HU176142B - Process for separating purified albumine from blood - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás tisztított albumin kinyerésére vérplazmából.

Az ismert eljárások szerint az albumint alkoholokkal, például etanollal alacsony hőmérsékleten végzett frakcionált kicsapással különítik el a vérplazmából, vagy pedig a kicsapást fiziológiás sóoldatban hajtják végre, például ammóniumszulfát fokozatos hozzáadásával. Ezeknek az ismert eljárásoknak több hátrányuk is van. így az etanollal végzett kicsapások során a fehérje könnyen denaturálódik, és ennek következtében csökken a termelés. A fiziológiás sóoldatban végrehajtott kicsapásoknál az elválasztás nem éles, és így szenynyezett termék képződik.

A 3 415 804 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás fehérjeelegyek frakcionált kicsapását ismerteti. A kicsapást polietilénglikol jelenlétében hajtják végre, mivel az gátolja a fehérjék diszpergálhatóságát. Ezt az eljárást emberi vérplazma frakcionálására is alkalmazták, azonban a kapott frakciókat — ezek egyike albuminfrakció volt — β-globulin és más fehérjék szennyezték. Ennek következtében ez az ismert eljárás nem szolgáltat gyógyászati célokra alkalmazható, megfelelően tisztított albumint.

Az 1252/75 számú dán szabadalmi leírás eljárása szerint az albumint úgy különítik el a vérből és hasonló termékekből, hogy az albumint tartalmazó folyadékot valamely alkohol és albumin-stabilízáló anyagok jelenlétében hevítik. Erre a célra különféle stabilizáló anyagokat sorolnak fel, s például kaprilsav-származékokról tesznek említést. Ezzel az ismert eljárással sem sikerült azonban teljesen kiküszöbölni az etanolnak vagy más hasonló alkoholoknak azt a hátrányát, hogy a fehérjéket denaturálják.

Ismeretes továbbá a 134 425 számú publikált dán szabadalmi bejelentésből, hogy albumin termokoagulálással is előállítható. Az albumint tartalmazó oldatot, például placentát vagy emberi vérplazmát, kaprilsav ionjai jelenlétében, 52—64 °C közötti hőmérsékleten és 10 4,8—5,25 közötti pH-értéken kezelik. A termokoagulálásnál hemoglobin, denaturált albumin és idegen fehérjék válnak ki. A tisztított albumin oldatban marad, amelyből azután kinyerhető.

Ez az utóbbi ismert eljárás is meglehetősen szennye15 zett terméket szolgáltat. A termék tisztasága fokozható ugyan olyan módon, hogy a termokoagulálás előtt frakcionált kicsapást hajtanak végre, például triklórecetsavval és etanollal, azonban gyógyászati célokra alkalmas tiszta termék még ilyen módon sem nyerhető.

A termokoagulálás a 739 024 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásból is ismert, azonban ennél az ismert eljárásnál nem végeznek előzetes leválasztást polietilénglikollal.

A technika állásának a vizsgálata során megállapít25 ható, hogy az ismert eljárások alapján előállított albuminban a következő szennyezések fordulnak elő:

1. Egyéb proteinek, amelyek döntő részének az elkülönítése kielégítő mértékben megtörténik és a megmaradó rész eltávolítása már nem indokolt.

2. Makroaggregátumok és albumin dimerek, amelyek elkülönítését — kielégítő mértékben — mind ez ideig nem sikerült megoldani.

Ring és társai vizsgálataik alapján beszámolnak arról, hogy az aggregátum-tartalmú albumin infúzió alkalmazása komoly anaphylaxiás reakciókhoz vezet, míg az aggregátumokat nem tartalmazó oldatokat a betegek jól tolerálják (Monogra., Allergy, 12, 27—35, 1977).

A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amely lehetővé teszi az albumin igen tiszta formában és magas kitermeléssel történő előállítását az emberi vérplazmából és ugyanakkor megfelel az intravénás alkalmazás követelményének is. Fentieken túlmenően az eljárásnak olyannak keli lennie, hogy a plazmában levő egyéb proteinek (különösen az immunglobulin) az eljárás során ne károsodjanak, sőt olyan formában maradjanak, amely lehetővé teszi azok tiszta formában történő előállítását is (No—212 számú magyar szabadalmi bejelentés).

Tekintettel arra, hogy az emberi vérplazma erősen korlátozott alapanyagforrás, a cél elsősorban azon lehetőségek kiaknázására irányul, amelyek a konzerválás alkalmazásában és nem az egyéb proteinek (különösen az immunoglobulin) denaturálásában rejlenek.

A találmány azon a felismerésen alapul, hogy egyszerű módon, alkoholok alkalmazása nélkül összekapcsolható az albuminok polietilénglikol jelenlétében történő frakcionáh kicsapása a stabilizátorként alkalmazott kaprilsav jelenlétében való hőkezeléssel, és akkor koagulálnak azok a szennyező anyagok, amelyek egyébként az albuminnal együtt kicsapódnának. Ennek következtében a találmány szerinti eljárás kedvező termeléssel szolgáltat igen tiszta albumint.

A találmány szerint úgy járunk el, hogy vérplazmát polietilénglikollal elegyítünk, a pH-t 6—Ί közötti értékre állítjuk be, és így a fibrinogént és a globulinokat leválasztjuk, a felül úszó folyadékot, amely 150—300 g/1, célszerűen 180—200 g/1 polietilénglikolt tartalmaz, 4,5—

5,3 közötti pH-értékűre állítjuk be, az albumint leválasztjuk, a polietilénglikolt tartalmazó albumint vizes közegben ismét feloldjuk, a kapott albumin-oldatot 50—65 °C-on és 4,6-5,0 közötti pH-értéken kaprilsav jelenlétében termokoagulálásnak vetjük alá, s a tisztított albumint az oldatból kicsapjuk.

Vérplazmaként előnyösen stabilizált vérplazmát alkalmazunk, és ehhez adjuk hozzá a polietilénglikolt a kicsapáshoz szükséges mennyiségben, amely például 150—300 g/1 lehet. Polietilénglikolként például 4000-es molekulasúlyú polietilénglikolt használunk, azonban ennél nagyobb vagy kisebb molekulasúlyú polietilénglikol is alkalmazható, így 1000—50 000 közötti molekulasúlyú.

A globulint tartalmazó frakció leválasztását 6—7 közötti pH-értéken végezzük, az optimális pH-érték azonban 6,7 körül van. A csapadékot célszerűen centrifugálással különítjük el, majd az így kapott, albumin-tartalmú oldat pH-ját 4,5—5,3 közötti értékre, célszerűen 4,9-re állítjuk be. Ekkor leválik az albumint tartalmazó frakció. Ez a frakció fehérjéket, szennyező anyagokat és polietilénglikolt is tartalmaz. A csapadékot vízben oldjuk, úgy, hogy a kapott oldat koncentrációja előnyösen 80 g/1 legyen. Ezután kaprilsavat adunk az oldathoz, például 2—3 g/1, előnyösen 2,5 g/1 mennyiségben. Az oldat pH-ját 4,6—5,0 közötti értékre, célsze176142 rűen 4,8-re állítjuk be, majd 50—65 ®C-ra, célszerűen 60 °C-ra melegítjük. A hőkezelést általában 30 percig végezzük.

A hőkezelés hatására a még jelenlevő szennyező fe5 hérjék koagulálódnak. Ha a hőkezelést kaprilsav hozzáadása nélkül végeznénk 55 °C feletti hőmérsékleten, az albumin egy része elbomlana, és a termelés igen gyenge lenne.

A hőkezelés után a terméket lehűtjük, és a koagulá10 tumot centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk.

A centrifugált vagy szűrt oldatban jelenlevő tisztított albumint önmagában ismert módon, kicsapással különítjük el. Például úgy járhatunk el, hogy 40%-os etanolt adunk az oldathoz, a tisztított albumint 4,8-es pH15 értéken 0 °C alatti hőmérsékletre történő hűtéssel kicsapjuk. Az albumint például centrifugálással vagy fagyasztva szárítással különítjük el.

A találmány szerinti eljárás előnye, hogy alkalmazásával egyszerű módon állíthatunk elő rendkívül tiszta 20 albumint kedvező hozammal. Továbbá a találmány szerinti eljárás iparilag is jól kivitelezhető.

A találmány szerinti eljárásnál elkerüljük a globulinok denaturálását, és ezért az ezeket a fehérjéket tartalmazó frakciók is feldolgozhatok, és belőlük jó ter25 meléssel és tiszta állapotban nyerhetők ki az értékes globulinok.

Jóllehet önmagában, külön-külön ismert a polietilénglikol jelenlétében történő kicsapás és a termokoagulálás, mindeddig senki nem kísérelte meg ezeknek a 30 tisztítási módszereknek az összekapcsolását. Meglepő módon, a tisztítási módszerek összekapcsolásával elkerülhetjük az albumin denaturálását, és ennek következtében jó termelést érünk el. Semmiképpen nem volt előre látható az sem, hogy a találmány szerinti eljárás 35 egyidejűleg a termék tisztaságát is jelentős mértékben megnöveli.

A találmány szerinti eljárás egy további előnye, hogy kiindulási anyagként vérplazmát alkalmazunk. Ez azért lehetséges, mivel a globulinok, amint erre fentebb már 40 utaltunk, nem denaturálódnak, és így kedvező termeléssel szintén elkülöníthetők és felhasználhatók.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példa segítségével részletesen ismertetjük.

Példa

100 liter, citráttal stabilizált emberi vérplazmát 137 liter 33 súly%-os vizes polietilénglikol-oldattal elegyítünk. A képződő oldatban a polietilénglikol 3000 koncentrációja 19 súly%. Az oldat pH-értékét 6,7 ±0,l-re állítjuk be, az elegyet 45 percig állni hagyjuk, majd centrifugáljuk. A csapadék fibrinogénből és globulinból áll, a felül úszó folyadék tartalmazza az albumint. Az albumin-tartalmú felülúszó savasságát ecetsavval 4,8— 5,0 közötti pH-értékre állítjuk be.

A képződő csapadékot, amely albuminból áll, centrifugáljuk. Az albumint 80 liter desztillált vízben körülbelül 40 °C-on oldjuk, és 200 ml kaprilsavat adunk hozzá. Az oldat pH-ját 1 M vizes nátriumhidroxid-oldattal 4,8 ±0,1 értékre állítjuk be, majd az oldatot 30 percig hevítjük 60 ±0,5 °C-on. A képződő csapadékot centrifugáljuk, az oldatból az albumint 40%-os etanollal —5 °C-on, pH=4,8 értéken kicsapjuk.

A kicsapott albumint centrifugáljuk és fagyasztva szárítjuk. Desztillált vízben újból feloldjuk, 0,04 M kaprilsav-oldatot adunk hozzá és a pH értékét 7,0 ± 0,4re állítjuk be, az oldatot palackokba töltjük és 10 órán át 60 °C-on hőkezeljük. Ezután az oldat gyógyászati célokra felhasználható. A nagy molekulasúlyú anyagok mennyisége, azaz a 200 000 feletti molekulasúlyú frakció mennyisége kevesebb, mint a teljes fehérjetartalom 0,1 %-a. A termelés albuminból körülbelül 90%, a vérplazma albumintartalmára vonatkoztatva.

A poliakrilamid-elektroforézissel végzett vizsgálat szerint az albumin tisztasága 99,5% felett van.

Összehasonlító vizsgálatok

Az alábbi vizsgálatokat végeztük a találmány szerinti eljárás, valamint két ismert eljárás (3 415 804 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szereplő PEG-kicsapás és a 134 425 számú dán szabadalmi leírásban ismertetett termokoagulációs módszer) termékeinek összehasonlítására.

1. Az albumin elkülönítése a humán vérplazmából PEG-eljárással

1000 ml citráttal stabilizált humán vérplazmát 1370 ml 33% polietilénglikol 3000-t tartalmazó vizes oldattal elegyítünk és így 19%-os PEG-oldatot nyerünk. A pH-értékét 6,7 ±0,l-re állítjuk. A keveréket 45 percig állni hagyjuk, majd centrifugáljuk. A precipitátum fibrinogént és globulint tartalmaz, amíg az albumin a szupernatánsban marad. Az albumintartalmú szupernatánshoz annyi ecetsavat adunk, hogy annak pH-ja 5,0 és 4,8 között legyen.

A keletkező albumintartalmú precipitátumot kicentrifugáljuk. Az albumint 800 ml desztillált vízben feloldjuk és szűrjük.

A leszűrt oldatot hideg etanolban kicsapjuk (40% etanol, -5 °C, pH=4,8).

A precipitálódott albumint kicentrifugáljuk, majd fagyasztva szárítjuk. Ezután az albumint desztillált vízben feloldjuk, 0,04 M kaprilsavval pH-ját 7,0 ±0,4-re állítjuk, majd palackozzuk és 10 órán át 60 °C-on hőkezeljük.

2. Az albumin előállítása humán vérplazmából termokoagulációs módszerrel (kaprilsav stabilizáló jelenlétében)

1000 ml citráttal stabilizált humán vérplazmához 2 ml kaprilsavat adunk.

A pH-értékét 1 M NaOH vizes oldatával 4,8 ±0,l-re állítjuk. Az oldatot 30 percig 60 ±0,5 °C-on tartjuk. A keletkező precipitátumot kicentrifugáljuk. A centrifugált oldatot hideg etanollal kicsapjuk (40% etanol, -5 °C, pH=4,8).

A precipitálódott albumint kicentrifugáljuk, majd fagyasztva szárítjuk. Ezután desztillált vízben feloldjuk, 0,04 M kaprilsavval a pH-ját 7,0±0,4-re állítjuk, palackozzuk és 10 órán át 60 °C-on hőkezeljük.

3. Kereskedelmi forgalomban kapható humán albumin Cohn-féle eljárás alapján (forgalmazó: Cutter, USA).

4. Albumin előállítása a találmány szerinti eljárással (lásd a példában)

Fenti készítményekkel összehasonlító vizsgálatokat végeztünk az aggregátumok (makromolekulák) mcnvnyiségének meghatározása céljából. A vizsgálatokat „Sephadex^íR) G 150-en analitikai gélfiltrációs módszerrel végeztük, egy olyan puíler alkalmazásával, amely 1000 ml-re 1.5 g kálium-foszfátot (analitikai minőség).

3.4 g nátrium-foszfátot (analitikai minőség) és 8.8 g nátrium-kloridot tartalmaz desztillált vízben oldva.

A következő eredményeket kaptuk:

Aggregátum mennyisége

l. készítmény (PEG-kicsapás) kb. 5%

2. készítmény (termokoagulációs) kb. 1.5%

3. készítmény (Cohn-féle eljárás) kb. 2%

4. készítmény (találmány szerinti) 0.1% alatt

A fenti eredményekből világosan látható, hogy a találmány szerinti eljárással állítható elő a legtisztább 25 termék, ugyanakkor a többi eljárás, különösen a PEGkicsapás rosszabb minőségű terméket szolgáltat.

HUMÁN toleranciavizsgálatok:

200 mg/ml (20%) koncentrációjú, találmány szerinti készítmény, 100 ml per 2 perc adagolási sebesség mellett allergiás reakciókat nem okoz, a vérnyomást, pulzusszámot és testhőmérsékletet nem befolyásolja.

Claims (3)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás tisztított albumin kinyerésére vérplazmából a vérplazma frakcionált kicsapása, a kapott albumintartalmú frakció vizes oldása és a vizes oldat kaprilsav stabilizálószer jelenlétében végzett termokoagulá-

   45 Jása útján, azzal jellemezve, hogy a vérplazmát polietilénglikollal elegyítjük és a savasságot 6—7 közötti pHértékre állítjuk be. majd a kivált fibrinogén és globulinok feletti, 150—300 g/l, célszerűen 180—200 g/l polictilcnglikolt tartalmazó folyadék savasságát 4,5-5,3 5° közötti pH-értékre állítjuk be, s a kivált, polietilénglikolt tartalmazó albumim vizes közegben feloldjuk, majd a nyert oldat termokoagulálását 50—65 ^cC-on és

   4,6—5,0 közötti pH-értéken hajtjuk végre, végül a tisztított albumint kicsapással különítjük el az oldatból.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kaprilsav stabilizálószert 2—3 g/l mennyiségben alkalmazzuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tisztított albumin ki- ⁶⁰ csapását az albuminoldatnak kis szénatomszámú alkanollal, célszerűen etanollal történő elegyítésével végezzük.