MX2010011206A - Metodo para aislar biomacromoleculas usando glicol de polialquileno y metales de transicion. - Google Patents

Abstract

La presente invención trata sobre el método de aislar una macromolécula biológica en una composición. Específicamente, esta invención está relacionada con un método de aislamiento de una biomacromolécula en una composición que contiene impurezas, el método incluye añadir un glicol de polialquileno a la composición, añadir un metal de transición a la composición y separar la biomacromolécula de la impureza.

Description

METODO PARA AISLAR BIOMACROMOLECULAS USANDO GLICOL DE POLIALQUILENO Y METALES DE TRANSICION CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención trata sobre el método de aislar una macromolécula biológica en una composición. Específicamente, esta invención está relacionada con un método de aislamiento de una biomacromolécula en una composición que contiene impurezas, el método comprende añadir un glicol de polialquileno a la composición, añadir un metal de transición a la composición y separar la biomacromolécula de la impureza.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las macromoléculas biológicas (es decir, biomacromoléculas) , tales como, las proteínas recombinantes o los anticuerpos, son de suma importancia para una serie de tecnologías diversas. Tradicionalmente las biomacromoléculas se han purificado utilizando varios métodos diferentes, por ejemplo: filtración, centrifugación, cromatografía por exclusión molecular, cromatografía de afinidad, cromatografía por intercambio iónico, cromatografía de afinidad por metales inmovilizados, o mediante una combinación de los métodos anteriores, sólo por nombrar algunos. El método de purificación se escoge, por lo general, con base en una de las características de la biomacromolécula que la distingue de una o más impurezas que coexisten con la biomacromolécula Ref.:214180 en la composición, por ejemplo: tamaño, carga o afinidad por el enlace. Un gran número, de biomacromoléculas tiene importancia en el mercado, por lo que se desea tener la capacidad de purificar grandes cantidades de biomacromoléculas de forma rápida y rentable.

Las biomacromoléculas importantes en el mercado incluyen, por ejemplo: proteínas y ácidos nucleicos como el ADN y AR . Dos ejemplos de biomacromoléculas que con frecuencia se aislan a escala industrial son los anticuerpos monoclonales y las proteínas de fusión. Estos anticuerpos y proteínas de fusión son muy valiosos en varios campos terapéuticos y de diagnóstico y se han utilizado en el tratamiento de varias enfermedades como las de inmunodeficiencia heredada o adquirida así como en enfermedades infecciosas.

La obtención de biomacromoléculas en biorreactores a escala industrial que contienen células mamíferas o bacterianas se realiza, por lo general, a través de filtración o centrifugación. Sin embargo, la demanda actual por generar mayor producción de proteínas en los cultivos celulares ha requerido que los biorreactores operen con mayor densidad celular, lo cual aumenta la cantidad de impurezas, tales como, el ADN, las proteínas de células hospederas y otros componentes en el medio de cultivo. Los elevados niveles de contaminación exigen mayores esfuerzos tanto en las operaciones de obtención celular (por ejemplo, en los pasos de filtración y centrifugación) así como en los pasos de purificación por desplazamiento (por ejemplo: cromatografía y diálisis) . La presencia de estas altas concentraciones de impurezas puede aumentar el número de pasos de purificación que necesitan llevarse a cabo, lo cual aumenta el costo y disminuye el rendimiento general de la producción. El aumento en la producción de proteína puede incluso saturar la capacidad en algunos de los métodos cromatográficos .

Las formas tradicionales de abordar la producción de anticuerpos purificados pueden incluir centrifugación, cromatografía por intercambio iónico (por ejemplo: DEAE o hidroxiapatita) , purificación por inmunoafinidad (por ejemplo: proteína A o proteína G) y diálisis. Consultar por ejemplo: Antibodies : A Laboratory Manual, Harlow y Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) . Es común que se utilice una combinación de los métodos descritos con anterioridad, por ejemplo: purificación de los anticuerpos del plasma utilizando fraccionación con etanol seguida de una cromatografía por intercambio iónico y/o precipitación por ácido caprílico. Consultar por ejemplo: McKinney efc al., J. Immunol . Métodos 95:271-278 (1987); las patentes estadounidenses números 4,164,495; 4,177,188; RE 31,268; 4,939,176; 5,164,487 y el documento WO 2008/100578. Además, se ha utilizado acidificación de la fermentación para mejorar la recuperación y la estabilidad de los anticuerpos y de las proteínas recombinantes . Consultar por ejemplo: Lydersen et al., Annals New York Academy of Sciences 745:222-31 (1994) .

Varios otros métodos se han desarrollado para el aislamiento y/o purificación de anticuerpos. Consultar por ejemplo, las patentes estadounidenses números 7,038,017; 7,064,191; 6,846,410; 5,429,746; 5,151,504; 5,110,913; 4,933,435; 4,841,024; y 4,801,687. Sin embargo, muchos de estos métodos pueden arrojar grandes volúmenes de materia prima utilizada en el proceso y pérdidas en la recuperación, tener altos costos de producción en escala industrial, y/o tener bajos rendimientos.

La precipitación de biomacromoléculas inducida por la presencia de un agente precipitante puede ser un método rápido y efectivo para recuperar las biomacromoléculas. Las técnicas de precipitación convencionales incluyen la precipitación con sulfato de amonio y la precipitación con ácido caprílico. Una desventaja habitual de la precipitación es que se requiere remover los agentes precipitantes después de que se completa la precipitación. Debido a esta desventaja, la precipitación se utiliza con frecuencia como método de purificación con flujo ascendente. Otra desventaja de la precipitación es que requiere grandes concentraciones de agente precipitante para lograr el resultado deseado, creando de esta manera grandes cantidades de producto de desecho .

El glicol de polietileno (PEG) se ha utilizado con anterioridad para precipitar diversas biomacromoléculas . Consultar, por ejemplo: Ingham, K. , "Precipitations of Proteins wíth Polyethylene Glycol, " 301-306 (1990) y el documento WO 2008/100578. Se ha encontrado que en varios ambientes el glicol de polietileno no es desnaturalizante. Sin embargo, por lo general, se utilizan altas concentraciones de glicol de polietileno para lograr el resultado deseado, por ejemplo: 20% del volumen total. Las altas concentraciones del glicol de polietileno resultan en un aumento significativo del volumen, creando una gran cantidad de residuo y un aumento en la viscosidad de la composición. Además, las altas concentraciones de glicol de polietileno requeridas incrementan los costos asociados con la purificación.

La precipitación por afinidad de metales se ha intentado también con anterioridad. Consultar por ejemplo: Van Dam, M. et al., "Metal Affinity Precipitation of Proteins," Biotechno. Appl . Biochem, 492-502 (1989) y Zaworski, P.G., et al., "Precipitation of Proteins from Culture Supernatants Using Zinc, " Analytical Biochem 440-444 (1988) . Sin embargo, se requieren también altas concentraciones de zinc a fin de lograr la precipitación deseada (hasta 80 mM) . De ese modo, el uso por afinidad de metales a estas altas concentraciones produce cantidades importantes de residuos y aumentos significativos en los costos.

Como resultado de las dificultades e ineficiencias antes mencionadas, existe la necesidad de mejorar la estrategia para el aislamiento de biomacromoléculas .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención trata sobre el método de aislar una macromolécula biológica en una composición que contiene impurezas, el método comprende (a) añadir un glicol de polialquileno a la composición; (b) añadir un metal de transición a la composición; y (c) separar la biomacromolécula de la impureza. La combinación del glicol de polialquileno y del metal de transición permite la separación sinergística de la biomacromolécula de las impurezas y mejora drásticamente los resultados.

Se pueden utilizar diversos glicoles de polialquileno. En algunas modalidades, el glicol de polialquileno se selecciona del grupo que consiste en glicol de polipentileno, glicol de polibutileno, glicol de polipropileno o glicol de polietileno. En otras modalidades, el glicol de polialquileno es un glicol de polietileno. Se pueden utilizar diversos pesos moleculares en los glicoles de polialquileno. En algunas modalidades, el glicol de polietileno tiene un peso molecular de entre 1,000 Da y 20,000 Da. En otras modalidades, el glicol de polietileno tiene un peso molecular de entre 2,000 Da y 15,000 Da.

Se pueden utilizar diversas concentraciones de glicoles de polialquileno en el método que abarca esta invención. En algunas modalidades, la concentración del glicol de polialquileno en la composición es de alrededor de 0.5% hasta cerca de 30% (p/v) . En otras modalidades, la concentración del glicol de polialquileno en la composición es de alrededor de 2.0% hasta cerca de 10% (p/v) . En algunas modalidades, el glicol de polialquileno se encuentra en la composición cerca del l%-2% (p/v) .

Se pueden utilizar metales de transición con el método de esta invención para aumentar la separación de biomacromoléculas de impurezas. En algunas modalidades, el metal de transición se selecciona del grupo que consiste de zinc, níquel, cobre, cobalto y manganeso. En algunas modalidades, el metal de transición es el zinc. Se pueden utilizar diversas concentraciones de metales de transición. En algunas modalidades, la concentración del metal de transición en la composición es de alrededor de lmM hasta cerca de 50 mM. En algunas modalidades, la concentración del metal de transición en la composición es de alrededor de 2.5 mM - 15 mM. En algunas modalidades, la concentración del metal de transición en la composición es de alrededor de 0.5 mM , - 15 mM. En algunas modalidades, la concentración del metal de transición en la composición es de alrededor de 1.5 mM - 3.5 mM.

Varios métodos pueden utilizarse para separar las biomacromoléculas de las impurezas. En algunas modalidades, la separación se lleva a cabo filtrando la composición, el filtrado forma un- flujo de permeado y un rechazo salino. En algunas modalidades, el filtrado se realiza con un filtro con extremo cerrado. En algunas modalidades, las biomacromoléculas permanecen sustancialmente en el rechazo salino. En algunas modalidades, la separación se realiza filtrando la composición, la biomacromolécula permanece en el rechazo salino; y en donde la filtración da como resultado una presión transmetnbrana ; y en donde la presión transmembrana permanece sustancialmente constante durante el filtrado. En algunas modalidades, la separación se realiza al someter la composición a una centrifugación, esta acción forma un sobrenadante y un precipitado. En algunas modalidades, la biomacromolécula aparece sustancialmente en el precipitado..

Varias biomacromoléculas se pueden aislar de acuerdo con esta invención. En algunas modalidades, la biomacromolécula es una proteína. En algunas modalidades, la proteína es una proteína soluble. En algunas modalidades, la proteína es un anticuerpo.

En algunas modalidades, esta invención es un método para aislar una biomacromolécula de una composición que contenga una impureza. En algunas modalidades, la composición incluye material celular eucariótico. En algunas modalidades, la impureza se selecciona de un grupo que consiste en: medio de crecimiento, proteína, lípido, ácido nucleico, ácido ribonucleico y combinaciones de los anteriores.

• En algunas modalidades, el método de esta invención aumenta la recuperación de la biomacromolécula en la composición, relativo a métodos que sólo utilizan un glicol de polialquileno o un metal de transición. En algunas modalidades, el añadir un glicol de polialquileno y un metal de transición aumenta la recuperación de la biomacromolécula en más de un 3%. En algunas modalidades, la recuperación del glicol de polialquileno y del metal de transición aumenta la recuperación de la biomacromolécula en más de un 10%. En algunas modalidades, la recuperación de la biomacromolécula es sinergística cuando se utiliza tanto un glicol de polialquileno como un metal de transición, comparado con el uso de un glicol de polialquileno o un metal de transición solo.

En algunas modalidades de esta invención, el glicol de polialquileno es un glicol de polietileno con un peso molecular de entre 1,000 Da y 20,000 Da, el metal de transición es el zinc, la separación se realiza por precipitación de la biomacromolécula en la solución y después se centrifuga la composición a fin de aislar el precipitado; y la biomacromolécula es un anticuerpo.

En algunas modalidades, de esta invención, el glicol de polialquileno es un glicol de polietileno con un peso molecular de entre 1,000 Da y 20,000 Da, el metal de transición es el zinc, la separación se realiza por precipitación de la biomacromolécula en la solución y después se filtra la composición a fin de aislar la biomacromolécula; y la biomacromolécula es un anticuerpo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 representa el efecto del pH en la precipitación Ab C. Las muestras Ab C fueron tituladas a pH 7, pH 8 y pH 9 y se retuvieron durante una hora (el punto isoeléctrico de Ab C siendo -8.5) . Las muestras después se filtraron para capturar el precipitado (en caso que hubiese) y se tomó la absorbancia a A280. Las medidas de absorbancia para las muestras tituladas se compararon con el material de inicio ("CCM"). La absorbancia recuperada para las muestras tituladas a pH 7 , pH 8 y pH 9 fue de 101.7%, 99.1%, 100.3%, respectivamente. Esto indica que el pH solo no es suficiente para inducir precipitación a la concentración del producto recolectado .

La FIG. 2 representa el efecto de la concentración PEG 3350 (p/v) sobre la precipitación y la recuperación de Ab C. Muestras del Ab C recolectado fueron ajustadas a pH 9 y se trataron con PEG 3350 al 0%, PEG 3350 al 4%, PEG 3350 al 7%, PEG 3350 al 10%, PEG 3350 al 13%, y PEG 3350 al 20%. Las muestras se retuvieron durante 30 - 60 minutos a una temperatura de 2-8°C y se centrifugaron a 14,000 rpm durante 3 minutos. Los sobrenadantes fueron decantados y los precipitados se volvieron a suspender en una resuspensión amortiguada o buffer. La recuperación fue calculada por medio de cromatografía por exclusión molecular, utilizando como control la muestra de Ab C recolectada. Como mínimo se requirió el PEG 3350 al 10% para precipitar Ab C y lograr una recuperación de >95%.

La FIG. 3A representa los efectos del pH y del peso molecular del PEG a diversas concentraciones del PEG. Muestras de Ab C fueron tituladas a pH 7, pH 8 y pH 9 y fueron tratadas con PEG al 5%, 10%, ó 15% con peso molecular de 400, 1000, 3350 y 8000 Da. Los datos muestran que PEG 1000 - PEG 8000 todos producen altas recuperaciones a cantidades > 5%. Las muestras se retuvieron durante 30 - 60 minutos a una temperatura 2-8°C y se centrifugaron a 14,000 rpm durante 3 minutos . Los sobrenadantes fueron decantados y los precipitados se volvieron a suspender en una resuspensión amortiguadora. La recuperación fue calculada por medio de cromatografía por exclusión molecular, utilizando como control la muestra de Ab C recolectado.

FIG. 3B representa el efecto del peso molecular del PEG en la recuperación de Ab C. Muestras de Ab C fueron tituladas a pH 8 y fueron tratadas con PEG 3350 al 10% o PEG 8000 a una temperatura de 2-8°C o a temperatura ambiente. Las muestras se retuvieron durante 30 - 60 minutos a 2-8°C o a temperatura ambiente y se centrif garon a 14,000 rpm durante 3 minutos . Los sobrenadantes fueron decantados y los precipitados se volvieron a suspender en una resuspensión amortiguada. La recuperación fue calculada por medio de cromatografía por exclusión molecular, utilizando como control la muestra de Ab C recolectado. Tanto PEG 3350 como PEG 8000 resultaron en alto rendimiento.

La FIG. 4A muestra la pureza de una formulación de anticuerpo Ab C antes de la precipitación con PEG, y la FIG. 4B representa la pureza de una formulación de anticuerpo Ab C después de ser precipitado con PEG 8000 al 10% a pH 8.0.

La FIG. 5A muestra la pureza de una formulación de anticuerpo Ab D antes de la precipitación con PEG, y la FIG. 5B representa la pureza de una formulación de anticuerpo Ab D después de ser precipitado con PEG 8000 al 10% a pH 8.0.

La FIG. 6A muestra la pureza de una formulación de anticuerpo Ab E antes de la precipitación con PEG, y la FIG. 6B representa la pureza de una formulación de anticuerpo Ab E después de ser precipitado con PEG 8000 al 10% a pH 8.0.

La FIG. 7Á muestra la pureza de una formulación de anticuerpo Ab F antes de la precipitación con PEG, y la FIG. 7B representa la pureza de una formulación de anticuerpo Ab F después de ser precipitado con PEG 8000 al 10% a pH 8.0.

La FIG. 8A representa el efecto de 0 mM ZnC12 y 10 mM ZnCl2 en precipitaciones de Ab C. También se presenta el efecto de agregar PEG al 5% en diferentes concentraciones de ZnCl2.

La FIG. 8B representa la pureza de una formulación de anticuerpo Ab C antes de la precipitación con PEG, y después de ser precipitado con PEG 3350 al 5% y 5mM ZnCl2 a pH 7.2 La FIG. 9 representa el efecto que varias concentraciones de PEG y ZnCl2 tienen sobre la precipitación de un anticuerpo en una composición a pH 7.0.

La FIG. 10 representa el efecto que varias concentraciones de PEG y ZnCl2 tienen sobre la precipitación de un. anticuerpo en una composición a pH 8.0.

La FIG. 11 representa el efecto que varias concentraciones de PEG y ZnCl2 tienen sobre la precipitación de un anticuerpo en una composición a pH 9.0.

La FIG. 12 representa el análisis de exclusión molecular de Ab F después de la precipitación con PEG 3350 y ZnC12 en presencia de imidazol . La fracción resolubilizada de Ab F se purificó subsecuentemente a través de un paso de intercambio de anión y un paso de cromatografía por interacción hidrofóbica .

Las FIGS. 13A-13B representan la filtración con extremo cerrado (Nutsche) del precipitado Ab F con diversas concentraciones en la adición continua (body feed) . Se muestra presión diferencial (psi (kPa) ) vs . rendimiento (L/m2) en (la FIG. 13A) ; y volumen (mi) del filtrado vs . tiempo (min) en (la FIG. 13B) .

La FIG. 14 representa el análisis de exclusión molecular de los aglutinados del precipitado Ab F arrastrado a diavolúmenes crecientes (DV) de la solución de lavado. Una impureza de bajo peso molecular (LMW) se resalta con la flechas.

Las FIGS. 15A-15C representan la remoción de bajos pesos moleculares por precipitación con PEG y ZnCl2, en presencia y ausencia de imidazol . El Ab F HCCF concentrado a 10 partes se muestra en (la FIG. 15A) . La precipitación de Ab F con PEG 3350 y ZnCl2 en ausencia de imidazol se muestra en (la FIG. 15B) (niveles de LMW -6%) ; y la precipitación de Ab F con 3350 y ZnC12 en presencia de imidazol se muestra en (la FIG. 15C) (niveles de LMW <1%) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se encontró que al agregar una combinación tanto de un glicol de polialquileno como de un metal de transición se mejoraba la precipitación de biomacromoléculas en una composición. Esta precipitación de biomacromoleculas resultó en la separación de la biomacromolécula de las impurezas presentes en la composición. Esta invención está relacionada con un método de aislamiento de biomacromoléculas dentro de una composición que contiene impurezas, el método' incluye (a) añadir un glicol de polialquileno a la composición; (b) añadir un metal de transición a la composición; y (c) separar la biomacromolécula de la impureza.

Se hace notar, a menos que se especifique lo contrario, que el término "un" o "una" unidad se refiere a una o más de esa unidad; por ejemplo: "una proteína" se entiende que representa una o más proteínas. De esa misma manera, los términos "un" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" se pueden utilizar en la presente de forma intercambiable.

Los términos "aislar" o "aislamiento" se refieren a separar una biomacromolécula de al menos otro componente indeseable o impureza encontrado en la composición. El término "aislamiento" incluye "purificación" y "clarificación" . No se requiere ningún nivel particular de aislamiento de la biomacromolécula, sin embargo, en algunas modalidades, al menos 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% (p/p) de una impureza se separa de la biomacromolécula. Por ejemplo, en algunas modalidades, el aislamiento de una biomacromolécula comprendería separar la biomacromolécula de las proteínas de células hospederas (HCP por sus siglas en inglés) presentes originalmente en la composición.

Los términos "clarificar" y "clarificación" se refieren a la remoción de grandes partículas de la composición. Por ejemplo, como se aplica a cultivos celulares y crecimiento en medios de cultivo, el término "clarificación" se refiere, por ejemplo, a la remoción de células procarióticas y eucarióticas , por ejemplo, células (mamíferas) lípidos, y/o ácidos nucleicos (por ejemplo, cromosómico y ADN plásmido) del cultivo celular.

Los términos "purificar" y "purificación" se refieren a separar la biomacromolécula de la invención de una impureza u otros contaminantes en la composición, independientemente del tamaño de la impureza. De esta manera, el término purificación abarcaría "clarificación" pero además abarcaría impurezas menores en tamaño que aquellas removidas durante la clarificación, por ejemplo: proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y otras formas de desperdicio celular, desperdicio viral, desperdicio bacterial contaminante, componentes del medio de cultivo y sustancias parecidas. No se requiere un nivel de purificación particular de la biomacromolécula, sin embargo, en algunas modalidades, al menos 50%, 70%, 80%, 90%, ó 95% (p/p) de una impureza se purifica a partir de la biomacromolécula. Por ejemplo, en algunas modalidades, la purificación de una biomacromolécula abarcaría la separación de biomacromoléculas del 80% de la HCP presente originalmente en la composición.

Los términos "sinergia", "sinergística" o "efecto sinergístico" como se utilizan en la presente describen un efecto con mayor magnitud que un aditivo. En algunas modalidades de esta invención, el uso simultáneo tanto del glicol de polialquileno como de un metal de transición proporciona recuperación sinergística del producto o precipitación sinergística de una biomacromolécula. Por ejemplo, si el uso único de glicol de polialquileno al 3% (p/v) precipitó 5% de la biomacromolécula y el uso único de lOmM de la concentración final del metal de transición precipitó 5% de la misma biomacromolécula, entonces el efecto aditivo para precipitar la biomacromolécula con el uso simultáneo de los dos: 3% del glicol de polialquileno y lOmM del metal de transición sería 10% de precipitación de la biomacromolécula. Por lo tanto, por comparación, el efecto sinergístico cuando se usa tanto el glicol de polialquileno al 3% como lOmM del metal de transición simultáneamente, se dará la precipitación de la biomacromolécula en una extensión mayor al 10% .

Se pueden utilizar diversos glicoles de polialquileno. En algunas modalidades, el término polialquileno puede ser una composición de la fórmula general 1: En algunas modalidades, n puede estar alrededor de 10 hasta más o menos 5,000, alrededor de 20 hasta más o menos 2,500, alrededor de 50 hasta más o menos 2,000, o alrededor de 100 hasta más o menos 500, y m va de 1 hasta más o menos 10. Se han descrito anteriormente moléculas adicionales de glicol de polialquileno . Ejemplos adecuados incluyen glicoles de polipropileno, como los que se describen en la patente U.S. Pat. No. 5,643,575. Otros glicoles de polialquileno útiles en los métodos de la invención se describen en el catálogo de Shearwater Polymers, Inc. " Polyethylene Glycol and Derivatives 2001". La divulgación de cada uno de ellos se incorpora a la presente a modo de referencia.

En algunas modalidades, se pueden utilizar heteropolímeros , en donde sustitutos de alquilo diferentes están contenidos en la molécula de polialquileno, por ejemplo, una molécula de polialquileno de la Fórmula II: donde R1, R2, R3, R4 pueden ser independientemente un hidrógeno o alquilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, heterarilalquilo, fosfato, fosfoalquilo, sulfato, sulfoalquilo sustituidos o no sustituidos, donde cada subunidad z puede ser igual o diferente.

En algunas modalidades, "y" puede estar alrededor de 1 hasta más o menos 10. En algunas modalidades, el valor de "y" puede variar opcionalmente para cada subunidad z. En algunas modalidades, z puede estar alrededor de 10 hasta más o menos 5,000, alrededor de 20 hasta más o menos 2,500, alrededor de 50 hasta más o menos 2,000, o alrededor de 100 hasta más o menos 500.

En algunas modalidades, el glicol de polialquileno es soluble en agua a temperatura ambiente. En algunas modalidades, el glicol de polialquileno se selecciona de un grupo que consiste en glicol de polipentileno, glicol de polibutileno, glicol de polipropileno, o glicol de polietileno, en donde cualquiera de los sustitutos del alquilo son opcionalmente no sustituidos o sustituidos con un alquilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heterocicloalquilo, heterarilalquilo, fosfato, fosfoalquilo, sulfato o sulfoalquilo . En algunas modalidades, el glicol de polialquileno es un glicol de polietileno.

Se pueden utilizar varios pesos moleculares de los glicoles de polialquileno. Aunque los glicoles de polialquileno pueden variar sustancialmente en el peso molecular promedio, en algunas modalidades, el glicol de polialquileno tiene un peso molecular promedio de alrededor de 1,000 Da hasta más o menos 1000,000 Da. En algunas modalidades, el glicol de polialquileno tiene un peso molecular de entre 1,000 Da y 50,000 Da, alrededor de 2,000 Da hasta más o menos 25,000 Da, alrededor de 3,000 Da hasta más o menos 20,000 Da, o alrededor de 4,000 hasta más o menos 10,000. En algunas modalidades, el glicol de polialquileno tiene un peso molecular de alrededor de 3,000 Da, 4,000 Da, 5,000 Da, 6,000 Da, 7,000 Da, 8,000 Da, ó 9,000 Da. En algunas modalidades, el glicol de polialquileno tiene un peso molecular de entre 2,000 Da y 15,000 Da.

En algunas modalidades, en donde el glicol de polialquileno es un glicol de polietileno, el glicol de polietileno tiene un peso molecular de entre 1,000 Da y 50,000 Da, de alrededor de 2,000 Da hasta más o menos 25,000 Da, de alrededor de 3,000 Da hasta más o menos 20,000 Da, o de alrededor 4,000 hasta más o menos 10,000. En algunas modalidades, el glicol de polietileno tiene un peso molecular de alrededor de 3,000 Da, 4,000 Da, 5,000 Da, 6,000 Da, 7,000 Da, 8,000 Da, ó 9,000 Da. En algunas modalidades, el glicol de polietileno tiene un peso molecular entre 2,000 Da y 15, 000 Da.

Se pueden utili'zar varias concentraciones de glicoles de polialquileno en la composición. El polietileno puede agregarse a la composición ya sea de un extracto concentrado o de uno puro. El extracto concentrado se diluye al añadirse en la composición. En algunas modalidades, al añadir el glicol de polialquileno a la composición se obtiene como resultado una composición con una concentración de glicol de polialquileno de alrededor de 1% hasta más o menos 40%, de alrededor 2% hasta más o menos 35% (p/v) , de alrededor 2.5% hasta más o menos 30% (p/v) , o de alrededor 3% hasta más o menos 30% (p/v). En algunas modalidades, la concentración de glicol de polialquileno es de alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 11%, 12%, 13%, 14%, o 15% (p/v) de la composición. En algunas modalidades, al añadir el glicol de polialquileno a la composición se obtiene como resultado una composición que tiene una concentración de glicol de polialquileno de alrededor de 2.0% hasta más o menos 10% (p/v) . En algunas modalidades, al añadir el glicol de polialquileno a la composición se obtiene como resultado una composición que tiene una concentración de glicol de polialquileno de alrededor de 0.5% hasta más o menos 30% (p/v) . En algunas modalidades, al agregar el glicol de polialquileno a la composición se obtiene como resultado una composición que tiene una concentración de glicol de polialquileno de alrededor de 0.5% hasta más o menos 2.5% (p/v) . En algunas modalidades, la concentración del glicol de polialquileno utilizado en combinación con un metal de transición es de alrededor de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, ó 70% menos que la concentración del glicol de polialquileno utilizado sin la adición del metal de transición, para lograr una cantidad equivalente de biomacromolécula separada. En tales modalidades, los costos se pueden reducir gracias a que se utilizan menos glicoles de polialquileno y también se producen menos desechos residuales después de la purificación.

Los conocedores de la materia entenderán que para diferentes biomacromoléculas puede llegar a ser más efectivo el uso de diferentes concentraciones, pesos moleculares o tipos de glicoles de polialquileno. Al no estar delimitado por ninguna metodología se puede determinar una concentración adecuada de glicol de polialquileno al agregar varias concentraciones, pesos moleculares o tipos de glicol de polialquileno a una composición que contenga un metal de transición y una biomacromolécula ; es entonces cuando se puede determinar el método más eficiente para la purificación de esa biomacromolécula.

Se pueden utilizar metales de transición en esta invención a fin de aumentar la separación de la biomacromolécula de la impureza. El término "metal de transición" se refiere a cualquier elemento en el bloque d de la tabla periódica, incluyendo zinc, cadmio y mercurio. Ejemplos de metales de transición incluyen: escandio, titanio, vanadio, cromo, hierro, zinc, níquel, cobre, cobalto y manganeso. En algunas modalidades, el metal de transición es el zinc, níquel, cobre o manganeso. En algunas modalidades el metal de transición es el zinc. En algunas modalidades, más de un tipo de metal de transición puede ser usado. Por ejemplo, en algunas modalidades, se puede usar una combinación de dos o más metales de transición como zinc, níquel, cobre, cobalto y manganeso. En algunas modalidades, el metal de transición se microniza para disminuir el tamaño promedio de las partículas del metal de transición.

Varias concentraciones de metales de transición en la composición son adecuadas para su uso en esta invención. Los conocedores de la materia reconocerán que diversas cantidades endógenas de metales de transición pueden estar presentes normalmente en pequeñas cantidades en la composición, por ejemplo, la materia recolectada (metales de transición endógenos) ; y que varias cantidades de metales de transición se pueden añadir a la materia recolectada de acuerdo con la presente invención (metales de transición exógenos) . En algunas modalidades, la concentración de los metales de transición abarca tanto cationes exógenos como endógenos. Sin embargo, con fines prácticos, dado que, por lo general, la cantidad de metales de transición endógenos es relativamente pequeña comparada con la cantidad de metales de transición exógenos, la concentración de los metales de transición se puede calcular simplemente considerando los metales de transición exógenos. En algunas modalidades, se añade una alícuota del metal de transición de un extracto concentrado (o puro) a la composición de esta invención para obtener la concentración final deseada del metal de transición en la composición. En algunas modalidades, se añade composición adicional al metal de transición, a fin de diluir la concentración del metal de transición en la composición. En algunas modalidades, añadir el metal de transición a la composición da como resultado una composición con una concentración de metal de transición de alrededor de 0.1 mM hasta más o menos 1 M, alrededor de 0.1 mM hasta más o menos 100 mM, alrededor 0.2 mM hasta más o menos 75 mM, alrededor 0.5 mM hasta más o menos 50 mM, o alrededor 1 mM hasta más o menos 20 mM. En algunas modalidades, añadir el metal de transición a la composición da como resultado una composición con una concentración de metal de transición de alrededor de 1.5 mM hasta más o menos 15 mM, 2.5 mM hasta más o menos 15 mM, o alrededor de 0.3 mM hasta más o menos 7.0 mM. En algunas modalidades, la concentración del metal de transición utilizado en combinación con un glicol de polialquileno es de alrededor de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, o 70% menos que la concentración del metal de transición utilizado sin la adición del glicol de polialquileno, para lograr una cantidad equivalente de biomacromolécula separada. En tales modalidades, los costos se pueden reducir gracias a que se utilizan menos metales de transición y también se producen menos desechos residuales después de la purificación.

Los conocedores de la materia entenderán que diferentes concentraciones de metales de transición pueden ser más efectivas para biomacromoléculas diferentes. Al no estar delimitado por ninguna metodología se puede determinar una concentración adecuada de metales de transición al añadir varias concentraciones de metales pesados a una composición que contenga un glicol de polialquileno y una biomacromolécula ; es entonces cuando se puede determinar la concentración más baja a la cual se puede recuperar la máxima cantidad de biomacromolécula.

Los conocedores de la materia entenderán que el metal de transición puede existir en forma de sal; por ejemplo, una sal de cobre como CuCl2 puede producir un catión de cobre cuando se coloca en una solución acuosa. De esta manera, como se utiliza en la presente, la frase "añadir un metal de transición" abarcará no solamente el agregar el metal de transición cargado eléctricamente pero también la adición de una sal u otro componente que produzca un metal de transición al ser introducido a la composición de esta invención. En algunas modalidades, el metal de transición es una sal (por ejemplo: CuC12, NÍC12, ZnC12, MnCl2, CuBr2 , NiBr2 , , ZnBr2 , MnBr2, CuS03 , NÍS03, ZnS03 , y MnS03 ) , o la combinación de uno o más de estos cationes o sales. En algunas modalidades, el metal de transición es una sal halogenada, por ejemplo: CuCl3, NÍC13, etc. En algunas modalidades, el metal de transición es: glicinato de cobre, glicinato de níquel, glicinato de zinc, o glicinato de manganeso. Es de esperarse que ciertos metales de transición pueden ser más adecuados para aislar/purificar diferentes biomacromoléculas . Sin embargo, los conocedores de la materia pueden probar fácil y rápidamente diversos metales de transición a fin de determinar cuál de ellos logra la máxima recuperación de la biomacromolécula en cuestión.

En algunas modalidades, ligandos competitivos que afectan el enlace iónico del metal en la agregación son útiles para esta invención. Ejemplos de los ligandos incluyen, sin limitación a: imidazol, glicina, triptófano, cisteína, histidina, histamina, cloruro de amonio. (Consultar Kagedal, L, " Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography" in Protein Purification : Principies, High Resolution Methods, and Applications (Janson, J-C,1998) y Przbycien et al. "A Model for Metal Affinity Precipitation" J. Coll . Int. Sci (1996) ) .

El término "composición" en esta invención se refiere a una mezcla de al menos una molécula de biomacromolécula de esta invención y opcionalmente de al menos una impureza; en dónde la impureza y la biomacromolécula no son la misma. En algunas modalidades, la composición abarca una biomacromolécula, un organismo celular hospedero (por ejemplo, células mamíferas) y un medio de cultivo suficiente para propagar el organismo hospedero y permitir la expresión de la biomacromolécula de interés. La selección y el uso del medio de cultivo son conocidos para aquéllos versados en la materia. En algunas modalidades, el medio de crecimiento es un medio de cultivo celular. El medio de cultivo celular puede variar de acuerdo con el tipo de cultivo celular que se desee propagar. En algunas modalidades, el medio de cultivo es el disponible comercialmente . En algunas modalidades, la composición abarca un medio de cultivo que contenga: por ejemplo, sales inorgánicas, carbohidratos (por ejemplo, azúcares, tales como: la glucosa, galactosa, maltosa o fructosa), amino ácidos, vitaminas (por ejemplo: grupo de vitamina B (por ejemplo, B12) vitamina A, vitamina E, riboflavina, tiamina y biotina) , ácidos grasos y lipidos (por ejemplo: colesterol y esteroides) , proteínas y péptidos (por ejemplo: albúmina, transíerrina, fibronectina y fetuin) , suero de la sangre (por ejemplo, composiciones que incluyen albúminas, factores de crecimiento e inhibidores de crecimiento, tal como, suero bovino fetal, suero de ternera recién nacida y suero de caballo) , oligoelementos (por ejemplo: zinc, cobre, selenio e intermediarios del ácido tricarboxílico) y combinaciones de las mismas. Ejemplos de medios de cultivo incluyen, pero no están limitados a: medios de cultivo basal, (por ejemplo, MEM, DMEM, GMEM) , medios de cultivo complejo (RPMI 1640, Iscoves DMEM, Leibovitz L-15, Leibovitz L-15, TC 100), medios de cultivo libres de suero (por ejemplo, CHO, Ham FIO y sus derivados, Ham F12, DMEM/F12) . Neutralizadores comunes encontrados en los medios de cultivo incluyen: PBS, Hanks BSS, sales Earles, DPBS, HBSS, y EBSS. Medios de cultivo para células mamíferas son bien conocidos en el medio y están disponibles en, por ejemplo: Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO) , HyClone (Logan, UT) , Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA) , Cambrex Corporation (E. Rutherford, NJ) , JRH Biosciences (Lenexa, KS) , Irvine Scientific (Santa Ana, CA) , entre otros. Otros componentes encontrados en el medio de cultivo pueden incluir: ascorbato, citrato, cisteína/cistina, glutamina, ácido fólico, glutatión, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido lipoico, ácido oleico, ácido palmítico, piridoxal/piridoxina, riboflavina, selenio, tiamina y transferrina . Los conocedores de la materia reconocerán que existen modificaciones al medio de cultivo, lo cual entra en el área de competencia de esta invención.

En algunas modalidades, la composición abarca además materia recolectada. El término "materia recolectada" se refiere a un medio de cultivo en donde las células están presentes inmediatamente antes de la recolección, o un medio de cultivo en donde las células recolectadas se colocan inmediatamente después de la recolección y en el cual las células se vuelven a suspender. La materia recolectada puede incluir cualquier composición enumerada anteriormente para medios de cultivo o cualquier otro medio adecuado para la resuspensión de células recolectadas o fracciones celulares. Por ejemplo, en algunas modalidades, el medio de cultivo recolectado puede contener agua, una solución neutralizante, agentes osmóticos, agentes anti-degradantes , etc. En algunas modalidades, la invención se relaciona con un método para separar la biomacromolécula de la materia recolectada.

La biomacromolécula de esta invención puede aislarse de una composición que contenga un cultivo celular, en donde el cultivo celular incluya un medio de crecimiento y varias células eucarióticas , por ejemplo, células mamíferas. Las células mamíferas de esta invención abarcan a cualquier célula mamífera que sea capaz de crecer en cultivo. Células mamíferas prototipo incluyen: células CHO (incluyendo: CHO-Kl, CHO DUKX-B11, CHO DG44), VERO, BHK, HeLa, CV1 (incluyendo Cos; Cos-7) , MDCK, 293, 3T3, C127, líneas celulares de mieloma (especialmente murinos) , células PC12, HEK-293 (incluyendo HEK-293T y HEK-293E) , PER C6 , Sp2/0, NSO y células W138. También se pueden usar células mamíferas derivadas de cualquiera de las células anteriores .

La biomacromolécula de la presente invención se puede aislar de un cultivo celular que conste de cultivo de crecimiento y varias células procarióticas y no mamíferas, por ejemplo: E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro del género de las Pseudomonas, por ejemplo: P. aeruginosa, células de levadura, por ejemplo: Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces y Yarrowia, células de insectos, por ejemplo: Trichoplusia, Lipidotera, Spodoptera, Drosophila y Sf9, células vegetales, por ejemplo: Arabidopsis . Los conocedores de la materia pueden seleccionar una célula procariótica o no mamífera adecuada dependiendo de la biomacromolécula de interés .

Se pueden aislar varias biomacromoléculas de acuerdo con esta invención. En algunas modalidades, la biomacromolécula es un anticuerpo, proteína recombinante o una proteína de fusión. En algunas modalidades, la proteína es una proteína soluble. En algunas modalidades, la proteína en un anticuerpo .

Los términos "biomacromolécula biológica" o "biomacromolécula" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula con una masa molecular que excede lkDA que puede ser aislada de un organismo o cultivo celular, por ejemplo: cultivo celular eucariótico (por ejemplo, mamífero) o cultivo celular procariótico (por ejemplo, bacteriano) . En algunas modalidades, el término biomacromolécula se refiere a moléculas con una masa molecular que excede 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 125 kDa, ó 150 kDa. En algunas modalidades, el uso del término se refiere a polímeros, por ejemplo: biopolímeros como los ácidos nucleicos (tales como, el AND y el ARN) , polipéptidos (tales como, proteínas, carbohidratos y lípidos) . En algunas modalidades, el término "biomacromolécula" se refiere a una proteína. En algunas modalidades, el término "biomacromolécula" se refiere a una proteína recombinante o una proteína de fusión. En algunas modalidades, la proteína es soluble. En algunas modalidades, la biomacromoléculas es un anticuerpo, por ejemplo: un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

Como se utiliza en la presente, el término "proteína" tiene la intención de abarcar tanto "proteína" en singular como "proteínas" en plural . De esa manera, como se utiliza en la presente, los términos que incluyen, pero no están limitados a: "péptido", "polipéptido" , "cadena de amino ácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de amino ácidos están incluidos en la definición de "proteína"; y el término "proteína" se puede utilizar en lugar de, o puede intercambiarse con, cualquiera de estos términos. El término incluye además proteínas, que han sufrido modificaciones pqst-translacionales , por ejemplo: glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, segmentación proteolítica , o modificación por amino ácidos que no ocurren naturalmente. Las proteínas también incluyen polipéptidos que forman multímeros, por ejemplo: dímeros, trímeros, etc. El término proteína también incluye proteínas de fusión, por ejemplo, una proteína que se produce vía un proceso de fusión de genes en donde una proteína (o fragmento de una proteína) se adhiere a un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) . Ejemplos de proteínas de fusión de esta invención incluyen proteínas bifuncionales con enlaces disulfuro que contienen regiones Fe enlazadas de IgGl humano y IgE humano; y receptor linfotoxina beta inmunoglobulina (31.

Los anticuerpos pueden ser purificados de acuerdo al método de esta invención. El término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo policlonal, monoclonal, multiespecífico, humano, humanizado o quimérico, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por biblioteca de expresión Fab, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluyendo por ejemplo, anticuerpos antiidiotípicos hasta anticuerpos de la invención) , y fragmentos de enlace de epítope con cualquiera de los anteriores. En algunas modalidades, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo mónoclonal. El término "anticuerpo" también se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contiene un sitio de enlace antígeno que une inmunoespecíficamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina que pueden purificarse a través del método de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) de clase (por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3, y IgG4) o subclase de molécula de inmunoglobulina . Los anticuerpos de esta invención también incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla, y humanizados. Ejemplos de anticuerpos de esta invención incluyen anticuerpos comercializados, tales como: natalizumab (anticuerpo monoclonal anti-a4 integrina humanizado) ; anticuerpo monoclonal Anti-Alpha V Beta 6 humanizado; anticuerpo monoclonal anti-VLAl IgGl kappa humanizado; huB3F6 (anticuerpo monoclonal IgGl/kappa humanizado) .

Los anticuerpos purificados mediante el método de la invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. En algunas modalidades, los anticuerpos purificados por el método de la invención son anticuerpos humanos, murinos (por ejemplo, ratón y rata), de burros, conejos, cabras, conejillo de indias, camellos, caballos o pollos. Como se utiliza en la presente, anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen secuencia de amino ácidos de inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos de una o más inmunoglobulina y que no expresen inmunoglobulinas endógenas. Consultar, por ejemplo, U.S. Pat . No. 5,939,598 por Kucherlapati et al. En algunas modalidades, el término "anticuerpo" incluye, pero no está limitado a, los anticuerpos IgGl, IgG2 , IgG3 , y IgG4, incluyendo anticuerpos comercializados, tales como, natalizumab (TYSBARI®, Elan Pharmaceuticals , San Diego, CA) .

Los anticuerpos que pueden¦ purificarse mediante el método de la invención incluyen, por ejemplo: anticuerpos nativos, anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos que se enlazan a y/o reconocen uno o más antígenos) , anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos (Jakobovits et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol . 7:33 (1993) ; las patentes estadoúnidenses números 5,591,669 y 5,545,807), anticuerpos y fragmentos de anticuerpos aislados de bibliotecas de anticuerpos fago (McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol . 222:581-597 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); aterhouse et al., Nucí. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)). Los anticuerpos purificados mediante este método de la invención pueden estar fusionados de forma recombinante a un polipéptido heterólogo N-terminal o C-terminal o conjugado químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes o no covalentes) a polipéptidos u otros composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos purificados por el método de la presente invención pueden estar fusionados de forma recombinante o conjugada a moléculas útiles como etiquetas' en pruebas de detección y moléculas efectoras, tales como: polipéptidos heterólogos, fármacos o toxinas. Consultar, por ejemplo, las publicaciones en PCT de los documentos WO 92/08495; WO 91/14438; O 89/12624; la patente estadounidense número 5,314,995; y el documento EP 396, 387.

En algunas modalidades, la biomacromolécula o composición de esta invención es aceptable farmacéuticamente. "Aceptable farmacéuticamente" se refiere a una biomacromolécula o composición que, bajo la mira de un buen juicio médico, es adecuado para el contacto con tejidos humanos y animales, sin exceso de toxicidad u otras complicaciones conmensurables, con una proporción razonable de riesgo/beneficio.

En algunas modalidades, la biomacromolécula es una proteína soluble. El término "soluble" se refiere a la propensión de la proteína de localizarse sustancialmente en los ambientes hidrofílicos o de base acuosa de las células hospederas, por ejemplo, el citoplasma, periplasma o medio extracelular . De esa manera, durante la fraccionación celular, una proteína soluble, por lo general, estará aislada sustancialmente con los componentes citoplásmicos , periplásmicos o extracelulares de la célula hospedera. En algunas modalidades, una proteína soluble, es soluble en agua, en ausencia de detergentes. Los conocedores de la materia reconocerán que ni la localización celular de un polipéptido ni la fraccionación celular de una proteína es absoluta. De esta manera, la frase "localizada sustancialmente" se refiere a una proteína en que 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% de la proteína está en una localización celular designada, por ejemplo, citoplasma, periplasma o medio extracelular . En algunas modalidades, la proteína puede ser una membrana de proteína, o una membrana asociada de proteína.

La presente invención es útil para aislar una biomacromolécula de una composición que contenga una impureza. En algunas modalidades, la composición contiene material celular eucariótico. En algunas modalidades, la impureza se selecciona del grupo que consiste en el componente del medio de crecimiento, proteína, lípido, ácido nucleico, ácido ribonucleico y combinaciones de los anteriores.

El término "impureza" se refiere a uno o más componentes de la composición que sea diferente a la biomacromolécula de esta invención. En algunas modalidades, la impureza puede incluir una célula mamífera intacta (por ejemplo, células ováricas de hámster chino (células CHO) o células de mieloma murino (células NSO) ) , o células parciales, por ejemplo, desecho celular. En algunas modalidades, la impureza abarca una proteína, (por ejemplo, una proteína soluble o insoluble, o fragmentos de proteínas, tales como, HCP) , lípidos (por ejemplo, material de la pared celular) , ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN cromosómico o extracromosómico) , ácido ribonucleico (t-ARN o mARN) , o combinaciones de las anteriores, o cualquier desecho celular que sea diferente a la biomacromolécula de interés. En algunas modalidades, la impureza puede originarse en el organismo huésped que produce o contiene la biomacromolécula de interés. Por ejemplo, una impureza puede ser un componente celular de una célula procariótica o eucariótica (por ejemplo: pared celular, proteínas celulares, ADN o ARN, etc.) que enuncie una proteína de interés. En algunas modalidades, la impureza no proviene del organismo hospedero, por ejemplo, una impureza puede provenir del medio de cultivo celular o del medio de crecimiento, de una solución neutralizada o del aditivo del medio. La impureza como se utiliza en la presente puede incluir un solo componente indeseado, o una combinación de diversos componentes indeseados .

Se pueden utilizar varios medios para separar la biomacromolécula de esta invención de una o más impurezas. Ejemplos de medios de separación de biomacromoléculas de una impureza incluyen, sin limitante: precipitación, inmunoprecipitación, cromatografía, filtración, ultrafiltración, diafiltración, filtración Nutsche, filtración de flujo cruzado, centrifugación y combinaciones de las anteriores.

En algunas modalidades, la separación de la biomacromolécula de la impureza se logra por precipitación, es decir que las palabras "separación" y "precipitación" pueden ser intercambiables. La precipitación se refiere a la formación de una composición sólido en una solución. En algunas modalidades, el sólido es de mayor densidad que la solución y "cae" fuera de la fase del soluto, hundiéndose al fondo de la solución (sedimentación) . En algunas modalidades, la precipitación se puede acentuar o acelerar por medio de la centrifugación.

En algunas modalidades, al momento de añadir el metal de transición y el glicol de polialquileno a la composición, la biomacromolécula se precipita sustancialmente de la composición. En algunas modalidades, la impureza simplemente se decanta de la biomacromolécula precipitada y en consecuencia se aisla la biomacromolécula. En algunas modalidades, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de la biomacromolécula se precipita de la composición .

En algunas modalidades, la separación de la biomacromolécula de la impureza se logra por medio del uso de un filtro. El término "filtración" o "filtrar" se refiere al proceso de remover partículas suspendidas de una composición, pasando la composición a través de una o más membranas semipermeables (o medio) de diámetro del tamaño del poro específico. El término "flujo de permeado" cuando se habla de una filtración, se refiere a la fracción de la composición que pasa a través de los poros del filtro durante la filtración. El término "rechazo salino" cuando se habla de una filtración, se refiere a la fracción de la composición que permanece en el filtro o que no pasa por los poros del filtro durante la filtración. En algunas modalidades, después del filtrado la biomacromolécula de la presente invención está sustancialmente en el flujo de permeado (es decir que pasa a través de los poros del filtro y se colecta) , mientras que la impureza (por ejemplo, desechos celulares, ADN y/o HCP) está sustancialmente en el rechazo salino. En algunas modalidades, después del filtrado la biomacromolécula de la presente invención está sustancialmente en el rechazo salino, mientras que la impureza está sustancialmente en el flujo de permeado. En algunas modalidades la filtración "escala de laboratorio" se puede utilizar para predecir condiciones apropiadas para la filtración a escala industrial.

Tipos de filtros adecuados, propiedades químicas y configuraciones de módulo para la purificación de biomacromoléculas en particular resultan familiares para los conocedores de la materia y pueden seleccionarse con base en varios factores, por ejemplo: la cantidad y el tamaño de los componentes de la composición que van a ser filtrados; el volumen de la composición que va a ser filtrado; y la densidad celular y viabilidad de la composición que va a ser filtrado. Consultar, por ejemplo, Reynolds T, Boychyn , Sanderson T, Bulmer M, More J, Hoare, M( Biotechnology and Bioengineering, 83(4), p . 454-464 (2003). En algunas modalidades, se pueden utilizar filtros, tales como: filtros de membrana, filtros de plato, filtros de cartucho, filtros de bolsa, filtros con hoja de presión, filtros con tambor rotatorio, o filtros a vacío. En algunas modalidades, se utilizan filtros de profundidad o filtros cruzados. El tipo de módulos para el filtro de flujo cruzado que aplica para esta invención incluye, fibra hueca, tubular, placa plana (placa-y-marco) , de elemento espiral, o de flujo vórtice con geometría de filtro (por ejemplo, rotativo) . En algunas modalidades, se utiliza un filtro de flujo tangencial. En algunas modalidades, se utilizaron módulos de fibra hueca, tubular y con membrana de hoja plana a modo de flujo tangencial (flujo cruzado) . Los filtros disponibles comercialmente que pueden utilizarse, se elaboran por varios proveedores como: Millipore Corporation (Billerica, MA) , Pall Corporation (East Hills, NY) , GE Healthcare Sciences (Piscataway, NJ) , and Sartorius Corporation (Goettingen, Alemania) . En algunas modalidades se utiliza un filtro con extremo cerrado. Los filtros con extremo cerrado que pueden utilizarse, se elaboran por varios proveedores como: Millipore Corporation (Billerica, MA) , Pall Corporation (East Hills, NY) , GE Healthcare Sciences (Piscataway, NJ) , and Sartorius Corporation (Goettingen, Alemania) .

El diámetro del poro en los filtros de esta invención puede variar de acuerdo con el tipo de biomacromolécula que se esté aislando y el tipo de impurezas presentes en la composición. En algunas modalidades, el diámetro del poro del filtro puede tener de 0.1 pm a 4.0 µt?, de 0.2 µt? a 2.0 µp?, o de 0.2 µ?? a 1.5 pm de diámetro.

El movimiento de una composición, tal como la materia recolectada, a través de un filtro durante la filtración, genera una presión transmembrana que resulta por la resistencia de la membrana. Conforme la superficie de la membrana va acumulando (o polarizando) material celular, se produce una resistencia mayor para poder fluir a través de la membrana a una. velocidad de flujo constante, de ese modo se aumenta la fuerza de impulso o la presión .transmembrana. Si la cantidad de material celular se reduce cerca de la superficie de la membrana, o si la membrana está .menos polarizada, la presión transmembrana tiende a mantenerse constante sustancialmente . Los métodos para calcular el potencial de la transmembrana son bien sabidos por .los conocedores de la materia, e incluyen el uso de transductores de presión o medidores. En algunas modalidades, la presión transmembrana puede calcularse al tomar la diferencia entre el promedio de la presión de salida del rechazo salino y flujo recolectado y de la presión del flujo de permeado.

Generalmente durante la filtración de una composición, por ejemplo, materia recolectada, la presión transmembrana de un filtro aumenta significativamente conforme se carga más composición al filtro. Por ejemplo, en alguna modalidades, la presión transmembrana aumenta 5 psi (34.4 kPa) , 7 psi (48.2 kPa) , 10 psi (69 kPa) , 15 psi (103.4 kPa) ó 20 psi (1378 kPa) o más a partir del inicio del proceso de filtración (cuando la primera cantidad de composición se coloca en el filtro) hasta el final del proceso de filtración (es común que se siga una concentración de 7 - lOx del material celular y una diafiltración de 3 - 5x) conforme los poros del filtro se obstruyen. Así, el término "constante sustancialmente" cuando se refiere a la presión transmembrana, se refiere a las presiones transmembrana que no aumentan más de 4 psi (37.5 kPa) , 3 psi (20.6 kPa) , ó 2 psi (13.7 kPa) durante el proceso de la filtración. En algunas modalidades, esta invención se dirige a un método de purificación de biomacromoléculas en una composición, el método abarca (a) añadir un glicol de polialquileno a la composición; (b) añadir un metal de transición a la composición; y después (c) filtrar la composición a través de una membrana, el filtrado da como resultado una presión transmembrana, en donde la presión transmembrana permanece constante sustancialmente durante la filtración.

En algunas modalidades, el método de esta invención disminuye el rechazo de proteína en el filtro. El término "rechazo de proteína en el filtro" puede ejemplificarse con la ecuación R = (1- [CP/CR}) , en dónde R representa el coeficiente de rechazo de proteína en el filtro, CP es la concentración instantánea de permeado de la biomacromolécula de interés, y CR es la concentración instantánea de sólidos en la biomacromolécula de interés. En algunas modalidades, esta invención se dirige a un método de aislamiento de una biomacromolécula en una composición que abarca añadir un glicol de polialquileno a la composición, añadir un metal de transición a la composición y filtrar la biomacromolécula, en dónde el valor del coeficiente de rechazo de la proteína del filtro es menor para un rendimiento volumétrico dado relativo a una biomacromolécula en una composición sin la adición del glicol de polialquileno y/o del metal de transición.

Cuando se aislan biomacromoléculas , en algunas modalidades pueden estar presentes grandes volúmenes de una composición (por ejemplo, materia recolectada) ; como en el caso de procesos de manufactura comercial. Grandes volúmenes presentan diversos retos para los procesos de purificación. Por ejemplo, el efecto que tiene un pequeño cambio en la velocidad del flujo a través del filtro, en la recuperación de una biomacromolécula, se amplifica cuando se utilizan grandes volúmenes. De igual manera, cuando se usan grandes volúmenes, también se amplifica el efecto que tiene el aumento en la densidad celular de la materia recolectada, en la recuperación del producto. Así, el uso de grandes volúmenes de una composición presenta problemas únicos que se amplifican y tienen mayores ramificaciones en relación con el uso de menores volúmenes. De ese modo, en algunas modalidades esta invención se dirige a un método de aislamiento de una biomacromolécula presente en un gran volumen de composición. El término "grandes volúmenes" se refiere a los volúmenes asociados con la producción comercial y/o industrial de una biomacromolécula. En algunas modalidades, el término "grandes volúmenes" se refiere a una cantidad de 10 a 30,000 litros, de 20 a 20,000 litros o de 50 a 15,000 litros.

En algunas modalidades, el método de la presente invención abarca la separación de la biomacromolécula de impurezas, al someter a la composición a una fuerza centrífuga (es decir, a una centrifugación) , dónde la centrifugación forma un sobrenadante (con el material no sedimentado) y un precipitado (con el material sedimentado) . Diversas formas de centrifugación son bien sabidas por los conocedores de la materia. Consultar, por ejemplo, Boychyn M, Doyle , Bulmer M, More J, Hoare M, Biotechnology and Bioengineering, 69(1), pp . 1-10 (2000). En algunas modalidades, la centrifugación forma un sobrenadante libre sustancialmente de impurezas (células o desechos de células) y un sedimento concentrado de células/desecho celular. El. término "precipitado o sedimento" o "torta sólida" , cuando se habla de centrifugación, se refiere a la fracción de la composición que se precipita (o sedimenta) durante la centrifugación para formar una masa de células/desecho de células. El término "sobrenadante" se refiere a la fracción de la composición que no se precipita (o sedimenta) durante la centrifugación, por ejemplo, la fracción de la composición que permanece en la fase acuosa de la composición. En algunas modalidades, después de la . centrifugación, las biomacromoléculas de esta invención se encuentran sustancialmente en el sobrenadante (es decir que permanecen sustancialmente suspendidas en la ' fracción líquida de la composición) . En algunas modalidades, después de la centrifugación las biomacromoléculas de esta invención se encuentran sustancialmente en el sedimento (por ejemplo, se precipitan fuera de la solución o están presente en el sedimento que resulta a raíz de la centrifugación) . En algunas modalidades, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% (p/p) de las biomacromoléculas se encuentran en el sedimento. En algunas modalidades, se utiliza un gradiente de densidad para separar la biomacromolécula de la impureza. De ese modo, en algunas modalidades tanto la biomacromolécula como las impurezas permanecen en el sobrenadante después de la centrifugación, aunque a diferentes densidades y por eso a diferentes ubicaciones en el aparato centrifugador.

Se pueden utilizar varios aparatos centrifugadores. En algunas modalidades, la centrifugación se puede lograr por medio de una centrifugadora de disco apilado. En algunas ejecuciones, se puede usar la filtración a "escala de laboratorio" a fin de predecir las condiciones apropiadas para la filtración a escala industrial. Las variables de centrifugación pueden ser diversas a fin de lograr el aislamiento óptimo de la biomacromolécula de interés. Por ejemplo, en algunas modalidades, se pueden utilizar varias velocidades de rotación o velocidades de flujo para aumentar la calidad de la biomacromolécula recuperada, y/o la cantidad de biomacromolécula recuperada.

La presente invención puede ser útil cuando se aisla una biomacromolécula en un biorreactor que contiene un cultivo celular con una alta densidad inicial de material biológico. Por ejemplo, en algunos cultivos de alta densidad, la presión transmembrana cae con frecuencia significativamente a través del filtro, probablemente como resultado de que se ensucia la superficie de la membrana debido a la alta concentración de material celular. El aumento de suciedad en el filtro, a su vez, puede impactar de forma adversa la cantidad de biomacromolécula recuperada, disminuyendo los rendimientos y dando como resultado niveles de impurezas relativamente más altos en el flujo de permeado. En algunos casos, la presión transmembrana puede aumentar a valores que sobrepasan las capacidades mecánicas del filtro, lo que provoca que la operación se detenga antes de concluir y resulta en un rendimiento de producto significantemente menor. A fin de reducir la presión transmembrana del filtro, aumentar la proteína recuperada en el rechazo salino y disminuir la cantidad de impurezas en el rechazo salino, en algunas modalidades, el método de la presente invención abarca el añadir un glicol de polialquileno y un metal de transición antes de la filtración, provocando floculación de células grandes y desechos celulares junto con la precipitación de otras impurezas (como el ADN) . La floculación de impurezas (células, desechos celulares y AND) en grandes partículas puede mejorar la transferencia de la masa de la composición cerca de la superficie del filtro, reduciendo, de esta forma, la presión transmembrana a través del filtro a una corriente predeterminada del flujo de permeado o velocidad de flujo.

En algunas modalidades, es conveniente o deseable recuperar biomacromoléculas de una composición de alta densidad celular (por ejemplo, materia recolectada) . Las composiciones de alta densidad celular presentan problemas únicos relativos a las composiciones de densidad celular normal. Por ejemplo, las composiciones de alta densidad celular pueden tener mayores cantidades de impurezas presentes en la composición, por consiguiente se aumenta la cantidad de impurezas que se necesita remover durante el proceso de purificación. Por ejemplo, una composición de alta densidad celular puede ensuciar el filtro más rápidamente, prohibiendo, en consecuencia, la filtración de la composición. En algunas modalidades, composiciones de alta densidad celular requieren del uso de más filtros o de filtros con mayores áreas de superficie. Cualquiera de los dos requerimientos pueden resultar en mayores costos asociados con filtración y/o pérdida del producto. En esta invención, se agregan glicol de polialquileno y metales de transición a la composición, por ello se remueven algunas impurezas y' se permite la purificación de composiciones de alta densidad celular. De esa manera, algunas modalidades en esta invención se dirigen a un método de aislar una biomacromolécula en una composición de alta densidad celular. El término "alta densidad celular" se refiere, por lo general, a densidades celulares en materia recolectada de alrededor de 1 x 105 a 3.5 x 107, de alrededor de 1.0 x 106 hasta más o menos 1.0 x 107, de alrededor de 5.0 x 106 hasta más o menos 9.0 x 106 células por mi para células mamíferas. Desde luego, que los conocedores de la material apreciarán que varias células crecen tradicionalmente a diferentes densidades celulares. Por ello, en algunas modalidades, cultivos celulares de "alta densidad celular" se refiere a cultivos celulares conteniendo células a una mayor densidad que la densidad practicada tradicionalmente para esa línea de células.

En algunas modalidades de la presente invención, el pH de la composición se ajusta antes de separar la biomacromolécula de la impureza. Por ejemplo, en algunas modalidades, el pH de la composición se ajusta a un pH menor al de la materia recolectada. Los composiciones de la presente invención, por ejemplo, aquellos que comprenden materia recolectada, por lo general, tiene un pH de alrededor de 6.0 hasta más o menos 8.0, de alrededor de 6.5 hasta más o menos 7.5 o alrededor de 6.8 hasta más o menos 7.2 sin ajuste. En algunas modalidades, cualquier pH menor al pH de la materia recolectada puede utilizarse en el aislamiento de la presente invención. En algunas modalidades, el pH de la composición es menor al pH dentro de un intervalo de alrededor de 1.0 hasta más o menos 6.0, de alrededor de 2.0 hasta más o menos 5.5, de alrededor de 3.0 hasta más o menos 6.5, de alrededor de 3.0 hasta más o menos 5.0, de alrededor de 4.0 hasta más o menos 5.0, de alrededor de 4.0 hasta más o menos 4.7, de alrededor de 4.3 hasta más o menos 5.0, o de alrededor de 4.7 hasta más o menos 5.0. En algunas modalidades, el pH de la composición es menor a, dentro de un intervalo de, alrededor de 4.0 hasta más o menos 4.7. En algunas modalidades, el pH puede bajarse hasta un pH de alrededor de 3.5. Para algunas biomacromoléculas , un pH menor a 3.5 provoca la desnaturalización o inestabilidad de las biomacromoléculas de interés, en esa manera no es deseable. En algunas modalidades, el pH de la composición se eleva a un pH dentro del intervalo de alrededor de 6.0 hasta más o menos 10.0, de alrededor de 6.5 hasta más o menos 9.5, de alrededor de 7.0 hasta más o menos 9.0, de alrededor de 7.5 hasta más o menos 8.5, de alrededor de 7.0 hasta más o menos 8.0, o de alrededor de 7.5. El algunas modalidades, el pH de la composición se eleva a cerca del intervalo de alrededor de 7.0 hasta más o menos 9.0. En algunas modalidades, el pH se puede elevar a un pH de cerca de 8.0 o alrededor de 9.0.

El pH de la composición de la presente invención se puede ajustar mediante varios medios. En algunas modalidades, el pH se baja al añadir un ácido o una base a la composición. Entre los Ácidos adecuados se incluyen, pero no están limitados a: ácidos fuertes tales como, el ácido perclórico (HC104) , ácido yodhídrico (HI) , ácido bromhídrico (HBr) , ácido clorhídrico (HCl), ácido nítrico (HN03) , ácido sulfúrico (diprótico) (H2S04) , o ácidos débiles como ácido acético (CH3COOH) (por ejemplo, ácido acético glacial) , ácido cítrico (C6H807) , ácido fórmico (HCOOH) , ácido cianhídrico (HCN) , iones de sulfato ácido (HS04") , o combinaciones de cualquiera de los ácidos enumerados anteriormente. Bases adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, bases fuertes como el hidróxido de potasio (KOH) , hidróxido de bario (Ba(OH)2), hidróxido de cesio (CsOH) , hidróxido de sodio (NaOH) , hidróxido de estroncio (Sr(OH)2)/ hidróxido de calcio (Ca(OH)2), hidróxido de litio (LiOH) , hidróxido de rubidio (RbOH) , o de bases débiles tales como, amoníaco, o combinaciones de cualquiera de las bases enumeradas anteriormente .

En algunas modalidades, el pH de la composición se puede ajustar utilizando soluciones amortiguadas, tales como, soluciones amortiguadoras fosfatadas, (por ejemplo, fosfatos de sodio y de potasio) , solución amortiguadora de bicarbonato, solución amortiguadora de citrato, solución amortiguadora de borato, solución amortiguadora de acetato, solución amortiguadora de trometamina, solución amortiguadora de HEPES y combinaciones de los anteriores.

En algunas modalidades, la adición de un metal de transición a la composición da como resultado la coprecipitación tanto de la biomacromolécula de interés como de la impureza, obteniendo una pureza reducida de la biomacromolécula al momento de aislarla. En algunas modalidades, añadir glicol de polietileno a la composición es lo adecuado para aumentar la recuperación de la biomacromolécula de interés. El término "aumento en la recuperación" se refiere a la comparación del método de la presente invención (con adición tanto de glicol de polialquileno como de metales de transición) relativo a un método idéntico de purificación pero sin la adición del metal de transición o del glicol de polialquileno. Por ejemplo, si el Método A es el método de la presente invención (excepto que no abarca la adición de metales de transición a la materia recolectada) y da como rendimiento 100 mg de biomacromolecula de interés; y el Método B es idéntico al Método A (excepto que el Método B abarca la adición de metales de transición a la materia recolectada) y dio como rendimiento 110 mg de biomacromolécula, entonces se puede determinar que el Método B. tiene un "aumento en la recuperación selectiva" del 10%. En algunas modalidades, el método de la presente invención aumenta la recuperación de la biomacromolécula en más de 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% ó 25%. En algunas modalidades, el método de la presente invención aumenta la recuperación hasta en un 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ó 50%. En algunas modalidades, la adición del glicol de polialquileno y metales de transición aumenta la recuperación de la biomacromolécula en más de 3%. En algunas modalidades, la recuperación del glicol de polialquileno y los metales de transición aumenta la recuperación de la biomacromolécula en más de 10%.

En algunas modalidades de la invención, un glicol de polialquileno se añade a la composición. En algunas modalidades de la presente invención, el glicol de polialquileno es un glicol de polietileno con un peso molecular de entre 1,000 Da a 20,000 Da; el metal de transición es el zinc; la separación se lleva a cabo por precipitación de la biomacromolécula en solución y después se centrifuga la composición para aislar el precipitado; y la biomacromolécula es un anticuerpo.

En algunas modalidades de la presente invención, el glicol de polialquileno es un glicol de polietileno con un peso molecular de entre 1,000 Da a 20,000 Da; el metal de transición es el zinc; la separación se lleva a cabo por precipitación de la biomacromolécula en la solución y después se filtra la composición para aislar el precipitado; y la biomacromolécula es un anticuerpo.

En algunas modalidades de la invención, el método de la presente invención está dirigido hacia un método para aumentar la fuerza de un proceso de filtrado, el método incluye: (a) añadir un glicol de polialquileno a la composición; (b) añadir un metal de transición a la composición; y (c) filtrar la composición a través de una membrana. El término "aumentar la fuerza" se refiere a la habilidad para utilizar un intervalo más amplio de velocidades de flujo para un filtro dado, mientras que no se aumente la presión transmembrana, las concentraciones de impurezas o la pérdida de producto. El término "aumentar la fuerza" también se refiere a la habilidad de filtrar un volumen mayor, o una densidad celular mayor, de materia recolectada para un filtro dado, mientras no se aumente la presión transmembrana, las concentraciones de impurezas o la pérdida de producto.

En algunas modalidades de la presente invención, el método está dirigido hacia un método de clarificación de una composición que contenga una biomacromolécula ; por ejemplo, materia cultivada, antes de filtración, el método incluye: (a) añadir un glicol de polialquileno a la composición; (b) añadir un metal de transición a la composición; y (c) separar una biomacromolécula de una impureza en una composición. En algunas modalidades, clarificar una composición se asocia con la disminución de la turbidez, ésta se mide utilizando un turbidímetro, como por ejemplo, el turbidímetro Hach 2100A (Hach Co., Loveland, CO) .

Las etapas del método de la presente invención pueden ordenarse en varias secuencias. Por ejemplo, en algunas modalidades, la adición del glicol de polialquileno ocurre antes de añadir el metal de transición y de separar la biomacromolécula de la impureza. En algunas modalidades, el glicol de polialquileno se añade primero, después se agrega el metal de transición y por último se separa la biomacromolécula de la impureza. En algunas modalidades, uno o más procedimientos de purificación pueden ocurrir entre, ya sea (a) la adición de un glicol de polialquileno a la composición; (b) la adición de un metal de transición a la composición; o (c) la separación de la biomacromolécula de la impureza. Alternativamente, los pasos (a), (b) , o (c) del método de la presente invención pueden ser contiguos, por ejemplo no ocurren procedimientos de purificación adicional entre los pasos (a) , (b) , o (c) . Sin embargo, cuando los pasos (a) , (b) , o (c) son contiguos, pueden ocurrir procedimientos de purificación adicionales antes o después de los pasos (a), (b) , o (c) . En algunas modalidades, el glicol de polialquileno y el metal de transición se mezclan para formar una sustancia común antes de añadirse a la composición. En algunas modalidades, el glicol de polialquileno y el metal de transición se agregan simultáneamente a la composición. En algunas modalidades, el glicol de polialquileno y el metal de transición se agregan consecutivamente, en cualquier orden, a la composición.

En algunas modalidades, concentrar la biomacromolécula antes de la precipitación es algo efectivo para reducir la cantidad requerida de glicol de polialquileno y/o metales de transición para la precipitación y la recuperación de la biomacromolécula. Por ejemplo, la concentración antes de la precipitación puede reducir de dos hasta cuarenta veces la cantidad de glicol de polialquileno y/o metales de transición requeridos. La ultrafiltración, la microfiltración entre otros métodos de concentración de biomacromoléculas son métodos efectivos de concentración antes de la precipitación.

En algunas modalidades, el precipitado puede lavarse para remover aún más las impurezas antes de la resolubilización de las biomacromoléculas. Por ejemplo, el precipitado se puede lavar con una o más soluciones (o combinaciones de soluciones) incluyendo, sin limitación, agua o soluciones que contengan un glicol de polialquileno (por ejemplo, a una concentración de cerca de 0.5% hasta casi 5% (p/v)), un metal de transición (por ejemplo, a una concentración de cerca de 0.5mM hasta casi 5% (p/v) ) , un quelante (por ejemplo, EDTA) , una composición aromático heterocíclico (por ejemplo, imidazol) , o una variedad de soluciones amortiguadoras. En algunas modalidades el lavado se logra al añadir una solución, dejando a que se asiente el precipitado en la solución, y/o decantando o extrayendo por sifón la solución del precipitado.

En algunas modalidades, la biomacromolécula retiene una o más actividades biológicas después de la precipitación y la resolubilización. En algunas modalidades, la biomacromolécula retiene una o más actividades biológicas después de la precipitación, lavado y resolubilización. El término "actividad biológica" se refiere a la función que ocurre de forma natural en la biomacromolécula ("ocurrir de forma natural" puede también incluir funciones aberrantes o alteradas introducidas por medio de mutaciones en una biomacromolécula tales como: proteína, anticuerpo o enzima) . Un ejemplo de actividad biológica para un anticuerpo incluye el enlace específico de un anticuerpo a un antígeno. Un ejemplo de actividad biológica para una enzima incluye la actividad enzimática o catalítica específica de una enzima. En algunas modalidades, la biomacromolécula retiene la actividad biológica en un intervalo de alrededor de 50% hasta más o menos 100% (comparado con la actividad específica de la biomacromolécula antes de la precipitación o antes de la precipitación y el lavado) . Por ejemplo, la biomacromolécula puede retener cerca del 50%, cerca del 60%, cerca del 70%, cerca del 80%, cerca del 90%, cerca del 95%, o cerca del 100% de su actividad biológica específica antes de la precipitación o antes de la precipitación y el lavado.

En algunas modalidades, el pH de la solución se baja para tener un efecto mayor en la resolubilización y/o disociación del metal de transición (tal como el zinc) de la biomacromolécula .

Ejemplos La invención se va a describir en mayor detalle a manera de ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos se ofrecen con propósitos ilustrativos y no tienen, de ninguna manera, la intensión de limitar la invención. Aquellos conocedores de la materia reconocerán de inmediato la variedad de parámetros no críticos que pueden cambiarse o modificarse para producir modalidades alternativas de acuerdo a la invención.

EJEMPLO 1 A fin de investigar la precipitación de varios anticuerpos y otras proteínas provenientes de composiciones de cultivos celulares, se probaron varios métodos y éstos incluyen: (1) precipitación utilizando solamente glicol de polietileno (PEG) 3350 en una sola adición. (2) precipitación utilizando solamente cloruro de zinc en una sola adición, (3) precipitación utilizando una combinación de PEG y cloruro de zinc en una sola adición, (4) precipitación utilizando solamente PEG en cortes increméntales (por ejemplo, adiciones increméntales del PEG) , y (5) precipitación utilizando una combinación de PEG y zinc en cortes increméntales (por ejemplo, adiciones increméntales del PEG y/o zinc) .

A fin de investigar la precipitación de los anticuerpos Ab C, Ab D, y Ab E, utilizando solamente PEG en un solo corte, materia recolectada clarificada conteniendo el anticuerpo se ajustó a un pH 8.0 con base 2MTris. La materia recolectada luego se reguló a una temperatura de entre 2-8°C y se retuvo a esa temperatura durante todo el proceso de purificación. La materia recolectada después se filtró a través de un filtro de 0.22 µt?. Una sustancia de PEG 3350 al 70% se añadió al material filtrado para alcanzar una concentración de PEG 3350 al 10%. El material se revolvió durante 10 minutos y se mantuvo durante una hora. La composición PEG al 10% se centrifugó luego a 3,000 x g durante 10 minutos, y después de esto, se decantó el sobrenadante. El precipitado que resulta se resuspendió en una solución amortiguadora de resuspensión PEG-Zn por balanceo/mezcla durante una hora. La solución amortiguadora de resuspensión consiste en una solución amortiguadora y un agente quelante.

La muestra recolectada, la muestra resuspendida y el sobrenadante se analizaron por medio de SEC-HPLC (por sus siglas en inglés, cromatografía por exclusión molecular-cromatografía líquida de alto rendimiento) a fin de determinar la pureza y la recuperación, tomando en cuenta cualquier factor de concentración o dilución. Además la muestra recolectada y la muestra resuspendida se analizaron para detectar el contenido de ADN y HCP por medio de los métodos Elisa y QPCR. El término "título" se refiere a la concentración de producto en la materia prima antes de la purificación. Los resultados se presentan en la Tabla 1.

TABLA 1 EJEMPLO 2 A fin de investigar la precipitación de los anticuerpos Ab C, Ab D, y Ab E, utilizando solamente cloruro de zinc en un solo corte, materia recolectada clarificada conteniendo el anticuerpo se ajustó a un pH 7.2 con base 2 Tris. La, materia recolectada luego se reguló a una temperatura de entre 2-8°C y se retuvo a esa temperatura durante todo el proceso de purificación. La materia recolectada después se filtró a través de un filtro de 0.22 pm. Una sustancia de cloruro de zinc A 250 mM se añadió al material filtrado para alcanzar una concentración de 10 mM ZnCl2. El material se revolvió durante 10 minutos y se mantuvo durante una hora.

La composición 10 mM ZnCl2 se centrifugó luego a 3,000 x g durante 10. minutos, y después de esto se decantó el sobrenadante. El sedimento resultante se resuspendió en una solución amortiguadora de resuspensión PEG-Zn, pH 7.2, por balanceo/mezcla durante una hora.

La muestra recolectada, la muestra resuspendida y el sobrenadante se analizaron por medio de SEC-HPLC a fin de determinar la pureza y la recuperación, tomando en cuenta cualquier factor de concentración o dilución. Además la muestra recolectada y la muestra resuspendida se analizaron para detectar el contenido de ADN y HCP por medio de los métodos Elisa y QPCR. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

TABLA 2 EJEMPLO 3 A fin de investigar la precipitación de los anticuerpos Ab C y Ab F, utilizando una combinación de PEG y cloruro de zinc en una sola adición, la materia recolectada clarificada conteniendo el anticuerpo se ajustó a un pH 7.2 con base 2MTris. La materia recolectada luego se reguló a una temperatura de entre 2-8°C y se retuvo a esa temperatura durante todo el proceso de purificación. La materia recolectada después se filtró a través de un filtro de 0.22 µp\ .

El primer corte consistió en añadir una sustancia PEG 3350 al 70% al material filtrado para alcanzar una concentración de PEG al 1.6% y añadir 250 mM de ZnCl2 al material filtrado para alcanzar una concentración final de 2.7 mM de ZnCl2. El material se revolvió durante 10 minutos y se mantuvo durante una hora. La muestra resultante luego se filtró ("filtrado del corte 1") a través de un filtro de 0.22µp\ y se guardó el filtrado.

El segundo corte se realizó al añadir PEG a la muestra filtrada hasta llegar a una concentración final de 5.5% y el cloruro de zinc a una concentración final de 5 mM. Este material se retuvo durante 1 hora.

El precipitado resultante se centrifugó a 3,000 x g durante 10 minutos, y después de esto, se decantó el sobrenadante. El sedimento resultante se resuspendió en una solución amortiguadora de resuspensión PEG-Zn, pH 7.2, por balanceo/mezcla durante una hora.

La muestra recolectada, el filtrado del primer corte, el sobrenadante y la muestra resuspendida se analizaron por medio de SEC-HPLC a fin de determinar la pureza y la recuperación, tomando en cuenta cualquier factor de concentración o dilución. Además la muestra recolectada y la muestra resuspendida se analizaron para detectar el contenido de ADN y HCP por medio de los métodos Elisa y QPCR. Los resultados se presentan en la Tabla 3.

TABLA 3 Producto Título pH % PEG Recupera Pureza 3350 ción del producto Ab C 10.0 8 4% 83% 95% g/L Ab F 9.3 g/L 8 8% 90% 85% EJEMPLO 4 A fin de investigar la precipitación de los anticuerpos Ab F, utilizando solamente PEG en cortes increméntales, la materia recolectada clarificada conteniendo el anticuerpo se ajustó a un pH 8.0 con base 2MTris. La materia recolectada luego se reguló a una temperatura de entre 2-8°C y se retuvo a esa temperatura durante todo el proceso de purificación. La materia recolectada después se filtró a través de un filtro de 0.22 µp?.

El primer corte PEG consistió en añadir una sustancia PEG ' 3350 al 70% al material filtrado para alcanzar una concentración de PEG al 4.75%. El material luego se revolvió durante 10 minutos y se mantuvo durante una hora. La muestra resultante luego se filtró ("filtrado del corte 1") a través de un filtro de 0.22µp\ y se guardó el filtrado.

El segundo corte PEG se realizó al añadir PEG a la muestra filtrada hasta llegar a una concentración final de 10.5%. Este material se retuvo durante 1 hora y el precipitado resultante se centrifugó a 3,000 x g durante 10 minutes . El sobrenadante se decantó y el sedimento resultante se resuspendió en una solución amortiguadora de resuspensión PEG-Zn, pH 4.0, por balanceo/mezcla durante una hora.

La muestra recolectada, el filtrado del primer corte, el sobrenadante y la muestra resuspendida se analizaron por medio de SEC-HPLC a fin de determinar la pureza y la recuperación, tomando en cuenta cualquier factor de concentración o dilución. Además la muestra recolectada y la muestra resuspendida se analizaron para detectar el contenido de ADN y HCP por medio de los métodos Elisa y QPC . Los resultados se presentan en la Tabla 4.

TABLA 4 EJEMPLO 5 Se examinó el efecto del título (concentración) en los requisitos del reagente para la precipitación Ab F. El fluido de cultivo celular recolectado (HCCF, por sus siglas en inglés) de Ab F (concentración inicial de 6.5 g Ab F/L de HCCF) se ajustó a un pH 7.2 con base 2MTris a 2-8°C. El HCCF se concentró utilizando PELLICON-2® 50 kilo Dalton (kDa) de cartucho (Millipore, Inc.), ya sea a 32.5 g/L o a 65 g/L; una muestra a 65 g/L luego fue diafiltrada (amortiguador de intercambio) en un amortiguado de fosfato de sodio 5mM a pH 7.2 con una conductividad de aproximadamente 7mS/cm a 6°C. Se generaron cuatro diferentes muestras: una a 6.5 g/L Ab F en fluido de cultivo celular (CCF por sus siglas en inglés) , una a 32.5 g/L Ab F en CCF, una a 65 g/L Ab F en CCF y una a 65 g/L en él amortiguado de fosfato de sodio. El cloruro de zinc y el PEG 3350 se adicionaron a la concentración requerida a fin de lograr el rendimiento deseado para cada muestra respectiva. Las condiciones experimentales se presentan en la Tabla 5 y los resultados del experimento se presentan en la Tabla 6.

Tabla 5 Tabla 6 Producto Título pH % PEG ZnClj Recuperació Pureza 3350 (mM) n del producto Ab F 6.5 g/L 7.2 4% 10 93% 96% Ab F 32.5 7.2 4% 5 92% 82% g/L Ab F 65 g/L · 7.2 4% 5 90% 83% Ab F 65 g/L 7.2 1.5% 2.5 92%% 87% (diafiltra do) EJEMPLO 6 Se investigaron los efectos de varios otros agentes precipitantes de varias moléculas IgGl . Cultivos celulares que expresaron ya sea anticuerpos Ab A o Ab B se incubaron con diferentes cantidades de, ya sea: glicol de polietileno, cloruro de zinc, etanol, ácido caprílico o rivanol . La cantidad de anticuerpo precipitado fue determinada luego, ya sea, por medio de cromatografía por exclusión molecular (para el cloruro de zinc, etanol, ácido caprílico y rivanol) o por Proteína A HPLC. Los resultados se presentan en la Tabla 7.

TABLA 7 Los datos anteriores sugieren que la presencia de PEG, etanol y zinc aumenta el rendimiento de monómero, así como la remoción del material celular (como se midió con OD280) . Los datos sugieren que el ácido caprílico remueve el rendimiento del monómero, pero no afecta la OD2ao - El rivanol no precipitó ninguna substancia.

EJEMPLO 7 La cantidad de agente precipitante requerido para el uso a escala industrial se puede determinar basado en una cámara de crecimiento de 10,000 L. La tabla 8 enumera (1) concentraciones y cantidades de etanol, cloruro de zinc y PEG requerido para la precipitación (2) volumen adicional agregado por el precipitante, (3) riesgos asociados con el precipitante, (4) temas de remoción requeridos para los procesos de desplazamiento adicionales, y (5) requisitos especiales de eliminación del precipitante propue TABLA 8 Método de Concentraciones Cantida Volumen Riesgos Temas de RequisiPrecipiAproximadas d Total Adicional Remoción tos tante Requerí de Especiada Precipitante les de Eliminación Etanol 35% 3, 500 L 3, 500 L Inflamable Posible Si Cloruro 50 mM-B0 mM 5 Kg. 80 L Ninguno No Sí de Zinc PEG 6000 6% - 21% 600- 3,000- Ninguno No SI 2100Kg 20, O0OL EJEMPLO 8 Los daños al utilizar más de un agente precipitante se investigaron en composiciones que contienen el anticuerpo Ab C a un pH 7.0. Los composiciones se ajustaron para contener, ya sea: PEG al 0.5%, PEG al 1%, PEG al 2%, o PEG al 4%; y ya sea: 2.5 mM de ZnCl2, 5 mM de ZnCl2, ó 10 mM ZnCl2. Los resultados se muestran en la FIG. 9.

Como se puéde ver, la adición tanto del PEG como del ZnCl2 proporcionó un efecto de precipitación significativamente mayor que al utilizar simplemente el PEG o el ZnCl2 por separado. El efecto de precipitación aumentada fue también mayor que el efecto aditivo del PEG o el ZnCl2 De esta manera, el PEG y el ZnCl2 exhiben un efecto sinergístico en la recuperación del producto cuando se utilizan en conjunto.

EJEMPLO 9 Los daños al utilizar más de un agente precipitante se investigaron en composiciones que contienen anticuerpo Ab C a un pH 8.0. Los composiciones se ajustaron para contener, ya sea: PEG al 0.5%, PEG al 1%, PEG al 2%, o PEG al 4%; y, ya sea: 2.5 mM de ZnCl2, 5 mM de ZnCl2, o 10 mM ZnCl2. Los resultados se muestran en la FIG. 10.

Como se puede ver, la adición tanto del PEG como del ZnCl2 proporcionó un efecto de precipitación significativamente mayor que al utilizar simplemente el PEG o el ZnCl2 por separado. El efecto de precipitación aumentada fue también mayor que el efecto aditivo del PEG o el ZnCl2 De esta manera, el PEG y el ZnCl2 exhiben un efecto sinergístico en la recuperación del producto cuando se utilizan en conjunto.

EJEMPLO 10 Los daños al utilizar más de un agente precipitante se investigaron en composiciones que contienen el anticuerpo Ab C a un pH 9.0. Los composiciones se ajustaron para contener, ya sea: PEG al 0.5%, PEG al 1%, PEG al 2%, o PEG al 4%; y, ya sea: 2.5 mM de ZnCl2, 5 mM de ZnCl2, o 10 mM ZnCl2. Los resultados se muestran en la FIG. 11.

Como se puede ver, la adición tanto del PEG como del ZnCl2 proporcionó un efecto de precipitación significativamente mayor que al utilizar simplemente el PEG o el ZnCl2 por separado. Este efecto de precipitación sinergística fue también mayor que el efecto aditivo esperado del PEG o el ZnCl2 en conjunto.

EJEMPLO 11 Se investigó el efecto de PEG, ZnCl2 y la combinación de los dos, en la precipitación de varios otros anticuerpos. Se analizaron cuatro diferentes anticuerpos: dos anticuerpos IgGl y dos anticuerpos IgG4. Los resultados de la recuperación del producto se presentan en la Tabla 9.

TABLA 9 Los datos en la Tabla 9 demuestran que la combinación de PEG y ZnCl2 proporcionan más que un efecto aditivo en la precipitación de varios tipos y clases de anticuerpos. Por ejemplo, el efecto aditivo esperado al añadir PEG al 5% (4%) y 10 mM ZnCl2 (35%) a una composición que contiene el anticuerpo Ab C sería de 39%. Sin embargo, se observa un efecto sinergístico ya que se precipita el 91.1% del anticuerpo Ab C.

EJEMPLO 12 Después de la concentración se realizó la precipitación de Ab F por captura con filtración Nutsche y lavado de precipitado.

El fluido de cultivo celular recolectado (HCCF) de Ab F (concentración inicial de 6.7 g Ab F/L de HCCF) se ajustó a un pH 7.2 con base 2MTris a 2-8°C. El HCCF se concentró utilizando PELLICON-2® 50 kilo Dalton (kDa) de cartucho (Millipore, Inc.), a 67 g/L y la muestra luego fue diafiltrada (amortiguador de intercambio) en un amortiguado de fosfato de sodio 5mM a pH 7.2. (Nota: la concentración se puede lograr usando una variedad de membranas de microfiltración/ultrafiltración y filtros o métodos; por ejemplo, con otros métodos de concentración tales como, el amortiguador de intercambio centrífugo o las células agitadas) . Mientras se agitaba vigorosamente, se añadió un solo bolo de la solución madre con un contenido de 250 mM de cloruro de zinc a pH 3.0 a la muestra concentrada para llegar a una concentración final de 2.5 mM. Después de la adición del cloruro de zinc, un solo bolo de PEG 3350 al 30% y 100 mM de imidazol se añadieron inmediatamente a la muestra agitada, para llegar a una concentración final de PEG 3350 al 1.5% y 10 mM de imidazol. El precipitado resultante se agitó durante 30 minutos. Después se agregó tierra de diatomeas (CELPURE® 1000) al precipitado agitado para llegar a una concentración final de 60 g/L (p/v) y se alimentó en un filtro Nutsche con extremo cerrado (presurizado) a una velocidad de flujo constante. Una torta de precipitado se formó cuando la presión del filtro alcanzó 30 psi (206.8 kPa) . La torta en el filtro se lavó subsecuentemente al menos con 3 volúmenes equivalentes de una serie de soluciones, incluyendo agua. La torta de precipitado resultante se resolubilizó luego con 40 mM EDTA, 60 mM de acetato a pH 5.0. Nota: las muestras precipitadas se pueden resolubilizar con un intervalo de soluciones, incluyendo: 100 mM EDTA a pH 7.2; 100 mM de acetato a H 5.0; 2.5 mM EDTA y 60 mM de acetato a pH 5.0; 250 mM Tris pH 8.0. La muestra resolubilizada se analizó para determinar la pureza por medio de la cromatografía por exclusión molecular (SEC), geles denaturantes SDS-PAGE y geles denaturantes SDS-PAGE con chip de gel, proteína de células huésped y contenido de ADN .

El mAb resolubilizado se purificó subsecuentemente a través de dos pasos cromatográf icos : cromatografía por intercambio de aniones y cromatografía por intercambio hidrofóbico. Cada eluato resultante se analizó por medio de SEC, proteína de células hospederas y contenido de ADN. Los resultados se muestran en las Figuras 12-14.

EJEMPLO 13 Después de la concentración se realizó la precipitación de Ab F por captura y lavado; y por sedimentación y uso de sifón.

El fluido de cultivo celular recolectado (HCCF) de Ab F (concentración inicial de 6.7 g Ab F/L de HCCF) se ajustó a un pH 7.2 con base 2MTris a 2-8°C. El HCCF se concentró utilizando PELLICON-2® 50 kilo Dalton (kDa) de cartucho (Millipore, Inc.), a 67 g/L y la muestra luego fue diafiltrada (amortiguador de intercambio) en un amortiguado de fosfato de sodio 5mM a H 7.2. (Nota: la concentración se puede lograr usando una variedad de membranas de microf iltración/ultraf iltración y filtros o métodos; por ejemplo, con otros métodos de concentración tales como, el amortiguador de intercambio centrífugo o las células agitadas) . 35 mM de cloruro de zinc se mezclaron con la muestra concentrada para llegar a una concentración final de 2.5 m . Después de la adición del cloruro de zinc, PEG 3350 al 11% y 200 mM de imidazol se añadieron inmediatamente a la muestra, para llegar a una concentración final de PEG 3350 al 1.5% y 10 mM de imidazol. El precipitado resultante se agitó durante 30 minutos. El precipitado se dejó asentar durante dos horas y el sobrenadante se removió por medio de succión. La torta del precipitado se lavó, resuspendiendo el precipitado a su volumen original, con al menos 2 volúmenes equivalentes de varias soluciones, incluyendo agua, permitiendo que el precipitado se asentara durante 2 horas entre cada lavado de precipitado. La torta de precipitado resultante se resolubilizó luego con 40 mM EDTA, 60 mM de acetato a pH 5.0. La muestra resolubi 1 i zada se analizó para determinar la pureza por medio de la cromatografía por exclusión molecular (SEC), geles denaturantes SDS-PAGE y geles denaturantes SDS-PAGE con chip de gel, proteína de células hospederas y contenido de ADN . Los resultados se presentan en la Tabla 10..

Tabla 10 EJEMPLO 14 Se llevó a cabo la precipitación de Ab F con PEG 3350 y ZnCl2 para la remoción de impurezas de bajo peso molecular.

El fluido de cultivo celular recolectado (HCCF) de Ab F (concentración inicial de 6.7 g Ab F/L de HCCF) se ajustó a un pH 7.2 con base 2MTris a 2-8°C. El HCCF se concentró utilizando PELLICON-2® 50 kilo Dalton (kDa) de cartucho (Millipore, Inc.), a 67 g/L y la muestra luego fue diafiltrada (amortiguador de intercambio) en un amortiguado de fosfato de sodio 5mM a pH 7.2. (Nota: la concentración se puede lograr usando una variedad de membranas de ultrafiltración, incluyendo 50 kDa MWCO PELLICON-2®, o con otros métodos, tales como, el amortiguador de intercambio centrífugo o las células agitadas) . Mientras se agitaba vigorosamente, se añadió un solo bolo de la solución madre con un contenido de 250 mM de cloruro de zinc a pH 3.0 a la muestra concentrada para llegar a una concentración final de 2.5 mM. Después de la adición del cloruro de zinc, un solo bolo de PEG 3350 al 30% y 100 mM de imidazol se añadió inmediatamente a la muestra agitada, para llegar a una concentración final de PEG 3350 al 1.5% y 10 mM de imidazol. El precipitado resultante se agitó durante 30 minutos, se muestreó y resolubilizó, además se analizó por medio de la SEC para determinar el contenido de impurezas de bajo peso molecular (LMW por sus siglas en inglés) . Se encontró que la precipitación con ZnCl2 y PEG 3350 en la presencia de imidazol reduce los niveles de impurezas de bajo peso molecular a casi cero; se encontró que la precipitación con ZnCl2 y PEG 3350 en la ausencia de imidazol reduce los niveles de impurezas de bajo peso molecular de -16% a ~6%. Los resultados se muestran en Las FIGS . 15A-15C.

La presente invención no debe limitarse al campo de aplicación de las modalidades específicas descritas, las cuales tienen la intensión de ilustrar los aspectos individuales de la invención; y cualquier composición o método que sea funcionalmente equivalente entrará en el campo de aplicación de esta invención. Por cierto, diversas modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán evidentes para los conocedores de la materia con las descripciones anteriores y figuras que acompañan. Las modificaciones tienen la intención de caer dentro del campo de aplicación de las reivindicaciones anexas .

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan a la presente por referencia con la misma extensión como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específica e individualmente indicada para ser incorporada por referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (44)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método de aislamiento de una biomacromolécula dentro de una composición que contiene impurezas, caracterizado porque incluye: a) añadir un glicol de polialquileno a la composición,- b) añadir un metal de transición a la composición; y c) separar la biomacromolécula de la impureza.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el glicol de polialquileno se selecciona del grupo que consiste en glicol de polipentileno, glicol de polibutileno, glicol de polipropileno o glicol de polietileno .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el glicol de polialquileno es un glicol de polietileno.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el glicol de polietileno tiene un peso molecular de entre 1,000 Da y 20,000 Da.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el glicol de polietileno tiene un peso molecular de entre 2,000 Da y 15,000 Da.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque añadir un glicol de polialquileno a la composición da como resultado una composición que tiene una concentración de glicol de polialquileno de alrededor de 0.5% hasta cerca de 30% (p/v) .

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque añadir un glicol de polialquileno a la composición da como resultado una composición que tiene una concentración de glicol de polialquileno de alrededor de 2.0% hasta cerca de 10% (p/v) .

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el metal de transición se selecciona del grupo que consiste de zinc, níquel, cobre, cobalto y manganeso .

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el metal de transición es zinc.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque añadir un metal de transición da como resultado una composición que tiene una concentración de metal de transición de alrededor de lmM - 50 mM.

11. El método de conformidad con la reivindicación- 1, caracterizado porque añadir un metal de transición da como resultado una composición que tiene una concentración de metal de transición de alrededor de 2.5 mM - 15 mM.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la separación de (c) se realiza filtrando la composición, la filtración forma un flujo de permeado y un rechazo salino.

13. El método de conformidad · con la reivindicación 12, caracterizado porque la filtración se realiza en un filtro con extremo cerrado.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la biomacromolécula se encuentra sustancialmente en el rechazo salino.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la separación de (c) se realiza sometiendo la composición a la centrifugación, la centrifugación forma un sobrenadante y un precipitado.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la biomacromolécula se encuentra sustancialmente en el precipitado.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomacromolécula es una proteína.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, en caracterizado porque la proteína es una proteína soluble.

19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína es un anticuerpo.

20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición comprende material celular eucariótico.

21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la impureza se selecciona de un grupo que consiste en proteína, lípido, ácido nucleico, ácido ribonucleico, medio de crecimiento y combinaciones de los anteriores .

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque la adición del glicol de polialquileno y metal de transición aumenta la recuperación de la biomacromolécula en más de un 3%.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque la adición del glicol de polialquileno y metal de transición aumenta la recuperación de la biomacromolécula en más de un 10%.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y del 17-23, caracterizado porque la separación en (c) se realiza por filtración de la composición, en donde la " filtración da como resultado una presión transmembrana; y en donde la presión transmembrana permanece sustancialmente constante durante la filtración.

25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque (a) el glicol de polialquileno es un glicol de polietileno que tiene un peso molecular de entre 1,000 Da y 20,000 Da ; (b) el metal de transición es el zinc; (c) la separación se realiza por precipitación de la biomacromolécula en solución y después se centrifuga la composición para separar el precipitado; y d) la biomacromolécula es un anticuerpo.

26. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) el glicol de polialquileno es un glicol de polietileno que tiene un peso molecular de entre 1,000 Da y 20,000 Da; b) el metal de transición es el zinc; c) la separación se realiza por precipitación de la biomacromolécula en solución y después se filtra la composición para separar el precipitado; y d) la biomacromolécula es un anticuerpo.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque la adición del glicol de polialquileno y el metal de transición tiene un efecto sinergístico en la precipitación de la biomacromolécula .

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, caracterizado porque el precipitado de la biomacromolécula se forma y luego se lava.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el precipitado se lava con agua.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el precipitado se lava con una solución que contenga ZnCl2 a una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta más o menos 5 mM.

31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el precipitado se lava con una solución que contenga glicol de polialquileno a una concentración de alrededor de 0.1% hasta más o menos 2.5%.

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, caracterizado porque incluyen además el uso de una composición seleccionado del grupo que consiste en : a) imidazol ; b) glicina; O triptófano; d) cisteína; e) histidina; f) histamina; y g) cloruro de amonio para aislar la biomacromolécula .

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la composición es imidazol.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizado porque un glicol de polialquileno se utiliza para aislar la biomacromolécula a una concentración en el intervalo de alrededor de 0.5 % hasta más o menos 5 % (p/v) .

35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizado porque un glicol de polialquileno se utiliza para aislar la biomacromolécula a una concentración (p/v) seleccionada del grupo que consiste en: a) cerca de 0. 5 b) cerca de 1% c) cerca de 1. 5 %; d) cerca de 2 e) cerca de 2. 5 %; f) cerca de 3 %; g) cerca de 3. 5 %; h) cerca de 4 %; i) cerca de 4. 5 %; j) cerca de 5 %.

36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizado porque un metal de transición se utiliza para aislar la biomacromolécula a una concentración en el intervalo de alrededor de 0.5 mM hasta más o menos 5 mM .

37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, caracterizado porque un metal de transición se utiliza para aislar la biomacromolécula a una concentración seleccionada del grupo que consiste en: a) cerca de 0.5 mM; b) cerca de 1 mM; O cerca de 1. .5 mM; d) cerca de 2 mM; e) cerca de 2 , .5 mM; f) cerca de 3 mM; g) cerca de 3 .5 mM; h) cerca de 4 mM; i) cerca de 4 .5 mM; y j) cerca de 5 mM.

38. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el glicol de polialquileno se añade a la composición para dar como resultado una concentración de alrededor de 1.5% (p/v) de glicol de polialquileno y en donde el metal de transición se añade a la composición para dar como resultado una concentración de alrededor de 2.5 mM de metal de transición.

39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-38, caracterizado porque se concentra la biomacromolécula antes de la adición del glicol de polialquileno o el metal de transición.

40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-38, caracterizado porque se concentra la biomacromolécula antes de la adición del glicol de polialquileno y el metal de transición.

41. El método de conformidad con la reivindicación 39 ó 40/ caracterizado porque la concentración previa reduce la cantidad de glicol de polialquileno o metal de transición requerida para el aislamiento de la biomacromolécula en un factor de dos a 40 veces.

42. El método de conformidad con la reivindicación 39 ó 40, caracterizado porque la concentración previa reduce la cantidad de glicol de polialquileno o metal de transición requerida para el aislamiento de la biomacromolécula en un factor seleccionado del grupo que consiste en: a) cerca de 2 veces; b) cerca de 3 veces; c) cerca de 4 veces; d) cerca de 5 ¦veces ; e) cerca de 10 veces ; f) cerca de 15 veces ; g) cerca de 20 veces ; h) cerca de 25 veces ; i) cerca de 30 veces ; j) cerca de 35 veces; y k) cerca de 40 veces .

43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, caracterizado porque la biomacromolécula retiene alrededor del 50% a cerca del 100% de actividad biológica comparada con la actividad específica de la biomacromolécula antes de la precipitación o antes de la precipitación y lavado.

44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, caracterizado porque la biomacromolécula retiene actividad biológica a un valor seleccionado del grupo que consiste en: a) cerca de 50 % b) cerca de 60 % c) cerca de 70 % d) cerca de 80 % e) cerca de 90 ¾. f) cerca de 95 % g) cerca de 100 comparada con la actividad específica de biomacromolécula antes de la precipitación o antes de precipitación y lavado.