CN102796705A - Dac hyp组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开的内容涉及适合皮下施用的达珠单抗组合物及其制造方法。

Description

DAC HYP组合物和方法
1.发明背景
达珠单抗(Daclizumab，DAC)是人源化IgG1单克隆抗体，结合人高亲和性白介素-2(IL-2)受体α亚基(CD25或Tac)，其在活化的而不是静息的t-和B-淋巴细胞表面表达。当与活化的细胞上的CD25结合时，DAC阻断高亲和力IL-2受体复合物的形成，从而阻断IL-2诱导的活化细胞的增殖。
如对PHA胚细胞的直接结合测试所测定，DAC以0.3nM的近似结合亲和力(KD)与CD25结合，并以剂量依赖的方式抑制PHA胚细胞增殖(Hakimi等，1993，J.Immunol.151(2)：1075-85)。在次最优的IL-2剂量(2.5ng/mL)下，15nM DAC对IL-2依赖性细胞系Kit225/K6的增殖抑制了50％(Pilson等，1997，J.Immunol.159(3)：1543-56)。在IL-2依赖性、抗原诱导的T细胞增殖测试中，使用0.5-1μg/mL(3-7nM)范围内的DAC时观察到50％的增殖抑制(Junghans等，1990，Cancer Res.50(5)：1495-502)。
一种形式的DAC之前由Hoffman-La公司以ZENAPAXTM的商品名上市销售，其用作免疫抑制方案(包括环孢素和皮质类固醇)的佐剂以治疗肾移植患者的急性同种异体移植物排斥。ZENAPAX被提供为用于进一步稀释且静脉施用的浓缩物。每管浓缩物含有5mL溶液，所述溶液含有5mg/mL DAC、3.6mg/mL一水合磷酸二氢钠、11mg/mL十二水合磷酸氢二钠、4.6mg/mL氯化钠、0.2mg/mL聚山梨酯80以及足以将pH调节至pH 6.9的HCl和/或NaOH。成人和儿童患者推荐剂量为1.0mg/kg，其通过使用50mL无菌的0.9％氯化钠溶液稀释经计算的体积的25mg/5mL ZENAPAX浓缩物，并在15分钟的时间内通过外周或中央静脉进行静脉内施用来实现。
DAC还显示出治疗葡萄膜炎(Nussenblatt等，2004，FOCIS 2004meeting；Jul 18-23，Montreal，QC.Abstract 4688；Nussenblatt等，2003，J.Autoimmun.21：283-93)和多发性硬化症(参见如Bielekova等，2004，Proc.Nat′I.Acad.Sci.USA 101(23)：8705-8708；Rose等，2007，Neurology 69：785-789；美国专利No.7,258,859)的效力，目前治疗多发性硬化症的课题正在进行临床实验。尽管已经证实DAC是安全且有效的，仍希望获得具有长储存寿命并且无需进一步配制或操作即可方便地施用的高浓度液体制剂，以及与ZENAPAX DAC相比具有改进特性(如安全性增强)的新的达珠单抗分子。
2.发明简述
如发明背景部分提到的，达珠单抗是与人白介素-2受体(IL-2R)α亚基(也被称为CD25或Tac)特异性结合的人源化IgG1抗体，所述人白介素-2受体是淋巴细胞活化的重要介导者。一种形式的达珠单抗之前由Hoffman-La公司以ZENAPAXTM的商品名上市销售，当其用作免疫抑制方案(包括环孢素和皮质类固醇)的佐剂时，其在治疗肾同种异体移植物排斥中显示是安全且有效的(参见如欧洲药品局(“EMEA”)对ZENAPAX的市场授权)，在治疗多发性硬化症中也显示有效(参见如Bielekova等，2004，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 101(23)：8705-8708；Rose等，2007，Neurology 69：785-789；美国专利No.7,258,859)。根据EMEA，ZENAPAX DAC在GS-NS0(鼠骨髓瘤)细胞中表达，并利用包括Q-Sepharose层析、S-Sepharose层析、渗滤、Q-Sepharose II层析、超滤、S-300凝胶过滤层析和超滤的过程进行纯化。现在已经发现在无血清、无胆固醇和无其他动物产物的培养基中适应性生长的NS0细胞系中表达并通过不同的过程分离的达珠单抗具有不同于、在某些情况下优于ZENAPAX达珠单抗(“ZENAPAX DAC”)的特性和性质。这种新的达珠单抗在本文中被称为DAC HYP，其具有：与ZENAPAX DAC不同的同等型谱(如通过阳离子交换层析所确定)；与ZENAPAX DAC不同的N-连接的糖基化谱(即使两种形式的达珠单抗均在NS0细胞中表达)；和在生物测试中低于ZENAPAX DAC的ADCC细胞毒性。
如，达珠单抗的同等型可能源于重链N-和C-末端的异质性。达珠单抗成熟VH链的氨基酸序列起始于图2所示氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的位置20。成熟VH链的N-末端谷氨酰胺(Q)(图2中粗体、下划线文本)可以环化，形成焦谷氨酸(pE)。在某些情况下，信号肽序列可以截短，剩余与成熟VH链的N-末端谷氨酰胺残基相连的缬氨酸-组氨酸-丝氨酸(VHS)序列。由于每个达珠单抗分子包含两条VH链，达珠单抗的多种N-末端同等型可以包括含有以下的形式：(1)两个谷氨酰胺残基(Q/Q)；(2)一个谷氨酰胺残基和一个VHS序列(Q/VHS或VHS/Q)；(3)两个VHS序列(VHS/VHS)；(4)一个谷氨酰胺残基和一个焦谷氨酸残基(Q/pE或pE/Q)；(5)一个焦谷氨酸残基和一个VHS序列(pE/VHS或VHS/pE)；和(6)两个焦谷氨酸残基(pE/pE)。还可能有不同的C-末端同等型，其含有0、1或2个C-末端赖氨酸(K)残基(0K，1K或2K)，产生复杂的同等型谱。
相当令人惊奇的是，当ZENAPAX DAC VH链的N末端谷氨酰胺完全环化为焦谷氨酸时，DAC HYP并没有达到完全环化。因此DAC HYP阳离子交换层析的特征在于pE/Q同等型峰和Q/VHS同等型峰。尽管不希望受任何理论的束缚，据信这些独特的pE/Q和Q/VHS同等型可以受到用于表达DAC HYP的先导序列的影响。因此，在一个方面中，本文公开的内容提供了一种达珠单抗组合物，如阳离子交换层析所确定，其中pE/Q同等型占N-末端同等型的3％-17％、3％-15％、5％-15％，更优选5％-12％或7％-12％，和/或其中Q/VHS同等型占N-末端同等型的1％-15％，更优选3％-12％。
在某些实施方式中，达珠单抗组合物的特征在于与图18或图23的DACHYP曲线基本相似的阳离子交换层析曲线。
达珠单抗具有与重链残基Asn296相连的N-连接的寡糖。当利用酰胺酶PNGaseF使这些N-连接的寡糖释放并通过HPLC进行分析时，尽管事实上二者均是在NS0细胞系中重组产生，DAC HYP呈现与ZENAPAX DAC不同的糖基化谱。的确，DAC HYP的糖基化谱异常均一。参考图21的上面的图，ZENAPAX DAC的糖基化谱的特征在于代表寡糖G0-GlcNAc、G0、G1、Man5、G2、Man6、Man7和唾液酸化寡糖的峰。图21的下面的图显示DAC HYP的糖基化谱的特征在于对应于G0-GlcNAc糖型和G0糖型的两个主峰以及对应于G1糖型的次要峰。G0-GlcNAc糖型可占AUC的约5％至约20％，更通常占AUC的约7.2％至14.6％。G0糖型可占AUC的70％至99.2％，更通常占AUC的80.9％至99.2％。G1糖型可占AUC的1％至9％，更通常占AUC的1.4％至3.8％。唾液酸化寡糖占总AUC的1.0％或更少。
免疫原性和效应器功能的高水平对于长期施用的药物是个难题。此外，快速清除率可以降低药物的可用性。如技术人员所熟知的，治疗性抗体的糖基化方式的差异可以导致免疫原性的差异。具有高度均一的糖基化方式的抗体(如DAC HYP)可以提供有益的免疫原性谱、ADCC水平和清除率。此外，具有更加均一的糖基化方式的生物制剂减少了批次间的变化，并且可以改善一致性和稳定性。
因此，在另一个方面中，本文公开的内容提供了达珠单抗组合物，其特征在于均一的N-连接的糖基化谱。在一个实施方式中，达珠单抗组合物的特征在于N-连接的糖基化谱，如通过HPLC所测定，其包括总AUC约5-20％的G0-GlcNAc糖型，在某些实施方式中为总AUC约5％-18％或约7-15％(如7.2％-14.6％或6.9％至14.7％)的G0-GlcNAc糖型(在某些具体的实施方式中为总AUC 7.3％的G0-GlcNAc糖型)，以及总AUC约70％-99.2％的G0糖型，在某些实施方式中为总AUC约75％-90％、约75-92％或约81-88％的G0糖型(在某些具体实施方式中总AUC 86％的G0糖型)。可选的，G1峰少于总AUC的约10％、少于总AUC的约5％、少于总AUC的约4％或少于总AUC的约3％，在某些实施方式中为约1％至约4％(如1.4％至3.8％)或约1％至约3％。Man5糖型优选占总AUC的约3％或更少。在其他实施方式中，达珠单抗组合物的特征在于与图19中所显示的谱实质相似的HPLC N-连接的糖型谱。
在某些方面中，公开的达珠单抗组合物的特征在于总数为两个以上的糖型峰。在某些实施方式中，公开的达珠单抗组合物的特征在于(a)对应于G0-GlcNAc糖型和G0糖型的两个主峰，其总共占总AUC的约75％至约100％、约80％至约100％或约85％至约100％和/或(b)对应于Man5，Man6，和Man7糖型的峰，其总共占总AUC的约6％或更少和/或(c)对应于Man6和Man7糖型的峰，其总共占总AUC的约2％或更少。在这样的实施方式中，G0-GlcNAc、G0、G1和/或Man5的百分数可以以前段中所描述的量存在。
DAC HYP的结合和抑制性质，以及如在测定对IL-2诱导的T细胞增殖的抑制的测试中所评价的DAC HYP功能效力，与ZENAPAX DAC的那些类似。然而，相当令人惊奇的是，DAC HYP显示出明显低于ZENAPAX DAC的ADCC细胞毒性，这可能是由于，至少部分地由于它们的非岩藻糖化甘露糖糖基化水平的差异(参见图21)。如图22A和图22B所示，如细胞测试中所测定，DAC HYP显示比ZENAPAX DAC低至少25％的ADCC细胞毒性。如技术人员可以认识到的，DAC HYP的降低的ADCC细胞毒性对于涉及不期望细胞死亡的长期给药的适应症有益，如治疗多发性硬化症和葡萄膜炎。在这些长期应用疗法的情况下，如，如在多发性硬化症和其他非肿瘤适应症的治疗中，DAC HYP疗法可以比使用ZENAPAXTM的疗法更安全。
因此，在另一个方面中，公开的内容提供了达珠单抗组合物，其特征在于在1μg/mL的浓度下，显示低于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或甚至更低的ADCC细胞毒性，其中ADCC细胞毒性在利用25∶1、40∶1、50∶1或60∶1的效应细胞与靶细胞比率，如当利用Kit225/K6作为靶细胞时和/或当利用来自3个或以上、6个或以上、10个以上或或50个或以上健康供体的PBMC效应细胞时的体外试验中测定。在具体实施方式中，公开的内容提供了达珠单抗组合物，其特征在于在1μg/mL的浓度下，显示5-30％、10-30％、15-30％、15-30％、5-25％、10-25％、20-30％、15-25％、15-35％或20-35％范围的ADCC细胞毒性，其中ADCC细胞毒性在利用25∶1、40∶1、50∶1或60∶1的效应细胞与靶细胞比率，如当利用Kit225/K6作为靶细胞时和/或当利用来自3个或以上、6个或以上、10个或以上或50个或以上健康供体的PBMC效应细胞时的体外试验中测定。考虑到DAC HYP是IgG1免疫球蛋白并且不含已知的能降低ADCC细胞毒性的框架突变，利用DAC HYP观察到的、与ZENAPAX DAC相比较低水平的ADCC细胞毒性是令人惊讶的。
与ZENAPAX DAC相比，DAC HYP的安全性可以通过使用高产无血清过程进一步改善，该过程允许生产无牛血清白蛋白(BSA)的高纯产品。因此，本文公开的内容提供了达珠单抗组合物，其无BSA和/或是不存在BSA的细胞培养过程的产物。
特征在于有1个或多个上面讨论特性的达珠单抗组合物(DAC HYP组合物)可以通过在哺乳动物细胞中重组表达方便地获得。尽管不希望受任何特定操作理论的束缚，据信1个或多个上面讨论的独特的特点和/或特性可能由于，至少部分地由于高产重组表达系统的使用。这可以以任何方法实现，如通过利用DHFR进行基因扩增，或利用处于弱启动子控制下的选择标记基因，所述弱启动子优选与驱动目标蛋白(优选分泌蛋白)表达的强启动子联合使用。不受理论的束缚，据信处于弱启动子控制下的标记选择有利于鉴定稳定转染子，在所述稳定转染子中，表达载体整合入转录活跃的染色体区域，从而获得高表达水平的目标蛋白。在一个实施方式中，驱动选择标记表达的弱启动子是SV40启动子(Reddy等，1978，Science 200：494-502)，其中一个或两个增强子区域的活性已经如通过部分或完全缺失而降低或消除，可选的其与驱动目标蛋白表达的强启动子，如CMV IE启动子联合使用(Boshart等，1985，Cell 41(2)：52130)。
因此，在另一个方面中，公开的内容提供了用于产生重组细胞系的载体，重组细胞系能稳定表达高水平的达珠单抗，如DAC HYP，其中选择标记的表达处于SV40启动子的控制下，所述SV40启动子中增强子功能已经如通过一个或两个增强子序列的部分缺失而降低(命名为dE-SV40)。可以用于产生稳定表达细胞系的具体的dE-SV40启动子序列位于载体pHAT.IgG1.rg.dE(SEQ ID NO：5)的位置6536-6735，其在图3A-图3D和图3E(SEQ ID NO：12)中显示。可以用于产生稳定表达细胞系的具体载体的多种实施方式描述于2011年11月30日提交的美国申请61/565,419号和2011年11月30日提交的国际申请PCT/US11/62720号中，其通过引用并入本文。
一般地讲，用于表达达珠单抗如DAC HYP的载体将包含由pHAT.IgG1.rg.dE所示例的一个或多个特征(描述于下面5.1节中)，如启动子。达珠单抗的两条链可以置于独立的转录调控下，但优选位于相同的载体上，而其编码区可以是含有内含子和外显子的基因组DNA或cDNA。作为独立的转录调控的替代方案，两条链可以表达为单个转录本或单个开放读码框，其编码区被内部核糖体进入位点或自切割内蛋白序列分开，在这种情况下，重链和轻链编码序列位于单个启动子的控制下。示例性启动子是CMV IE启动子和增强子(位于pHAT.IgG1.rg.dE(SEQ ID NO：5)的位置0001-0632和3982-4604处)。其他特征包括转录起始位点(如果没有选择的启动子)，转录终止位点和复制起点。这些特征的示例展示于表1中，其中概述了pHAT.IgG1.rg.dE的元件。
用于在NS0细胞中由单个外源核酸表达达珠单抗如DAC HYP的重链和轻链的具体实施方式，使用在哺乳动物细胞中可操作的选择标记，如新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、潮霉素B磷酸转移酶(Hph)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puror)、杀稻瘟素S脱氨酶(bsrr)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)、谷氨酰胺合成酶(GS)或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)。在优选的实施方式中，公开的载体中的选择标记是处于增强子减弱的SV40启动子控制下的大肠杆菌鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶选择标记，其编码序列可以在图3A-图3D中所示pHAT.IgG1.rg.dE(SEQ ID NO：5)的位置6935-7793处找到。
在另一个方面中，本文公开的内容提供了宿主细胞，其经用于重组生产达珠单抗如如DAC HYP的载体转染。宿主细胞可以是任何哺乳动物细胞，包括如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、Sp2/0细胞、PER.C6细胞、Vero细胞、BHK细胞、HT1080细胞、COS7细胞、WI38细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、MDCK细胞和293细胞。一经转染，载体可以整合入基因组从而产生稳定生产的细胞系。技术人员将领会的是，在指定施用于人的组合物中包含动物产物是不理想的。因此，优选不需要血清或其他动物产物(如胆固醇)来生长的宿主细胞。可以使需要这样动物产物的宿主细胞适应利用无血清和无其他动物产物的培养基。使鼠骨髓瘤NS0细胞适应在无血清和胆固醇的培养基中生长的方法描述于Hartman等，2007，Biotech.&Bioeng.96(2)：294-306和Burky等，2007，Biotech.&Bioeng.96(2)：281-293中。适应在无血清和无胆固醇培养基中生长的具体NS0细胞株已经使用上面描述的可用于产生DAC HYP的载体稳定转染(克隆7A11-5H7-14-43)。
如技术人员将认识到的，用于培养生产重组蛋白的细胞的基础和补料培养基以及其他变量如补料时间表、生长速率、温度和氧水平，可能影响表达的蛋白的产量和质量。优化这些条件的方法在技术人员所知范围内；示例性条件列于公开内容的示例性实施方式中。优选使细胞适应生长于无胆固醇、血清和其他动物源性成分的培养基中；在这种情况下基础和补料培养基优选包括能替代这些成分的限定性化学物质。还已经发现含有高水平葡萄糖，如10-35g/L葡萄糖的培养基有利地使细胞培养的生产力增加。在具体的实施方式中，基础培养基具有约10-20g/L，更优选约15g/L的葡萄糖和/或补料培养基具有22-35g/L，更优选约28g/L的葡萄糖。如本领域已知的，可以按照逐渐上升的补料时间表在8-15天，优选9-13天，或最优选10-13天的时间内将补料培养基加入细胞中。
对于在NS0生产株7A11-5H7-14-43中表达的DAC HYP，生长和补料培养基的组分以及其他影响表达和生产的变量已经被优化。因此，公开的内容还提供了经优化的基础培养基、补料培养基、补料时间表以及用于以高产量和纯度生产达珠单抗的其他培养方法和条件。这些培养基以及培养参数和方法更详细地描述于5.3节中。
还已经发现利用某些层析步骤的组合从细胞培养物中纯化达珠单抗得到了经纯化的达珠单抗和DAC HYP药物物质组合物，以及在高浓度下以液体形式中稳定储存的液体达珠单抗和DAC HYP药物制剂，其中通常达珠单抗或DAC HYP的额定浓度为至少约100mg/mL±10-15％，在一些实施方式中为150mg/mL±10-15％(如通过UV光谱学或折光率所测定)。
一般通过用具有约267-327mOsm/kg范围内的摩尔渗透压浓度(如270-310mOsm/kg)和25℃时约pH 5.8-6.2范围内的pH(如25℃时5.9-6.1)的交换缓冲液与浓缩的达珠单抗制剂发生交换以产生中间制剂，接着用聚山梨酯稀释缓冲液稀释中间制剂以获得稳定的高浓度液体制剂，从而制备稳定的高浓度达珠单抗药物制剂，其中如通过UV光谱学或折光率所测定，所述高浓度液体制剂包含约100mg/mL±10％达珠单抗(如DAC HYP)，在某些实施方式中包含至少约150mg/mL达珠单抗(如DAC HYP)。稀释缓冲液与交换缓冲液相同，但含有约0-10％(w/v)的聚山梨酯80，其以一定量使用以使最终稳定的高浓度达珠单抗制剂具有计算的聚山梨酯80浓度(额定浓度)，其在0.02-0.04％范围内，在某些实施方式中为约0.03％(w/v)。交换和稀释缓冲液中可以包含多种不同的缓冲剂和赋形剂以得到限定范围内的摩尔渗透压浓度和pH。适于配制稳定的高浓度液体达珠单抗和DAC HYP药物制剂的交换缓冲液的具体非限定性示例含有约40mM琥珀酸盐和约10mM NaCl并在25℃时具有约6.0的pH。适于与该交换缓冲液使用的稀释缓冲液的具体非限定性示例含有约40mM琥珀酸盐、约100mMNaCl和约1％(w/v)聚山梨酯80，并在25℃时具有约6.0的pH。可以使用酸或碱调节最终制剂的pH以获得25℃时约6.0的实际pH。
稳定的高浓度液体达珠单抗制剂的特征在于聚集水平低，如通过大小排阻层析所测定，其通常含有至少95％的单体和少于3％的聚集体，有时少于1.5％的聚集体，更通常大于99％的单体和少于0.8％的聚集体。高浓度液体达珠单抗药物制剂的其他纯度特征更详细地描述于5.6节中。
高浓度达珠单抗药物制剂的特征还在于储存期长，在不会产生大于5％的降解和形成大于3％的聚集体(如分别通过SDS-PAGE和大小排阻层析所测定)的情况下，其储存在2-8℃时能够稳定长达54个月或更长时间，如至少5年，在加速条件下(23-27℃/60±5％的相对湿度)储存时能够稳定长达9个月的时间，而在加压条件下(38-42℃/75±5％的相对湿度)储存时能够稳定长达3个月的时间。
如上所述，可以通过用聚山梨酯稀释缓冲液稀释中间制剂以获得已完成的达珠单抗药物制剂，从而制备稳定的高浓度液体达珠单抗制剂。因此，在另一个方面中，公开的内容提供了无聚山梨酯的经纯化的达珠单抗(优选DAC HYP)中间制剂，其含有至少150mg/mL达珠单抗，在某些实施方式中含有约170-190mg/mL达珠单抗，其可以用聚山梨酯稀释缓冲液进行稀释以获得本文描述的稳定的高浓度达珠单抗液体药物制剂。在具体的实施方式中，浓缩的无聚山梨酯中间制剂额定含有约155mg/mL或约180mg/mL的达珠单抗(优选DAC HYP)、约40mM柠檬酸钠和约100mM NaCl，在25℃时pH为6.0。在具体的实施方式中，浓缩的无聚山梨酯中间制剂额定含有约155mg/mL或约180mg/mL达珠单抗(优选DAC HYP)、约40mM琥珀酸钠和约100mMNaCl，在25℃时pH为6.0。达珠单抗组合物的特征在于聚集物水平低，其在下面进一步描述。
已经发现通过超滤浓缩的达珠单抗会诱导形成聚集体，其会导致高浓度达珠单抗药物制剂含有不可接受水平(如＞3％)的聚集体。因此，优选在浓缩达珠单抗药物物质之前利用“精炼”步骤以去除聚集体。浓缩前可接受的聚集体水平将取决于将被浓缩的达珠单抗药物物质的浓度、最终达珠单抗药物制剂中的期望浓度以及最终达珠单抗药物制剂中可接受的聚集体水平。如，如果期望获得含有少于3％聚集体的150mg/mL达珠单抗制剂，并且达珠单抗药物物质必须被浓缩10到30倍(如20倍)以实现该已完成的达珠单抗制剂，则将被浓缩的达珠单抗组合物应当含有＜0.3％的聚集体，优选＜0.2％的聚集体，优选甚至更低水平，如约0.1％的聚集体。
可以利用多种已知技术获得含有可接受聚集体水平的起始达珠单抗药物物质组合物，以用于浓缩成本文描述的经浓缩的达珠单抗中间制剂和最终药物制剂，所述技术包括，如强阳离子交换层析和疏水相互作用层析。然而，已经令人惊讶的发现，弱阳离子交换层析将含有4-12mg/mL范围内的达珠单抗和高至2.5％聚集体的达珠单抗组合物的聚集体水平降至极低水平，通常降至约0.1％聚集体。与利用含氮溶液(如硫酸铵溶液)的疏水相互作用层析相比，使用弱阳离子交换以去除聚集体在环境上更加温和。
因此，在另一个方面中，公开的内容提供了精炼达珠单抗组合物以去除聚集体的方法，这样得到的精炼组合物通常包含约4至15mg/mL的达珠单抗，如通过大小排阻层析所测定，其中0.3％或更少(如0.2％或更少或者0.1％或更少)是聚集体形式。该方法通常包括使含有约4-10mg/mL，通常约8-9mg/mL，优选约8.5mg/mL达珠单抗和＞0.5％聚集体的达珠单抗组合物在适宜缓冲液中流经弱阳离子交换树脂以吸附达珠单抗，并用洗脱缓冲液洗脱被吸附的达珠单抗。可用的弱阳离子交换树脂包括但不限于CM-650M(TosohBiosciences)、CM-Sepharose、CM-HyperD。平衡、清洗和洗脱缓冲液的组分取决于所使用的弱阳离子交换树脂，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。对于CM-650M树脂(Tosoh Biosciences，产品编号101392)，含有约20mM柠檬酸钠、pH为4.5的平衡和清洗缓冲液，以及含有20mM柠檬酸钠和75mM硫酸钠、pH为4.5的洗脱缓冲液运作良好。所用流速取决于树脂的选择和柱尺寸。对于具有约10-30cm(如17-19cm)范围内的床高的CM-650M树脂圆柱形柱，约50-200cm/hr范围内(如90-110cm/hr，优选约100cm/hr)的流速运作良好。层析可以于室温或者更低温度下进行，如4°、10°、15°、20°或25℃范围内的温度。通常使用的温度范围是18-25℃(如18-22℃)。
依据ZENAPAX EMEA，ZENAPAX DAC的纯化过程包括以下12个步骤：
(i)培养基浓缩；
(ii)Q-Sepharose层析；
(iii)S-Sepharose层析；
(iv)低pH处理以失活病毒；
(v)浓缩/渗滤；
(vi)DV50过滤以去除病毒；
(vii)Q-Sepharose II层析；
(viii)Viresolve层析以去除病毒；
(ix)超滤浓缩；
(xi)S-300凝胶过滤层析；
(xii)超滤浓缩
(xiii)无菌灌装入瓶。
该过程效率低，纯化产率低。已经发现利用较少步骤的过程可以实现较高的产量，同时获得较高的纯度，这使得所得达珠单抗药物物质能够配制成上面描述的高浓度药物制剂。因此，本文公开的内容还提供了分离和/或纯化达珠单抗药物物质和高浓度药物制剂的改进的方法。该过程联合利用蛋白A亲和层析、强阴离子交换层析(Q-Sepharose)和弱阳离子交换层析(CM-650M)，这使得进行连续性流动处理而无需稀释过程中间产物。获得经纯化的达珠单抗药物物质的改进的方法包括以下步骤：
(i)蛋白A亲和层析，以从其他细胞培养组分中分离达珠单抗；
(ii)低pH病毒失活；
(iii)强阴离子交换(Q-Sepharose)层析，以去除DNA
(iv)弱阳离子交换(CM-650M)层析，以减少聚集体；和
(v)过滤，以去除病毒。
如本领域公知，确切的体积、柱尺寸和操作参数将部分取决于纯化的规模。用于大规模纯化的具体体积、柱尺寸和操作参数描述于5.4节中。
可以利用多种常规方法，如微过滤、离心和直接从生物反应器中深度过滤，从细胞培养物中收获将通过上述方法被纯化和可选地被配制的粗达珠单抗。然而，已经发现可以通过在低于15℃的温度下将细胞培养物的pH降至约pH5以使细胞絮凝，从而方便地收获粗达珠单抗，所述絮凝的细胞可以通过离心去除。在一个具体实施方式中，通过将细胞培养物的pH降至约pH 5，将培养物冷却至低于15℃(如4℃)30-90分钟，并对所得悬液进行离心以去除细胞，从而收获粗达珠单抗。该过程通常适用于任何向培养基中分泌重组蛋白的细胞培养物，而不是特定适用于产生达珠单抗或治疗性抗体的培养物。可以使用多种不同的酸，包括弱或强的有机酸，或者弱或强的无机酸来调节培养物的pH。对于达珠单抗培养物，已经发现柠檬酸作用良好。收获前可以使用浓缩的柠檬酸溶液，如0.5M-2M溶液调节培养物的pH。
通过利用三个层析步骤、病毒失活、病毒过滤和最终超滤来完成DACHYP的纯化。蛋白A亲和层析是纯化过程中的第一个步骤，其清除大部分过程相关的杂质。为使蛋白A亲和柱能够再利用，必须使其再生并消毒。已经发现NaOH水溶液能够有效地完成柱的再生和消毒。然而，使用NaOH溶液可能使蛋白A树脂降解，增加总生产成本。还已经发现使用含有NaOH和苯甲醇的溶液对蛋白A亲和层析树脂进行消毒能够得到良好的结果，并使纯化循环数显著增加。因此，公开的内容还提供了使蛋白A亲和柱和树脂再生和消毒的消毒溶液和方法。缓冲液通常含有约100至500mM柠檬酸钠、约10至30mM NaOH和约0.5至3％(v/v)苯甲醇，并具有约pH 10至13范围内的pH。缓冲液还可以可选地包括其他组分，如盐和/或洗涤剂。柠檬酸钠和苯甲醇对于保护蛋白A树脂免受NaOH破坏和增强杀微生物活性均很重要。在具体实施方式中，蛋白A消毒缓冲液包含约200mM柠檬酸钠、约20mM NaOH和约1％(v/v)苯甲醇。如5.4.2节所描述，含有苯甲醇和氢氧化钠的消毒溶液具有有益的抗微生物效果，并可以用于在任何抗体纯化过程中对蛋白A柱进行消毒。
消毒缓冲液可以用于在分批式过程中对蛋白A层析树脂进行消毒，其中用过量的(如1.5-2X体积)消毒缓冲液清洗树脂，随后在过量的(如1.5-2倍体积)消毒缓冲液中孵育约30-45分钟，随后用平衡缓冲液或储存缓冲液平衡。消毒缓冲液还可以用于对制备好的蛋白A层析柱进行消毒，其中用过量的(如1.5-2倍柱体积)消毒缓冲液以适宜流速(如约110-190cm/hr或135-165cm/hr)对柱进行清洗，使柱在零流动的条件下保持约30-40min，随后用平衡缓冲液或储存缓冲液对柱进行清洗。适宜的平衡和储存缓冲液描述于0节中。
用本文描述的消毒缓冲液对蛋白A柱进行消毒使单批树脂可以使用的纯化次数显著增加。如用常规NaOH缓冲液消毒(如50mM NaOH、0.5M NaCl)时，单批蛋白A树脂通常仅可维持约30个纯化循环，而用本文描述的消毒缓冲液消毒的蛋白A柱可以使用多于100个纯化循环。尽管不希望受任何操作理论的束缚，据信本文描述的消毒缓冲液部分地保护了经固定化的蛋白A免受NaOH诱导的降解，从而使树脂的使用寿命增加。因此，尽管预期对所有蛋白A树脂都有改善，包括使用设计为抵抗NaOH降解的蛋白A突变株的那些(如MabSuRe树脂)，然而当用于对使用未修饰的经固定化蛋白A或未经改造为对NaOH稳定的蛋白A的蛋白A树脂和柱进行消毒时，本文描述的消毒缓冲液特别有益。公开的内容进一步提供了包括使用蛋白A亲和树脂进行多于30、多于35或多于40个抗体纯化运行以及在一些情况下高达50个或高达100个蛋白纯化循环的方法，其包括如本文中所公开进行纯化运行并用消毒溶液清洗树脂。
如上所述，达珠单抗与活化的而非静息的T和B淋巴细胞上表达的的CD25特异性结合，并阻断IL-2与CD25的结合，从而抑制高亲和力IL-2受体复合物的形成，抑制活化的T-和B-细胞的增殖。本文中描述的DAC组合物和制剂，特别是DAC HYP组合物和制剂，同样与CD25特异性结合并显示类似的生物学性质。因此本文中描述的DAC组合物和制剂，特别是DAC HYP，因而可以用于通常针对达珠单抗特别是ZENAPAX描述的任何测试和治疗方法中。因此，本文公开的内容还提供了利用本文中描述的DAC组合物和制剂，特别是DAC HYP组合物和高浓度稳定液体制剂抑制活化的T-和B-细胞增殖的方法，其在体外应用中和体内作为治疗方法来治疗活化的T-和B-细胞增殖在其中发挥作用的疾病，如治疗和预防同种异体移植物排异，治疗葡萄膜炎和治疗多发性硬化症。
该方法通常包括使活化的T-和/或B-细胞与足以抑制其增殖的量的本文中描述的达珠单抗组合物或制剂接触。
对于治疗方法，该方法通常包括对受试者施用一定量的达珠单抗组合物，如本文中描述的DAC HYP组合物或高浓度DAC制剂，以提供治疗效果。在一个具体的实施方式中，达珠单抗组合物和制剂可以单独或与其他药剂如β干扰素联合用于治疗多发性硬化症。本文描述的DAC组合物可以每周至每月(如每周、每两周、每月两次、每四周或每月)以75mg至300mg(如75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg或300mg)或1mg/kg至4mg/kg范围内的剂量对患者皮下施用。组合物可以提供于便于皮下使用的预充注射器中，优选以100mg/mL±10-15％或150mg/mL±10-15％的达珠单抗额定浓度。还可以对经浓缩的DAC组合物进行稀释以用于静脉施用。
3.附图简述
图1提供了DAC-HYP轻链cDNA(SEQ ID NO：1)和已翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。粗体、下划线的天门冬氨酸(D)残基是经恰当加工的成熟蛋白的首个氨基酸，该残基上游的氨基酸序列对应于信号序列。
图2提供了DAC-HYP轻链cDNA(SEQ ID NO：3)和已翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。粗体、下划线的谷氨酰胺(Q)残基是经恰当加工的成熟蛋白的首个氨基酸，该残基上游的氨基酸序列对应于信号序列。
图3A-图3D共同提供了载体pHAT.IgG1.rg.dE的全长核苷酸序列(SEQ IDNO：5)。
图3E提供了可以用于选择高产生产株的dESV40启动子(SEQ ID NO：12)的具体实施方式。
图4A-4B提供了载体pHAT.IgG1.rg.dE的示意图(图4A)，其源于经调节以表达任何重和轻链基因或甚至非抗体多肽的载体pABX.gpt(图4B)。
图5提供了DAC HYP的示例性生产过程。
图6展示了蛋白A亲和层析过程中产物级分的UV(280nm)、pH和电导率监测。
图7展示了Q-Sepharose层析过程中产物级分的UV(280nm)、pH和电导率监测。
图8展示了CM阳离子交换层析过程中产物级分的UV(280nm)、pH和电导率监测。
图9提供了DAC HYP超滤系统的示意性展示。
图10提供了0-60分钟的DAC HYP肽层析图。参照谱是100mg/mL的DACHYP制备品，批次1和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。
图11提供了55-115分钟的DAC HYP肽层析图。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次1和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。
图12提供了110-170分钟的DAC HYP肽层析图。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次1和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。
图13提供了DAC HYP 150mg/mL批次批次1和批次2的覆盖圆二色光谱。参照是100mg/mL的DAC HYP制备品。
图14A-图14B分别提供了覆盖的零级紫外光谱和覆盖的二级导数紫外光谱。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次1和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。所有三种光谱显示于图14A和图14B的每一个中，但是一旦相互覆盖即以单个光谱出现。
图15A-图15B分别提供了全比例和扩展比例的大小排阻层析图。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次1和批次2对应于150mg/mL的DACHYP制备品。
图16是DAC HYP聚集作为时间函数的制图。
图17显示了还原的和非还原的SDS-PAGE(分别是左图和右图)。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次1和批次2对应于150mg/mL的DACHYP制备品。
图18显示了DAC HYP的阳离子交换层析图。参照谱是100mg/mL的DACHYP制备品，批次1和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。峰标记对应于不同的N-和C-末端同等型。
图19显示了从DAC HYP上酶切下的N-连接寡糖的HPLC层析图。参照谱是100mg/mL的DAC HYP制备品，批次1和批次2对应于150mg/mL的DACHYP制备品。
图20显示了DAC HYP的ADCC反应曲线。参照谱是100mg/mL的DACHYP制备品，批次1和批次2对应于150mg/mL的DAC HYP制备品。
图21显示了从DAC HYP(下图)和ZENAPAX DAC(上图)释放的N-连接寡糖的HPLC层析图，其展示它们不同的糖基化谱。
图22A-图22B提供了两种DAC HYP制备品(称作DAC HYP批次3和DACHYP批次4)、DAC Penzuburg和ZENAPAX DAC的ADCC活性之间的比较，其中利用效应细胞对靶细胞比率可变的ADCC测试方式(图22A)以及抗体浓度可变的ADCC测试方式(图22B)。
图23提供了DAC HYP、DAC Penzuburg和ZENAPAX DAC电荷同等型的比较。
4.发明详述
本文公开的内容在其他事物中提供了具有特定性质的DAC组合物、在不同温度下稳定储存的特别可用于某些施用方式的高浓度DAC制剂、可用于生产DAC组合物的载体和宿主细胞、可用于生产DAC组合物的经优化的培养基肉汤和培养条件、纯化DAC组合物和高浓度DAC制剂的方法，以及利用DAC组合物和高浓度制剂以例如抑制活化的T-和/或B-细胞增殖以及治疗和/或预防活化的T-和/或B-细胞所介导的疾病(如多发性硬化症)的方法。
本文中使用的达珠单抗(DAC)是指具有图1中展示的轻(VL)链序列(SEQ ID NO：2的位置21-233)和图2中展示的重(VH)链序列(SEQ ID NO：4的位置20-465)的人源化IgG1单克隆抗体。DAC的CDR序列如下：
VLCDR#I：S A S S S I S Y M H (SEQ ID NO：6)
VLCDR#2：T T S N L A S (SEQ ID NO：7)
VLCDR#3：H Q R S T Y P L T (SEQ ID NO：8)
VHCDR#1：S Y R M H (SEQ ID NO：9)
VHCDR#2：Y I N P S T G Y T E Y N Q K F K D (SEQ ID NO：10)
VHCDR#3：G G G V F D Y (SEQ ID NO：11)
文献中已经报导了某些达珠单抗分子，一种具体形式的DAC之前由Hoffman La Roche公司以ZENAPAX的商品名上市销售，其作为免疫疗法(包括环孢素和皮质类固醇)的佐剂用于预防肾移植患者中的同种异体移植物排斥。以ZENAPAX的商品名销售的DAC形式在本文中被称为“ZENAPAXDAC”。
德国Penzberg的一个机构生产的另一种形式的DAC，尽管从未市售，已经用于某些临床试验中。这种形式的DAC在本文中被称为“DAC Penzberg”。
如本文中所描述，本文公开的内容部分地涉及新形式的DAC，其具有不同于，在一些情况下优于ZENAPAX DAC和DAC Penzberg的特性和性质的特性和性质。因此，本文公开的内容部分地涉及新的DAC组合物。新DAC组合物的特征在于如简述部分中更完整描述的一个或多个以下特征：
(1)特征性pE/Q和/或Q/VHS N-末端同等型；
(2)以两个主峰和一个次要峰为特征的均一的N-连接寡糖谱；
(3)与ZENAPAX DAC和DAC Penzberg相比降低的ADCC细胞毒性；和
(4)当配制为高达150±10-15％的额定浓度时具有低水平的聚集体形式(＜3％)。
具有一个或多个这些特性和/或性质的DAC组合物在本文中被称为“DAC HYP”组合物。为了列举本文中描述的本发明的多个方面和特征，描述了具有所有四项上述性质的具体DAC HYP，以及具体组合物和其生产和纯化方法。然而，将要理解的是，DAC HYP组合物不需要具有所有四项上述特性以落入本文公开的范围内。在具体实施方式中，DAC HYP具有上述特性(1)至(4)中的至少两项(如至少(1)和(2)，(1)和(3)，(1)和(4)，(2)和(3)，(2)和(4)或(3)和(4)的组合)或上述特性(1)至(4)中的至少三项(如至少(1)、(2)和(3)，(1)、(2)和(4)，(1)、(3)和(4)，(2)、(3)和(4)的组合)。当配制为100mg±10-15％或甚至150±10-15％的浓度时，这样的DAC HYP组合物还可以具有＜3％的聚集体、＜2％的聚集体以及甚至更低水平，如＜1％的聚集体。
此外，尽管本文中描述的发明的某些方面和实施方式使用DAC HYP进行展示和列举，技术人员将领会的是，其不限于DAC HYP，并通常可用于达珠单抗组合物中，也不限于具有与DAC相似的CD25特异性结合性质的IgG2、IgG3、和IgG4抗-CD25抗体以及未经人源化的适合施用于人体的抗-CD25抗体。这些多种不同的抗CD25抗体在本文中被称为“DAC类似物”。这样的DAC类似物常常包括上面提及的6个DAC CDR，但可以包括其他CDR序列。
可以利用标准的测试和方法确认DAC HYP组合物的特性和性质。例如可以利用阳离子交换层析并在220nm下检测来评估N-末端和C-末端同等型谱。在一种具体的方法中，100μL测试样品(溶于缓冲液A中的1mg/mL抗体)在室温下，在装配ProPac WCX-10G保护柱(Dionex公司)的ProPac WCX-10柱(Dionex公司)上利用以下分离梯度进行解析(柱用缓冲液A平衡)：
Figure BSA00000750254200171
缓冲液A＝15mM磷酸钠pH 5.9
缓冲液B＝250mM NaCl，15mM磷酸钠pH 5
可以通过用酰胺酶PNGase F切割N-连接的寡糖，用荧光标记使寡糖衍生化并通过荧光检测的正相HPLC对所得混合物进行分析，从而评估N-连接的糖基化谱。在一种具体的方法中，经邻氨基苯甲酸衍生化的切割下的N-连接聚糖于50℃在250×4.6mm的聚合-胺键合的Asahipak Amino NH2P-504E柱上(5μm粒径，Phenomenex，目录编号CHO-2628)利用以下洗脱梯度进行解析(使用100μL的样品注入体积；柱用85％的缓冲液A/15％的缓冲液B平衡)：
Figure BSA00000750254200172
缓冲液A＝1％v/v四氢呋喃，2％v/v醋酸，在乙腈中的
缓冲液B＝1％v/v四氢呋喃，5％v/v醋酸，3％v/v三乙胺，在水中
可以利用还原的SDS-PAGE(预制14％Tris-甘氨酸梯度微型胶，Invitrogen产品编号601632)及胶态蓝染色和/或大小排阻层析及在280nm下检测，从而确认纯度。具体地，15μL测试样品(洗脱缓冲液中的20mg/mL抗体)可以于室温在装配0.5μm柱前过滤器(Upchurch产品编号A-102X)的7.8mm×30cm的TSK G3000SWXL柱(Tosoh Biosciences，产品编号601342)上利用等度洗脱缓冲液梯度(200mM KPO4、150mM KCl、pH6.9)以1mL/min的流速进行解析。
本文中描述的DAC HYP组合物和其他DAC制剂，如本文中描述的稳定的高浓度液体DAC制剂，可用于治疗被认为是至少部分地由活化的T-和/或B-细胞所介导的多种疾病和病症，包括例如同种异体移植物的排斥和多发性硬化症。用于治疗和/或预防同种异体移植物排斥的具体患者群体、制剂、施用方法和剂量以及时间表描述于美国专利6,013,256号中，其通过引用并入本文。可用于治疗多发性硬化症患者的具体患者群体、制剂、施用方法、剂量以及时间表描述于美国专利7,258,859号中，其通过引用并入本文。所有这些制剂、施用方法、剂量和时间表以及公开的具体患者群体和组合疗法，对于DAC HYP组合物和可用时本文中描述的高浓度DAC制剂同样适用。
本文中描述的DAC HYP组合物和制剂以能够提供治疗效果的量施用。治疗效果包括但不限于基本疾病的治疗。治疗效果还可以包括特定疾病的症状或副作用的改善或减轻，如利用标准的诊断和其他测试所评估。对于多发性硬化症，美国专利7,258,859号中描述了评价治疗效果的多种方法，包括例如利用磁共振成像对脑部病变进行评估和/或评估失能进展，其通过引用并入本文。所有这些不同的测试可以用于在患有多发性硬化症的患者的背景中评估治疗效果。
无论是用DAC HYP、一般的DAC或DAC类似物制备，稳定的高浓度DAC制剂特别用于可皮下施用，以治疗慢性疾病，如多发性硬化症。制剂可以以快速皮下注射方便施用或者被稀释以静脉内施用。制剂可以每周至每月(如每周、每两周、每月两次、每四周或每月)以75mg至300mg范围(如75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg)或1mg/kg至4mg/kg范围的剂量对患者皮下施用。组合物可以提供于便于皮下使用的预充注射器中。经稀释的制剂可以以适宜剂量以与皮下施用相同的频率进行静脉内施用。
5.示例性实施方式
下面以示例性实施方式的形式进一步描述本文中描述的本发明的多个方面和特征。应当领会的是，尽管示例性实施方式利用具体的细胞培养基、细胞培养条件、柱层析树脂以及平衡、清洗和洗脱缓冲液，但是可以进行常规改变。而且，尽管用具体生产株(克隆7A11-5H7-14-43)对多种细胞培养方法进行列举，预期其他DAC或DAC类似物生产株，进行或不进行常规优化，也能成功使用。此外，可以偏离与特定实施方式(无论在上面的简述中或在下面的示例性实施方式中)关联描述的特征而基本不影响公开的方法和组合物的理想特性，此外除非其明显相互排斥，不同的实施方式可以联合起来并以多种方式共同使用。因此，应当理解的是，下面提供的示例性实施方式意在展示而非限定，其不应当被视为对权利要求的限制。
下面列举的制造方法用于生产150mg/mL的DAC HYP药物物质。对于制造100mg/mL的DAC HYP药物物质，可引入小的过程变化：
用于生产100mg/mL DAC HYP的细胞培养(参见5.3节)不包含消泡乳液，而10,000L生物反应器中的150mg/mL DAC HYP细胞培养使用低浓度的DowCorning Antifoam C以尽量减少起泡。当生产具有100mg/mL抗体终浓度的DAC HYP制剂时，用0.5M NaOH、0.5M硫酸钠的缓冲液对CM-650M柱进行消毒(参见5.4.5节)；当生产具有150mg/mL抗体终浓度的DAC HYP制剂时，从消毒缓冲液中删除硫酸钠。对于制造100mg/mL的DAC HYP，在下游过程的末期，临加入聚山梨酯80并将药物物质稀释至终体积前利用一步超滤/渗滤(UF/DF)(参见5.4.7节)，而对于制造150mg/mL浓度的药物物质，使用两步UF/DF。
下面的实施例显示了100mg/mL和150mg/mL的各批次DAC HYP之间的比较性分析。在几项研究中，将150mg/mL的DAC HYP批次与以10,000L规模制造的、下面被称为参照标准批次RS0801的100mg/mL DAC HYP批次相比较。
5.1.DAC HYP表达构建体
通过将鼠骨髓瘤细胞系NS-1与来自经自T-细胞白血病患者建立的人T-细胞系免疫的小鼠的脾细胞融合，从而制备产生抗-Tac、小鼠IgG2a单克隆抗体的杂交瘤(Uchiyama等，1981，J.Immunol.126(4)：1393-7)。选择抗-Tac是由于其与活化的T-细胞而非静息的T-细胞或B-细胞具有反应性。之后抗-Tac显示与人IL-2受体的α亚基反应(Leonard等，1982，Nature 300(5889)：267-9)。
小鼠抗-Tac的轻链和重链可变区氨基酸序列由各自的cDNA确定(Queen等，1989，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86(24)：10029-33)。如Queen等中所描述，小鼠抗-Tac的结合亲和力保留于人源化形式中。首先将鼠抗-Tac的互补决定区(CDR)移至人抗体Eu的受体框架上。借助三维模型，对决定CDR的构象以及进而结合亲和力关键的小鼠框架残基进行鉴定，并在受体框架中用人的对应部分替代。此外，受体框架中的非典型氨基酸被替换为人相应位点的共有残基以消除潜在的免疫原性。
如Queen等(1989)所描述，通过重叠寡核苷酸的退火和延伸将DAC HYPVL和VH基因构建为小外显子。对于表达IgG1形式的DAC HYP，如Cole等(1997，J.Immunol.159(7)：3613-21)和Kostelny等(2001，Int.J.Cancer93(4)：556-65)所概述，将所得VL和VH基因克隆入单个表达载体中，以构建pHAT.IgG 1.rg.dE(参见图3和图4A)。质粒pHAT.IgG 1.rg.dE含有达珠单抗IgG1重和κ轻链的基因，每个均处于在人巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下。该质粒含有大肠杆菌鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因作为选择标记。pHAT.IgG1.rg.dE中的遗传元件描述于下面表1中。
Figure BSA00000750254200211
dESV40启动子跨越pHAT.IgG1.rg.dE的位置6535至6735(6536-6562是72bp增强子A的27个残基；6566-6629是三个21bp的重复。6536-6735是Genbank：J02400.1(猿猴病毒40全基因组)中5127-1和1-133的反向互补序列)。通过DNA测序验证了表达载体中DAC HYP轻和重链基因的核苷酸序列。
5.2.DAC HY0稳定细胞系
小鼠骨髓瘤NS0细胞系获自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC目录#85110503，Salisbury，Wiltshire，UK)。将这些NS0细胞的小瓶解冻入添加了10％FBS的DMEM中。细胞于37℃在7.5％的CO2下保持于湿润的孵育器中。随后，在添加了1mg/mL BSA的SFM-3基础培养基中培养细胞。SFM-3是DEME与添加了10mg/mL胰岛素和10μg/mL转铁蛋白的Ham氏F-12以1∶1混合的混合物。在约3个月的时间里，通过逐渐减少存在于培养基中的FBS的量直至其被消除，并接着最终在单个步骤中去除BSA，从而使NS0细胞适应无添加物的SFM-3。所得宿主细胞系在SFM-3中传代15至20次并制备冷冻储存物。
用pHAT.IgG1.rg.dE(经FspI酶(New England Biolabs，目录编号R0135L，批次43)线性化)通过电穿孔转染适应SFM-3的细胞。简言之，将30-40μgpHAT.IgG1.rg.dE加入1×107个指数生长的适应的NS0细胞中，并利用GenePulser仪器(BioRad，Richmond，CA)在1.5kV，25μF下施以两次脉冲。电穿孔后，将细胞以20,000细胞/孔置于五个96孔板上的DMEM±10％FBS中，该密度有利于霉酚酸(“MPA”)选择之后形成每孔单个集落。如Hartman等2007，Biotech.&
Bioeng96(2)：294-306中所述，在霉酚酸存在下对已稳定整合载体的转染子进行选择。从产生高水平DAC HYP的NS0稳定转染子开始，通过有限稀释克隆或荧光活化细胞分选(FACS)在含有2.5％或5％胎牛血清(FBS；HyClone，Logan，UT)的PFBM-1中进行连续三轮亚克隆。在每轮亚克隆中，将一个最好的生产株用于下一轮亚克隆。在第三轮亚克隆后，选择出最终的生产细胞系(7A11-5H7-14-43)。随后通过在1mL 90％FBS/10％DMSO中(Sigma，St.Louis，MO)使每管1×107个细胞冷冻，从而制备最终生产细胞系的种储存物。
5.3.DAC HYP重组生产
5.3.1.细胞培养和回收
将细胞从单个细胞储存物管中解冻，并在T瓶、滚瓶、转瓶和生物反应器内逐渐增大的体积中扩增，直至达到生产规模。生产培养完成后，通过离心和深度过滤使细胞培养物液体澄清，并将其转移至收获物保存容器。生产培养持续期约10天。
如本领域已知，可以在多种不同的细胞培养设施中利用标准设备进行细胞培养和回收。在另一个实施例中，将细胞从单个细胞储存物管中解冻，并在摇瓶和生物反应器内逐渐增大的体积中扩增，直至达到生产规模。生产培养完成后，通过离心和深度过滤使细胞培养物液体澄清，并将其转移至收获物保存容器。生产培养持续期约10天。
5.3.1.1.接种物的制备
通过使单个的细胞储存物管解冻，起始生产批次。将细胞转移至含有化学限定性培养基Protein Free Basal Medium-2(PFBM-2)的T瓶中。可以通过要求无NaCl、酚红、转铁蛋白和胰岛素而制备的Hybridoma-SFM培养基粉末，从Invitrogen订购制备PFBM-2的定制粉末，所述Hybridoma-SFM培养基粉末包含当复原时产生5mg/L浓度的量的EDTA铁(III)钠盐，而其余组分的量调节为当复原时其浓度与复原后的杂交瘤-SFM相同。所制备的PFBM-2培养基包含以下组分：8g/L定制粉末、2.45g/L碳酸氢钠、3.1Sg/L NaCl和16.5g/L单水合D-葡萄糖(15g/L葡萄糖)。
通过此后每两天连续传代入滚瓶或转瓶中，使细胞扩增。将T瓶、滚瓶和转瓶置于孵育器中，其在37℃的温度设定点下在对于T瓶与滚瓶为7.5％CO2和对于转瓶为5％CO2的环境下运行。
依据细胞培养物的体积，通过叠加至顶部空间或通过注入到培养物中，对转瓶添加5％CO2，将叶轮转速控制为每分钟恒定的转动次数(RPM)。所有接种物扩增传代的目标接种密度为约2.5×105活细胞/mL。
此外，可以根据本领域已知的方法，利用多种标准的培养容器、体积和条件来制备接种物。例如，通过使单个的细胞储存物管解冻，起始生产批次。可以将细胞转移至含有化学限定性培养基Protein Free Basal Medium-2(PFBM-2)的摇瓶中。可以通过要求无NaCl、酚红、转铁蛋白和胰岛素而制备的Hybridoma-SFM培养基粉末，从Invitrogen订购制备PFBM-2的定制粉末，所述Hybridoma-SFM培养基粉末包含当复原时产生5mg/L浓度的量的EDTA铁(III)钠盐，而其余组分的量调节为当复原时其浓度与复原后的杂交瘤-SFM相同。所制备的PFBM-2培养基包含以下组分：8g/L定制粉末、2.45g/L碳酸氢钠、3.15g/L NaCl和16.5g/L单水合D-葡萄糖(15g/L葡萄糖)。可选地，在生物反应器阶段，可以例如以0.04mg/L的浓度加入七水合硫酸铜。
通过此后每两天连续传代入摇瓶中，使细胞扩增。将摇瓶置于孵育器中，其在37℃的温度设定点下在7.5％CO2的环境下运行。
以每分钟恒定的转动次数(RPM)在孵育器中的摇床上摇动摇瓶。所有接种物扩增传代的目标接种密度为约2.2-2.5×105活细胞/mL。
细胞储存物解冻后约14天，当已经产生足够数目的活细胞时，接种数个，通常3或4个不锈钢搅拌容器种生物反应器中的第一个。使用前，将种生物反应器原位清洁、原位蒸汽处理，并加入适宜体积的PFBM-2培养基。对生物反应器进行原位蒸汽处理前，校准pH和溶解氧探头。以足够数目的细胞接种第一个种生物反应器，以达到2.0-2.5×105活细胞/mL的初始细胞密度的目标。在每个反应器中生长约2天并达到2.0-2.5×105活细胞/mL的初始细胞密度目标后，向更大的体积进行连续转移(通常100L至300L，接着至1,000L种生物反应器，或60L至235L、950L和3750L种生物反应器)。通过自动控制加入CO2气体或1M碳酸钠(Na2CO3)，从而保持培养物pH。种和生产生物反应器的目标操作条件包括37℃的温度设定点，pH 7.0以及30％的溶解氧(作为空气饱和度的百分数)。100L、300L和1000L生物反应器分别以100rp、80rpm和70rpm搅动。在一些情况下，种和生产生物反应器的目标操作条件包括37℃的温度设定点，以注入CO2和加入碱控制的7.0的pH以及30％的溶解氧(作为空气饱和度的百分数)。较大体积的生物反应器可以以100rpm、80rpm、70rpm或40rpm的速度搅动。
5.3.2.生产细胞培养物的生物反应器
在1,000L种生物反应器中培养约2天后，将接种物转移至不锈钢搅拌容器生产生物反应器中。生产生物反应器具有约10,000L的工作体积。使用前，将生物反应器原位清洁、原位蒸汽处理，并加入约4,000L的PFBM-2培养基。对生物反应器进行原位蒸汽处理前，校准pH和溶解氧探头。
在另一个实施方式中，转移至具有约15,000L工作体积的不锈钢搅拌容器生产生物反应器中前，接种物在3750L种生物反应器中生长，使用前将生产生物反应器原位清洁、原位蒸汽处理，并加入约4,000-7,000L的PFBM-2培养基。
生产生物反应器的目标接种密度在2.0-2.5×105活细胞/mL的范围内。在培养过程中加入化学限定性Protein Free Feed Medium浓缩物(PFFM-3)(一种化学限定性浓缩型补料培养基，其通过复原PFFM3亚组分1和2、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、七水合磷酸氢二钠、L-酪氨酸、叶酸、盐酸和氢氧化钠制备)。
PFFM3含有表4中所示的组分：
Figure BSA00000750254200251
PFFM3亚组分1含有下面表5中所示的组分：
Figure BSA00000750254200252
Figure BSA00000750254200261
pFFM3亚组分2含有下面表6中所示的组分：
Figure BSA00000750254200262
Figure BSA00000750254200271
向培养物中加入PFFM-3的时机和量如下面表7中所示发生：
Figure BSA00000750254200272
通过自动控制加入CO2气体和1M碳酸钠(Na2CO3)，从而使培养物pH保持于约pH 7.0，优选pH 7.0至pH 7.1之间。溶解氧量允许下降至约30％的空气饱和度。将氧气/空气混合物注入培养物中以达到恒定的总气体流动速率，并通过按需调节空气对氧气的比率以及通过达到氧气对空气的最大比率后增加搅动速度，从而控制溶解氧。在另一个实施例中，对搅动进行调节，以保持恒定的功率/体积比率。将基于西甲硅油的消泡乳液按照基于泡沫水平的所需量加入生物反应器中。定期取样以测试细胞密度、细胞活力、产物浓度、葡萄糖和乳酸浓度、溶解的O2、溶解的CO2、pH和摩尔渗透压浓度。接种后约10天，收获生物反应器培养物。收获前，对生物反应器的内含物进行取样，作为未经处理的大量物质。
5.3.3.收获和细胞去除
临收获前，首先将生产生物反应器冷却至＜15℃，接着用0.5M或1M或2M柠檬酸调节至pH 5.0±0.1，并保持约30-90或45-60分钟的时间，以在转移至收获容器前使细胞和细胞碎片絮凝。随后通过连续离心使经pH调节的收获物澄清，所述离心在如批次记录文件中所限定的碗速(bowl speed)和流动速率的预设参数下运行。
通过深度过滤器随后通过0.22μm膜过滤器对离心分离液进行过滤，并收集于预先灭菌的容器中。利用1-2M Tris溶液将无细胞的收获物调节至约pH6.4，并储存于2-8℃以供进一步处理。在一些情况下，该pH调节发生于将初始生物反应器的pH调节至pH 5.0的12小时内。
5.4.DAC HYP的纯化
5.4.1.概述
设计DAC HYP纯化和配制过程，以相对于ZENAPAX生产过程提高效率，并确保持续清除产物和过程相关的杂质。以下小节描述了纯化过程。纯化是基于三种层析技术(蛋白A亲和层析，Q Sepharose阴离子交换层析，和CM-650(M)阳离子交换层析)以及低pH病毒灭活、病毒过滤、超滤/渗滤和配制步骤。所有步骤发生于封闭的设备中。DAC HYP纯化过程的概述呈现于图5中并在下面讨论。
5.4.2.蛋白A层析
蛋白A亲和层析步骤是下游操作次序中的第一个纯化步骤。依据柱的尺寸，该步骤发生于一次或多次循环中，对于表8A中描述的柱通常是两次或三次循环(即无细胞收获物被分成两等份，随后将每等份单独上样到蛋白A柱上并洗脱)。重组蛋白A亲和层析树脂特异性结合IgG，将抗体从细胞培养收获物的其他组分中分离出来。
在用平衡缓冲液平衡蛋白A柱后，使经中和的无细胞收获物流经柱，以使抗体结合到柱树脂上。平衡缓冲液是20mM柠檬酸钠、150mM氯化钠、pH 7.0。将柱上样至不大于每升填充树脂35克抗体(蛋白)的容量。上样后，用平衡缓冲液清洗柱，以从树脂上去除未结合和松散结合的杂质，并用柠檬酸缓冲液预洗脱，以调节柱上柠檬酸和氯化钠的浓度。柠檬酸缓冲液是10mM柠檬酸钠，pH 7.0。随后利用pH 3.5的10mM柠檬酸钠洗脱缓冲液以pH跃阶变化将已结合的抗体从柱上洗脱下来。蛋白A层析条件的概要列于表8A中：
Figure BSA00000750254200291
随着产物从柱上洗脱下来，在280nm波长下监测流出物的吸光值，并用其指导产物级分的收集(参见图6)。
含有氢氧化钠和苯甲醇的消毒缓冲液的使用有利地杀灭了大范围的微生物，同时对蛋白A树脂的质量影响最小。为了阐述这一点，将多种消毒溶液与多种微生物混合并孵育一段时间。在不同的孵育时间间隔，将混合消毒缓冲液的一部分中和，测定微生物滴度并与对照相比较。微生物活性以一段时间中微生物对数的减少表示。表8B显示了微生物滴度的减少，其作为与消毒缓冲液(20mM氢氢化钠、200mM柠檬酸钠和1％苯甲醇)接触时间的函数。
表8C显示了不同消毒缓冲液作用下的微生物减少：
Figure BSA00000750254200303
Figure BSA00000750254200311
A＝50mM NaOH，0.5M NaCl(60min)
B＝20mM NaOH，200mM柠檬酸钠，1％苯甲醇(60min)
C＝200mM柠檬酸钠，0.5％苯甲醇(48hr)
D＝2％苯甲醇(24hr)
前面的数据显示含有苯甲醇和氢氧化钠的消毒溶液对杀灭大量微生物非常有效，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、孢子形成细菌、酵母和真菌。在常规消毒30分钟后，在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色假丝酵母上观察到了大于5个对数级(log10)的减少。尽管杀灭真菌(黑曲霉)耗时较长，但是在细胞培养物液体中也很少有真菌感染。从生物技术设施中分离出的最常见的微生物是芽孢杆菌、假单胞菌和葡萄球菌。在30分钟接触时间后，这些都可以被消毒溶液有效杀灭。相比之下，单独的氢氧化钠或苯甲醇不能有效杀灭所有微生物。而且，氢氧化钠消毒溶液不能杀灭形成孢子的芽孢杆菌。
5.4.3.保持低pH以灭活病毒
设计该步骤以灭活对低pH敏感的内源性病毒样颗粒和病毒。将每个蛋白A循环中的蛋白A洗脱液洗脱入收集容器中，其中加入0.5M HCl直至达到pH3.5±0.1。将产物转移至保持容器，其中通过另一个pH计验证pH。将低pH保持步骤严密控制于pH 3.5±0.1或±0.2(如pH 3.35-3.64)进行30-120分钟或30-240分钟。保持30-120分钟后，利用1M Tris碱将经病毒灭活的洗脱液中和至pH 7.8±0.1或±0.3(如pH 8.05-8.34)，随后通过0.22μm过滤器转移至产物池容器中。低pH病毒灭活条件的概要列于表9中：
Figure BSA00000750254200321
*可选的，中和后pH目标可以是25℃，8.2。
5.4.4.Q sepharose阴离子交换流过层析
Q Sepharose阴离子交换层析步骤用于减少产物和过程相关的杂质(如核酸、宿主细胞蛋白、产物聚集体、沥出的蛋白A配体等)并为纯化过程提供额外的病毒清除能力。以一定方式选择上样电导率和pH，以使抗体流经柱并且带负电荷的杂质，如宿主细胞蛋白和细胞DNA与带正电荷的树脂结合。
用20mM tris、20mM氯化钠、pH 7.8的平衡缓冲液平衡阴离子交换柱。将来自低pH保持步骤的经pH调节的产物上样到柱上，至每升填充树脂不大于60克抗体(蛋白)或不大于30-60克抗体(蛋白)的容量。上样完成后，用平衡缓冲液将未结合的抗体和杂质从柱上去除。
通过在280nm波长下监测流出物的吸光值来指导产物的收集(参见图7)。
消毒流速为100cm/hr，保持时间为60min。
O sepharose层析条件的概要列于表10中：
Figure BSA00000750254200331
对于某些用途，储存缓冲液体积设置点为3，而柱储存温度被设置为5-25℃。
5.4.5.CM-650(M)阳离子交换层析
该层析步骤是过程中利用的最后步骤，以减少痕量水平的过程和产物相关杂质。除了减少抗体的聚集体和切割片段之外，该步骤还使过程相关的杂质减少，如宿主细胞核酸和蛋白以及沥出的蛋白A。
用20mM柠檬酸钠、pH 4.5的平衡缓冲液平衡柱。用0.5M柠檬酸将阴离子交换洗脱液池调节至pH 4.5±0.1或±0.2(如4.35-4.64)，并将其上样到柱上至每升填充树脂不大于25或30克抗体(蛋白)的目标上样容量。结合步骤之后，用平衡缓冲液清洗柱，以将任何未结合或松散结合的杂质从树脂上去除。随后用20mM柠檬酸钠、75mM硫酸钠、pH 4.5的洗脱缓冲液以一步洗脱模式将已结合的抗体从柱上洗脱下来。通过在280nm波长下监测流出液的吸光值来指导峰的收集(参见图8)
CM-650(M)层析条件的概要列于表11中：
Figure BSA00000750254200332
Figure BSA00000750254200341
*可选的，不使用稀释缓冲液。
5.4.6.纳米过滤
纳米过滤步骤的目的是为纯化过程提供额外的病毒清除能力。该步骤中通过大小排阻机制将病毒和病毒样颗粒去除。过滤器的孔隙设计为能使抗体穿过过滤器而将病毒样颗粒和病毒保留于过滤器上侧上。
使已经0.22μm或0.1μm过滤器过滤的阳离子交换洗脱液穿过保留小病毒的纳米过滤器，随后用无聚山梨酯80的DAC HYP配制缓冲液(40mM琥珀酸盐、100mM氯化钠、pH 6.0)冲洗过滤器。应用缓冲液冲洗步骤以回收管线和过滤器网罩中残留的抗体。
纳米过滤参数的概要列于表12中：
*或＞50L/m2
**或＞50L/m2
Figure BSA00000750254200352
或约50L/m2。
5.4.7.超滤/渗滤(UF/DF)
设计该步骤以浓缩产物并使产物中的缓冲液与无聚山梨酯80的DACHYP配制缓冲液交换。该步骤利用30kDa额定分子量的截留膜以切向流模式运行。利用两个超滤/渗滤阶段，以基于终浓度的预期产物体积和每个UF系统的相对滞留体积产生150mg/mL的制剂。
利用大型UF系统进行第一阶段处理(参见图9)。首先将纳米过滤滤液浓缩至约30mg/mL，随后使其渗滤至交换缓冲液(无聚山梨酯80的配制缓冲液)中。将经渗滤的抗体溶液进一步浓缩至约100mg/mL，随后以约55mg/mL的浓度从UF/DF系统回收并转移穿过0.22μm过滤器。经渗滤的抗体溶液也可以以约20-60mg/mL的浓度回收。第一阶段参数的概要列于表13中：
Figure BSA00000750254200353
Figure BSA00000750254200361
*或0.1M NaOH
**或2次40min
Figure BSA00000750254200362
或20-70范围。
用较小UF系统进行第二阶段处理，但使用相同的30kDa截留膜。将DACHYP溶液(通常55mg/mL)浓缩至约180mg/mL，从UF系统中回收，随后转移穿过0.22μm过滤器。用无聚山梨酯80的配制缓冲液冲洗UF系统并转移穿过0.22μm过滤器，获得约170mg/mL或约150-170mg/mL的经纯化的药物物质。
第二阶段参数的概要列于表14中：
Figure BSA00000750254200363
Figure BSA00000750254200371
**或2次40min。
5.5.配制DAC HYP
最后的过程步骤是将经纯化的药物物质稀释至150或100mg/L±10％的最终目标浓度，即在含有适宜浓度的聚山梨酯80的缓冲液中150±15mg/mL(150mg/mL制剂的情况下)或100±10mg/mL(100mg/mL制剂的情况下)的最终目标浓度。配制分阶段进行。
例如首先将无聚山梨酯80的配制缓冲液(40mM琥珀酸钠、100mM氯化钠、pH 6.0)加入经纯化的药物物质中，以达到所配制药物物质的目标体积90％。随后加入计算量的聚山梨酯80稀释缓冲液(40mM琥珀酸盐、100mM氯化钠、1％聚山梨酯80、pH 6.0)以达到最终制剂中聚山梨酯80目标浓度0.03％(w/v)。最后，用无聚山梨酯80的配制缓冲液(对于150mg/mL制剂由琥珀酸盐和琥珀酸制成，对于100mg/mL制剂由琥珀酸盐和HCl制成)调节产物体积，以达到150±15mg/mL(优选150±8mg/mL)的最终抗体浓度。100mg/mL药物产物以类似方式配制至100±10mg/mL(优选100±5mg/mL)的终浓度。
所配制的药物物质通过0.22μm过滤器过滤入置于半刚性圆柱形支持物中的BioProcess Container TM
Figure BSA00000750254200372
袋(或等同物)。支持物以盖封闭BPC，并提供弹性袋和外部环境之间的保护性屏障。所配制的药物物质在进入受控的(access-controlled)冷却器中储存于2-8℃，以用于药物产物充入/完成操作。
制剂条件的概要列于表15中：
Figure BSA00000750254200373
Figure BSA00000750254200381
将1mL药物产物充入瓶或注射器中。完成的150mg/mL和100mg/mL产物中组分的概要具有表16中显示的组分(所有的量均是额定值)：
Figure BSA00000750254200382
5.6.DAC HYP药物物质的表征
DAC HYP在两个重链亚基的氨基酸296处被糖基化，其中主要寡糖形式以缺少末端半乳糖的核心岩藻糖化双天线结构存在。
DAC HYP重链的N-末端以三种主要形式存在：1)N-末端谷氨酰胺(由DNA序列预测)，2)N-末端焦谷氨酸(来自N-末端谷氨酰胺的环化)和3)N-末端缬氨酸、组氨酸和丝氨酸残基以及预测的N-末端谷氨酰胺残基(得自信号肽的不完全切割)。
DAC HYP重链C-末端以有和没有C-末端赖氨酸残基的形式存在。其主要形式缺少C-末端赖氨酸残基，产生C-末端甘氨酸。
DAC HYP具有144kDa的分子量，其基于由核苷酸序列限定的一级氨基酸组成计算得出。还原的重链的相应分子量是48.9kDa，还原的轻链是23.2kDa。这些分子量未将碳水化合物含量或翻译后修饰考虑在内。
DAC HYP与CD25高度特异性结合，CD25表达于活化的而非静息的T和B淋巴细胞上。DAC HYP与这些活化的细胞上的CD25的结合阻断了IL-2与CD25的结合以及随后高亲和力IL-2受体复合物的形成。因此，IL-2诱导的活化细胞的增殖被阻断。据信观察到的和潜在的DAC HYP治疗效力大部分依赖于其对活化的自反应T细胞的增殖的抑制作用。然而，DAC HYP也可以通过其对其他带有CD25的细胞类型(如嗜酸性粒细胞)的阻断作用而发挥治疗作用。
为了证实高浓度150mg/mL DAC HYP制剂适于临床研究，进行综合的物理化学和生物评价，以对本文中被称为批次1和批次2(或分别是批次150-1或批次150-2)的两批次DAC HYP 150mg/mL药物物质进行表征并与来自以10,000L规模制造的DAC HYP 100mg/mL批次的参照标准批次RS0801相比较。
结果表明，DAC HYP药物产物150mg/mL批次为高纯度，与100mg/mL批次类似，并适于用于临床研究。这些特性的概要显示于表17中：
Figure BSA00000750254200391
Figure BSA00000750254200401
5.6.1.颜色、外观和澄清度
通过在直射光下针对黑色背景和白色背景在不放大的情况下肉眼检查溶液的颜色和澄清度来评估DAC HYP药物物质的外观。还评价了溶液中可见颗粒的存在。各批次DAC HYP药物产物的典型外观描述于表17中。
5.6.2.pH测定
按照美国药典规程<791>号测定DAC HYP的pH。多个批次的DAC HYP药物产物的pH范围汇总于表17中。
5.6.3.UV光谱测定产物浓度
通过UV光谱测定DAC HYP的浓度。用缓冲液依重量对DAC HYP样品进行稀释。在278nm下针对缓冲液空白测量每个经稀释样品溶液的UV吸光值。利用DAC HYP吸收系数计算样品的蛋白浓度。多个批次的DAC HYP药物产物的蛋白浓度汇总于表17中。
5.6.4.N-末端测序
通过N-末端测序对DAC HYP 150mg/mL批次进行评价。利用自动Edman降解测序仪分析样品。
轻链前15个残基的预期氨基酸序列DIQMTQSPSTLSASV(SEQ ID NO：13)在所有样品中得到证实。
DAC HYP中大多数重链被焦谷氨酸残基(pE)封闭，将不会产生N-末端重链序列。DAC HYP中次级最普遍的N-末端重链序列以缬氨酸、组氨酸、丝氨酸(VHS)序列起始，其得自重链信号肽三个末端残基未被加工。VHS重链序列前十五个N-末端残基中的十四个(VHSQVQLVQSGAEVK(SEQ IDNO：14))在所有样品中得到证实。由于之前的测序循环中从LC检测到的大量谷氨酰胺，第四个残基谷氨酰胺不能被证实。重链具有N-末端谷氨酰胺的证据也存在于所有样品中。该序列是天然N-末端重链谷氨酰胺残基未经环化成焦谷氨酸形式的结果。150mg/mL批次的N-末端测序结果与由重链和轻链编码序列预测的序列一致。100mg/mL批次获得了类似的结果。
5.6.5.重链和轻链质量分析
通过液相层析质谱(LC-MS)分析评价DAC HYP 150mg/mL批次和参照标准RS0801重链和轻链的分子量。所有批次用酰胺酶PNGasesF去糖基化，用二硫苏糖醇还原，用碘乙酸烷基化，并通过反相层析分离。由蛋白序列计算重链和轻链的理论质量。如下面表18中所示，所观察到的样品的分子量在计算分子量的1Da之内：
Figure BSA00000750254200421
如前面小节中所描述，已知两种最普遍的DAC HYP重链形式含有N-末端焦谷氨酸(pE)残基或缬氨酸、组氨酸、丝氨酸(VHS)序列并且不含C-末端赖氨酸。对于150mg/mL批次中两种主要重链变体和轻链所获得的质量与参照标准RS0801类似，并与由蛋白序列预测的质量一致。
重链和轻链的质量结果与以下小节中呈现的肽图谱结果共同证实了DAC HYP 150mg/mL批次中存在预期的轻链和重链一级结构。
5.6.6.肽图谱
利用反相HPLC肽图谱对DAC HYP 150mg/mL批次和参照标准RS0801(产自以10,000L规模制造的100mg/mL药物物质的DAC HYP)进行评价。所有批次用二硫苏糖醇还原，用碘乙酸烷基化，并用胰蛋白酶酶促消化。所得肽通过反相层析分离并通过在215nm下的紫外吸光值进行检测以产生肽图。
为了确定一级氨基酸序列，将150mg/mL批次的肽图谱与参照标准RS0801进行比较。在参照标准RS0801的肽图谱中，与预期的重链和轻链残基的百分之九十八相对应的肽之前已经通过质谱鉴定。肽图谱中未被考虑在内的残基是非常极性的二肽中的单个氨基酸或残基，未预期其被反相柱滞留。在参照标准中已经鉴定出与重链N-末端肽N-末端处的焦谷氨酸、谷氨酰胺和VHS序列一致的质量。DAC HYP在重链Fc部分Asn296处含有一致的N-连接糖基化位点，对于含有Asn296残基的肽，已经鉴定出与连接的复杂双天线寡糖核心结构一致的质量。
比较DAC HYP 150mg/mL批次和参照标准RS0801的肽图谱显示于图10(0至60分钟)、图11(55至115分钟)和图12(110至170分钟)中。DAC HYP150mg/mL批次的肽图谱与参照标准类似，并证实150mg/mL批次中存在预期的一级结构。
5.6.7.圆二色光谱
通过远紫外圆二色光谱(far-UV CD)对DAC HYP 150mg/mL批次和参照标准RS0801进行分析，以评价二级结构。分析前，用水将样品稀释至0.2mg/mL的蛋白终浓度。利用0.1cm小室在195至260nm下获取光谱，所获得的信号减去缓冲液后转换为摩尔椭圆率。
DAC HYP 150mg/mL批次批次1和批次2以及参照标准RS0801的覆盖far-UV CD光谱显示于图13中。所有批次的光谱显示出在约202nm下的正带和在约217nm下的负带。在217nm下的负带是IgG分子主要构象β片层构象的特征。各批次的far-UV CD光谱相似，这支持了DAC HYP 150mg/mL批次和参照标准RS0801之间具有相同的二级结构。
5.6.8.紫外光谱
通过紫外(UV)光谱对DAC HYP 150mg/mL批次和参照标准RS0801进行分析以评价三级结构。分析前，用配制缓冲液(40mM琥珀酸盐、100mM氯化钠、0.03％聚山梨酯80、pH 6.0)将样品稀释至0.5mg/mL的蛋白终浓度。用1cm路径长度的石英比色皿获取在250nm至350nm下的光谱并将其以280nm下1.0的吸光度归一化。
覆盖的零级和二级导数UV光谱(由平滑的零级数据计算)分别显示于图14A和14B中。被评价的所有批次的零级和二级导数光谱是可叠加的，这支持了DAC HYP 150mg/mL批次批次1和批次2以及参照标准RS0801之间具有相同的三级结构。
5.6.9.大小排阻层析
利用带有含水流动相的多孔硅土柱进行大小排阻层析(SEC)，并在280nm下检测紫外吸光值。具体地，利用洗脱缓冲液(200mM KPO4、150mMKCl、pH 6.9)等度梯度以1mL/min的流速在装配0.5μm柱前过滤器(Upchurch产品编号A-102X)的7.8mm×30cm TSK G3000SWxL柱(Tosoh Biosciences，产品编号601342)上于室温对15μL测试样品(洗脱缓冲液中的20mg/mL抗体)进行分析。
如图15A(全比例)和图15B(扩展比例)中所显示，DAC HYP 150mg/mL批次的层析谱与参照标准RS0801类似。所有批次显示相同的对应于达珠单抗单体的主峰和次要的聚集体峰。如下面表19中所显示，DAC HYP 150mg/mL批次的聚集体结果与DAC HYP 100mg/mL批次类似：
Figure BSA00000750254200441
利用带有多角度光散射检测的SEC(SEC-MALS)对150mg/mL批次和参照标准RS0801进行分析，以确定聚集体峰分子量。对于所有批次，获得的聚集体峰分子量为约300kDa，这与抗体二聚体一致。
在18个月的时间内监测DAC HYP中聚集体的形成。当于5℃储存18个月时，制剂中聚集体水平升高，但聚集体的百分数稳定且没有超过约1.5％(参见图16)。新批次的新数据表明，当储存于5℃时，约1.8-1.9％的聚集体可能在6周时出现，但对于所有被测样品，当储存于5℃时，在5年时间内仅形成少于3％的聚集体。
5.6.10沉降速率分析型超速离心
利用沉降速率分析型超速离心(SV-AUC)对DAC HYP 150mg/mL批次和100mg/mL批次中的单体和聚集体进行表征。单体和每种聚集体的沉降系数值和相对丰度显示于下面表20和21中。
Figure BSA00000750254200442
Figure BSA00000750254200443
单体是每个批次中观察到的主要组分。单体峰的沉降系数在批次之间高度一致，表明单体的构象在150mg/mL和100mg/mL批次之间是类似的。150mg/mL批次的单体含量与100mg/mL批次类似。
每个批次中的主要聚集体种类具有与抗体二聚体一致的沉降系数。这与SEC-MALS结果一致，表明SEC聚集体峰主要由抗体二聚体构成(参见前面的小节)。通过AUC，在每个批次中还观察到低水平的两种较大聚集体种类，其具有与三聚体和四聚体一致的沉降系数。150mg/mL批次中的二聚体、三聚体和四聚体含量与100mg/mL批次类似。
5.6.11定量还原SDS-PAGE
利用4-20％(通常14％)tris-甘氨酸凝胶和胶态蓝染色通过SDS-PAGE确定纯度。在还原条件下以10μg的样品上样量对样品进行分析。通过用如密度测定法测定的重链和轻链条带面积的总和除以总条带面积来计算纯度。
如下面表22中所显示，150mg/mL批次为高纯度并与100mg/mL批次类似：
Figure BSA00000750254200451
5.6.12定性SDS-PAGE
通过还原和非还原凝胶电泳评价DAC HYP的纯度。用预制的14％或8-16％的Tris-甘氨酸凝胶进行分析。如前所述，将两批次150mg/mL DAC HYP制剂的等份与参照批次比较。分析DAC HYP纯度的还原和非还原凝胶显示于图17中。150mg/mL比次的带型与参照标准RS0801类似，在150mg/mL比次中没有检测到新条带。
5.6.13阳离子交换层析
利用阳离子交换层析(CEX)对DAC HYP150mg/mL批次和100mg/mL批次的电荷同等型分布进行分析。利用无孔的、羧酸盐官能化的弱阳离子交换柱进行CEX，并在220nm下检测。100μL测试样品(溶解于缓冲液A中的1mg/mL抗体)于室温在装配ProPac WCX-10G保护柱(DioneX公司)的ProPacWCX-10柱(Dionex公司)上利用下列分离梯度进行解析(柱用缓冲液A平衡)：
Figure BSA00000750254200461
缓冲液A＝15mM磷酸钠pH 5.9
缓冲液B＝250mM NaCl，15mM磷酸钠pH 5
如图18中所显示，150mg/mL批次的CEX层析图与参照标准RS0801一致，150mg/mL批次中没有检测到新的电荷同等型。在CEX层析图中存在的五个主要同等型是由于重链N-末端的异质性产生，其包括：1)两个焦谷氨酸残基(pE/pE)；2)一个焦谷氨酸残基和一个谷氨酰胺残基(pE/Q)；3)一个焦谷氨酸残基和一个VHS序列(位于成熟重链N-末端谷氨酰胺残基前面的截短的VHS信号肽)(pE/VHS)；4)一个谷氨酰胺残基和一个VHS序列(Q/VHS)；5)两个VHS序列(VHS/VHS)。图18中还解析并鉴定了C-末端赖氨酸(K)同等型。上面描述的每种N-末端同等型可以以不同的C-末端同等型(0，1，或2K)存在。由于混合物的复杂性，利用所描述的方法仅清楚地解析了和可测定主要pE/pE和pE/VHS同等型的C-末端同等型。
表23和24中分别提供了150mg/mL批次和100mg/mL批次的N-和C-末端同等型的定量结果，其中所报告的百分数是基于在具体峰的曲线下面积(AUC)与所有峰的总AUC相比的百分数：
Figure BSA00000750254200462
Figure BSA00000750254200471
5.6.14.寡糖图谱
通过寡糖图谱对DAC HYP150mg/mL批次和100mg/mL批次的寡糖分布进行分析。利用酰胺酶PNGaseF使N-连接的寡糖从重链Asn296中酶切释放。随后用荧光标记(在这种情况下为邻氨基苯甲酸)使寡糖衍生化，并通过尼龙膜从抗体中分离。衍生化的、切割下的N-连接的聚糖于50℃在带有荧光检测的250×4.6mm聚合-胺键合的Asahipak Amino NH2P-504E柱上(5μm粒径，Phenomenex，目录编号CHO-2628)利用下列洗脱梯度进行解析(使用100μL的样品注入体积；柱用85％的缓冲液A/15％的缓冲液B平衡)：
Figure BSA00000750254200473
Figure BSA00000750254200481
缓冲液A＝1％v/v四氢呋喃，2％v/v醋酸，在乙腈中
缓冲液B＝1％v/v四氢呋喃，5％v/v醋酸，3％v/v三乙胺，在水中
比较150mg/mL批次和参照标准RS0801的层析图显示于图19中。表25中标记并报告了占总峰面积至少1.0％的寡糖峰：
Figure BSA00000750254200482
所有批次主要由G0和G0-GlcNAc(在双天线结构的一个臂上缺少GlcNAc的G0)组成，这代表DAC HYP过程。唾液酸化寡糖在约68分钟洗脱，其在所有被测批次中低于1.0％。被称为峰3的未表征寡糖在所有被测样品中以相似丰度存在。
5.6.15.氧化
通过监测存在于肽图谱中的氧化型和非氧化型胰蛋白酶肽，对DACHYP批次潜在的蛋氨酸氧化进行评价。利用质谱提取离子层析图确定每种含蛋氨酸肽的非氧化型和氧化型峰面积。对于每种蛋氨酸残基，通过用氧化型肽的质谱峰面积除以氧化型和非氧化型肽的峰面积之和，计算氧化型蛋氨酸的百分数。
如下面表26中所显示，150mg/mL批次和五个100mg/mL批次的蛋氨酸氧化结果类似：
重链Met251和Met427最不稳定，并显示出最大程度的氧化。在同时被测以评价可比性的批次中，Met251和Met427的氧化水平分别不超过4.8％和1.8％。
5.6.16.结合效力(CD25的结合)
通过ELISA对DAC HYP150mg/mL和100mg/mL批次与IL-2受体α亚基(CD25)的结合进行评价，作为释放测试的一部分测定效力。将可溶性CD25固定化到微量滴定板上，并与不同量的DAC HYP孵育。先后利用偶联辣根过氧化物酶的山羊抗人IgG抗体和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物对已结合的DAC HYP进行检测。利用4参数拟合，将所得吸光值对DAC HYP浓度的log10作图，利用平行线分析产生相对效力值的百分数。
药物物质结果汇总于下表：
Figure BSA00000750254200511
150mg/mL批次的结合效力结果与100mg/mL批次类似。
5.6.17.表面等离振子共振(CD25的结合)
进行表面等离振子共振分析，以确定DAC HYP与IL-2受体α亚基(CD25)结合相互作用的亲和常数(KD)。
将山羊抗人IgG Fc抗体固定化于芯片表面以捕获DAC HYP样品，之后利用自动化方法将不同浓度的可溶性CD25一式两份注入到捕获的DAC HYP上。收集结合数据并使用参照流室和缓冲液空白进行校正，并用BIAEvaluation软件利用1∶1的Langmuir模型进行拟合，以获得平衡常数。
DAC HYP150mg/mL批次和参照标准RS0801的结果汇总于表28中：
Figure BSA00000750254200512
Figure BSA00000750254200521
150mg/mL批次的缔合常数(Ka)、解离常数(Kd)和亲和常数(KD)值与参照标准RS0801类似。
5.6.18.功能效力
作为释放测试的一部分，对DAC HYP 150mg/mL批次和100mg/mL批次的功能效力进行评价。功能效力测试测定DAC HYP与IL-2受体α亚基(CD25)的结合对IL-2诱导的T-细胞增殖的抑制。在IL-2的存在下，将不同量的DACHYP与表达IL-2受体的KIT-225K6细胞(Hori等，1987，Blood 70：1069-1072)孵育。随后利用alamar蓝检测DAC HYP对T-细胞增殖的抑制。利用4参数拟合，将所得荧光值对DAC HYP浓度的log10作图，利用平行线分析产生相对效力值百分数。
功能效力的结果汇总于表29中：
Figure BSA00000750254200522
150mg/mL批次的功能效力结果与100mg/mL批次类似。
5.6.19.抗体依赖性细胞的细胞毒性
相对于参照标准RS0801100mg/mL DAC HYP，对两批次的DAC HYP150mg/mL制剂进行评价。
用51Cr标记表达IL-2受体的KIT-225K6细胞，随后与DAC HYP孵育。加入不同量的人效应细胞(PBMC)，以获得不同的效应细胞与靶细胞(KIT-225K6)的比率。带有Fc受体的单核细胞与DAC HYP Fc域相互作用并随后引起靶细胞裂解。细胞毒性程度通过测定51Cr从靶细胞的释放而确定，并以最大细胞裂解的百分数表示。
每个样品使用来自多个供体的PBMC。对于每个供体，基于细胞毒性百分数、相对于参照标准RS0801计算样品的ADCC活性百分数。ADCC结果汇总于下面表30中：
150mg/mL批次、参照标准RS0801、阳性和阴性对照抗体以及无抗体对照(抗体非依赖性细胞毒性或AICC)的应答曲线显示于图20中。
150mg/mL批次的ADCC活性与参照标准RS0801类似。
5.6.20.残留的蛋白A
通过ELISA方法测定残留的蛋白A，其中用变性缓冲液对标准品、样品对照、空白板和测试样品进行稀释并置于沸水浴中以使蛋白A解离，并使达珠单抗变性和沉淀。煮沸之后，将标准品、对照和样品冷却，离心，并加入到包被有多克隆抗蛋白A捕获抗体的微量滴定板中。接着先后利用生物素化的抗蛋白A抗体及链霉亲合素碱性磷酸酶和对硝基苯基磷酸盐(PNPP)底物对样品中的残余蛋白A进行检测。在分光光度酶标仪中分析板并生成log-1og标准曲线，由此确定蛋白A的浓度。测试样品结果以份数每百万份(ppm)单位报告。通过将ng/mL蛋白A的结果除以以mg/mL计的测试样品抗体浓度来计算份数每百万份结果。
5.6.21.DNA含量
在合同实验室中利用定量聚合酶链式反应(Q-PCR)测试方法确定对小鼠DNA的检测。在该方法中，对样品进行DNA提取。接着利用小鼠特异性引物和探针扩增小鼠DNA重复元件的特异性片段，通过Q-PCR分析样品提取物。DNA扩增使得产生被检测的荧光信号。通过与使用已知量的小鼠DNA生成的标准曲线相比较，从而定量测定样品中的DNA。结果表示为皮克DNA每毫克抗体。不同批次的DAC HYP药物产物中的平均DNA含量汇总于表17中。
5.6.22.宿主细胞蛋白(HCP)
利用市售试剂盒对产物中残留的宿主细胞蛋白进行定量。使用针对NS0细胞裂解物的、经亲和纯化的山羊多克隆抗体捕获和检测NS0 HCP。通过从模拟生产过程中收集无细胞收获物，从而产生HCP标准品。使用HCp工作标准品制备标准曲线，并将含有HCP的样品系列稀释以达到标准曲线的范围。将标准品、样品对照和测试样品加入到包被有抗-NS0HCP多克隆抗体的板中。接着先后利用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗-NS0HCP多克隆抗体和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物检测宿主细胞蛋白。接着在分光光度酶标仪上分析板并生成四参数曲线拟合，以对样品中HCP的量进行定量。
NS0 HCP ELISA测试结果以份数每百万份(ppm)单位报告。通过将ng/mL HCP的结果除以mg/mL抗体浓度，计算份数每百万份的结果。各批次DAC HYP药物产物的平均HCP汇总于表17中。
5.6.23.聚山梨酯80的浓度
利用分光光度法对聚山梨酯80进行定量，该方法基于与聚山梨酯80形成有色的硫氰酸钴复合物。利用一系列聚山梨酯80标准品构建标准曲线。从标准曲线中确定样品中聚山梨酯80的浓度。多个批次DAC HYP药物产物中聚山梨酯的浓度范围汇总于表17中。
5.6.24.摩尔渗透压浓度
利用蒸汽压降低渗透压计测定摩尔渗透压浓度。分析样品前，利用具有预期样品摩尔渗透压浓度的摩尔渗透压浓度标准品对渗透压计进行校准。多个批次DAC HYP药物产物的摩尔渗透压浓度范围汇总于表17中。
5.6.25.结论
所进行的物理化学和生物分析提供了对DAC HYP 150mg/mL和DACHYP 100mg/mL制剂的综合评价。目前为止，所有测试批次的物理化学和生物特性类似。
对于所有的DAC HYP批次，通过N-末端测序确定的重链和轻链前15个氨基酸、肽图谱和分子量分析与达珠单抗基因序列一致。
如通过SEC-MALS和SV-AUC所测定，被测所有150mg/mL和100mg/mL批次中聚集体水平和聚集体种类的大小分布类似，通过凝胶电泳测试的其纯度也是如此。
150mg/mL批次的电荷同等型分布与100mg/mL批次相似，仅在N末端同等型pE/VHS(150mg/mL批次＝31％pE/VHS；100mg/mL批次＝34至42％pE/VHS)和Q/VHS(150mg/mL批次＝11到12％Q/VHS；100mg/mL批次＝4至9％Q/VHS)的相对量中存在细微差异。DAC HYP的特性如下：
CEX测定的N-末端同等型：
pE/pE：31-46％
pE/Q：7-12％
pE/VHS：31-42％
Q/VHS；3-12％
VHS/VHS：1-17％
CEX测定的C-末端同等型：
0K：53-80％
1K：14-28％
2K：5-19％
DAC HYP的N-连接聚糖分布如下：
G0-GlcNAc：7.2％-14.6％
G0：80.9-88.2％
峰3：1.3-1.7％
G1：1.4-3.8
测定的DAC HYP氧化水平很低。
如ELISA和表面等离振子共振CD25结合实验中所证实，DAC HYP是具有生物活性的，并且能够抑抑制IL-2诱导的T-细胞增殖。DAC HYP的特征还在于储存中聚集体水平低。
5.7.DAC HYP的稳定性
高浓度的DAC HYP制剂储存稳定。以下表格提供了150mg/mL DACHYP药物物质批次的稳定性数据。
下面表31提供了在推荐条件下(2-8℃)在50mL袋中储存后的稳定性数据。下面表32提供了于23-27℃在50mL袋中储存的加速稳定性数据。下面表33提供了加压稳定性数据。
Figure BSA00000750254200561
Figure BSA00000750254200571
5.8.不同形式的达珠单抗之间的比较
Hoffman-La Roche公司(“Roche”)制造了一种以ZENAPAXTM上市销售的达珠单抗静脉内用制剂，其用于治疗同种异体移植物排斥(已被终止)。DAC Penzberg是100mg/mL的达珠单抗皮下用制剂，其由PDL BioPharma用于临床试验中(参见下面5.9.1节描述的CHOICE研究)。
DAC HYP、ZENAPAX DAC和DAC Penzberg制剂之间的比较显示于表34中。在该表中，配制缓冲液是DAC渗滤入以得到最终制剂的缓冲液。因此，记录的浓度是额定浓度：
Figure BSA00000750254200581
将DAC HYP的多个特征与ZENAPAX DAC和DAC Penzberg的相比较。
DAC HYP与ZENAPAX DAC的糖基化之间的比较显示于图21中。对三种形式的达珠单抗的示例性批次的分析显示于表35中：
Figure BSA00000750254200582
DAC HYP还具有显著低于ZENAPAX DAC的甘露糖糖基水平(如Man5、Man6、Man7)和低于ZENAPAX DAC的唾液酸化糖基水平(参见如图21)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是可以用于评估Fc依赖性活性和抗体-靶结合的潜在细胞毒性作用的体外测试。利用来自六个健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞以及利用表达CD25的KIT225/K6细胞系作为靶细胞，以效应细胞对靶细胞比率可变的形式或抗体浓度可变的形式测定多种达珠单抗制备品的ADCC活性。
对于效应细胞对靶细胞比率可变的形式，使51Cr标记的KIT225/K6细胞(12.500细胞/孔)与1μg/mL抗体(终浓度)在v形底的96孔板中在100μL体积的ADCC测试培养基(每500mL含有435mL RPMI-1640、5.0mL L-谷氨酰胺、50mL热灭活的胎牛血清、500μL 1000×2-疏基乙醇、5.0m青霉素-链霉素(100×)和5.0mL HEPES(1M储存液))中于4℃预孵育30分钟。对照血胞在不含抗体的ADCC测试培养基中孵育，以随后测定抗体依赖性51Cr的释放。
在另外的96孔聚丙烯板中将PBMC(效应细胞)在ADCC测试培养基中进行系列稀释，获得每100μL 6.25×105个细胞、3.13×105个细胞、1.56×105个细胞、7.81×104个细胞或3.91×104个细胞的细胞浓度。将每孔100μL体积的PBMC悬浮液加入到含有51Cr标记的KIT225/K6和抗体的板中，得到50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1和3.13∶1的效应细胞对靶细胞(E∶T)的比率。此外，将每孔100μL体积的ADCC测试培养基单独(无单抗)加入到含有51Cr标记的KIT225/K6和单抗的板中，以确定51Cr的自发性释放。使测试板以50RCF旋转2分钟，并在7.5％CO2的孵育室中于37℃孵育4小时。
4小时孵育结束前30分钟，将25μL体积的8％TritonX-100加入到适当的对照孔中，以确定51Cr从靶细胞中的最大释放。4小时孵育一经完成，使板以350RCF旋转5分钟，并将每孔中100μL体积的上清液转移至小管中。将每个小管插入到闪烁管中，并在Beckman Gamma 5500B计数器或其等同物中计数1分钟。
对于抗体浓度可变的形式，使51Cr标记的KIT225/K6细胞(12.500细胞/孔，靶细胞)与单抗(终浓度)的不同剂量的抗体(5、1、0.2、0.04、0.008和0.0016μg/mL)在V形底的96孔板中在100μL体积的ADCC测试培养基中于4℃预孵育30分钟。对照孔单独用ADCC测试培养基(无单抗)孵育，以随后测定抗体不依赖性51Cr的释放。
在另外的96孔聚丙烯板中将PBMC(效应细胞)在ADCC测试培养基中系列稀释至3.13×105个细胞/100μL的浓度。将每孔100μL体积的PBMC悬浮液加入到含有51Cr标记的KIT225/K6和单抗的板中，得到25∶1的效应细胞对靶细胞(E∶T)的比率。此外，将每孔100μL体积的ADCC测试培养基单独(无效应细胞)加入到含有51Cr标记的KIT225/K6和单抗的板中，以确定51Cr的自发性释放。使测试板以50RCF旋转2分钟，并在7.5％CO2的孵育室中于37℃孵育4小时。
4小时孵育结束前30分钟，将25μL体积的8％TritonX-100加入到适当的对照孔中，以确定51Cr从靶细胞中的最大释放。4小时孵育一经完成，使板以350RCF旋转5分钟，并将每孔中100μL体积的上清液转移至小管中。将每个小管插入到闪烁管中，并在Beckman Gamma 5500B计数器或其等同物中计数1分钟。
ADCC结果显示于图22A(效应细胞对靶细胞比率可变的形式)和图22B(抗体浓度可变的形式)中。这些数据显示，用以等级浓度测试的DAC HYP所达到的最大ADCC活性比由相同浓度的ZENAPAX DAC和DAC Penzberg激发的活性低约30-40％。
DAC HYP对ZENAPAX DAC对DAC Penzberg的电荷同等型谱(对应于N末端变体)的比较显示于图23中。
5.9.DAC HYP的临床试验
5.9.1.CHOICE研究
CHOICE试验是随机化、双盲、以安慰剂为对照的2期试验，其中在患有复发型MS的230名患者的干扰素β疗法中加入达珠单抗。该试验测试DACPenzberg的两种剂量方案(参见上面5.8节中对产品的描述)，所述DACPenzberg以皮下注射施用：1mg/kg达珠单抗每四周施用，2mg/kg达珠单抗每两周施用。研究结果显示，与单独的干扰素β疗法相比，在干扰素β疗法中以每两周施用2mg/kg加入达珠单抗在24周时使得新的或扩大的、钆增强的病变显著减少。
CHOICE研究的结果描述于Wynn等，2010，Lancet Neurol.9(4)：381-90中。达珠单抗治疗一般耐受性良好。常见的不良事件在所有治疗分支中相似。在24％的DAC/干扰素β治疗的患者中和14％的安慰剂/干扰素β治疗的患者中观察到了3级不良事件。最常见的3级不良事件是感染，其发生于7％的DAC/干扰素β治疗的患者中和3％的安慰剂/干扰素β治疗的患者中。无偶然性感染或死亡，并且所有感染用标准疗法解决。
CHOICE试验表明，在具有干扰素β-a1疗法背景的MS患者中，达珠单抗的耐受性良好，与单独的干扰素β-a1相比，其导致新的/扩大的、钆增强的病变剂量依赖性地减少72％。试验的效力与免疫调节型CD56bright天然杀伤(NK)细胞的明显扩增有关。
5.9.2.SELECT研究
进行了随机化、双盲、以安慰剂为对照的剂量范围研究(SELECT)，以确定DAC HYP两种不同剂量水平的安全性和效力。
综述。本研究在捷克共和国、德国、匈牙利、印度、波兰、俄罗斯、乌克兰和英国内的76个中心进行。每名患者的照料包括一名治疗的神经病学家、一名治疗护士(或研究助理)、一名检验的神经病学家、一名MRI技师和一名药剂师(或经授权的指定人员)。利用集中的Interactive Voice ResponseSystem在所有地点中进行随机化。150名患者完成24周的随访后进行方案限定的临时无益(protocol defined interim futility)分析。
患者。符合资格标准的患者年龄为18-55岁，其患有临床上确诊的复发消退型多发性硬化症的(根据2005McDonald标准#1-4；参见Polman等，2005Ann Neurol 58：840-846)，基线扩展残疾状态量表(Expanded Disability StatusScale(EDSS))为0-0.50(Kurtzke，1983，Neurology 33(11)：1444-52)以及随机化前12个月内至少一次MS复发，或随机化前6周内进行脑部MRI发现一个新的Gd+病变。这些患者被随机化，以在52周内每4周一次以皮下注射接受DAC HYP(150mg或300mg)或安慰剂。具有怀孕潜力的患者需要实施有效的避孕措施。
如果患者患有原发-进行型、继发-进行型或进行-复发型MS，有恶性肿瘤病史、严重的变态或过敏性反应或已知的药物超敏性或具有在研究者看来将不能施用DAC HYP的其他重要的医学情形，则将其排除。额外的排除标准包括以前用DAC HYP或ZENAPAXTM、总淋巴辐射、克拉屈滨(cladribine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、T细胞或T细胞受体免疫接种或除那他珠单抗(natalizumab)或利妥昔单抗(rituximab)以外的任何治疗性单抗进行治疗。随机化时，患者在前一年内不能已经接受过环磷酰胺或利妥昔单抗的治疗；前6个月内不能接受过那他珠单抗、环孢霉素(cyclosporine)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、氨甲喋呤、静脉内免疫球蛋白、血浆取出法(plasmapheresis)或细胞单采法(cytapheresis)的治疗；或随机化前3个月内不能接种活病毒疫苗，不能接受过醋酸格拉太咪尔(glatiramer acetate)、IFNβ、干扰素α的治疗；或前30天内不能接受过皮质类固醇、4-氨基吡啶或相关产品的治疗。
组的特征如下：
Figure BSA00000750254200621
DAC：达珠单抗；HYP，高产处理；SD，标准偏差；MS：多发性硬化；EDSS：扩展残疾状态量表；Gd+，钆增强。
*之前没有接受过除了类固醇外的MS治疗的患者。
**安慰剂n＝203，DAC HYP 150mg n＝206；DAC HYP 300mg n＝206(组间比较的所有p值＞0.05)。
终点。本研究的主要目的是确定DAC HYP单药疗法是否能够降低MS的复发，如通过52周时的年化复发率(annualized relapse rate，ARR)所定义。复发定义为新的或重现的神经学症状(与发热或感染无关)，其持续＞24小时，并经检验的神经病学家评估伴有新的神经学发现。由三名不知情的MS神经学家组成的神经学评价独立委员会(Independent Neurology EvaluationCommittee(INEC))对所有疑似复发进行评价，以判定MS复发的方案确定是否令人满意。主要分析(primary analysis)中仅包括INEC认可的复发。
次级目的是确定DAC HYP是否能够有效地在第8、12、16、20和24周时对一小组患者进行脑部MRI扫描时减少累积的新Gd+病变的数目；在第52周时减少新的或新扩大的T2超强(hyperintense)病变的数目；减少基线和第52周之间复发患者的比例；以及提高生活质量(QoL)(如通过第52周时在29项多发性硬化症影响量表(MSIS-29)(Hobart等，2001，Brain 124(pt 5)：962-73)中生理影响分值从基线的变化所测定)。通过基线和第52周之间EDSS分值的变化评估经证实的失能进展(基线EDSS≥1.0时EDSS增加1.0个点，或基线EDSS＝0并持续12周时增加1.5个点)。EDSS评价每12周，并在第20、52、60和72周进行。
额外的QoL终点是第52周时如通过EQ-直观类似量表(EQ-Visal AnalogueScale)(EQ-VAS)(EuroQol-测定健康相关的生活质量的一个新机构，2011，17.11.11登录http://www.euroqol.org/)所测定的受试者健康总体评估，以及EQ-5D健康调查(EuroQol-测定健康相关的生活质量的一个新机构，2011，17.11.11登录http://www.euroqol.org/)、12项简易形式的健康调查SF-12(Ware等，1996，Medical Care 34(3)：220-33)和MSIS-29心理量表(Hobart等，2001，Brain 124(pt 5)：962-73)中的变化。
额外的MRI终点是第52周时Gd+病变的数目、第24和52周时总的和新的或新扩大的T2超强病变的容积、第24和52周时总的和新的T1超强病变“黑洞”(“black holes”，定义为强度等于/次于灰质并且施用钆后不会增强的病变)的容积以及如通过SIENA法(Smith等，2001，J Comput Assist Tomogr 25(3)：466-75)评估的全脑容积变化的百分数。
在多个时间点利用经验证的FACS测试对淋巴细胞子集进行测定。将CD56brightNK细胞定义为CD3-/CD16+/CD56bright淋巴细胞。利用标准ELISA评估对DAC HYP的免疫原性，以筛选抗药物抗体，接着利用细胞测试对所有阳性样品进行中和抗体的测验。
统计学分析。选择大约600名患者的样品量，其具有90％的能力以检测DAC HYP治疗组和安慰剂组之间ARR 50％的减少，这由假设具有10％脱试率、5％I型误差率的负二项分布的模拟和双面测试估测得到。基于对RRMS受试者最近完成的试验，安慰剂组的ARR表现为0.476。所有报告的p值均是双尾的。
主要分析评估了每个DAC HYP组对安慰剂之间ARR的差异。对用替代性MS药物进行挽救治疗后发生的复发进行了检查。利用适应进入研究前一年复发数目、基线EDSS(EDSS≤2.5对EDSS＞2.5)和基线年龄(≤35对＞35岁)的负二项回归模型对差异进行评估。次级分析利用负二项回归(第8和24周之间新Gd+病变的数目；新的或新扩大的T2超强病变的数目)、Cox比例危险模型(第一次复发前的时间、疾病发展前的时间)和方差分析模型(EDSS的变化、新的或新扩大的T2病变的容积、新的T1次强病变的容积、QoL)以及比例优势模型(第52周时新Gd+病变的数目)测试治疗差异。由Kaplan-Meier存活曲线分布估测无复发的患者比例。
对于第8周和24周之间新Gd+病变的累积数目，如果患者错过了1或2次连续的扫描或者所有扫描，则将末次非基线观察前置，或者分别使用每个治疗组内病变的平均数目。对于其他MRI终点，错过的数据以每个治疗组内的平均值输入。对于MSIS-29，如果患者错过＜10项，则用未错过项目的平均值输入分值。对于错过≥10项的患者以及对于其他QoL测定，用随机的斜率和截距模型估测错过的数据。
效力终点的统计学测试利用DAC HYP 300mg组对安慰剂以及DAC HYP150mg组对安慰剂的分开的比较。利用闭锁型序贯(sequential closed)测试步骤控制由于多种比较引起的总体I型误差率。
在包括进行随机化的所有患者的意向治疗(intent-to-treat)群体中对效力分析进行评价。然而，研究完成前，来自单个研究中心的21名患者被预先从ITT群体中排除，因为研究完成前(中心的所有患者正在接受有效治疗)鉴定出其在中心接受了错误剂量的证据。在一项敏感性分析中，利用所有的随机化患者重复所有的主要和次级效力分析。所有的安全性分析均基于安全的群体，所述安全的群体定义为接受研究药物的至少一次剂量并且具有至少一次随机化后评估的所有患者。
在150名受试者完成第24周随访后进行了预先计划好的无益分析，以提供机会在DAC HYP的假定效果不明显的情况中终止。由于效力可在研究期间里变化，因此没有计划在无益分析时为了优越性的证据提早终止研究。通过分别评估每个剂量组8和24周间新Gd+病变的累积数目及ARR终点的条件性效力来评价无益。安全性监测委员会在分析时审查了数据，并基于数据的总体一致性和风险好处评估推荐继续研究。
结果概要。
从2/15/2008至5/14/2010，使合乎条件的参与者随机化。三个治疗组的基线特性类似，尽管DAC HYP 150mg组中的患者比DAC HYP 300mg组中的那些倾向于具有较多的T2和Gd+T1病变。在所有的随机化患者中，总共577人(93％)完成了治疗期，其中完成研究的DAC HYP患者和经安慰剂治疗的患者比例相似。
详细的结果。临床效力。第52周时(主要的终点)，对于ARR，随机化接受DAC HYP 150mg(0.21)或300mg(0.23)的患者与安慰剂组(0.46)相比较低(表36)，表现为DAC HYP 150mg对安慰剂减少54％(95％CI，31％至69％，p＜0.0001)，DAC HYP 300mg对安慰剂减少50％(95％CI，26％至66％，p＝0.0002)(表36)。在52周内，复发患者的比例在DAC HYP 150mg(19％)和300mg(20％)组中相对安慰剂组中的36％减少(两个比较的p≤0.01)(表36)。与安慰剂相比，第52周时3个月的持续性失能进展在DAC HYP 150mg中减少了57％(危险比率＝0.43，95％CI，0.21至0.88，p＝0.021)，在DAC HYP300mg中减少了43％(危险比率＝0.57，95％CI，0.30至1.09，p＝0.091)。
第52周时观察到MSIS-29生理分值对于DAC HYP 150mg对安慰剂相对提高4.0，在DAC HYP 300mg患者中变化较不显著(分别为p＜0.0008和p＝0.1284对安慰剂，表36)。健康相关的生活质量的其他测定，包括生理和心理功能以及总体健康的测定中也观察到了类似的提高(表36)。
Figure BSA00000750254200661
Figure BSA00000750254200671
Figure BSA00000750254200681
Figure BSA00000750254200691
MRI。在整个研究群体和第8至到24周之间每月进行MRI的小组中，如通过MRI所确定，DAC HYP均使新MS病变的活力降低(表36)。与临床终点相反，与150mg剂量组相比，300mg剂量组中的点效力估值稍强，甚至在调整潜在的基线不平衡之后。纵向分析显示，与300mg剂量组相比，150mg剂量组中的Gd+病变活力在治疗的前几个月中较高，但在第52周时与其相似(表36)。包括来自已排除研究地点的21名患者的敏感性分析在所有效力分析中得到了相似的结果。
安全性。不良事件(AE)发生于DAC HYP 150mg组(73％)、DAC HYP300mg组(76％)和安慰剂(79％)组相似比例的患者中(表37)。严重AE发生于安慰剂组26％、DAC HYP 150mg组15％和DAC HYP300mg组17％的患者中。排除MS复发，SAE发生于每组6％、7％和9％的患者中(表37)。在＞0.5％的DAC HYP患者中发生的AE显示于表37中。严重感染的发生率在DAC HYP治疗的患者中为2％而在安慰剂中为0％。在继续用药的同时患有严重感染的7名患者中，1名由于严重感染终止了治疗而6名在感染消退后重新进入治疗。皮肤事件的发生率在DAC HYP 150mg组中为18％，DAC HYP300mg组中为22％，安慰剂组中为13％(表37)。严重皮肤事件发生于1％的经DAC HYP治疗的患者中。1名正在从严重皮疹中恢复的经DAC HYP治疗的患者由于腰肌脓肿并发症而死亡。尸检时发现之前未诊断出的腰肌脓肿波及到肠系膜动脉并导致局部血栓和急性缺血性结肠炎。试验期间发生5例恶性肿瘤：2例宫颈癌(安慰剂组和DAC HYP 150mg组中各1例)；DAC HYP 150mg组中1例甲状腺肿瘤是非严重的甲状腺结节；和DAC HYP 300mg组中2例黑色素瘤。黑色素瘤病例经局部切除治疗，未报道复发。
Figure BSA00000750254200731
实验室发现。在第52周时，与安慰剂相比，经DAC HYP治疗的患者中总NK细胞计数(细胞/mm3)增加(中值：42.0(150mg DAC HYP)，46.5(300mgDAC HYP)，比4.5安慰剂，p＜0.001)。总NK细胞数目的增加与CD56brightNK细胞的选择性增加相关，其中中值在基线时为7.77，至治疗末期为44.84。相比之下，CDdimNK细胞仅有微小的改变(中值从122.68变化至123.70)。在两个DAC HYP分支对安慰剂组中，CD56brightNK细胞在基线后第一时间点(第4周)扩增明显(p＜0.0001)。CD56brightNK细胞中值从基线时淋巴细胞的0.6％扩增至第52周时的2.8％。相比之下，经DAC HYP治疗的患者中B-细胞和总淋巴细胞计数中度减少(表38)。第52周时，经DAC HYP治疗的患者中CD4+和CD8+T细胞计数减少约7-10％，CD4+/CD8+比率在治疗期间保持恒定。
Figure BSA00000750254200751
Figure BSA00000750254200761
Figure BSA00000750254200771
肝功能测试(LFT)异常在5X ULN以上，其发生于4％经DAC和＜1％经安慰剂治疗的患者中。这些异常通常发生于治疗期晚期(中值为开始+308天)并在62天的中值内消退。在17名经DAC HYP治疗的、升高＞5X ULN的患者中，6名在消退后继续或重新用DAC HYP治疗至少6个月，在此期间所有患者均未复发。在2名患者中，LFT的升高与感染有关(1例乙型肝炎和1例巨细胞病毒感染)。
免疫原性。第24周时，在6名(2％)经DAC HYP治疗的患者中(150mg剂量组中5名患者，300mg剂量组中1名受试者)检测到了DAC HYP中和抗体。在一些患者中，这些抗体是暂时存在的，第52周时DAC HYP中和抗体仅出现于每个DAC HYP剂量组的1名受试者中。
结论。如通过主要对未曾接受过治疗的MS患者群体的治疗中复发率、MRI确定的新病变和失能进展的降低所测定，利用每月皮下施用DAC HYP的单一疗法拮抗CD25在1年间显示出对MS疾病活性的强效并且临床上有意义的效果。
6.具体实施方式，通过引用并入
本文公开的多个方面描述于以下编号的段落中列出的实施方式中。
1.经修饰的NS0细胞，其已经适应于在无血清和胆固醇的培养基中生长并被改造以表达重组蛋白，所述细胞当生长于无血清和胆固醇的培养基中时能够在10天分批补料过程中在100L培养中达到超过100mg/L/天重组蛋白的体积生产力。
2.实施方式1的经修饰的NS0细胞，其当生长于无胆固醇和动物衍生组分的培养基中时能够在10天分批补料过程中在1,000L培养中达到超过100mg/L/天重组蛋白的体积生产力。
3.实施方式1的经修饰的NS0细胞，其当生长于无胆固醇和动物衍生组分的培养基中时能够在10天分批补料过程中在16,000L培养中达到超过100mg/L/天重组蛋白的体积生产力。
4.实施方式1-3任意一项的经修饰的NS0细胞，其中按照以下时间表加入补料培养基，其中加入的体积代表初始细胞培养体积的百分数：
  天   加入的体积
  0   0
  1   0
  2   4
  3   7.8
  4   7.8
  5   7.8
  6   11
  7   13
  8   15
  9   15
  10   0
5.实施方式1的经修饰的NS0细胞，其能够在13天分批补料过程中在100L培养中达到超过200mg/L/天重组蛋白的体积生产力。
6.实施方式5的经修饰的NS0细胞，其当生长于无胆固醇的培养基中时能够在13天分批补料过程中在1,000L培养中达到超过200mg/L/天重组蛋白的体积生产力。
7.实施方式5的经修饰的NS0细胞，其当生长于无血清和胆固醇的培养基中时能够在10天分批补料过程中在16,000L培养中达到超过100mg/L/天重组蛋白的体积生产力。
8.实施方式1的经修饰的NS0细胞，其用可用于表达抗CD25单克隆抗体的核酸稳定地转染。
9.实施方式8的经修饰的NS0细胞，其中抗CD25单克隆抗体包含序列对应于SEQ ID NO：2位置21-233的VL链以及序列对应于SEQ ID NO：4位置20-465的VH链。
10.实施方式1的经修饰的NS0细胞，其用载体pAbX.gpt转化。
11.实施方式1的经修饰的NS0细胞，其用载体pHAT.IgG1.rg.dE转化。
12.实施方式1的经修饰的NS0细胞，其被命名为克隆7A11-5H7-14-43。
13.生产重组蛋白的方法，其包括培养实施方式1-12中任意一项的经修饰的NS0细胞。
14.实施方式13的方法，其中所述经修饰的NS0细胞培养于在10天分批补料过程中在100L、1,000L或16,000L培养中能够产生至少100mg/L/天重组蛋白或在13天分批补料过程中在100L、1,000L或16,000L培养中能够产生至少200mg/L/天重组蛋白的条件下。
15.实施方式13或实施方式14的方法，其中所述经修饰的NS0细胞在无血清和胆固醇存在的情况下培养。
16.实施方式15的方法，其中所述经修饰的NS0细胞在无环庚三烯酚酮和氢化可的松存在的情况下培养。
17.实施方式13或实施方式14的方法，其中所述经修饰的NS0细胞培养于含有10-35g/L葡萄糖的基础和/或补料培养基中。
18.实施方式17的方法，其中所述经修饰的NS0细胞培养于含有15g/L葡萄糖的基础培养基和/或含有28g/L葡萄糖的补料培养基中。
19.实施方式18的方法，其中所述基础培养基由PFBM2±10％的组分构成。
20.实施方式18的方法，其中所述补料培养基由PFFM3±10％的组分构成。
21.实施方式19或实施方式20的方法，其中所述细胞在基础培养基中培养1-3天，接着在补料培养基中培养10-13天。
22.实施方式18的方法，其中按照表7中列出的时间表±10％加入补料培养基。
23.可用于重组表达目标蛋白的载体，其包括驱动在哺乳动物细胞中可操作的选择标记表达的弱启动子以及驱动目标蛋白表达的强启动子。
24.实施方式23的载体，其中所述目标蛋白是治疗性抗体。
25.实施方式24的载体，其中所述目标蛋白是抗-CD25抗体。
26.实施方式25的载体，其中所述抗-CD25抗体包含达珠单抗CDR。
27.实施方式26的载体，其中所述抗-CD25抗体是达珠单抗。
28.获得具有高目标蛋白体积生产力的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括用实施方式23-27任意一项的载体转染细胞，并选择能够在10天分批补料过程中在100L、1,000L或16,000L培养中产生至少100mg/L/天目标蛋白或能够在13天分批补料过程中在100L、1,000L或16,000L培养中产生至少200mg/L/天重组蛋白的细胞。
29.包含达珠单抗的组合物，其中达珠单抗的特征在于存在pE/Q重链N-连接的同等型和/或Q/VHS重链N-末端同等型
30.实施方式29的组合物，其中所述pE/Q重链N-末端同等型占达珠单抗的约6-15％。
31.实施方式29的组合物，其中所述pE/Q重链N-末端同等型占达珠单抗的约7-12％。
32.实施方式29-31任意一项的组合物，其中所述Q/VHS重链N-末端同等型占达珠单抗的约1-15％。
33.实施方式32的组合物，其中所述Q/VHS重链N-末端同等型占达珠单抗的约3-12％。
34.实施方式29的组合物，其中所述达珠单抗重链存在于以下N-末端同等型中：
  同等型   发生率
  pE/pE   25％-50％
  pE/Q   6％-15％
  pE/VHS   25％-48％
  Q/VHS   1％-15％
  VHS/VHS   0.5％-25％
35.实施方式29的组合物，其中所述达珠单抗重链存在于以下N-末端同等型中：
  同等型   发生率
  pE/pE   31-46％
  pE/Q   7％-12％
  pE/VHS   31％-42％
  Q/VHS   3％-12％
  VHS/VHS   2％-17％
36.实施方式29的组合物，其中所述达珠单抗的特征在于阳离子交换层析同等型谱基本与图18类似。
37.实施方式29的组合物，其中所述达珠单抗是DAC HYP。
38.包含达珠单抗的组合物，其中所述达珠单抗的特征在于N-连接的糖基化HPLC谱含有两个主峰，一个对应于寡糖G0 GlcNAc，一个对应于寡糖G0，其中这两个峰合并的AUC占所有峰的总AUC的约88-99.5％。
39.实施方式38的组合物，其中所述G0 GlcNAc峰的AUC占所有峰的总AUC的约5-18％，所述G0峰的AUC占所有峰的总AUC的约75-92％。
40.实施方式39的组合物，其中所述G0 GlcNAc峰的AUC占所有峰的总AUC的约6-16％，所述G0峰的AUC占所有峰的总AUC的约78-90％。
41.实施方式38-40任意一项的组合物，其中所述N-连接的糖基化谱具有少于约3％的Man5。
42.实施方式41的组合物，其中所述N-连接的糖基化谱具有少于约0.5％的G2、Man6和/或Man7。
43.实施方式38的组合物，其中所述N-连接的糖基化谱含有对应于唾液酸化寡糖的第三个峰，所述唾液酸化寡糖峰的AUC占所有峰的总AUC的1％或更少。
44.实施方式38的组合物，其中所述N-连接的糖基化谱含有对应于寡糖G1的第三个峰，所述G1峰的AUC占所有峰的总AUC的约1-5％。
45.实施方式44的组合物，其中所述G1峰的AUC占所有峰的总AUC的约1-2％。
46.实施方式38的组合物，其中所述达珠单抗具有与图19或图21下图基本相似的N-连接的糖基化HPLC谱。
47.实施方式38的组合物，其中所述达珠单抗是DAC HYP。
48.包含达珠单抗的组合物，如在体外细胞测试中所测定，其显示低于35％的ADCC平均细胞毒性，所述体外细胞测试利用来自至少3个健康供体的效应细胞和以Kit 225K6细胞作为靶细胞，达珠单抗浓度为1μg/mL，效应细胞与靶细胞的比率为约25∶1。。
49.实施方式48的组合物，其中所述达珠单抗在所述测试中显示10％至30％的ADCC平均细胞毒性。
50.实施方式48或实施方式49的组合物，其中所述测试使用来自至少6名健康供体的效应细胞。
51.实施方式48或实施方式49的组合物，其中所述测试利用来自至少10名健康供体的效应细胞。
52.实施方式48-51任意一项的组合物，其中所述达珠单抗是DAC HYP。
53.可用于制备达珠单抗药物制剂的组合物，其包含约150-190mg/mL达珠单抗和一定量的赋形剂，以使用稀释缓冲液对所述组合物进行稀释能得到经稀释的组合物，所述经稀释的组合物含有约85-165mg/mL达珠单抗，并具有约267-327mOsm/kg范围内的摩尔渗透压浓度和25℃时约pH 5.8-6.2范围内的pH，如通过大小排阻层析所测定，其中至少约95％的达珠单抗是单体形式。
54.实施方式53的组合物，其含有一定量的赋形剂，以使用稀释缓冲液进行稀释时，经稀释的组合物含有约85-115mg/mL达珠单抗。
55.实施方式53的组合物，其含有一定量的赋形剂，以使用稀释缓冲液进行稀释时，经稀释的组合物含有约150±15mg/mL达珠单抗。
56.包含约4至15mg/mL达珠单抗的组合物，其中0.1％或更少的达珠单抗是聚集体形式。
57.实施方式56的组合物，其通过在弱阳离子交换树脂上通过柱层析对含有约4到15mg/mL达珠单抗、其中上至2.5％的达珠单抗是聚集体形式的达珠单抗组合物进行纯化而获得。
58.实施方式57的组合物，其中所述弱阳离子交换树脂是CM-650M。
59.实施方式58的组合物，其中用含有约20mM柠檬酸钠、pH 4.4-4.6的平衡缓冲液平衡CM-650M树脂，并用含有约20mM柠檬酸钠和约75mM硫酸钠、pH 4.4-4.6的洗脱缓冲液将达珠单抗洗脱下来。
60.实施方式59的组合物，其中所述层析在圆柱形柱中利用高度为约10-30cm或约17-19cm的树脂床进行，并在约4-22℃或约18-22℃范围的温度下和约50-200cm/hr或90-110cm/hr范围内的流速下将达珠单抗洗脱下来。
61.适合施用于人的组合物，其包含约85-165mg/mL达珠单抗和约0.02-0.04％(w/v)聚山梨酯80，其中所述组合物具有约267-327mOsm/kg范围内的摩尔渗透压浓度和25℃时约pH 5.8-6.2范围内的pH，如通过大小排阻层析所测定，至少约95％的达珠单抗是单体形式。
62.实施方式61的组合物，其中如通过大小排阻层析所测定，至少约99％的达珠单抗是单体形式。
63.实施方式61的组合物，其包含约85-115mg/mL达珠单抗。
64.实施方式63的组合物，其基本由约100mg/mL达珠单抗、约40mM琥珀酸钠、约100mM氯化钠和约0.03％(w/v)聚山梨酯80组成，并在25℃时具有约6.0的pH。
65.实施方式61的组合物，其包含约135-165mg/mL达珠单抗。
66.实施方式65的组合物，其基本由约150mg/mL达珠单抗、约40mM琥珀酸钠、约100mM氯化钠和约0.03％(w/v)聚山梨酯80组成，并在25℃时具有约6.0的pH。
67.实施方式65的组合物，其是通过包括在适合的缓冲液中通过超滤对包含约4到15mg/mL达珠单抗的达珠单抗组合物进行浓缩以实现约85-180mg/mL范围内的达珠单抗浓度以及可选地用稀释缓冲液对经浓缩的组合物进行稀释步骤的过程而获得。
68.适合皮下施用的药物组合物，其包含约85-165mg/mL达珠单抗，其中在约2-8℃范围内的温度下储存约12个月时间后聚集体形式的达珠单抗的百分数不超过约3％。
69.实施方式68的药物组合物，其包含约85-115mg/mL达珠单抗。
70.实施方式68的药物组合物，其包含约135-165mg/mL达珠单抗。
71.实施方式69或实施方式70的药物组合物，其中在约2-8℃范围内的温度下储存约12个月时间后聚集体形式的达珠单抗的百分数不超过约2％。
72.实施方式69或实施方式70的药物组合物，其中在约2-8℃范围内的温度下储存约18个月时间后聚集体形式的达珠单抗的百分数不超过约3％。
73.从细胞培养物中收获重组蛋白的过程，其包括步骤：
(i)将表达并分泌重组蛋白的细胞培养物的pH调节至约pH 4.5-5.5范围内的pH；
(ii)将经pH调节的细胞培养物在约4至15℃范围内的温度下孵育约30-90分钟；和
(iii)将孵育后的经pH调节的细胞培养物离心，以除去细胞碎片。
74.生产经纯化的达珠单抗组合物的过程，其包括步骤：
(i)将达珠单抗从达珠单抗粗制品中吸收到亲和层析树脂上；
(ii)用清洗缓冲液清洗亲和树脂，以去除污染物；
(iii)用洗脱缓冲液洗脱已吸收的达珠单抗；
(iv)通过将pH调节至约pH 3-4范围内的pH并将经pH调节的洗脱物在特定温度下孵育足以使病毒失活的一段时间，从而使洗脱物中的病毒失活；
(v)将病毒失活的洗脱物中和至约pH 7.7-7.9(25℃下测定)范围内的pH；
(vi)使经中和的洗脱物流过强阴离子交换层析树脂；
(vii)使步骤(vi)的洗脱物中的达珠单抗吸附到弱阳离子交换层析树脂上；和
(viii)从弱阳离子交换层析树脂上将已吸附的达珠单抗洗脱下来。
75.实施方式74的过程，其中所述达珠单抗粗制品从细胞培养物中收获。
76.实施方式74的过程，其中所述达珠单抗粗制品通过在达珠单抗分泌到培养基中的条件下培养宿主细胞7A11-5H7-14-43并收获所分泌的达珠单抗而获得。
77.实施方式76的过程，其中使用实施方式73的方法收获达珠单抗。
78.实施方式74的过程，其进一步包括步骤：
(ix)对步骤(viii)中洗脱下的达珠单抗组合物进行过滤，以去除病毒；和
(x)通过超滤来对经过滤的溶液进行浓缩，以获得包含约85-180mg/mL达珠单抗的经纯化的达珠单抗组合物。
79.实施方式78的过程，其进一步包括用稀释缓冲液对经纯化的达珠单抗组合物进行稀释以获得包含约85-165mg/mL达珠单抗和约0.02-0.04％(w/v)聚山梨酯80的组合物的步骤，其中所述组合物具有约267-327mOsm/kg范围内的摩尔渗透压浓度和25℃时约pH 5.8-6.2范围内的pH，如通过大小排阻层析所测定，至少约95％的达珠单抗是单体形式。
80.实施方式79的过程，其中所获得的组合物具有少于50ppm的来自达珠单抗重组来源的宿主细胞蛋白、少于10ppm的蛋白A，并且组合物中不多于3％的达珠单抗是聚集体形式。
81.基础培养基PFBM2。
82.补料培养基PFFM3。
83.达珠单抗组合物，其通过包括在达珠单抗分泌到培养基中的条件下培养实施方式1-12任意一项的宿主细胞的步骤的过程而获得。
84.实施方式83的达珠单抗组合物，其中所述过程进一步包括从细胞培养基中分离所分泌的达珠单抗的步骤。
85.可用于对蛋白A亲和层析树脂进行消毒的缓冲液，其包含约100-500mM柠檬酸钠、约10-30mM NaOH和约0.5-3％(v/v)苯甲醇。
86.对蛋白A亲和层析柱进行消毒的方法，其包括用实施方式85的消毒缓冲液以足以使柱消毒的流速和时间对柱进行清洗。
87.实施方式86的方法，其中用约1.8倍柱体积的消毒缓冲液以约150cm/hr的流速对柱进行清洗，经清洗的柱不流动孵育约30-45分钟，接着用平衡缓冲液平衡。
88.实施方式87的方法，其中所述平衡缓冲液包含约20mM柠檬酸钠和150mM NaCl，并具有约pH 7(25℃时)的pH。
89.治疗患有多发性硬化症的患者的方法，其包括对患者施用足以提供治疗益处的量的DAC HYP。
90.实施方式89的方法，其中所述DAC HYP组合物经静脉内施用。
91.实施方式90的方法，其中所述DAC HYP组合物以对应于约0.8-0.9mg/kg DAC HYP的量施用。
92.实施方式91的方法，其中所述DAC HYP组合物以对应于约1mg/kgDAC HYP的量施用。
93.实施方式89-92任意一项的方法，其中所述DAC HYP每周施用一次，持续至少6周、至少12周、至少24周时间。
94.实施方式89-93任意一项的方法，其中所述DAC HYP以单一疗法施用。
95.实施方式94的方法，其中所述患者已经对之前β-干扰素的治疗无应答或者已经终止了之前β-干扰素的治疗。
96.实施方式89-93任意一项的方法，其中所述DAC HYP辅佐β-干扰素施用。
97.实施方式89的方法，其中所述DAC HYP组合物经皮下施用。
98.实施方式97的方法，其中所述DAC HYP组合物以对应于约1mg/kgDAC HYP的量施用。
99.实施方式98的方法，其中所述DAC HYP组合物每2周一次施用。
100.实施方式99的方法，其中所述DAC HYP组合物施用持续总共约24周时间。
101.实施方式97的方法，其中所述DAC HYP组合物以对应于约2mg/kgDAC HYP的量施用。
102.实施方式101的方法，其中所述DAC HYP组合物每4周施用一次。
103.实施方式102的方法，其中所述DAC HYP组合物施用持续总共约24周时间。
104.实施方式103的方法，其中所述DAC HYP组合物以对应于75mg至300mg DAC HYP的量施用。
105.实施方式104的方法，其中所述DAC HYP组合物以对应于150mg的量施用。
106.实施方式104的方法，其中所述DAC HYP组合物以对应于300mg的量施用。
107.实施方式103-106任意一项的方法，其中所述DAC HYP组合物每4周施用一次。
108.实施方式107的方法，其中所述DAC HYP组合物施用持续总共至少48周时间。
109.实施方式103-108任意一项的方法，其中所述DAC HYP以单一疗法施用。
110.实施方式109的方法，其中所述患者已经对之前β-干扰素的治疗无应答或者已经终止了之前β-干扰素的治疗。
111.实施方式103-108任意一项的方法，其中所述DAC HYP辅佐β-干扰素施用。
112.来自细胞培养物的重组蛋白，其通过或可通过包括下述步骤的过程来获得：
(i)将表达并分泌重组蛋白的细胞培养物的pH调节至约pH 4.5-5.5范围内的pH；
(ii)将经pH调节的细胞培养物在约4至15℃范围内的温度下孵育约30-90分钟；和
(iii)将孵育后的经pH调节的细胞培养物离心，以除去细胞碎片。
113.经纯化的达珠单抗组合物，其通过或可通过包括下述步骤的过程来获得：
(i)将达珠单抗从达珠单抗粗制品中吸收到亲和层析树脂上；
(ii)用清洗缓冲液清洗亲和层析树脂，以去除污染物；
(iii)用洗脱缓冲液洗脱已吸收的达珠单抗；
(iv)通过将pH调节至约pH 3-4范围内的pH并将经pH调节的洗脱物在特定温度下孵育足以使病毒失活的一段时间，从而使洗脱物中的病毒失活；
(v)将病毒失活的洗脱物中和至约pH 7.7-7.9(25℃下测定)范围内的pH；
(vi)使经中和的洗脱物流过强阴离子交换层析树脂；
(vii)使步骤(vi)的洗脱物中的达珠单抗吸附到弱阳离子交换层析树脂上；和
(viii)从弱阳离子交换层析树脂上将已吸附的达珠单抗洗脱下来。
114.经纯化的达珠单抗组合物，其通过或可通过实施方式74-80任意一项的过程来获得。
本申请中引用的所有公开文本、专利、专利申请和其他文献出于所有目的通过引用完整并入本文，其程度与如每篇单独的公开文本、专利、专利申请或其他文献被各自指明出于所有目的通过引用并入本文一致。
尽管已经展示和描述了多个具体实施方式，将领会的是，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下做出多种变化。
Figure ISA00000750254400011
Figure ISA00000750254400021
Figure ISA00000750254400031
Figure ISA00000750254400051
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Figure ISA00000750254400071
Figure ISA00000750254400081
Figure ISA00000750254400091
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Claims (33)

1.经修饰的NS0细胞，其已经适应于在无血清和胆固醇的培养基中生长并被改造以表达重组蛋白，所述细胞当生长于无血清和胆固醇的培养基中时能够在10天分批补料方法中在100L培养中达到超过100mg/L/天重组蛋白的体积生产力。
2.权利要求1的经修饰的NS0细胞，其能够达到超过以下的体积生产力：
(a)当生长于无胆固醇和动物衍生组分的培养基中时在10天分批补料方法中在1,000L培养中100mg/L/天重组蛋白；
(b)当生长于无胆固醇和动物衍生组分的培养基中时在10天分批补料方法中在16,000L培养中100mg/L/天重组蛋白；
(c)在13天分批补料方法中在至少100L培养中200mg/L/天重组蛋白；
(d)当生长于无胆固醇的培养基中时在13天分批补料方法中在1,000L培养中200mg/L/天重组蛋白；
(e)当生长于无血清和胆固醇的培养基中时在10天分批补料方法中在16,000L培养中100mg/L/天重组蛋白。
3.权利要求1的经修饰的NS0细胞，其中所述分批补料方法包括按照以下时间表加入补料培养基，其中加入的体积代表初始细胞培养体积的百分数：
  天   加入的体积   0   0   1   0   2   4   3   7.8   4   7.8   5   7.8   6   11   7   13   8   15   9   15
  10   0
4.权利要求1的经修饰的NS0细胞，其用可用于表达抗CD25单克隆抗体的核酸稳定地转染，可选地其中抗CD25单克隆抗体包含序列对应于SEQ IDNO：2位置21-233的VL链以及序列对应于SEQ ID NO：4位置20-465的VH链。
5.生产重组蛋白的方法，其包括培养权利要求1的经修饰的NS0细胞：
(a)在10天分批补料方法中在100L、1,000L或16,000L培养中能够产生至少100mg/L/天重组蛋白或在13天分批补料方法中在100L、1,000L或16,000L培养中产生至少200mg/L/天重组蛋白的条件下；
(b)无血清和胆固醇存在，以及可选地无环庚三烯酚酮和氢化可的松存在；
(c)在含有10-35g/L葡萄糖的基础和/或补料培养基中；或
(d)在含有15g/L葡萄糖的基础培养基和/或含有28g/L葡萄糖的补料培养基中，可选地其中所述基础培养基由PFBM2±10％或PFFM3±10％的组分构成，并且其中所述细胞在基础培养基中培养1-3天，接着在补料培养基中培养10-13天。
6.可用于重组表达目标蛋白的载体，其包括驱动在哺乳动物细胞中可操作的选择标记表达的弱启动子以及驱动目标蛋白表达的强启动子，可选地其中所述载体是pAbX.gpt或pHAT.IgG1.rg.dE和/或所述目标蛋白是(a)治疗性抗体；(b)抗CD25抗体；(c)包含达珠单抗(daclizumab)CDR的抗CD25抗体；或(d)达珠单抗。
7.获得具有高目标蛋白体积生产力的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括用权利要求6的载体转染细胞，并选择能够在10天分批补料方法中在100L、1,000L或16,000L培养中产生至少100mg/L/天目标蛋白或能够在13天分批补料方法中在100L、1,000L或16,000L培养中产生至少200mg/L/天重组蛋白的细胞。
8.包含达珠单抗的组合物，其中达珠单抗的特征在于存在pE/Q重链N-连接的同等型和/或Q/VHS重链N-末端同等型，可选地其中所述pE/Q重链N-末端同等型占达珠单抗的约3-17％、约3-15％、约6-15％、约5-15％、约5-12％或约7-12％，或可选地其中所述Q/VHS重链N-末端同等型占达珠单抗的约1-15％或约3-12％。
9.权利要求8的组合物，其中所述达珠单抗重链存在于以下N-末端同等型中：
(a)
  同等型   发生率   pE/pE   25％-50％   pE/Q   3％-15％   pE/VHS   25％-48％   Q/VHS   1％-15％   VHS/VHS   0.5％-25％
或(b)
  同等型   发生率   pE/pE   31-46％   pE/Q   5％-12％   pE/VHS   31％-42％   Q/VHS   3％-12％   VHS/VHS   1％-17％
10.权利要求8的组合物，其中所述达珠单抗的特征在于阳离子交换层析同等型谱基本与图18类似，可选地其中所述达珠单抗是DAC HYP。
11.包含达珠单抗的组合物，其中所述达珠单抗的特征在于N-连接的糖基化HPLC谱含有两个主峰，一个对应于寡糖G0-GlcNAc，一个对应于寡糖G0，其中这两个峰合并的AUC占所有峰的总AUC的约75-100％、约80-100％、约85-100％或约88-99.5％，可选地其中：
(a)所述G0-GlcNAc峰的AUC占所有峰的总AUC的约5-20％、约5-18％、约7-15％或约6-16％，所述G0峰的AUC占所有峰的总AUC的约70-99.2％、约75-92％、约75-90％、约78-90％或约81-88％，并且可选地，其中N-连接的糖基化谱具有少于约3％的Man5或少于约0.5％的G2、Man6和/或Man7；
(b)所述N-连接的糖基化谱含有对应于唾液酸化寡糖的第三个峰，所述唾液酸化寡糖峰的AUC占所有峰的总AUC的1％或更少，或其中N-连接的糖基化谱含有对应于寡糖G1的第三个峰，所述G1峰的AUC占所有峰的总AUC的少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％或约1-5％或约1-4％或约1-3％；
(c)所述N-连接糖基化谱含有对应于Man5、Man6和Man7糖型的峰，其总共少于总AUC的约6％；或
(d)所述达珠单抗具有与图19或图21下图基本相似的N-连接的糖基化HPLC谱。
12.包含达珠单抗的组合物，如在体外细胞测定法中所测量，其显示(a)低于30％、低于25％、低于20％、低于15％、低于10％或低于5％的ADCC平均细胞毒性或(b)5-30％、10-30％、10-25％或15-25％的ADCC平均细胞毒性，所述体外细胞测定法利用来自至少3个健康供体的效应细胞和以Kit225K6作为靶细胞，达珠单抗浓度为1μg/mL，效应细胞与靶细胞的比率为约25∶1，可选地其中所述测试利用来自至少6个或至少10个健康供体的效应细胞。
13.权利要求12的组合物，其中所述达珠单抗是DAC HYP。
14.可用于制备达珠单抗药物配制剂的组合物，其包含约150-190mg/mL达珠单抗和一定量的赋形剂，以使用稀释缓冲液对所述组合物进行稀释得到经稀释的组合物，所述经稀释的组合物含有约85-165mg/mL或85-115mg/mL或150±15mg/mL达珠单抗，并具有约267-327mOsm/kg范围内的摩尔渗透压浓度和25℃时约pH 5.8-6.2范围内的pH，并且如通过大小排阻层析所测量，其中至少约95％的达珠单抗是单体形式。
15.组合物，其包含：
(a)约4至15mg/mL达珠单抗，其中0.1％或更少的达珠单抗是聚集体形式，可选地其中所述组合物通过在弱阳离子交换树脂上通过柱层析对含有约4到15mg/mL达珠单抗、其中上至2.5％的达珠单抗是聚集体形式的达珠单抗组合物进行纯化而获得；或
(b)约85-165mg/mL或约85-115mg/mL或约135-165mg/mL达珠单抗；和约0.02-0.04％(w/v)聚山梨酯80，其中所述组合物具有约267-327mOsm/kg范围内的摩尔渗透压浓度和25℃时约pH 5.8-6.2范围内的pH，并且如通过大小排阻层析所测量，至少约95％或至少约99％的达珠单抗是单体形式，其中所述组合物适合施用于人，可选地其中所述组合物基本由约100mg/mL或约150mg/mL达珠单抗、约40mM琥珀酸钠、约100mM氯化钠和约0.03％(w/v)聚山梨酯80组成，并在25℃时具有约6.0的pH。
16.适合皮下施用的药物组合物，其包含约85-165mg/mL、约85-115mg/mL或约135-165mg/mL达珠单抗，其中在约2-8℃范围内的温度下储存约12个月时间后聚集体形式的达珠单抗的百分数不超过约2％或约3％，或者在约2-8℃范围内的温度下储存约18个月时间后不超过约3％。
17.从细胞培养物中收获重组蛋白的方法，其包括步骤：
(i)将表达并分泌重组蛋白的细胞培养物的pH调节至约pH 4.5-5.5范围内的pH；
(ii)将经pH调节的细胞培养物在约4至15℃范围内的温度下孵育约30-90分钟；并
(iii)将孵育后的经pH调节的细胞培养物离心，以除去细胞碎片。
18.生产经纯化的达珠单抗组合物的方法，其包括步骤：
(i)将达珠单抗从达珠单抗粗制品中吸收到亲和层析树脂上；
(ii)用清洗缓冲液清洗亲和树脂，以去除污染物；
(iii)用洗脱缓冲液洗脱已吸收的达珠单抗；
(iv)通过将pH调节至约pH 3-4范围内的pH并将经pH调节的洗脱物在特定温度下孵育足以使病毒失活的一段时间，从而使洗脱物中的病毒失活；
(v)将病毒失活的洗脱物中和至约pH 7.7-7.9(25℃下测量)范围内的pH或约pH 7.7-8.5(25℃下测量)范围内的pH；
(vi)使经中和的洗脱物流过强阴离子交换层析树脂；
(vii)使步骤(vi)的洗脱物中的达珠单抗吸收到弱阳离子交换层析树脂上；和
(viii)从弱阳离子交换层析树脂上将已吸收的达珠单抗洗脱下来；可选地，包括步骤：
(ix)对步骤(viii)中洗脱下的达珠单抗组合物进行过滤，以去除病毒；和
(x)通过超滤来对经过滤的溶液进行浓缩，以获得包含约85-180mg/mL达珠单抗的经纯化的达珠单抗组合物。
19.权利要求18的方法，其中所述达珠单抗粗制品从细胞培养物中收获，可选地利用权利要求17的方法。
20.权利要求18的方法，其中进行步骤(i)至(x)，其进一步包括用稀释缓冲液对经纯化的达珠单抗组合物进行稀释以获得包含约85-165mg/mL达珠单抗和约0.02-0.04％(w/v)聚山梨酯80的组合物的步骤，其中所述组合物具有约267-327mOsm/kg范围内的摩尔渗透压浓度和25℃时约pH 5.8-6.2范围内的pH，并且如通过大小排阻层析所测量，至少约95％的达珠单抗是单体形式，可选地，其中所获得的组合物具有少于50ppm的来自达珠单抗重组来源的宿主细胞蛋白、少于10ppm的蛋白A，并且组合物中不多于3％的达珠单抗是聚集体形式。
21.培养基，其是基础培养基PFBM2或补料培养基PFFM3。
22.达珠单抗组合物，其通过包括在达珠单抗分泌到培养基中的条件下培养根据权利要求1的宿主细胞的步骤的方法而获得，可选地，其中所述方法进一步包括从细胞培养基中分离所分泌的达珠单抗的步骤。
23.用于对蛋白A亲和层析树脂进行消毒的缓冲液，其包含约100-500mM柠檬酸钠、约10-30mM NaOH和约0.5-3％(v/v)苯甲醇。
24.对蛋白A亲和层析柱进行消毒的方法，其包括用权利要求23的消毒缓冲液以足以使柱消毒的流速和时间对柱进行清洗，可选地，其中用约1.8倍柱体积的消毒缓冲液以约150cm/hr的流速对柱进行清洗，经清洗的柱不流动孵育约30-45分钟，接着用平衡缓冲液平衡。
25.治疗患有多发性硬化症的患者的方法，其包括对患者施用足以提供治疗益处的量的DAC HYP。
26.权利要求25的方法，其中施用DAC HYP组合物：
(a)静脉内；
(b)以对应于约0.8-0.9mg/kg或约1mg/kgDAC HYP的量；
(c)每周一次，持续至少6周、至少12周、至少24周时间；
(d)以单一疗法；或
(e)根据(a)至(d)的任意组合。
27.权利要求26的方法，其中DAC HYP以单一疗法施用，并且所述患者已经对之前β-干扰素的治疗无应答或者已经终止了之前β-干扰素的治疗。
28.权利要求26的方法，其中DAC HYP辅佐β-干扰素施用。
29.权利要求25的方法，其中施用DAC HYP组合物：
(a)皮下；
(b)以对应于约1mg/kg DAC HYP的量，可选地每2周一次，或以对应于约2mg/kg DAC HYP的量，可选地每4周一次；
(c)持续总共约24周时间；或
(d)根据(a)至(c)的任意组合。
30.权利要求29的方法，其中所述DAC HYP组合物以对应于75mg至300mg DAC HYP或150mg或300mg的量施用。
31.权利要求30的方法，其中所述DAC HYP组合物每4周施用一次，可选地持续总共至少48周时间。
32.权利要求30的方法，其中所述DAC HYP以单一疗法施用，可选地，其中所述患者已经对之前β-干扰素的治疗无应答或者已经终止了之前β-干扰素的治疗。
33.权利要求30的方法，其中所述DAC HYP辅佐β-干扰素施用。
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