentate)은 그 다음 60℃에서 10분간 저온살균되었다(pasteurized).

농축된 용액은 차가운 RO 물로 희석되었다. 흰 구름이 즉시 형성되었고, 정착되도록 허용되었다. 상부 희석수가 제거되었고, 침전된, 점성의, 끈적한 덩어리(PMM)가 기울여따르기 또는 원심분리에 의해 회수되었다. PMM은 스프레이 건조되어 최종 생산물을 형성하였다.

열처리는 그 다음 제거된 희석수(상청액으로 일컬어지는), 부분적으로 농축된 상청액 또는 농축된 상청액에서 실행되었다.

열처리가 농축된 상청액에서 수행되는 경우에, 'c'달톤의 분자량 절단을 가지는 폴리에테르술폰(polyethersulfone, PES) 막을 사용하여 한외여과에 의해 'a'L의 상청액은 'b'L의 부피로 감소되었고, 그 다음 농축물은 'd'L의 물로 동일한 막에서 정용여과되었다. 정용여과된 농축물은 60℃에서 10분간 저온살균되었다(pasteurized). 저온살균된 농축물은 중량 'e'% 단백질을 함유하였다. 상청액으로부터 회수된 추가적인 단백질에서, 여과된 단백질 용액의 총 단백질 회수는 'f'wt%였다. 저온살균된 농축물은 두 개의 부분으로 나뉘어졌다. 'g'L의 한 부분은 스프레이 건조되어 명칭 'h'C200이 부여된 최종 생산물을 형성하였고 'i'%(N×6.25)d.b.의 단백질 함량을 가졌다.

여섯 실행을 위한 파라미터 'a' 내지 'i'는 다음 표4에서 설명된다.

표4

저온살균되고, 농축된 상청액의 'j'L의 나머지 부분은 10분간 85℃로 가열되었고, 그 다음 원심분리되어 침전된 단백질을 제거하였다. 그 결과 농축물은 스프레이 건조되어 명칭 'h'C200H가 부여된 최종 생산물을 형성하였고, 'k'%(N×6.25)d.b.의 단백질 함량을 가졌다. 여섯 실행을 위한 파라미터 'h', 'j' 및 'k'는 다음 표5에서 설명된다.

표5

열처리가 상청액 또는 부분적으로 농축된 상청액에서 수행되는 경우에, 'n'달톤의 분자량 절단을 가지는 폴리에테르술폰(polyethersulfone, PES) 막을 사용하여 한외여과에 의해 'l'L의 상청액은 'm'L의 부피로 감소되었다. 상청액, 또는 부분적으로 농축된 상청액은 그 다음 10분간 85℃로 가열되었고, 그 다음 원심분리되어 침전된 단백질을 제거하였다. 필요하다면, 잔류 침전된 단백질은 여과에 의해 제거되었다. 투명해진 표본은 그 다음 'p'달톤의 분자량 절단을 가지는 폴리에테르술폰(polyethersulfone, PES)을 사용하여 한외여과에 의해 'o'L 로 부피에서 감소되었다. 그 농축물은 중량 'q'% 단백질을 함유하였다. 상청액으로부터 회수된 추가적인 단백질에서, 여과된 단백질 용액의 총 단백질 회수는 'r'wt%였다. 그 농축물은 스프레이 건조되어 명칭 'h'C200HS가 부여된 최종 생산물을 형성하였고 's'%(N×6.25)d.b.의 단백질 함량을 가졌다. 여섯 실행을 위한 파라미터 'h', 및 'l' 내지 's'는 다음 표6에서 설명된다.

표6

실시예3

본 실시예는 본 발명의 한 실시예에 따른 신규 카놀라 단백질 분리물의 생산을 설명한다.

카놀라 밀(meal)은 주변 온도에서 염화나트륨 용액에 추가되었고 30분간 휘저어서 수용성 단백질 용액을 제공하였다. 잔류 카놀라 밀은 제거되었고 그 결과 단백질 용액은 원심분리 및 여과에 의해 투명하게 되었다.

단백질 추출 용액의 부분표본은 폴리에테르술폰 막에서 농축에 의해 부피에서 감소되었다. 그 다음 그 보유물(retentate)은 60℃에서 1분간 저온살균되었다(pasteurized).

농축된 용액은 차가운 RO 물로 희석되었다. 흰 구름이 즉시 형성되었다. 침전된, 점성의, 끈적한 덩어리(PMM)가 상청액으로부터 원심분리에 의해 분리되었다. PMM은 스프레이 건조되어 최종 생산물을 형성하였다.

"a"L의 상청액은 약 0.1M로 염 농도를 조정하기 위해 "b"kg의 염화나트륨과 결합되었다. 염 추가를 따라서, 희석 염산을 추가함으로써 pH는 3.5로 조정되었다. 그 표본의 전도율은 14.03mS였다. 그 표본은 단백질 침전이 일어나면서 10분간 휴식되도록 허용되었다.

침전된 단백질은 산성화된 상청액으로부터 원심분리에 의해 제거되었다. 침전된 단백질은 스프레이 건조되어 최종 생산물을 형성하였다.

산성화된 상청액의 pH는 희석 염산의 추가에 의해 3으로 낮아졌다. "c"L 산성화된 상청액은 그 다음 'e'달톤의 분자량 절단을 가지는 폴리에테르술폰(polyethersulfone, PES) 막을 사용하여 한외여과에 의해 'd'L 로 부피에서 감소되었고, 그 농축물은 "f"L의 산성화된 물로 동일한 막에서 정용여과되었다. 정용여과된 농축물은 어떤 잔류 침전된 단백질을 제거하기 위해 여과되었다. "g"kg의 부분표본은 스프레이 건조되어 명칭 'h'C200IS가 부여된 최종 생산물을 형성하였고 'i'%(N×6.25)d.b.의 단백질 함량을 가졌다.

파라미터 "a", 내지 "i"는 다음 표8에서 설명된다.

표8

실시예4

본 실시예는 실시예 2 및 3에서 생산된 스프레이 건조된 카놀라 단백질 분리물의 용해도의 평가를 포함한다.

스프레이 건조된 농축된 상청액(C200)과 실시예2에서 생산된 변형된 생산물(C200H 및 C200HS)과 실시예3의 과정에서 생산된 등전 침전된 상청액(C200IS)의 용해도가 Morr et al., J. Food. Sci. 50:1715-1718의 과정의 수정판을 사용하여 결정되었다.

0.5g의 단백질을 공급하기 위한 충분한 단백질 파우더(powder)가 비이커 속에서 무게를 달아 소량의 역삼투(RO) 정화된 물이 추가되었고 그 혼합물이 부드러운 반죽이 형성될 때까지 휘젓는다. 그 다음 추가적인 물이 약 45ml로 부피를 가져오기 위해 추가되었다. 비이커의 내용물은 그 다음 천천히 60분간 자성 교반기(magnetic stirer)를 이용하여 휘젓는다. 단백질을 분산시킨 후 pH가 즉시 결정되었고, NaOH 또는 HCl로 적절한 수준(2,3,4,5,6, 또는 7)으로 조정되었다. 표본은 또한 원래 pH에서도 준비되었다. pH 조정된 표본에서, pH가 측정되었고, 60분 휘저으면서 두번 보정되었다. 60분간 휘저은 후에, 표본은 RO 물로 50ml 총 부피로 되었고, 1% w/v 단백질 분산을 보였다. 단백질 분산의 부분표본은 레코 FA28 질소 결정기(Leco F28 Nitrogen Determinator)를 사용하여 레코 분석에 의해 단백질 함량 결정을 위해 보관되었다. 표본의 또 다른 일부는 8000g에서 10분간 원심분리되었다. 이것은 어떤 용해되지 않는 물질을 퇴적시키고, 투명한 상청액을 만들었다. 그 다음 상청액의 단백질 함량은 레코 분석(Leco analysis)에 의해 결정되었다.

용해도(%)=(상청액 단백질 농도(supernatant protein conc.)/ 원 분산 단백질 농도(original dispersion protein conc.))×100

얻어진 결과들은 표9에서 설명된다.

표9

표9의 결과로부터 보여지는 바와 같이, 변경되고 농축된 상청액(C200H), 열처리되고 농축된 상청액(C200HS), 및 등전 침전된 상청액(C200IS)로부터 건조된 분리물은 실시예1에 따라 생산된 농축된 상청액(C200)으로부터의 건조된 분리물보다 다양한 pH 수치에서 물에서 현저히 더 용해가능하였다.

실시예5

이 실시예는 청량음료 및 스포츠 음료에서 실시예2 및 3에서 생산된 스프레이 건조된 카놀라 단백질 분리물의 용해도의 평가를 함유한다.

실시예2의 과정에 의해 생산된 변경된 생산물(C200H 및 C200HS) 및 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200)과 실시예3의 과정에 의해 생산된 등전 침전된 상청액(C200IS)의 청량음료(스프라이트) 또는 스포츠 음료(오렌지 게토레이드)의 용해도가 실시예4에서 전술한 바와 같이 그러나, 물을 대신하는 스포츠 음료 또는 청량음료이고, 2% w/v의 단백질 농도와 pH 조정 없이 Morr et al., J. Food Sci. 50:1715-1718의 과정의 수정을 이용하여 결정되었다.

그 결과는 다음의 표10에서 설명된다.

표10

표10의 결과에서 보여지듯이, 변경되고 농축된 상청액(C200H), 열처리되고 다음 농축된 상청액(C200HS) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)으로부터 건조된 분리물은 농축된 상청액(C200)으로부터 건조된 분리물보다 청량음료 및 스포츠 음료에서 현저히 더 용해가능하였다.

실시예6

본 실시예는 다양한 pH수치에서 물에 용해된 실시예 2 및 3에서 생산된 스프레이 건조된 카놀라 단백질 분리물의 용액에서 투명도의 평가를 포함한다.

0.5g의 단백질을 공급하기 위한 충분한 단백질 파우더(powder)가 비이커에서 무게를 달아 소량의 역삼투(RO) 정화된 물이 추가되었고 그 혼합물이 부드러운 반죽이 형성될 때까지 휘젓는다. 그 다음 추가적인 물이 약 45ml로 부피를 가져오기 위해 추가되었다. 비이커의 내용물은 그 다음 천천히 60분간 자성 교반기(magnetic stirer)를 이용하여 휘젓는다. 단백질을 분산시킨 후 pH가 즉시 결정되었고, NaOH 또는 HCl로 적절한 수준(2,3,4,5,6, 또는 7)으로 조정되었다. 표본은 또한 원래 pH에서도 준비되었다. pH 조정된 표본에서, pH가 측정되었고, 60분 휘저으면서 두번 보정되었다. 60분간 휘저은 후에, 표본은 RO 물로 50ml 총 부피로 되었고, 1% w/v 단백질 분산을 보였다. 용액들의 투명도는 분광 광도계(spectrophotometer)를 비우는데 사용되는 순수 물로 600nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 읽어지는 흡광도가 더 낮을수록 투명도가 더 크다.

얻어진 결과들은 표11에서 설명된다.

표11

표11의 결과로부터 보여지듯이, 변경되고 농축된 상청액(C200H), 열처리되고 다음 농축된 상청액(C200HS) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)으로부터 건조된 분리물은 농축된 상청액(C200)으로부터 건조된 분리물보다 다양한 pH에서 물에서 현저히 더 큰 투명도를 가지는 용액들을 생산하였다. 그 차이는 낮은 pH에서 가장 두드러졌다.

실시예7

본 실시예는 청량음료 또는 스포츠 음료에 용해된 실시예 2 및 3에서 생산된 스프레이 건조된 분리물의 용액에서 투명도의 평가를 포함한다.

투명도는 무색의, 투명한, 상업적인 탄산 청량음료(스프라이트) 또는 유색의, 상업적인 비탄산 스포츠 음료(오렌지 게토레이드)에서 2% w/v 단백질의 용액에 의해 600nm에서 가시광선의 흡광도를 측정함으로써 평가되었다. 분광 광도계는 단백질 함유 표본의 투명도를 측정하기 전에 적절한 음료의 순수한 표본으로 비워졌다. 읽어지는 흡광도가 더 낮을수록, 더 좋은 빛이 투과되었고 그 용액의 투명도는 더 좋았다.

얻어진 결과들은 표12에서 설명된다.

표12

표12의 결과로부터 보여지듯이, 변경되고 농축된 상청액(C200H), 열처리되고 다음 농축된 상청액(C200HS) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)으로부터 스프레이 건조된 분리물로부터 준비되는 용액들의 투명도가 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200)으로부터 준비된 것들보다 훨씬 더 우수하였다.

실시예8

본 실시예는 일반 음료들의 pH수치들을 포함한다.

일반 음료들의 pH수치는 pH 미터에 의해 결정되었고 얻어진 결과들은 표13에 설명된다.

표13

실시예9

본 실시예는 실시예1,2 및 3의 과정에 의해 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200)과, 변경된 생산물(C200H 및 C200HS) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)의 용해도의 추가적인 평가를 포함한다.

0.5g의 단백질을 공급하기 위한 충분한 단백질 파우더(powder)가 비이커에서 무게를 달아 소량의 역삼투(RO) 정화된 물이 추가되었고 그 혼합물이 부드러운 반죽이 형성될 때까지 휘젓는다. 그 다음 추가적인 물이 약 45ml로 부피를 가져오기 위해 추가되었다. 비이커의 내용물은 그 다음 천천히 60분간 자성 교반기(magnetic stirer)를 이용하여 휘젓는다. 단백질을 분산시킨 후 pH가 즉시 결정되었고, NaOH 또는 HCl로 적절한 수준(2,3,4,5,6, 또는 7)으로 조정되었다. 표본은 또한 원래 pH에서도 준비되었다. pH 조정된 표본에서, pH가 측정되었고, 60분 휘저으면서 두번 보정되었다. 60분간 휘저은 후에, 표본은 RO 물로 50ml 총 부피로 되었고, 1% w/v 단백질 분산을 보였다. 그 분산들의 표본들(20ml)은 그 다음 30분간 105℃ 오븐에서 건조되고 데시케이터에서 냉각된 이미 무게를 단 원심분리 튜브에 이동되었고, 그 튜브들은 뚜껑을 닫았다. 표본들은 10분간 7800g에서 원심분리되었고, 불용성 물질을 퇴적시키고 투명한 상청액을 생산하였다. 그 상청액과 투브 뚜껑은 버리고, 팰릿 물질은 밤새 55℃로 설정된 오븐에서 건조되었다. 그 다음날 아침 튜브들은 데시케이터로 이동되어 냉각되었다. 건조된 팰릿 물질의 무게가 기록되었다. 초기 단백질 파우더의 건조 중량은 사용된 파우더의 중량에 ((100-파우더의 수분함량(%))/100)의 인자로 곱하여 계산되었다. 그 생산물의 용해도는 그 후 다음과 같이 계산되었다.

용해도(%)=(1-(건조된 불용성 팰릿 물질 중량/(2/5×건조 단백질 파우더의 초기 중량)))×100

얻어진 결과들은 표14에서 설명된다.

표14

표14의 결과로부터 보여지듯이, 변경되고 농축된 상청액(C200H), 열처리되고 다음 농축된 상청액(C200HS) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)으로부터 건조된 분리물은 농축된 상청액(C200)으로부터 건조된 분리물보다 다양한 pH에서 물에서 현저히 더 용해가능하였다.

실시예10

본 실시예는 실시예1,2 및 3의 과정에 의해 생산된 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200)과, 변경된 생산물(C200H) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)의 pH7에서 열 안정성의 평가를 포함한다.

1.6g의 단백질을 공급하기 위한 충분한 단백질 파우더(powder)가 비이커에서 무게를 달아 약 15g의 역삼투(RO) 정화된 물이 추가되었고 그 혼합물을 60분간 자성 교반기(magnetic stirer)를 이용하여 휘젓는다. 필요하다면, 그 생산물은 자성 교반이 진행되면서 또한 수동으로 교반 막대를 가지고 분산되었다. 30분간 휘저은 후 그 표본의 pH가 결정되었고, 필요하다면 NaOH 또는 HCl을 사용하여 7로 조정되었다. 그 표본은 30분 더 휘저었다. 60분의 교반 후에 pH가 체크되었고, 필요하다면 7로 재조정되었다. 그 다음 표본은 RO 물로 20ml 총 부피로 되었고, 8% w/w 단백질 분산을 보였다. 그 분산들은 그 다음 30분간 105℃ 오븐에서 건조되고 데시케이터에서 냉각된 이미 무게를 단 원심분리 튜브에 이동되었다. 그 튜브들에서 분산의 무게가 기록되었고, 그 표본들은 뚜껑을 닫고, 90℃ 수조에 30분간 두어서 열처리하였다. 물의 수준은 열처리 내내 표본 액체 수준보다 더 높이 유지되었다. 열처리 후에 표본들은 얼음수조에 두어 즉시 냉각되었다. 그 표본들은 그 다음 밤새 냉장고에 보관되었다. 그 다음날 아침 표본들은 10분간 7800g에서 각각 세번 원심분리되었다. 상청액은 튜브로부터 기울려 따르고(완전히 콤팩트한 팰릿이 얻어지지 않은 어떤 표본에서 팰릿 물질의 소량의 손실이 관측됨에 주목), 튜브 뚜껑은 버려졌다. 팰릿 물질은 밤새 55℃ 오븐에 개봉된 튜브를 두어서 건조되었다. 그 다음날 아침 표본들은 데시케이터로 이동되어 냉각되었다. 건조된 팰릿 물질의 무게가 기록되었다. 초기 단백질 파우더의 건조 중량은 사용된 파우더의 중량에 ((100-파우더의 수분함량(%))/100)의 인자로 곱하여 계산되었다. 생산물의 용해도에 열처리가 미치는 영향은 다음과 같이 계산되었다.

열처리 후 불용성 파우더의 % = (건조 불용성 팰릿 물질 중량/ 원심분리 튜브에서 분산 중량/20)×건조 단백질 파우더 초기 중량))×100

얻어지는 결과들은 표15에서 설명된다.

표15

표15의 결과로부터 보여지듯이, 변경되고 농축된 상청액(C200H), 및 등전 침전된 상청액(C200IS)으로부터 스프레이 건조된 분리물로부터 준비되는 용액들의 열 안정성이 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200)으로부터 준비된 것들보다 더 우수하였다.

실시예11

본 실시예는 실시예1, 2 및 3의 과정에 의해 생산된 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200)과, 변경된 생산물(C200H 및 C200HS) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)의 pH6에서 열 안정성의 평가를 포함한다.

0.3g의 단백질을 공급하기 위한 충분한 단백질 파우더(powder)가 비이커에서 무게를 달아 약 25g의 역삼투(RO) 정화된 물이 추가되었고 그 혼합물을 총 60분간 자성 교반기(magnetic stirer)를 이용하여 휘젓는다. 30분간 휘저은 후 그 표본의 pH가 결정되었고, 필요하다면 NaOH 또는 HCl을 사용하여 6으로 조정되었다. 그 표본은 30분 더 휘저었다. 60분의 교반 후에 pH가 체크되었고, 필요하다면 6으로 재조정되고 그 다음 표본은 RO 물로 30ml 총 부피로 되었고, 1% w/w 단백질 분산을 보였다. 그 분산들은 그 다음 30분간 105℃ 오븐에서 건조되고 데시케이터에서 냉각된 이미 무게를 단 원심분리 튜브에 이동되었다. 그 튜브들에서 분산의 무게가 기록되었고, 그 표본들은 뚜껑을 닫고, 85℃ 수조에 10분간 두어서 열처리하였다. 물의 수준은 열처리 내내 표본 액체 수준보다 더 높이 유지되었다. 열처리 후에 표본들은 얼음수조에 두어 즉시 냉각되었다. 그 표본들은 그 다음 10분간 7800g에서 원심분리되었다. 상청액은 튜브로부터 기울려 따르고, 튜브 뚜껑은 버려졌다. 팰릿 물질은 밤새 55℃ 오븐에 개봉된 튜브를 두어서 건조되었다. 그 다음날 아침 표본들은 데시케이터로 이동되어 냉각되었다. 건조된 팰릿 물질의 무게가 측정되었다. 초기 단백질 파우더의 건조 중량은 사용된 파우더의 중량에 ((100-파우더의 수분함량(%))/100)의 인자로 곱하여 계산되었다. 생산물의 용해도에 열처리가 미치는 영향은 다음과 같이 계산되었다.

열처리 후 불용성 파우더의 % = (건조 불용성 팰릿 물질 중량/((원심분리 튜브에서 분산 중량/30)×건조 단백질 파우더 초기 중량))×100

얻어지는 결과들은 표16에서 설명된다.

표16

표16의 결과에서 보여지듯이, 변경되고 농축된 상청액(C200H), 열처리되고 농축된 상청액(C200HS) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)으로부터 스프레이 건조된 분리물로부터 준비되는 용액들의 열 안정성이 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200)으로부터 준비된 것들보다 더 우수하였다.

실시예12

본 실시예는 실시예1, 2 및 3의 과정에 의해 생산되는 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200), 변경된 생산물(C200H) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)의 0.10M NaCl의 염분과 pH3.5에서 용해도의 평가를 포함한다.

0.5g의 단백질을 공급하기 위한 충분한 단백질 파우더(powder)가 비이커에서 무게를 달아 약 45g의 0.1M NaCl이 추가되었다. 비이커의 내용물을 30분간 자성 교반기(magnetic stirer)를 이용하여 휘젓는다. 그 다음 pH가 HCl의 추가에 의해 3.5로 조정되었다. 그 표본은 30분 더 휘저었다. 이 때, pH가 체크되었고, 필요하다면 3.5로 재조정되고 그 다음 표본 중량은 추가적인 0.1M NaCl로 50g이 되었고, 1% w/w 단백질 분산을 보였다. 그 분산들의 표본들(약 30g)은 그 다음 30분간 105℃ 오븐에서 건조되고 데시케이터에서 냉각된 이미 무게를 단 원심분리 튜브에 이동되었다. 그 튜브들에서 분산의 무게가 기록되었고, 그 표본들은 뚜껑을 닫았다. 그 표본들은 10분간 7800g에서 원심분리되었고, 불용성 물질을 퇴적시켰다. 상청액은 튜브로부터 기울여 따르고(완전히 콤팩트한 팰릿이 얻어지지 않은 어떤 표본들에서 팰릿 물질의 소량의 손실이 관측됨에 주목), 튜브 뚜껑은 버려졌다. 팰릿 물질은 밤새 55℃로 설정된 오븐에서 건조되었다. 그 다음날 아침 튜브들은 데시케이터로 이동되어 냉각되었다. 건조된 팰릿 물질의 무게가 기록되었다. 초기 단백질 파우더의 건조 중량은 사용된 파우더의 중량에 ((100-파우더의 수분함량(%))/100)의 인자로 곱하여 계산되었다. 생산물의 용해도에 pH와 염 농도가 미치는 영향은 다음과 같이 계산되었다.

시험 조건하에서 불용성 파우더의 % = (건조 불용성 팰릿 물질 중량/((원심분리 튜브에서 초기 표본 중량/50)×건조 단백질 파우더 초기 중량))×100

얻어진 결과들은 다음의 표17에서 설명된다.

표17

표17의 결과로부터 보여지듯이, 변경되고 농축된 상청액(C200H), 및 등전 침전된 상청액(C200IS)으로부터 건조된 분리물은 농축된 상청액(C200)으로부터 건조된 분리물보다 pH3.5에서 염분에 현저히 더 용해가능하였다.

실시예13

본 실시예는 실시예1, 2 및 3의 과정에 의해 생산되는 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200), 변경된 생산물(C200H 및 C200HS) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)의 표면 소수성(surface hydrophobicity)의 평가를 포함한다.

다른 분리물들의 표면 소수성은 소수성 염료: 1-아닐린 8- 나프탈렌 술포네이트(1-aniline 8-naphthalene sulfonate, ANS)를 포함한 표면 소수성(S₀) 시험을 이용하여 실온(room temperature)에서 결정되었다. 상대적 형광강도(fluorescence intensity)가 네트(net) 상대 형광강도(RFI) 슬로프(slope)의 계산에 의해 결정되는 단백질에 대한 소수성(S₀)으로 분광 형광계(spectrofluorimeter)를 사용하여 측정되었다. 염료가 단백질 분자상에서 소수성 위치에 끌어당겨지므로, S₀가 더 높을수록 그 단백질은 더 큰 소수성을 나타낸다.

농축된 상청액 유래 단백질(C200)이 더 높은 비율의 글로불린(7S)을 포함하므로, 이 분리물은 ANS 시험에 따라 더 큰 소수성을 포함하는 것으로 알려졌다. 카놀라 글로불린은 아주 소수성으로 간주되고 이는 이 경우에 보여졌다. 변경된 생산물들은 감소된 수준의 글로불린 단백질로 기대되듯이 더 낮은 수치를 생산하였다. 두 개의 분리물들의 주요 성분은 알부민 나핀(albumin napin)이다. 이 단백질은 매우 극성이어서 매우 낮은 표면 소수성을 가져온다.

그 결과들이 표18에서 설명된다. 데이터는 각 분리물에 대해 100%(N×6.25)단백질을 반영하도록 조정되었다.

표18

표18의 결과로부터 보여지듯이, 변경되고 농축된 상청액(C200H), 열처리되고 농축된 상청액(C200HS) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)으로부터 건조된 분리물이 농축된 상청액(C200)으로부터 건조된 분리물보다 현저히 덜 소수성이었다. 또한, 그 결과는 표면 소수성은 글로불린의 함량에 선형으로 관계되는 것을 보여준다.

실시예14

본 실시예는 실시예1, 2 및 3의 과정에 의해 생산되는 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200), 변경된 생산물(C200H 및 C200HS) 및 등전 침전된 상청액(C200IS)의 1mg/ml 단백질 용액의 280nm에서 흡광도의 평가를 포함한다.

50mg의 단백질을 공급하기 위한 충분한 단백질 파우더(powder)가 비이커에서 무게를 달아 약 45ml의 10mM 인산염 버퍼(buffer), pH6.66이 추가되었고, 그 혼합물은 총 60분간 자성 교반기(magnetic stirer)를 이용하여 휘젓는다. 60분의 교반 후에 표본은 버퍼로 50ml 총 부피로 되어 1mg/ml의 단백질 농도를 보였다. 그 표본들은 10분간 7800g에서의 원심분리에 의해 투명화되었고, 그 다음 상청액들은 석영(quartz) 크벳(cuvette)으로 이동되어 280nm에서 흡광도가 블랭크(blank)로서 인산염 버퍼를 이용하여 읽어졌다.

얻어진 결과들은 표19에서 설명된다.

표19

표19의 결과로부터 보여지듯이, 스프레이 건조된 농축된 상청액(C200)으로부터 준비되는 용액들이 변경되고 농축된 상청액(C200H), 열처리되고 그 다음 농축된 상청액(C200HS), 및 등전 침전된 상청액(C200IS)보다 280nm에서 더 강하게 흡수하였다.

발명의 요약

본 발명의 요약에서, 증가된 함량의 2S 단백질과 감소된 양의 7S 단백질을 가지는 신규 카놀라 단백질 분리물이 제공되어 투명한 수용성 용액을 생산하는데, 특히 음료에서 활용성을 가진다. 본 발명의 범위 내에서 변형들이 가능하다.

Claims (20)

1. 건조중량 기준으로 최소 약 90 중량%(N×6.25)의 단백질 함량을 가지는 2S 카놀라 단백질을 주로 포함하고,
   2S 카놀라 단백질로 주로 구성되고 카놀라 단백질 미셀(micelle) 형성 및 침전으로부터의 수성 상청액으로부터 유래되는 카놀라 단백질 분리물들과 비교할 때 2S 카놀라 단백질의 증가된 비율과 7S 카놀라 단백질의 감소된 비율을 가지는 카놀라 단백질 분리물이고,
   상기 카놀라 단백질 분리물은 상기 상청액으로부터 7S 단백질의 등전 침전에 의해 유래되는 카놀라 단백질 분리물.
2. 제1항에 있어서,
   건조중량 기준 최소 약 100중량%(N×6.25)의 단백질 함량을 가지는 카놀라 단백질 분리물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 분리물에 존재하는 카놀라 단백질에서 최소 약 85중량%의 2S 카놀라 단백질과 약 15중량%보다 작은 7S 카놀라 단백질을 함유하는 카놀라 단백질 분리물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 분리물은 상기 분리물에 존재하는 카놀라 단백질에서 최소 약 90중량%의 2S 카놀라 단백질과 약 10중량%보다 작은 7S 카놀라 단백질을 함유하는 카놀라 단백질 분리물.
5. 제3항에 있어서,
   건조중량 기준 최소 약 100중량%(N×6.25)의 단백질 함량을 가지는 카놀라 단백질 분리물.
6. 2S 카놀라 단백질의 증가된 비율을 가지는 카놀라 단백질 분리물의 제조공정이고,
   (a) 2S 단백질로 주로 구성되어 2S 및 7S 단백질의 수용액을 준비하는 단계,
   (b) 상기 수용액으로부터 7S 단백질을 등전 침전시키는 단계,
   (c) 상기 수용액으로부터 침전된 7S 단백질을 제거하는 단계, 및
   (d) 2S 및 7S 단백질의 수용액과 비교하여 건조중량 기준 최소 약 90중량%(N×6.25)의 단백질 함량을 가지고, 2S 카놀라 단백질의 증가된 비율을 가지는 카놀라 단백질 분리물을 회수하는 단계를 포함하여 이루어지는 카놀라 단백질 분리물의 제조공정.
7. 제6항에 있어서,
   상기 등전 침전은 수용액에 존재하는 7S 카놀라 단백질의 최소 약 50중량%를 침전시키기에 충분한 염 조건과 pH하에서 이루어지는 제조공정.
8. 제7항에 있어서,
   상기 등전 침전은 수용액에 존재하는 7S 카놀라 단백질의 최소 약 75중량%를 침전시키기에 충분한 염 조건과 pH하에서 이루어지는 제조공정.
9. 제6항에 있어서,
   상기 등전 침전은,
   (i) 최소 약 0.3mS의 전도율로 수용액에 염을 추가하는 단계, 및
   (ⅱ) 염이 추가된 수용액의 pH를 약 2.0 내지 약 4.0의 수치로 조정하는 단계를 포함하여 이루어지는 제조공정.
10. 제9항에 있어서,
    상기 전도율은 약 10 내지 약 20mS이고, 상기 pH는 약 3.0 내지 약 3.5인 제조공정.
11. 제6항에 있어서,
    2S 및 7S 카놀라 단백질의 상기 수용액은 카놀라 단백질 미셀 형성 및 침전으로부터의 상청액, 부분적으로 농축된 상청액, 또는 농축된 상청액인 제조공정.
12. 제11항에 있어서,
    상기 카놀라 단백질 미셀 형성은,
    (a) 카놀라 오일 시드밀에서 단백질의 용해화를 일으키고 수용성 단백질 용액을 형성하기 위해 최소 약 5℃의 온도에서 카놀라 오일 시드밀을 추출하는 단계,
    (b) 상기 수용성 단백질 용액을 잔류 오일 시드밀로부터 분리하는 단계,
    (c) 농축된 단백질 용액을 제공하기 위해 선택적 막 기법에 의해 실질적으로 일정한 이온 강도를 유지하면서 최소 약 200g/L로 상기 수용성 단백질 용액의 농도를 증가시키는 단계,
    (d) 단백질 미셀의 형성을 일으키기 위해 약 15℃ 아래의 온도를 가지는 냉각수에 상기 농축된 단백질 용액을 희석시키는 단계, 및
    (e) 정착된 단백질 미셀 매스로부터 상청액을 분리시키는 단계에 의해 이루어지는 제조공정.
13. 제12항에 있어서,
    상기 상청액은 상기 등전 침전 이전에 약 100 내지 약 300g/L의 단백질 농도로 농축되는 제조공정.
14. 제13항에 있어서,
    상기 상청액은 약 200 내지 약 300g/L의 단백질 농도로 농축되는 제조공정.
15. 제13항에 있어서,
    상기 농축 단계는 약 3,000 내지 약 100,000달톤의 분자량 절단을 가지는 최소 하나의 막을 사용하여 한외여과에 의해 이루어지는 제조공정.
16. 제15항에 있어서,
    한외여과로부터의 농축된 상청액은 상기 등전 침전 이전에 정용여과를 거치는 제조공정.
17. 제16항에 있어서,
    상기 정용여과 단계는 약 3,000 내지 약 100,000달톤의 분자량 절단을 가지는 최소 하나의 막을 사용하여 물, 염분, 또는 산성화된 물의 약 2 내지 약 20볼륨, 바람직하게는 약 5 내지 약 10볼륨을 사용하여 이루어지는 제조공정.
18. 제6항에 있어서,
    (e) 상기 카놀라 단백질 분리물을 수용성 음료 조성물로 만드는 단계
    를 더 포함하여 이루어지는 제조공정.
19. 제1항의 카놀라 단백질 분리물의 수용액.
20. 제19항에 있어서,
    카놀라 단백질 분리물이 강화된 음료인 수용액.

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