JP6055615B2 - Dachyp組成物および方法 - Google Patents
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Description
(i)培養液濃度;
(ii)Q−セファロースクロマトグラフィー;
(iii)S−セファロースクロマトグラフィー;
(iv)ウイルス不活化のための低pH処置;
(v)濃縮/限外濾過;
(vi)ウイルス除去のためのDV50濾過;
(vii)Q−セファロースIIクロマトグラフィー;
(viii)ウイルス除去のためのバイアソルブ(viresolve)クロマトグラフィー;
(ix)限外濾過による濃縮;
(x)S−300ゲル濾過クロマトグラフィー;
(xi)限外濾過による濃縮;
(Xii)バイアルの無菌充填
を含む。
(i)ダクリズマブを他の細胞培養成分から単離するためのプロテインA親和性クロマトグラフィー;
(ii)低pHウイルス不活化;
(iii)DNAを取り除くための強い陰イオン交換(Q−セファロース)クロマトグラフィー;
(iv)アグリゲートを減らすための弱陽イオン交換(CM−650M)クロマトグラフィー;および
(v)ウイルスを取り除くための濾過
を含む。
本開示は、たとえば、活性化されたT細胞および/またはB細胞の増殖を抑制し、たとえば、多発性硬化症などの活性化されたT細胞および/またはB細胞媒介疾患を治療するおよび/または予防するために、とりわけ、特定の特性を有するDAC組成物、ある種の投与様式に特に有用であり異なる温度で貯蔵安定である高濃度DAC製剤、DAC組成物を生産するのに有用なベクターおよび宿主細胞、DAC組成物を生産するのに有用な最適化された培養液および培養条件、DAC組成物および高濃度製剤を精製するための方法ならびにDAC組成物および高濃度製剤を使用する方法を提供する。
(1)特徴的なpE/Qおよび/またはQ/VHS N末端アイソフォーム;
(2)2つの主要なピークおよび小ピークにより特徴付けられる均質なN連結オリゴ糖プロファイル;
(3)ZENAPAX DACおよびDACペンツベルグと比べて減少したADCC細胞傷害性;ならびに
(4)150±10−15%もの名目上の濃度で処方される場合の低レベルのアグリゲート形態(<3%)
のうちの1つまたは複数により特徴付けられる。
本明細書に記載の発明のさまざまな態様および特徴は、以下の例示的実施形態を用いてさらに記載される。例示的実施形態が、特定の細胞培養培地、細胞培養条件、カラムクロマトグラフィー樹脂および平衡化緩衝液、洗浄緩衝液および溶出緩衝液を利用する限り、日常の変更は実施可能であると認められる。さらに、さまざまな細胞培養方法が特定の生産株(クローン7A11−5H7−14−43)により例示される限り、日常の最適化を用いて、または用いずに、他のDACまたはDAC類似体生産株が良好に使用され得ることが期待される。さらに、(上記の要約または以下の例示的実施形態のいずれにおいても)特定の実施形態を伴って記載される特徴は、本開示の方法および組成物の望ましい特性に実質的に影響を与えずに逸脱可能であり、さらにその異なる実施形態は、これらが明確に互いに排他的でない限り、さまざまな方法で一緒に組み合わせ、使用することができる。したがって、以下に提供される例示的実施形態は例示を意図し、限定することを意図するものではないと理解されるべきであり、これらの実施形態に従った特許請求の範囲を限定すると解釈するべきではない。
DAC HYP(セクション5.3を参照されたい)を100mg/mLで生産するために使用される細胞培養は、消泡剤エマルジョンを含まず、一方、DAC HYPが150mg/mLの細胞培養は、発泡を最小に抑えるために、10,000Lバイオリアクターにおいて低濃度のDow Corning Antifoam Cを使用する。最終抗体濃度100mg/mLを有するDAC HYP製剤を生産する場合、CM−650Mカラム(セクション5.4.5を参照されたい)は、0.5MのNaOH、0.5Mの硫酸ナトリウムの緩衝液を用いて衛生化され、最終抗体濃度150mg/mLを有するDAC HYP製剤を生産する場合、硫酸ナトリウムは衛生化緩衝液から省かれる。DAC HYPを100mg/mLで作るために、ワンステップの限外濾過/ダイアフィルトレーション(UF/DF)が、ポリソルベート80の添加および製剤原料の最終容積への希釈の直前の、下流プロセスの終わりに使用され(セクション5.4.7を参照されたい)、一方、製剤原料を濃度150mg/mLに作るためには、ツーステップのUF/DFが使用される。以下の実施例は、さまざまなロットの、100mg/mLおよび150mg/mLのDAC HYPの比較分析を示す。いくつかの研究において、150mg/mLのDAC HYPのバッチが、以下に参照標準ロットRS0801と称される、10,000L規模で製造された、1種のロットのDAC HYP100mg/mLと比較された。
抗Tac、マウスIgG2aモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、マウス骨髄腫細胞系NS−1と、T細胞白血病患者から生じたヒトT細胞系を用いて免疫化されたマウス由来の脾臓細胞とを融合することによって発生させた(Uchiyamaら、1981年、J.Immunol.126(4):1393−7頁)。抗Tacは、活性化T細胞とのその反応性に関して選択されたが、静止T細胞または静止B細胞とは反応性がない。抗Tacは、後に、ヒトIL−2受容体のアルファサブユニットと反応することが示された(Leonardら、1982年、Nature 300(5889):267−9頁)。
マウス骨髄腫細胞系NS0は、European Collection of Cell Cultures(ECACCカタログ番号85110503、Salisbury、Wiltshire、UK)から得られた。これらのNS0細胞のバイアルを、10%FBSを添加されたDMEM中で解凍した。細胞は、加湿インキュベーターにおいて37℃および7.5%CO2において維持された。細胞は、次いで、1mg/mLのBSAを添加された基本培地SFM−3において培養された。SFM−3は、10mg/mLインスリンおよび10μg/mLトランスフェリンを添加された、DMEMおよびHam’sF−12の1:1混合物である。およそ3ヶ月にわたって、NS0細胞を、それが排除されるまで培養培地中のFBSの量を徐々に減少させることによって、添加なしのSFM−3に適応させ、その後、単一ステップにおいてBSAを最終的に除去する。得られた宿主細胞系は、SFM−3において15−20回継代され、凍結バンクが調製された。
5.3.1.細胞の培養および回収
単一細胞バンクバイアルから細胞を解凍し、T−フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコおよびバイオリアクター内に、生産規模が達成されるまで、徐々により大きな容積に拡大する。生産培養が完了次第、細胞培養液を遠心分離および深層濾過により浄化し、収穫保持タンクに移送した。生産培養期間はおよそ10日である。
単一細胞バンクバイアルを解凍することによって生産バッチを開始する。細胞を、既知組成培地である無タンパク質基本培地−2(PFBM−2)を含有するTフラスコに移す。NaCl、フェノールレッド、トランスフェリンおよびインスリンを含まず、再構成した場合に、5mg/Lの濃度を得る量のEDTA鉄(III)ナトリウム塩を含み、再構成した場合に、それらの濃度が再構成されたHybridoma−SFMと同じであるように調整された残りの成分量を有するHybridoma−SFM培地粉末を要求することにより、PFBM−2を作るためのカスタム粉末をInvitrogenから注文することができる。調製されたPFBM−2培地は、以下の成分を含有する:8g/Lのカスタム粉末、2.45g/Lの重炭酸ナトリウム、3.15g/LのNaClおよび16.5g/LのD−グルコース一水和物(15g/Lグルコース)。
1,000Lのシードバイオリアクターにおいておよそ2日後、接種材料をステンレス製撹拌タンクの生産バイオリアクターに移送する。生産バイオリアクターは、およそ10,000Lの作業容積を有する。使用前に、バイオリアクターは、定置洗浄され、定置蒸気滅菌され、およそ4,000LのPFBM−2培地をロードされる。pHプローブおよび溶存酸素プローブは、バイオリアクターが定置蒸気滅菌される前に較正する。
収穫の直前に、生産バイオリアクターをまず<15℃に冷やし、pHを、0.5Mまたは1Mまたは2Mのクエン酸を使用して5.0±0.1に調整し、およそ30−90または45−60分の期間そのまま保持し、収穫槽に移送する前に細胞および細胞残渣を凝集させる。pHを調整した収穫は、その後、バッチ記録書類に定義のボウル速度および流速に関する所定のパラメーターの下で動作された連続遠心分離によって浄化される。
5.4.1.概説
DAC HYPの精製および製剤化方法は、ZENAPAX生産方法と比較して有効性を改良し、生産物関連不純物およびプロセス関連不純物の一貫したクリアランスを確実にするように設計された。以下のサブセクションは精製方法を記載する。精製は、低pHウイルス不活性化、ウイルスのろ過、限外濾過/ダイアフィルトレーションおよび製剤化ステップと組み合わせた、3種のクロマトグラフィー技術に基づく(プロテインA親和性クロマトグラフィー、Qセファロース陰イオン交換クロマトグラフィーおよびCM−650(M)陽イオン交換クロマトグラフィー)。すべてのステップは、閉鎖型装置において行われる。DAC HYPのための精製方法の概要を、図5に提示し、以下に記載する。
プロテインA親和性クロマトグラフィーステップは、一連の下流動作において第1の精製ステップである。このステップは、カラムのサイズに依存して1回または複数回のサイクル、通常、表8Aに記載のカラムに関して2回または3回のサイクルで行われる(すなわち、無細胞の収穫を2つのアリコートに分割し、その後各アリコートをプロテインAカラムに別々にロードし、溶出する)。組換えタンパク質A親和性クロマトグラフィー樹脂はIgGに特異的に結合し、細胞培養液の収穫の他の成分から抗体を分離する。
このステップは、低pH感受性の内因性ウイルス様粒子およびウイルスを不活性化するように設計されている。各プロテインAサイクルからのプロテインA溶出液は、回収タンク内に溶出され、ここに、0.5MのHClをpH3.5±0.1に達するまで加える。生産物は保持タンクに移送され、ここで別のpHメーターによってpHが確認される。低pH保持ステップは、pH3.5±0.1または±0.2(例えば、pH3.35−3.64)に、30−120分または30−240分の間厳密に制御される。30−120分の保持後、ウイルス不活性化溶出液を、1MのTris塩基を使用して、pH7.8±0.1または±0.3(例えば、pH8.05−8.34)に中和し、その後、0.22μmのフィルターを介して生産物プールタンクに移送する。低pHウイルス不活性化条件の要約を、表9に述べる。
Qセファロース陰イオン交換クロマトグラフィーステップを使用し、生産物関連不純物およびプロセス関連不純物(例えば、核酸、宿主細胞タンパク質、生産物アグリゲート、浸出されたプロテインAリガンドなど)を減少させ、さらなるウイルスクリアランス能力を精製方法に提供する。ロードの電導率およびpHを、抗体がカラムをフロースルーし宿主細胞タンパク質および細胞DNAなどの負に帯電した不純物が正に帯電した樹脂と結合するような様式で選択する。
このクロマトグラフィーステップは、微量レベルのプロセス関連不純物および生産物関連不純物を減少させるために、方法において使用する最終ステップである。抗体のアグリゲートおよび切断断片に加えて、このステップは、宿主細胞の核酸およびタンパク質などのプロセス関連不純物ならびに浸出したプロテインAもまた減少させる。
ナノ濾過ステップの目的は、精製方法に追加のウイルスクリアランス能力を提供することである。このステップにおけるウイルスおよびウイルス様粒子の除去は、サイズ排除機序を介して行われる。フィルターの細孔は、抗体が細孔を通過するが、ウイルス様粒子およびウイルスはフィルターの上流側に保有されるように設計される。
この方法ステップは、生産物を濃縮し、生産物中の緩衝液を、ポリソルベート80を含まないDAC HYP製剤化緩衝液と交換するように設計されている。この方法ステップは、30kDaの名目分画分子量のメンブレンを使用するタンジェンシャルフロー様式で動作する。最終濃度の期待生産物容量および各UF系の相対的保持容積のため、2つの限外濾過/ダイアフィルトレーション段階を使用し、150mg/mLの製剤を生産する。
最終方法ステップは、精製された製剤原料の150または100mg/L±10%の最終標的濃度、すなわち、適切な濃度のポリソルベート80を含有する緩衝液中、150±15mg/mL(150mg/mLの製剤化の場合)または100±10mg/mL(100mg/mLの製剤化の場合)の最終標的濃度への希釈である。製剤化は、段階的に実施される。
DAC HYPを、両方の重鎖サブユニットのアミノ酸296においてグリコシル化し、主要なオリゴ糖形態は、末端のガラクトースを欠いた、コアがフコシル化された二分岐構造として存在する。
DAC HYP製剤原料の外観は、色の視覚的検査ならびに拡大なしの黒色背景および白色背景に対する直射光における溶液の透明度によって査定する。溶液は、目に見える粒子の存在に関してもまた評価する。さまざまなロットのDAC HYP薬剤生産物の通常の外観を表17に記載する。
DAC HYPのpHは、U.S.Pharmacopeia Protocol No.(791)に従って決定する。DAC HYP薬剤生産物のさまざまなロットのpH範囲を、表17に要約する。
DAC HYPの濃度は、UV分光器により決定する。DAC HYP試料を、緩衝液を用いて重量測定法で希釈する。各希釈試料溶液のUV吸光度を、緩衝液ブランクに対して278nmにおいて測定する。試料のタンパク質濃度を、DAC HYPに関する吸光係数を使用して計算する。DAC HYP薬剤生産物のさまざまなロットのタンパク質濃度を、表17に要約する。
DAC HYP150mg/mLロットを、N末端配列決定によって評価した。試料を、自動Edman分解配列決定器を使用して分析した。
DAC HYP150mg/mLロットの重鎖および軽鎖ならびに参照標準RS0801の分子量を液体クロマトグラフィー質量分析(LC−MS)によって評価した。すべてのロットを、アミダーゼPNGaseFを用いて脱グリコシル化させ、ジチオスレイトールを用いて還元し、ヨード酢酸を用いてアルキル化し、逆相クロマトグラフィーにより分離した。理論的な重鎖および軽鎖の質量を、タンパク質配列から計算した。試料の観察された質量は、以下の表18に示すように計算質量の1Da以内であった。
DAC HYP150mg/mLロットおよび参照標準RS0801(10,000L規模で製造された100mg/mLの製剤原料のロットから生産されたDAC HYP)を、逆相HPLCペプチドマッピングを使用して評価した。すべてのロットを、ジチオスレイトールを用いて還元し、ヨード酢酸を用いてアルキル化し、トリプシンを用いて酵素的に消化した。得られたペプチドを、逆相クロマトグラフィーにより分離し、215nmの紫外線吸光度によって検出し、ペプチドマップを作製した。
DAC HYP150mg/mLロットおよび参照標準RS0801を、遠紫外円偏光二色性分光法(遠−UV CD)により分析し、二次構造を評価した。分析前に、試料を、最終タンパク質濃度0.2mg/mLに水を用いて希釈した。スペクトルを、0.1cmのセルを使用して195−260nmから入手し、得られたシグナルを、緩衝液を差し引いた後でモル楕円率に変換した。
DAC HYP150mg/mLロットおよび参照標準RS0801を、紫外(UV)分光法により分析し、三次構造を評価した。分析前に、試料を製剤化緩衝液(40mMのコハク酸塩、100mMの塩化ナトリウム、0.03%のポリソルベート80、pH6.0)で最終タンパク質濃度0.5mg/mlに希釈した。スペクトルを、1cmの路長の石英キュベットを使用して250から350nmから入手し、280nmにおける吸光度を1.0とし正規化した。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、水系移動相を有する多孔質シリカカラムおよび280nmの紫外吸光度を検出を用いて実施した。具体的には、15μLの試験試料(溶出緩衝液中20mg/mLの抗体)を、室温において、0.5μmプレカラムフィルター(Upchurch、part no.A−102X)を装備した7.8mm×30cmのTSK G3000SWXLカラム(Tosoh Biosciences、part no.601342)において、溶出緩衝液(200mMのKPO4、150mMのKCl、pH6.9)の均一濃度の勾配を使用して、1mL/分の流速で分析した。
DAC HYP150mg/mLおよび100mg/mLのロット中の単量体およびアグリゲートを、沈降速度超遠心分析法(SV−AUC)を使用して特徴付けた。単量体および個々のアグリゲートに関する沈降係数値および相対的存在度を、以下の表20および21に提示する。
純度を、4−20%(通常14%)のtris−グリシンゲルおよびコロイダルブルー染色を使用して、SDS−PAGEによって決定した。試料を、還元条件下で10μgの試料ロードを用いて分析した。純度を、密度測定によって測定された、重鎖および軽鎖のバンド面積の合計を全バンド面積で割ることによって計算した。
DAC HYPの純度を、還元型および非還元型のゲル電気泳動の両方によって査定した。プレキャストの14%または8−16%のTris−グリシンゲルを分析に使用した。150mg/mL DAC HYP製剤の2種のバッチ由来のアリコートを、前述のように参照バッチと比較した。DAC HYPの純度を分析する還元型および非還元型ゲルを、図17に示す。150mg/mLロットのバンドパターンは、参照標準RS0801のバンドパターンと同様であり、150mg/mLロットに新しいバンドは検出されなかった。
DAC HYP150mg/mLロットおよび100mg/mLロットの荷電アイソフォームの分布を、陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)を使用して評価した。CEXを、非多孔質のカルボン酸塩官能化の、弱陽イオン交換カラムを使用して実施し、220nmにおいて検出した。100μLの試験試料(緩衝液Aに溶解した1mg/mLの抗体)を、室温で、ProPac WCX−10Gガードカラム(Dionex Corporation)を装備したProPac WCX−10カラム(Dionex Coporation)において以下の分離勾配を使用して(カラムは緩衝液Aを用いて平衡化される)分離した。
DAC HYP150mg/mLロットおよび100mg/mLロットのオリゴ糖の分布を、オリゴ糖マッピングにより評価した。N連結オリゴ糖は、重鎖Asn296からアミダーゼPNGaseFを使用して酵素的に放出された。オリゴ糖を、続いて蛍光標識(この場合、アンスラニル酸)を用いて誘導体化し、ナイロンメンブレンを介して抗体から分離した。誘導体化され、切断されたN連結グリカンを、50℃で、250×4.6mmの高分子アミン結合Asahipak Amino NH2P−504Eカラム(粒径5μm、Phenomenex、カタログ番号CHO−2628)において蛍光検出を用いて、以下の溶出勾配(試料注入容積100μL;カラムは85%の緩衝液A/15%の緩衝液Bを用いて平衡化する)を使用して分離した。
DAC HYP ロットを、ペプチドマップ中に存在する、酸化および非酸化トリプシンペプチドをモニターすることによって、潜在的なメチオニンの酸化を評価した。ペプチドを含有する個々のメチオニンの非酸化型および酸化型のピーク面積を、質量スペクトルにより抽出されたイオンクロマトグラムを使用して決定した。個々のメチオニン残基に関して、酸化メチオニンのパーセントを、酸化ペプチドの質量スペクトルピーク面積を、酸化および非酸化ペプチドのピーク面積の合計で割ることによって計算した。
DAC HYP150mg/mLおよび100mg/mLのロットを、放出試験の一部の効力の測定として、ELISAを介してIL−2受容体のアルファサブユニット(CD25)との結合に関して評価した。マイクロタイタープレートに可溶性CD25を固定し、さまざまな量のDAC HYPと一緒にインキュベートした。結合したDAC HYPを、ホースラッディシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG抗体と、3,3’,5,5’−テトラ−メチルベンジジン基質とを並行して使用して検出した。得られた吸光度値を、4−パラメーターフィットを使用してlog10のDAC HYP濃度に対してプロットし、相対効力値のパーセントを、平行線分析を使用して作製した。
表面プラズモン共鳴分析を実施し、DAC HYPとIL−2受容体のアルファサブユニット(CD25)との結合相互作用に関する親和定数(KD)を決定した。
DAC HYP150mg/mLおよび100mg/mLのロットを、放出試験の一部として機能的効力を評価した。機能的効力のアッセイは、DAC HYPがIL−2受容体のアルファサブユニット(CD25)と結合することによる、IL−2誘導性T細胞増殖の阻害を測定する。IL−2の存在下で、さまざまな量のDAC HYPをIL−2受容体を発現するKIT−225K6細胞(Horiら、1987年、Blood70:1069−1072頁)と一緒にインキュベートした。DAC HYPによるT細胞増殖の阻害を、アラマーブルーを使用して続けて検出した。得られた蛍光値を、4−パラメーターフィットを使用してlog10のDAC HYP濃度に対してプロットし、相対効力値のパーセントを、平行線分析を使用して作製した。
DAC HYP150mg/mL製剤の2種のロットを、参照標準RS0801の100mg/mL DAC HYPのロットと比較して評価した。
残存プロテインAはELISA法によって決定でき、標準、試料対照、プレートブランクおよび試験試料を、変性緩衝液を用いて希釈し、プロテインAを解離させるために沸騰水のバスに配置し、変性させ、ダクリズマブを沈降させた。沸騰後、標準、対照および試料を冷却し、遠心分離にかけ、ポリクローナル抗プロテインA捕捉抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートに加えた。試料中に存在する残存プロテインAを、その後、ビオチン化抗プロテインA抗体と並行してストレプトアビジンアルカリホスファターゼおよびP−ニトロフェニルリン酸塩(PNPP)基質を使用して検出する。プレートを、分光光度プレートリーダーにおいて分析し、log−log標準曲線を作製し、これに対してプロテインAの濃度を決定する。試験試料の結果を、百万分率(ppm)単位で報告する。百万分率の結果はng/mLのプロテインAの結果を、mg/mLの試験試料の抗体濃度で割ることによって計算する。
マウスDNAの検出を、契約研究所において定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q−PCR)試験法を使用して決定する。この方法において、試料をDNA抽出に供する。その後、試料抽出液を、マウスDNAの反復成分の特異的断片を増幅するためにマウス特異的プライマーおよびプローブを使用して、Q−PCRによって分析する。DNAの増幅は検出される蛍光シグナルをもたらす。試料中のDNAを、既知の量のマウスDNAを使用して作製した標準曲線と比較することによって測定する。結果は、DNAのピコグラム/抗体のミリグラムで表す。さまざまなロットのDAC HYP薬剤生産物中の平均DNA含有量を、表17に要約する。
生産物中の残存宿主細胞タンパク質を、市販のキットを使用して定量する。NS0細胞溶解物に対する、アフィニティ精製したヤギポリクローナル抗体を、NS0 HCPの捕捉および検出の両方に使用する。HCP標準を、疑似的生産工程から無細胞収穫材料を回収することによって生産する。HCP作業標準を使用して標準曲線を作製し、HCPを含有する試料を、標準曲線の範囲を標的として段階的に希釈する。標準、試料対照および試験試料を、抗NS0 HCPポリクローナル抗体コーティングプレートに加える。その後、宿主細胞タンパク質を、ホースラッディシュペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした抗NS0 HCPポリクローナル抗体と並行して3,3’,5,5’−テトラ−メチルベンジジン(TMB)基質を用いて検出する。次いで、プレートを、分光光度プレートリーダーにおいて分析し4つのパラメーターカーブフィットを作製し、試料中のHCPの量を定量する。
ポリソルベート80は、有色のチオシアン酸コバルトとポリソルベート80の複合体の形成に基づく分光光度方法を使用して定量する。標準曲線を、一連のポリソルベート80標準を使用して構築する。試料中のポリソルベート80濃度を、標準曲線から決定する。DAC HYP薬剤生産物のさまざまなロットのポリソルベート濃度範囲を、表17に要約する。
浸透圧は、蒸気圧降下浸透圧計を使用して測定する。試料分析の前に、浸透圧計を、試料の予想浸透圧を一括する浸透圧標準を使用して較正する。DAC HYP薬剤生産物のさまざまなロットの浸透圧範囲を表17に要約する。
実施された物理化学的および生物学的分析は、DAC HYP150mg/mLおよびDAC HYP100mg/mL製剤の総合評価を提供する。今までのところ、すべての被験ロットの物理化学的および生物学的特徴は同様である。
pE/pE:31−46%
pE/Q:7−12%
pE/VHS:31−42%
Q/VHS:3−12%
VHS/VHS:1−17%
CEXによるC末端アイソフォーム:
0K:53−80%
1K:14−28%
2K:5−19%
DAC HYPのN連結グリカンの分布は以下の通りである。
G0−G1cNAc:7.2−14.6%
G0:80.9−88.2%
ピーク3:1.3−1.7%
G1:1.4−3.8
DAC HYPに関して測定された酸化レベルは低かった。
高濃度のDAC HYP製剤は貯蔵において安定である。以下の表は、150mg/mL DAC HYP製剤原料ロットに関する安定性データを提供する。
Hoffman−La Roche,Inc.(「Roche」)は、ZENAPAX(商標)という商品名で販売される、製造中止となっている同種移植の拒絶反応治療用ダクリズマブの静注製剤を製造した。DAC Penzbergは、PDL BioPharmaによる臨床試験に使用されるダクリズマブの100mg/mlの皮下製剤である(以下のセクション5.9.1に記載のCHOICE研究を参照されたい)。
5.9.1.CHOICE研究
CHOICE試験は、230例の再発性MS患者においてインターフェロンベータ療法に加えた、ダクリズマブの第2相、ランダム化、二重盲検、プラセボ対照試験であった。この試験は、皮下注射として投与した100mg/mlのDAC Penzberg(生産品の説明に関する上記のセクション5.8を参照されたい)の2種の投与計画:1mg/kgのダクリズマブを4週間ごとに投与、および2mg/kgダクリズマブを2週間ごとに投与、を試験した。この研究の結果は、インターフェロンベータ療法に2mg/kgで2週間ごとに投与するダクリズマブを加えることによって、インターフェロンベータ療法単独と比較して、新しい、または拡大したガドリニウム増強病巣が24週目に有意に縮小されることを示した。
ランダム化二重盲検プラセボ対照用量範囲探索試験(SELECT)を実施し、DAC HYPの2種の異なる投薬量レベルの安全性および有効性を決定した。
全研究集団および8から24週の間に実施される月1回のMRIによるサブセットの両方
において減少させた(表36)。臨床的エンドポイントと対照的に、有効性のこのポイントの推定値は、潜在的ベースラインの不均衡を調整後でも、150mg用量群と比較して300mg用量群においてわずかに強かった。縦モード解析は、Gd+病巣の活性が、治療の最初の2、3か月は300mg用量群と比較して150mg用量群において高かったが、52週には類似であったことを実証した(表36)。1つの排除研究現場由来の21例の患者を含んだ感度分析は、すべての有効性分析に関して類似の結果を得た。
本開示の様々な態様は、以下の番号付きパラグラフに述べられる実施形態に記載されている。
1.無血清および無コレステロール培地において増殖するよう適応されており、組換えタンパク質を発現するよう操作されている、無血清および無コレステロール培地において増殖される場合、10日間のフェドバッチ法において100Lの培養物中100mg/L/日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる改変されたNS0細胞。
2.コレステロールおよび動物由来成分のない培地において増殖される場合、10日間のフェドバッチ法において1,000Lの培養物中100mg/L/日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、実施形態1に記載の改変されたNS0細胞。
3.コレステロールおよび動物由来成分のない培地において増殖される場合、10日間のフェドバッチ法において16,000Lの培養物中100mg/L/日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、実施形態1に記載の改変されたNS0細胞。
4.流加培地が、追加される容積が最初の細胞培養物容積の割合を表す、次のスケジュール:
5.13日間のフェドバッチ法において少なくとも100Lの培養物中200mg/L/日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、実施形態1に記載の改変されたNS0細胞。
6.無コレステロール培地において増殖される場合、13日間のフェドバッチ法において1,000Lの培養物中200mg/L/日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、実施形態5に記載の改変されたNS0細胞。
7.無血清および無コレステロール培地において増殖される場合、10日間のフェドバッチ法において16,000Lの培養物中100mg/L/日の組換えタンパク質を超える容積生産性を達成することができる、実施形態5に記載の改変されたNS0細胞。
8.抗CD25モノクローナル抗体を発現するのに有用な核酸で安定的にトランスフェクトされる、実施形態1に記載の改変されたNS0細胞。
9.抗CD25モノクローナル抗体が、配列番号2の21位から233位に配列が一致するVL鎖および配列番号4の20位から465位に配列が一致するVH鎖を含む、実施形態8に記載の改変されたNS0細胞。
10.ベクターpAbX.gptを用いて形質転換された、実施形態1に記載の改変されたNS0細胞。
11.ベクターpHAT.IgG1.rg.dEを用いて形質転換された、実施形態1に記載の改変されたNS0細胞。
12.クローン7A11−5H7−14−43で表される実施形態1に記載の改変されたNS0細胞。
13.実施形態1−12のいずれか1つに記載の改変されたNS0細胞を培養することを含む、組換えタンパク質を生産する方法。
14.10日間のフェドバッチ法において100L、1,000Lもしくは16,000Lの培養物中少なくとも100mg/L/日の組換えタンパク質を、または13日間のフェドバッチ法において100L、1,000Lもしくは16,000Lの培養物中少なくとも200mg/L/日の組換えタンパク質を生産する条件下で、改変されたNS0細胞が培養される、実施形態13に記載の方法。
15.改変されたNS0細胞が、血清およびコレステロールの非存在下で培養される、実施形態13または実施形態14に記載の方法。
16.改変されたNS0細胞が、トロポロンおよびヒドロコルチゾンの非存在下で培養される、実施形態15に記載の方法。
17.改変されたNS0細胞が、10−35g/Lグルコースを含有する基本および/または流加培地において培養される、実施形態13または実施形態14に記載の方法。
18.改変されたNS0細胞が、15g/Lグルコースを含有する基本培地および/または28g/Lグルコースを含有する流加培地において培養される、実施形態17に記載の方法。
19.基本培地が、PFBM2±10%成分で構成されている、実施形態18に記載の方法。
20.流加培地が、PFFM3±10%成分で構成されている、実施形態18に記載の方法。
21.細胞が基本培地において1−3日間、次に流加培地において10−13日間培養される実施形態19または実施形態20に記載の方法。
22.流加培地が、表7において概要が述べられているスケジュール±10%に従って追加される、実施形態18に記載の方法。
23.哺乳動物細胞において作動可能である選択可能なマーカーの発現を推進する弱いプロモーターおよび対象のタンパク質の発現を推進する強いプロモーターを含む、対象のタンパク質を組換え的に発現するのに有用なベクター。
24.対象のタンパク質が治療抗体である、実施形態23に記載のベクター。
25.治療抗体が抗CD25抗体である、実施形態24に記載のベクター。
26.CD25抗体がダクリズマブのCDRを含む、実施形態25に記載のベクター。
27.CD25抗体がダクリズマブである、実施形態26に記載のベクター。
28.細胞に実施形態23−27のいずれか1つに記載のベクターをトランスフェクトし、10日間のフェドバッチ法において100L、1,000Lもしくは16,000Lの培養物中少なくとも100mg/L/日対象のタンパク質を、または13日間のフェドバッチ法において100L、1,000Lもしくは16,000Lの培養物中少なくとも200mg/L/日の組換えタンパク質を生産することができる細胞を選択することを含む、対象のタンパク質の高い容積生産性を有する哺乳動物宿主細胞を得るための方法。
29.ダクリズマブがpE/Q重鎖N連結アイソフォームおよび/またはQ/VHS重鎖N末端アイソフォームの存在により特徴付けられる、ダクリズマブを含む組成物。
30.pE/Q重鎖N末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ6−15%を構成する、実施形態29に記載の組成物。
31.pE/Q重鎖N末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ7−12%を構成する、実施形態29に記載の組成物。
32.Q/VHS重鎖N末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ1−15%を構成する、実施形態29−31のいずれか1つに記載の組成物。
33.Q/VHS重鎖N末端アイソフォームがダクリズマブのおよそ3−12%を構成する、実施形態32に記載の組成物。
34.ダクリズマブの重鎖が次のN末端アイソフォーム:
36.ダクリズマブが、図18のアイソフォームプロファイルと実質的に類似する陽イオン交換クロマトグラフィーアイソフォームプロファイルにより特徴付けられる、実施形態29に記載の組成物。
37.ダクリズマブがDAC HYPである、実施形態29に記載の組成物。
38.1つがオリゴ糖G0−GlcNAcに一致し1つがオリゴ糖G0に一致する2つの主要ピークを含有するN連結グリコシル化HPLCプロファイルによりダクリズマブが特徴付けられ、これら2つのピークの合わせたAUCが全ピークの総AUCのうちの約88−99.5%を構成する、ダクリズマブを含む組成物。
39.G0−GlcNAcピークのAUCが全ピークの総AUCのうちの約5−18%を構成し、G0ピークのAUCが全ピークの総AUCのうちの約75−92%を構成する、実施形態38に記載の組成物。
40.G0−GlcNAcピークのAUCが全ピークの総AUCのうちの約6−16%を構成し、G0ピークのAUCが全ピークの総AUCのうちの約78−90%を構成する、実施形態39に記載の組成物。
41.N連結グリコシル化プロファイルが約3%未満のMan5を有する、実施形態38−40のいずれか1つに記載の組成物。
42.N連結グリコシル化プロファイルが約0.5%未満のG2、Man6および/またはMan7を有する、実施形態41に記載の組成物。
43.N連結グリコシル化プロファイルがシアル酸付加オリゴ糖に一致する第三のピークを含有し、シアル酸付加オリゴ糖ピークのAUCが全ピークの総AUCのうちの1%以下を構成する、実施形態38に記載の組成物。
44.N連結グリコシル化プロファイルがオリゴ糖G1に一致する第三のピークを含有し、G1ピークのAUCが全ピークの総AUCのうちの約1−5%を構成する、実施形態38に記載の組成物。
45.G1ピークのAUCが全ピークの総AUCのうちの約1−2%を構成する、実施形態44に記載の組成物。
46.ダクリズマブが、図19のプロファイルにまたは図21の下のパネルのプロファイルに実質的に類似しているN連結グリコシル化HPLCプロファイルを有する、実施形態38に記載の組成物。
47.ダクリズマブがDAC HYPである、実施形態38に記載の組成物。
48.1μg/mLのダクリズマブ濃度および約25対1のエフェクター細胞対標的細胞比で、少なくとも3体の健康なドナー由来のエフェクター細胞および標的細胞としてKit225 K6細胞を使用して、インビトロ細胞アッセイにおいて測定される場合、35%未満のADCC平均細胞傷害性を示すダクリズマブを含む組成物。
49.ダクリズマブが、前記アッセイにおいて10%から30%のADCC平均細胞傷害性を示す、実施形態48に記載の組成物。
50.前記アッセイが少なくとも6体の健康なドナー由来のエフェクター細胞を使用する、実施形態48または実施形態49に記載の組成物。
51.前記アッセイが少なくとも10体の健康なドナー由来のエフェクター細胞を使用する、実施形態48または実施形態49に記載の組成物。
52.ダクリズマブがDAC HYPである、実施形態48−51のいずれか1つに記載の組成物。
53.約150−190mg/mLのダクリズマブ、ならびに希釈緩衝液を用いた組成物の希釈により約85−165mg/mLのダクリズマブを含有し、約267−327mOsm/kgの範囲の浸透圧および25℃で約pH5.8−6.2の範囲のpHを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約95%が単量体形態である希釈組成物を生じるような量の賦形剤を含む、ダクリズマブ製剤を作製するのに有用な組成物。
54.希釈緩衝液で希釈される場合、希釈組成物が約85−115mg/mLのダクリズマブを含有するような量の賦形剤を含有する、実施形態53に記載の組成物。
55.希釈緩衝液で希釈される場合、希釈組成物が約150±15mg/mLのダクリズマブを含有するような量の賦形剤を含有する、実施形態53に記載の組成物。
56.ダクリズマブの0.1%以下がアグリゲート形態である、約4から15mg/mLのダクリズマブを含む組成物。
57.ダクリズマブの最大2.5%がアグリゲート形態である、約4から15mg/mLのダクリズマブを含むダクリズマブ組成物を、弱陽イオン交換樹脂上のカラムクロマトグラフィーにより精製することによって得られる、実施形態56に記載の組成物。
58.弱陽イオン交換樹脂がCM−650Mである、実施形態57に記載の組成物。
59.CM−650M樹脂が約20mMのクエン酸ナトリウムを含有する平衡化緩衝液、pH4.4−4.6と平衡化しており、ダクリズマブが約20mMのクエン酸ナトリウムおよび約75mMの硫酸ナトリウムを含有する溶出緩衝液、pH4.4−4.6を用いて溶出される、実施形態58に記載の組成物。
60.クロマトグラフィーが、約10−30cmまたは約17−19cmの高さを有する樹脂床を使用して円筒形カラムにおいて実施され、ダクリズマブが約4−22℃または約18−22℃の範囲の温度で、約50−200cm/時または90−110cm/時の範囲の流速で溶出される、実施形態59に記載の組成物。
61.約85−165mg/mLのダクリズマブおよび約0.02−0.04%(w/v)ポリソルベート80を含み、約267−327mOsm/kgの範囲の浸透圧および25℃で約pH5.8−6.2の範囲のpHを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約95%が単量体形態である、ヒトに投与するのに適している組成物。
62.サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約99%が単量体形態である、実施形態61に記載の組成物。
63.約85−115mg/mLのダクリズマブを含む、実施形態61に記載の組成物。
64.約100mg/mLのダクリズマブ、約40mMのコハク酸ナトリウム、約100mMの塩化ナトリウムおよび約0.03%(w/v)ポリソルベート80から本質的になり、25℃で約6.0のpHを有する、実施形態63に記載の組成物。
65.約135−165mg/mLのダクリズマブを含む、実施形態61に記載の組成物。
66.約150mg/mLのダクリズマブ、約40mMのコハク酸ナトリウム、約100mMの塩化ナトリウムおよび約0.03%(w/v)のポリソルベート80から本質的になり、25℃で約6.0のpHを有する、実施形態65に記載の組成物。
67.約4から15mg/mLのダクリズマブを含むダクリズマブ組成物を適切な緩衝液中での限外濾過により濃縮して、約85−180mg/mLの範囲のダクリズマブ濃度を達成するステップ、および、場合によって、濃縮された組成物を希釈緩衝液で希釈するステップを含む方法により得られる、実施形態65に記載の組成物。
68.約85−165mg/mLのダクリズマブを含み、約2−8℃の範囲の温度での約12ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態中のダクリズマブの百分率が約3%を超えない、皮下投与に適している医薬組成物。
69.約85−115mg/mLのダクリズマブを含む、実施形態68に記載の医薬組成物。
70.約135−165mg/mLのダクリズマブを含む、実施形態68に記載の医薬組成物。
71.約2−8℃の範囲の温度での約12ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態中のダクリズマブの百分率が約2%を超えない、実施形態69または実施形態70に記載の医薬組成物。
72.約2−8℃の範囲の温度での約18ヶ月の期間の貯蔵後にアグリゲート形態中のダクリズマブの百分率が約3%を超えない、実施形態69または実施形態70に記載の医薬組成物。
73.(i)組換えタンパク質を発現し分泌する細胞培養物のpHを、約pH4.5−5.5の範囲のpHに調整するステップ、
(ii)pH調整された細胞培養物を約4から15℃の範囲の温度で約30−90分間インキュベートするステップ、および
(iii)インキュベートされたpH調整細胞培養物を遠心分離して細胞残渣を除去するステップ
を含む、細胞培養物から組換えタンパク質を収穫するための方法。
74.(i)未精製ダクリズマブ調製物から親和性クロマトグラフィー樹脂上にダクリズマブを吸着させるステップ、
(ii)親和性クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して混入物を除去するステップ、
(iii)吸着したダクリズマブを溶出緩衝液で溶出させるステップ、
(iv)pHを約3−4の範囲のpHに調整することにより溶出液中のウイルスを不活化し、pH調整された溶出液を規定温度でウイルスを不活化するのに十分な期間インキュベートするステップ、
(v)ウイルス不活化溶出液を約pH7.7−7.9(25℃で測定される)の範囲のpHまで中和するステップ、
(vi)中和された溶出液を強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通して流すステップ、
(vii)ステップ(vi)の溶出液のダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂上に吸着させるステップ、および
(viii)吸着したダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出させるステップ
を含む、精製されたダクリズマブ組成物を生産するための方法。
75.未精製ダクリズマブ調製物が細胞培養物から収穫される、実施形態74に記載の方法。
76.未精製ダクリズマブ調製物は、ダクリズマブが培養培地中に分泌される条件下で宿主細胞7A11−5H7−14−43を培養することと、分泌されたダクリズマブを収穫することにより得られる、実施形態74に記載の方法。
77.ダクリズマブが実施形態73に記載の方法を使用して収穫される、実施形態76に記載の方法。
78.(ix)ステップ(viii)の溶出されたダクリズマブ組成物を濾過して、ウイルスを除去するステップ、および
(x)濾過された溶液を限外濾過により濃縮して、約85−180mg/mLのダクリズマブを含む精製されたダクリズマブ組成物を産出するステップ
をさらに含む、実施形態74に記載の方法。
79.約85−165mg/mLのダクリズマブおよび約0.02−0.04%(w/v)のポリソルベート80を含み、約267−327mOsm/kgの範囲の浸透圧および25℃で約pH5.8−6.2の範囲のpHを有し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定される場合、ダクリズマブの少なくとも約95%が単量体形態である組成物が得られるように、精製されたダクリズマブ組成物を希釈緩衝液で希釈するステップをさらに含む、実施形態78に記載の方法。
80.得られる組成物が、ダクリズマブの組換え供給源由来の50ppm未満の宿主細胞タンパク質、10ppm未満のプロテインAを有し、組成物中のダクリズマブの3%以下がアグリゲート形態である、実施形態79に記載の方法。
81.基本培地PFBM2。
82.流加培地PFFM3。
83.ダクリズマブが培養培地中に分泌される条件下で、実施形態1−11のいずれか1つに記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法により得られる、ダクリズマブ組成物。
84.方法が、分泌されたダクリズマブを細胞培養培地から単離するステップをさらに含む、実施形態83に記載のダクリズマブ組成物。
85.約100−500mMのクエン酸ナトリウム、約10−30mMのNaOHおよび約0.5−3%(v/v)ベンジルアルコールを含む、プロテインA親和性クロマトグラフィー樹脂を衛生化するのに有用な緩衝液。
86.カラムを衛生化するのに十分な流速でおよび期間、実施形態85に記載の衛生化緩衝液を用いてカラムを洗浄することを含む、プロテインA親和性クロマトグラフィーカラムを衛生化する方法。
87.カラムを、約150cm/時の流速でおよそ1.8カラム容積の衛生化緩衝液を用いて洗浄し、洗浄されたカラムが約30−45分の期間流動なしでインキュベートされ、次に平衡化緩衝液を用いて平衡化される、実施形態86に記載の方法。
88.平衡化緩衝液が、約20mMのクエン酸ナトリウムおよび150mMのNaClを含み、約pH7(25℃で)のpHを有する、実施形態87に記載の方法。
89.治療効果を与えるのに十分な量のDAC HYP組成物を患者に投与することを含む、多発性硬化症に罹っている患者を治療する方法。
90.DAC HYP組成物が静脈内投与される、実施形態89に記載の方法。
91.DAC HYP組成物が、約0.8−0.9mg/kgのDAC HYPに一致する量で投与される、実施形態90に記載の方法。
92.DAC HYP組成物が、約1mg/kgのDAC HYPに一致する量で投与される、実施形態91に記載の方法。
93.DAC HYPが、少なくとも6週間、少なくとも12週間、少なくとも24週間の期間、週あたり1回投与される、実施形態89−92のいずれか1つに記載の方法。
94.DAC HYPが単独療法として投与される、実施形態89−93のいずれか1つに記載の方法。
95.患者がインターフェロンベータを用いた前治療に無効果であったかまたはインターフェロンベータを用いた前治療を中止している、実施形態94に記載の方法。
96.DAC HYPがインターフェロンベータに対して補助的に投与される、実施形態89から93のいずれか1つに記載の方法。
97.前記DAC HYP組成物が皮下投与される、実施形態89に記載の方法。
98.DAC HYP組成物が、約1mg/kgのDAC HYPに一致する量で投与される、実施形態97に記載の方法。
99.DAC HYP組成物が2週間に1回投与される、実施形態98に記載の方法。
100.DAC HYP組成物が計約24週間投与される、実施形態99に記載の方法。
101.DAC HYP組成物が、約2mg/kgのDAC HYPに一致する量で投与される、実施形態97に記載の方法。
102.DAC HYP組成物が、4週間に1回投与される、実施形態101に記載の方法。
103.DAC HYP組成物が、計約24週間投与される、実施形態102に記載の方法。
104.DAC HYP組成物が、75mgから300mgのDAC HYPに一致する量で投与される、実施形態103に記載の方法。
105.DAC HYP組成物が、150mgに一致する量で投与される、実施形態104に記載の方法。
106.DAC HYP組成物が、300mgに一致する量で投与される、実施形態104に記載の方法。
107.DAC HYP組成物が、4週間に1回投与される、実施形態103−106のいずれか1つに記載の方法。
108.DAC HYP組成物が、計少なくとも48週間投与される、実施形態107に記載の方法。
109.DAC HYPが単独療法として投与される、実施形態103−108のいずれか1つに記載の方法。
110.患者がインターフェロンベータを用いた前治療に無効果であったかまたはインターフェロンベータを用いた前治療を中止している、実施形態109に記載の方法。
111.DAC HYPがインターフェロンベータに対して補助的に投与される、実施形態103−108のいずれか1つに記載の方法。
112.(i)組換えタンパク質を発現し分泌する細胞培養物のpHを、約pH4.5−5.5の範囲のpHに調整するステップ、
(ii)pH調整された細胞培養物を約4から15℃の範囲の温度で約30−90分間インキュベートするステップ、および
(iii)インキュベートされたpH調整細胞培養物を遠心分離して細胞残渣を除去するステップ
を含む方法により細胞培養物から得られるまたは得られることが可能な、組換えタンパク質。
113.(i)未精製ダクリズマブ調製物から親和性クロマトグラフィー樹脂上にダクリズマブを吸着させるステップ、
(ii)親和性クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝液で洗浄して混入物を除去するステップ、
(iii)吸着したダクリズマブを溶出緩衝液で溶出させるステップ、
(iv)pHを約3−4の範囲のpHに調整することにより溶出液中のウイルスを不活化し、pH調整された溶出液を規定温度でウイルスを不活化するのに十分な期間インキュベートするステップ、
(v)ウイルス不活化溶出液を約pH7.7−7.9(25℃で測定される)の範囲のpHまで中和するステップ、
(vi)中和された溶出液を強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通して流すステップ、
(vii)ステップ(vi)の溶出液のダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂上に吸着させるステップ、および
(viii)吸着したダクリズマブを弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出させるステップ
を含む方法により得られるまたは得られることが可能な、精製されたダグリズマブ組成物。
114.実施形態74−80のいずれか1つに記載の方法により得られるまたは得られることが可能な、精製されたダグリズマブ組成物。
Claims (8)
- ベクターpHAT.IgG1.rg.dEを用いて安定に形質転換されている哺乳動物細胞。
- 前記細胞がマウス骨髄腫細胞である、請求項1に記載の細胞。
- 前記細胞がNS0細胞である、請求項2に記載の細胞。
- 請求項1に記載の細胞を培養して抗CD25抗体を生成する、抗CD25モノクローナル抗体を生成する方法。
- 前記細胞が血清およびコレステロールの非存在下で培養される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が、動物由来の成分の非存在下で培養される、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞が約7.0のpHで培養される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が、10−35g/Lグルコースを含有する基本および/または流加培地において培養される、請求項4に記載の方法。
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