KR20210009982A - 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 - Google Patents
2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210009982A KR20210009982A KR1020190087244A KR20190087244A KR20210009982A KR 20210009982 A KR20210009982 A KR 20210009982A KR 1020190087244 A KR1020190087244 A KR 1020190087244A KR 20190087244 A KR20190087244 A KR 20190087244A KR 20210009982 A KR20210009982 A KR 20210009982A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- interferon
- beta
- chromatography
- beta protein
- diglycosylated
- Prior art date
Links
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 title claims abstract description 94
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 title description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 title description 5
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims abstract description 67
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 23
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 18
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 claims description 7
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 56
- 239000000463 material Substances 0.000 description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 24
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 18
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 12
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 12
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 6
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 5
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 5
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 4
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 4
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000011162 core material Substances 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 4
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 description 2
- 229960003161 interferon beta-1b Drugs 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002704 mannoses Chemical class 0.000 description 2
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000012437 strong cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002305 strong-anion-exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 238000003989 weak cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PNIWLNAGKUGXDO-LNCRCTFVSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r)-5-amino-4,6-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical group O[C@@H]1[C@@H](N)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 PNIWLNAGKUGXDO-LNCRCTFVSA-N 0.000 description 1
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N L-pyrrolysine Chemical compound C[C@@H]1CC=N[C@H]1C(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PNIWLNAGKUGXDO-UHFFFAOYSA-N Lactosamine Natural products OC1C(N)C(O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 PNIWLNAGKUGXDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000002942 anti-growth Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940021459 betaseron Drugs 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000005467 butylenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012733 comparative method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 229940077362 extavia Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002093 isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- DOVBXGDYENZJBJ-ONMPCKGSSA-N lactosamine Chemical compound O=C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DOVBXGDYENZJBJ-ONMPCKGSSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 102200072402 rs121917906 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
Abstract
본 발명은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하여 친화성 크로마토그래피, low pH 불활성화, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 및 상기 방법에 의해서 분리된 2당화된 인터페론-베타 단백질에 관한 것이다. 본 발명 방법은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 수율이 현저히 우수하고, 대량 배양에서의 제조 관리 및 품질관리가 용이하며, 의약품으로 사용하는 데에 있어서의 규제에 적합한 우수한 품질의 2당화된 인터페론-베타 단백질을 분리할 수 있어 산업상 이용가능성이 크다.
Description
본 발명은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 및 상기 방법에 의해서 분리된 2당화된 인터페론-베타 단백질에 관한 것이다.
인간의 인터페론(Interferon, IFN)은 현재 8 종류로 알려져 있으며, 이들은 물리화학적 및 기능적 특징에 따라 1형과 2형의 두 가지로 분류된다. 1형 인터페론은 알파(alpha)-, 베타(beta)-, 카파(kappa)-, 델타(delta)-, 입실론(epsilon)-, 타우(tau)- 및 오메가(omega)-인터페론이 있고, 2형 인터페론에는 감마(gamma)-인터페론이 있다.
인터페론(IFNs)은 바이러스의 복제를 억제함으로써, 항 바이러스 활성을 나 타내고, 세포 증식을 억제하며, 면역 반응을 조절한다. 이중 인터페론 베타는 바이러스 감염 등에 의한 반응시 생산되는 사이토카인(cytokine)으로, 특히 다발성경화증(multiple sclerosis, MS) 치료제 등으로 사용되며, 항암활성도 나타내어 암치료제로 사용될 가능성도 있다.
현재, 치료용으로 사용되는 인터페론 베타는 2 종류가 존재하는데, 첫째로 인터페론 베타 1a는 인간 인터페론 베타 유전자를 포함하는 중국 햄스터 난소(chinese hamster ovary, CHO)로부터 생산되고, 166개 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, 크기가 25 kD인 당화된(glycosylated) 단백질이다. 둘째로 인터페론 베타 1b는 대장균으로부터 생산되는 165개 아미노산 잔기로 구성된 단백질인데, 당이 결여되어 있고, 아미노산 1번 메티오닌(methionine) 잔기가 결여되어 있으며, 17번 시스테인(cysteine) 잔기가 세린(serine)으로 치환되어 있다. 현재 시판되고 있는 인터페론 베타 1a는 레비프(Rebif)와 아보넥스(Avonex)가 있으며, 인터페론 베타 1b는 베타세론(Betaseron), 엑타비아 (Extavia)이 있다.
한편, 당단백질은 폴리펩티드 측쇄에 공유적으로 부착된 올리고당류 사슬을 함유하는 단백질이다. 당단백질은 구조, 보호, 운반, 호르몬 또는 효소 기능을 포함하는 매우 다양한 여러 생리학적 기능을 가지고 있으며, 이들의 생리학적 기능에 부착된 당쇄가 중요하게 작용하는 점이 일반적으로 알려져 있다. 당단백질은 현재 재조합적으로 생성될 수 있으나, 이는 세포 배양 수거물로부터 표적화된 당단백질을 추출하기 위해 광범위한 정제 절차를 필요로 하며, 제조/발현 및 정제 과정 중 당쇄의 탈락, 변형 등은 생리학적 기능에 영향을 미치게 되므로 제조/발현 과정에서 올바르게 형성되도록 하거나 정제 과정에 당쇄의 탈락/변형이 되지 않도록 각 과정을 구성하는 것이 중요하다.
인터페론도 당단백질의 일종이며, 야생형 인터페론-베타의 경우 80 번째 아미노산에 당쇄가 부착되어 있다. 특히, 2004년 인터페론의 당화에 변이를 초래하는 인터페론-베타 돌연변이 단백질을 개발되어 이를 치료제로 활용하고자 하는 연구가 진행중에 있다. 인터페론 베타를 치료제로 사용하기 위해서는 충분한 단백질 양과 높은 순도를 가지며, 장기 보존에 적합한 형태로 정제되어야 한다. 인터페론 베타는 안정성이 떨어지기 때문에, 정제과정에서 펩타이드 결합의 절단, 탈 아미드화, 메티오닌의 메티오닌 설파이드로의 산화, 디설파이드 교환과 같은 분해 반응이 흔히 일어나는데 (US2012/0177603), 정제 과정에서 이들에 대한 고려가 반드시 필요하다.
아울러, 일반적인 정제과정은 다수의 상이한 크로마토그래피 방법이 이용가능하기 때문에 적합한 정제 방법을 찾기 위해서는 다수의 조합을 시험해야만 한다. 이들 조합에서 서로 다른 순서, 심지어는 다른 수의 크로마토그래피 방법이 조합되어 사용될 수 있으나, 이들 조합에 따라서 정제 효과가 충분하지 않거나, 정제된 단백질에 손상이 발생할 수 있어 당화된 단백질을 정제하기 위해 적합한 순서의 크로마토그래피 단계를 결정하는 방법은 당업계에 항상 요구되는 과제이다.
특히, 종래의 기술들은 정제 과정 중 유기용매를 사용하기 때문에 대규모의 생산시 특별한 설비를 필요로 한다던지, 정제 과정이 복잡하여 고비용이 소요되는 단점이 있다. 따라서 유기용매를 사용하지 않아 대량의 정제가 용이하고, 간단하고 경제적이며 수율이 높은 2당화된 인터페론 베타 단백질의 정제 방법의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법을 개발하기 위하여 연구한 결과, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제를 하는 경우 충분한 단백질 양과 높은 순도를 가지며, 당화의 변형이나 기타의 인터페론-베타의 변형의 우려가 적은 새로운 정제 방법인 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 정제 방법에 의해서 수득된 2당화된 인터페론-베타 단백질을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 정제 방법에 의해서 수득된 2당화된 인터페론-베타 단백질을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 그들의 용도는 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 예를 들면 [Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)]; [Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)]; [Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991), Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)]; [Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]; [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds)., John Wiley & Sons, Inc., New York]; 또는 [Freitag, R., Chromatographical processes in the downstream processing of (recombinant) proteins, Meth. Biotechnol. 24 (2007) 421-453 (Animal cell biotechnology 2nd Edition)]를 참고할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 물질로서 추가의 개질없이 이용될 수 있는 고형 물질, 예를 들면 하이드록실아파타이트 또는 친화성 크로마토그래피 물질을 의미하고, 또한 크로마토그래피 작용기가 바람직하게는 공유 결합에 의해 부착되는 벌크 코어 물질을 포함하는 물질을 의미한다. 벌크 코어 물질은 크로마토그래피 과정, 즉, 분리되고자 하는 폴리펩타이드와 크로마토그래피 물질의 크로마토그래피 작용기 사이의 상호작용이 실질적으로 이루어지지 않는 것을 나타낸다. 크로마토그래피 물질은 단순히 크로마토그래피 작용기가 부착되고, 분리될 물질을 함유하는 용액이 크로마토그래피 작용기에 접근할 수 있도록 보장하는 3차원 골격을 제공하는 역할을 한다. 바람직하게는 상기 벌크 코어 물질은 고형상이다. 따라서, 바람직하게는 상기 "크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 작용기가 바람직하게는 공유 결합에 의해 부착된 고형상이다. 바람직하게는 상기 "크로마토그래피 작용기"는 이온화가능한 소수성 기 또는 소수성 기이거나, 또는 서로 다른 크로마토그래피 작용기가 일부 유형의 폴리펩타이드만 결합하도록 조합되어 있는 복합기이거나, 공유 결합된 하전된 기이다.
본 명세서에서 용어 “폴리펩타이드” 및 “단백질”은 통상(종래)의 의미에 따라 사용되는 것으로, 즉 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 폴리펩타이드는 특정의 길이로 한정되지 않지만, 본 발명의 문맥에서는 일반적으로 전장(full length) 단백질의 단편을 지칭하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 번역후의 수식, 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등 및 해당 분야에 공지된 다른 수식(자연적으로 발생하는 수식 및 비자연적 발생의 수식)을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 단백질은 임의의 다양한 공지의 재조합 및/또는 합성의 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "결합 모드“ 및 ”용출 모드"는 원하는 물질 (예를 들어, 2당화된 인터페론 베타)을 함유하는 용액이 정지상, 바람직하게는 고형상과 접촉하고, 여기서, 원하는 물질은 고형상의 크로마토그래피 물질에 결합하는 크로마토그래피 방법의 작동 방식을 의미한다. 그 결과, 원하는 물질이 고형상에 부착되어 있는 반면, 원하지 않는 물질은 용매의 흐름을 따라서 또는 상층액과 함께 제거된다. 이후에 원하는 물질은 고형상으로부터 용출되고 이에 의해 용출 용액과 함께 고형상으로부터 회수된다. 이는 원하지 않는 물질 모두가 제거되는 것을 반드시 의미하는 것은 아니지만, 원하지 않는 물질의 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상이 제거된다.
본 명세서에서 용어 "연속 용출" 및 "연속 용출 방법"은 예를 들면 용출, 즉 결합된 물질의 크로마토그래피 물질로부터의 분리를 야기하는 물질의 농도가 연속적으로 상승되거나 감소됨을 의미한다. 즉, 각각의 단계가 용출을 야기하는 물질의 농도를 2% 보다 크지 않게, 바람직하게는 1% 보다 크지 않게 변화시키는 일련의 작은 단계에 의해 농도가 변화된다. 이러한 "연속 용출"에서, 크로마토그래피 방법의 하나 이상의 조건, 예를 들면 pH, 이온 강도, 염의 농도, 및/또는 유속은 선형으로 변화되거나, 기하급수적으로 변화된다. 바람직하게는, 변화는 선형으로 변화되는 것이다.
본 명세서에서 용어 "단계 용출" 및 "단계 용출 방법"은 예를 들면 용출, 즉, 결합된 물질의 크로마토그래피 물질로부터의 분리를 야기하는 물질의 농도가 한번에, 즉, 한 값/수준에서 다음 값/수준으로 상승되거나 감소되는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 이러한 "단계 용출"에서, 크로마토그래피 방법의 하나 이상의 조건, 예를 들면 pH, 이온 강도, 염의 농도, 및/또는 유속은 제 1 값, 예를 들면 출발값에서 제 2값, 예를 들면 최종 값으로 한번에 변화된다. 단계에서의 변화는 용출을 야기하는 물질의 농도를 5% 보다 크게, 바람직하게는 10% 보다 크게 변화시킨다. "단계 용출"은 선형 변화와는 대조적으로 증분적으로, 즉, 단계별로 변화된다. "단계 용출 방법"에서는 각각의 증가 후에 새로운 분획이 수집된다. 각각의 증가후, 용출방법에서의 다음 단계까지 조건이 유지된다.
본 명세서에서 용어 “분리된 단백질” 및 "분리된 폴리펩타이드"는 탄화수소, 지질 또는 자연에서 폴리펩타이드와 관련된 다른 단백질 불순물과 같은 오염 세포 성분이 실질적으로 없는 폴리펩타이드이다. 전형적으로, 분리된 단백질의 제조는 매우 정제된 상태, 즉, 약 80% 이상 순수한, 약 90% 이상 순수한, 약 95% 이상 순수한, 95% 이상 순수한, 또는 99% 이상 순수한 폴리펩타이드를 함유한다. 특정한 단백질 제제가 분리된 폴리펩타이드를 함유하고 있음을 보여주는 방법은 예를 들어, 단백질 제제를 전기영동시키고 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색시킨 후 단일 밴드가 나타나는 것이다. 그러나, 용어 "분리된"은 이량체, 유도체화된 형태, 정확하게 절첩되지 않은 형태, 정확하지 않게 다이설파이드 가교된 형태 또는 스크램블된 형태와 같은 다른 물리적 형태의 동일한 폴리펩타이드의 존재를 배제하지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 ‘폴리뉴클레오티드’, ‘핵산’은 단일-가닥 또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "인간 인터페론-베타의 활성"이란 인간 인터페론-베타가 지닌다고 알려진 활성 중에서 어떠한 폴리펩티드가 인간 인터페론-베타로 동정되기에 충분한 하나 이상의 활성으로 정의된다. 그러한 활성으로서는 이미 전술한 바의 다발성경화증에 대한 경감, 완화 또는 치료 활성, 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 활성, 항 성장활성, 항 증식 활성, 림프구세포독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T 세포의 효과 증가 활성, 대식세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성, 암 예방 또는 치료 활성, 자가 면역 장애 예방 또는 치료 활성, 바이러스 감염 예방 또는 치료 활성, HIV와 관련된 질병의 예방 또는 치료 활성, C형 간염 예방 또는 치료 활성, 류마티스성 관절염 예방 또는 치료 활성 등을 예시할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “발현(expression)”이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.
본 발명은
(a) 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 정제 방법 (또는 분리 방법)에 각 단계에 대해서는 다음과 같다.
(a) 단계 : 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계
본 발명의 인터페론-베타 (인터페론-베타 폴리펩티드 또는 인터페론-베타 단백질)은 야생형의 인터페론 베타의 27번 아르기닌(R27)부위가 트레오닌으로 변이(R27T)된 것일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 인터페론-베타는 서열번호 1의 25번째 아미노산 및 80번째 아미노산의 2곳에 당쇄가 결합된 것으로 인터페론-베타 활성을 지니는 폴리펩티드로서 이해되어야 한다. 바람직하게는 본 발명의 인터페론-베타는 인간 인터페론-베타를 나타낸다.
본 발명의 인터페론-베타는 해당 유전자가 발현되도록 형질전환된 숙주세포로부터 발현되어 세포내 또는 세포외 위치로 발현될 수 있다. 본 발명에서 숙주 세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물을 진행시키는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독 후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질의 바람직한 변형 및 프로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현은 생물학적 활성 생성물을 생산할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 천연 폴딩의 가능성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 인터페론-베타를 안정되면서 연속적으로 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으나, 2당화된 인터페론-베타의 발현을 위해서는 원핵생물인 숙주세포는 사용될 수 없다. 본 발명의 숙주세포는 예를 들어, 이스트(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 동물 세포 및 사람 세포일 수 있으며, 바람직하게는 CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주가 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명에서 숙주세포는 CHO 세포주일 수 있다.
본 발명에서 배양은 목적 단백질인 인터페론-베타의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 형질전환 숙주세포는 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어, SFM4CHO, optiCHO SFM 등의 배지를 사용하고, 첨가물로써 200mM L-Glutamine 등을 사용할 수 있다. 숙주세포의 배양은 통상의 숙주세포 배양 조건상에서 가능하며 예를 들어, 온도범위 15℃ 내지 45℃에서 10시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과 (filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다.
(b) 단계 : 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계
본 명세서에서 용어 "친화성 크로마토그래피"는 친화성 크로마토그래피 물질을 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 친화성 크로마토그래피에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 작용기에 대한 정전기적 상호작용, 소수성 결합 및/또는 수소 결합 형성에 따른 이들의 생물학적 활성 또는 화학적 구조에 근거하여 분리된다. 특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 친화성 크로마토그래피 물질로부터 회수하기 위해서, 경쟁자 리간드가 첨가되거나, 또는 pH 값, 극성 또는 완충제의 이온 강도와 같은 크로마토그래피 조건을 변화시킨다. 친화성 크로마토그래피 물질은 일정한 유형의 폴리펩타이드에만 결합하도록 서로 다른 단일한 크로마토그래피 작용기가 조합되는 복합 크로마토그래피 작용기를 포함하는 크로마토그래피 물질이다. 이 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기의 특이성에 따라 일부 유형의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 친화성 크로마토그래피 물질은 인터페론, 바람직하게는 인테페론-베타에 친화성이 있는 염료 친화성 크로마토그래피 (dye affinity chromatography)일 수 있으며, 블루 세파로스를 레진(resin)으로 이용할 수 있다. 염료 친화성 크로마토그래피는 예를 들어 블루 덱스트란 세파로스 R (Blue Dextran Sepharose R) 또는 시바크론 R 블루 (Cibacron R Blue)가 고정된 매트릭스일 수 있다. 예를 들어, Amicon 사의 Matrex Gel Blue A, Merck 사의 Fraktogel 45 TSK AF-Blue 또는 GE Healthcare의 Blue-Sepharose R 6FF (fastflow)를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 2당화된 인터페론-베타 단백질은 Blue-Sepharose R 6FF를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해서 인터페론-베타 단백질이 분리, 특히 당화 상태가 유지되며 인터페론-베타 단백질이 분리되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서는 바람직하게는 친화성 크로마토그래피 물질로 Blue-Sepharose R 6FF를 사용할 수 있다.
Blue-Sepharose R 6FF를 이용한 염료 친화성 크로마토그래피에 의한 인터페론-베타의 분리, 정제는 당해 기술 분야에 여러 기술문헌으로 공지되어 있으며, 해당 기술 문헌에서의 크로마토그래피 수행 방법은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터페론-베타는 Blue-Sepharose R 6FF에 강하게 결합하며, 결합된 단백질들은 용출 전에 다양한 완충액에 의해 씻어 낼 수 있다. 통상적인 조건 하에서 인터페론-베타는 저농도라고 하더라도 Blue-Sepharose R 6FF에 잘 결합하기 때문에 이 단계는 본 발명에 따른 정제 공정의 첫 번째 크로마토그래피 단계로서 적합하다. IFN-β의 용출을 위해 사용되는 시약으로는 Chaotropic agent 나 salt 등이 사용될 수 있으며, 에틸렌글리콜 (ethylene glycol) 또는 프로필렌글리콜 (propylene glycol) 등의 환원제를 포함하는 수용액을 사용할 수 있다. 바람직하게는 본 단계에서의 용출을 위해서는 프로필렌 글리콜 수용액이 사용될 수 있으며, 20% 내지 40%의 프로필렌 글리콜 수용액이 사용될 수 있다.
(c) 단계 : 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계
본 명세서에서 용어 "low pH 불활성화"는 외피성 바이러스의 불활성화의 목적으로써 산을 첨가하여 pH 4.0 또는 그 이하의 pH의 산성 조건에서 바이러스성 외부 유입물을 불활성화하는 것을 나타낸다.
바람직하게는 low pH 불활성화는 산을 첨가하여 pH 2.0 내지 pH 4.0, 더 바람직하게는 pH 3.0 내지 pH 4.0 또는 pH 3.5 내지 pH 4.0이 되도록 처리한다. 처리 시간 및 온도는 10 내지 30℃ 또는 15 내지 25℃에서 30분 내지 4시간일 수 있다. 처리 후 필요에 따라서 염기성 용액을 이용하여 pH 6 내지 7.5, 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5로 중화하여 이후의 단계를 진행한다.
첨가 되는 산은 무기산, 예를 들어, 인산, 염산, 황산 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산일 수 있으며, 바람직하게는 인산 수용액 (phosphoric acid)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 (b) 단계의 용출물에 10배 희석된 pH 3.5의 인산 수용액을 첨가하여 pH를 4 또는 그 이하로 낮추고, 15 내지 25 ℃에서 1시간 동안 처리하여 low pH 불활성화를 수행하였고 이후 2M Trizma base를 이용하여 다시 중화하였다.
(d) 단계 : 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계
본 명세서에서 용어 "소수성 상호작용 크로마토그래피"는 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질이 이용되는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질은 소수성 기, 예를 들면 부틸-, 옥틸- 또는 페닐 기가 크로마토그래피 작용기로서 결합되어 있는 크로마토그래피 물질이다. 폴리펩타이드는 그 표면에 노출된 소수성 부위의 성질에 의해서 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질의 소수성 기와 상호작용하여 분리될 수 있다. 폴리펩타이드와 크로마토그래피 물질 사이의 상호작용은 온도, 용매 및 용매의 이온 강도의 영향을 받을 수 있다. 아미노산 측쇄의 움직임이 증가하고 더 낮은 온도에서는 폴리펩타이드 내부에 파묻힌 소수성 아미노산 측쇄가 접근가능해지므로, 온도 증가는 예를 들면 폴리펩타이드와 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질 사이의 상호작용을 더 크게한다. 또한 소수성 상호작용은 코스모트로픽 염에 의해 촉진되고 카오트로픽 염에 의해 감소된다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 물질은 부틸 세파로스, 페닐 세파로스, 옥틸 세파로스를 레진으로 하는, 예를 들면 페닐세파로스 CL-4B, 6FF, HP, 페닐 슈퍼로스, 옥틸세파로스 CL-4B, 4 FF 및 부틸세파로스 4FF일 수 있으며, 바람직하게는 부틸 세파로스, 더 바람직하게는 부틸세파로스 4FF를 레진으로 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
(e) 단계 : 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계
본 명세서에서 용어 "음이온 교환 크로마토그래피"는 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용한 크로마토그래피 방법을 의미한다. 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 양이온으로 하전된 기를 가지는 고형상의 고분자물질이며, 음이온이 교환되는 물질을 의미한다. 보통 카운터 이온이 음이온 교환 크로마토그래피 물질과 결합되어 있으며, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 주위 용액에 있는 유사하게 하전된 음이온을 카운터 이온과 교환할 수 있다.
예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피는 예를 들면, 상용의 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용한 크로마토그래피일 수 있으며, Biorad Laboratories사, Cyphergen사, GE Healthcare 등의 제조사에 의해서 제공되는 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피는 4가 암모늄을 음이온 교환 수지로 이용하는, 바람직하게는 Q 레진을 레진(resin)으로 이용하여 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 Capto Q ImpRes를 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행할 수 있다.
바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피에서 음이온 교환 크로마토그래피가 먼저 수행된다. 이는 인터페론 베타 정제과정에서 불순물에 해당하는 basic variant와 virus, HCP (host cell protein), HCD (host cell DNA) 및 내독소 (endotoxin)를 보다 효과적으로 제거하기 위하여 필요한 단계이다.
(f) 단계 : 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계
본 명세서에서 용어 "양이온 교환 크로마토그래피"는 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용한 크로마토그래피 방법을 의미한다. 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 음이온으로 하전된 기를 가지는 고형상의 고분자물질이며, 양이온이 교환되는 물질을 의미한다. 보통 카운터 이온이 양이온 교환 크로마토그래피 물질과 결합되어 있으며, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 주위 용액에 있는 유사하게 하전된 양이온을 카운터 이온과 교환할 수 있다.
하전된 기의 성질에 따라, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 예를 들어, 설폰산 기(SP) 또는 카복시메틸 기(CM)을 가질 수 있다. 또한, 하전된 기의 성질에 따라, 하전된 치환기의 강도에 따라 강하거나 약한 양이온 교환 크로마토그래피 물질로서 추가로 분류될 수 있다. 예를 들면 강한 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 설폰산 기를 갖고, 약한 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 카복실산 기를 갖는다.
예를 들면, 양이온 교환 크로마토그래피는 예를 들면, 상용의 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용한 크로마토그래피일 수 있으며, Biorad Laboratories사, Cyphergen사, GE Healthcare 등의 제조사에 의해서 제공되는 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 SP 세파로스를 레진(resin)으로 이용하여 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 sephadex S.F.F.를 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 수행할 수 있다.
본 발명의 정제를 통해 분리되는 인터페론-베타는 인간 인터페론-베타의 활성을 가지고 있으며, 인터페론-베타의 생물학적 및/또는 면역학적 특징을 가지면서, GMP (의약품 및 의약부외품의 제조 관리 및 품질관리 규칙)의 관점에서 일상적인 처리에 있어서 적용가능해서, 바람직하게는 규제에 의한 용인 요건 (밸리데이션, 재현성) 및 인터페론-베타가 특정한 생화학적인 특질 (소수성 등)을 가지고 있다.
분리된 2당화된 인터페론-베타의 비활성은, 적어도 2×108IU/mg이어야 하며, 바람직하게는 적어도 3×108IU/mg, 더 바람직하게는 적어도 4×108IU/mg의 비활성을 가질 수 있다. 측정할 수 있는 IFN-β의 2개가 필수적인 생물학적 활성은, 그 항바이러스 효과 및 항증식 효과다. 이 생물학적 활성을, 각 각, 바이러스의 세포 변성 효과 저해를 통하는 표준적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 인터페론 베타의 활성의 측정은 예를 들어, Stewart, W. E. 11 (1981), The Interferon System (제2 증보판), Springer-Verlag: Wien, New York; Grossberg, S. E. 들 (1984), Assay of Interferons. In: Came, P. E., Carter W. A, Interferons and their Applications, Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 2당화된 인터페론-베타의 정제방법은 바람직하게는 역상 크로마토그래피, 한외여과 또는 투석, 크기배제 크로마토그래피는 포함하지 않는다. 역상 크로마토그래피는 일반적으로 사용하는 버퍼인 아세토니트릴 (acetonitrile)이 유기용매이기 때문에, 대량 배양 및 정제를 위해서는 방폭 시설 등의 추가적인 설비가 필요하다는 단점이 있으며, 한외여과, 투석은 대량 배양 및 정제에 적절하지 않고, 폐액이 다수 발생할 수 있다는 단점이 있다. 아울러, 크기배제크로마토그래피는 대량 배양 및 정제시에 적절하지 않다는 단점이 있다.
바람직하게는 역상 크로마토그래피, 한외여과 또는 투석, 크기배제 크로마토그래피를 배제한 것은 상당한 노동력이 소요되거나, 많은 투자가 소요되는 고가의 설비를 필수적으로 사용하거나, 또한, 인화성 용매, 폭발 방호, 폐액의 처리 등 안전과 환경에 영향을 미치는 여러 제약을 원천적으로 배제할 수 있기 때문이다.
아울러, 본 발명은 상기한 본 발명의 정제 방법에 의해서 수득된 2당화된 인터페론-베타 단백질을 제공한다. 바람직하게는 본 발명의 인터페론 베타 단백질은 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 25번째 아미노산 및 80번째 아미노산에 당쇄를 가진다.
상기 인터페론 베타 단백질이 가지는 당쇄는 oxford notation 방법에 따라 표기된 A2G2, FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA2G2S*2, FA3G3S1, FA3G3S3, FA3G3S*3, FA4G4S1, FA4G4S3, FA4G4S4, FA4G4S*3, FA4G4S*4, FA4G4Lac1S3, FA4G4Lac1S*3, FA4G4Lac1S4, FA4G4Lac2S3, FA4G4Lac1S*3 구조의 당쇄일 수 있으며, 바람직하게는 상기 당쇄 중 어느 2개의 당쇄 구조를 가진다.
(F = core fucosylated;
A2, biantennary with both GlcNAcs as ß1-2 linked;
A3, triantennary with a GlcNAc linked ß1-2 to both mannoses and the third GlcNAc linked ß1-4 to the α1-3 linked mannose;
A3’, triantennary with a GlcNAc linked ß1-2 to both mannoses and the third GlcNAc linked ß1-6 to the α1-6 linked mannose;
A4, GlcNAcs linked as A3 with additional GlcNAc ß1-6 linked to α1-6 mannose;
Gx, number (x) of galactose linked beta 1-4 to antenna;
Sx, number (x) of sialic acids linked to galactose; sialic acid is in an α2-3 unless indicated by a * that α2-6 linkages are also present;
Lacx, number (x) of lactosamine (Gal-GlcNAc) extensions.
The additional possible lactosamine structures are listed in italic)
본 발명의 일실시예에서 5 리터 스케일로 배양하여 인터페론-베타가 발현시킨 후에 본 발명의 2당화 인터페론-베타의 정제 방법을 이용하여 정제하였다. 2당화 인터페론-베타의 정제는 각각 블루 세파로즈(Blue sepharose 6 fast flow) 레진을 이용한 친화성 크로마토그래피, 산 첨가에 의한 low pH 불활성화, 부틸 세파로즈(Butyl 4 fast flow) 레진을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피, 캡토 Q(Capto Q ImpRes) 레진을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피, SP 세파로즈(SP sepharose fast flow) 컬럼을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피를 순서에 따라 수행하여 진행하였다.
이에 대한 비교예로, 동일한 배양 발현에 의해 제조된 인터페론-베타를 기존 인터페론-베타 단백질의 정제 방법에 따라 블루 세파로즈(Blue sepharose 6 fast flow) 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피, CM 세파로즈(CM sepharose fast flow) 레진을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피, 를 이용한 역상크로마토그래피(VYDAC C4), 한외 여과·농축, 크기배제 크로마토그래피(Sephacryl 100HR)를 순서에 따라 수행하여 진행하였다.
본 발명의 일실시예에서는 각 정제 방법에 따라 분리, 정제된 인터페론-베타를 수율 (yield), 단백질 변형 여부, 비활성, 함량 및 전체 활성의 관점에서 평가한 결과, 본 발명의 방법이 비교예 방법에 비해서 전체 함량, 수율, 메티오닌이 결실된 형태 (Met deletion form) 모두 우수한 것으로 나타났고, 비활성의 경우 비교예 방법이 본 발명의 방법에 비해서 높게 나왔으나, 전체적인 정제량을 고려한 전체적인 활성에서도 본 발명의 방법이 현저히 우수한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하는 경우 2당화된 인터페론 베타를 우수한 품질 및 수율을 가지며, 더 높은 활성을 가지도록 분리/정제할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 일실시에에서는 각 정제 방법에 따라 분리, 정제된 인터페론-베타의 불순물을 CHO 세포의 세포유래단백질 (CHO-HCP) 함량, 엔도톡신 함량, IEF에서의 패턴의 관점에서 확인한 결과, CHO 세포의 단백질, 엔도톡신의 경우 모두 통상적인 기준치에 부합되었으나, 본 발명의 방법이 불순물의 함량이 더 적게 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 본 발명의 방법에 의해서는 염기성 변이체 (basic variant)가 존재하지 않아 비교예 1의 방법에 비해서도 좀 더 순도 높은 정제방법임을 알 수 있었다.
상기한 바와 같은 일련의 공정을 통해 각 단계별 정제 수율 및 순도를 하기 표 1에 나타내었다.
| Start Material | Eluted Pool | Yield | |||||
|
Conc.
(mg/mL) |
Volume
(mL) |
Amount
(mg) |
Conc.
(mg/mL) |
Volume
(mL) |
Amount
(mg) |
||
| Blue | N/A | 4,500 | N/A | 0.574 | 66 | 37.9 | N/A |
|
Low pH &
Neutralization |
0.574 | 64 | 36.7 | 0.544 | 68 | 37.0 | 100.7% |
|
HIC Loading Sample
Preparation |
0.544 | 64 | 34.8 | 0.131 | 261 | 34.1 | 97.8% |
| HIC | 0.131 | 255 | 33.3 | 0.095 | 123 | 11.7 | 35.1% |
| AEX | 0.095 | 115 | 10.9 | 0.407 | 25 | 10.2 | 93.2% |
| CEX | 0.078 | 150 | 11.7 | 0.290 | 30 | 8.7 | 74% |
| Total Yield | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | 20.1% |
본 발명에서 제공하는 인터페론-베타 단백질의 정제 방법은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 수율이 현저히 우수하고, 대량 배양에서의 제조 관리 및 품질관리가 용이하며, 의약품으로 사용하는 데에 있어서의 규제에 적합한 우수한 품질의 2당화된 인터페론-베타 단백질을 정제할 수 있다.
도 1은 본 발명의 정제방법을 모식적으로 기재한 것이다.
도 2는 본 발명의 정제방법 (우측패널) 및 비교 정제방법 (좌측패널)에 따라 정제된 정제물을 IEF 실험을 수행한 결과이다. 적색 화살표는 염기성 변이체를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 정제방법 (우측패널) 및 비교 정제방법 (좌측패널)에 따라 정제된 정제물을 IEF 실험을 수행한 결과이다. 적색 화살표는 염기성 변이체를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
숙주세포에서의 2당화된 인터페론-베타의 발현 및 수득
배양액은 해당 2당화된 인터페론-베타 유전자를 포함하는 생산 CHO 세포주를 Hyclone사의 optiCHO SFM를 기본으로 하는 배지를 이용하여 5 리터 스케일로 배양하여 인터페론-베타가 발현되도록 하였다.
배양 시 초기온도는 34.0℃, pH 7.0, 용존산소량 50%로 하여 천천히 교반하면서 배양을 진행하였고, 9일동안 배양한 후, 배양기에서 회수된 배양액을 4500 rpm, 4℃ 조건으로 30분 동안 원심분리를 진행하였다. 원심분리 후, 상등액을 무균적으로 0.22 μm filtration을 수행한 뒤, 정제를 진행하였다.
<실시예 2>
2당화된 인터페론-베타의 정제
실시예 1에서 수득된 인터페론-베타를 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제공정에 투입하였다.
먼저 수확된 인터페론-베타 분획을 10mM Sodium phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4의 용액으로 미리 평형화된 블루 세파로즈(Blue sepharose 6 fast flow; GE사) 컬럼에 결합시키고, 700mM sodium thiocyanate 용액으로 충분히 세척하였다. 그 후 20mM Sodium phosphate, 1.4M NaCl, 35% Propylene Glycol, 250mM L-Arginine, pH 7.4의 용액으로 용출시켜 이 분획을 수확하였다.
HPLC 분석 결과, 94% ~ 96%의 순도를 나타냈으며, 잔존 HCP 검출 결과로는 6300 ~ 9500ppm의 함량으로 첫 번째 정제가 완료되었다.
두 번째 스텝으로, pH 3.5의 Phosphoric acid (99%, 증류수를 이용하여 10배 희석)를 첨가하여 pH를 3.0이 되도록 조절하였다. 그 후 22℃에서 1시간 동안 처리한 다음 2M Trizma base로 중화하여 샘플로 하였다.
세 번째 스텝으로 20mM Tris, 1.4M NaCl, 300mM Arg, pH 7.4 용액으로 미리 평형화된 부틸 세파로즈(Butyl 4 fast flow; GE사) 컬럼에 결합시키고, 그 후 20mM Tris, pH 8.0의 용액으로 용출시켜 이 분획을 수확하였다.
네 번째 스텝으로 수득된 용출 분획물을 이용하여 20mM Tris, pH 8.0 용액을 이용하여, 캡토 Q(Capto Q ImpRes; GE사) 레진이 충진된 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다. 용매를 용출시킨 용액은 20mM Tris, 140mM NaCl, pH 8.0을 사용하였다.
마지막 스텝으로, 이전에 음이온 교환수지에서 용출된 분획물은 50mM sodium acetate, pH 5.0으로 평형화된 SP 세파로즈(SP sepharose fast flow; GE사) 컬럼에 투입되어 150mM부터 500mM까지 염 농도차에 의한 양이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다.
이로써 최종적으로 32%의 수율로써 얻어진 인터페론-베타 물질은 95% 이상의 순도를 나타내며, HCP는 기준치 이하인 100ppm을 기록하였고, IEF 및 SDS-PAGE 겔 분석결과 특이사항이 없는 최종 생산물을 수득하였다.
<비교예 1>
기존 인터페론-베타 단백질 정제 방법에 따른 정제
배양에서 수득된 인터페론-베타 분획을 10mM Sodium phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4의 용액으로 미리 평형화 된 블루 세파로즈(Blue sepharose 6 fast flow; GE사) 컬럼에 결합시키고, 700mM sodium thiocyanate 용액으로 충분히 세척하였다. 그 후 20mM Sodium phosphate, 1.4M NaCl, 35% Propylene Glycol, pH 7.0의 용액으로 용출시켜 이 분획을 수확하였다.
위 공정으로 얻어진 분획물은 20mM sodium phosphate, pH 2.7의 용액으로 5배 희석하고 CM 세파로즈(CM sepharose fast flow; GE사)레진을 이용하여 두 번째 공정인 양이온 교환 크로마토그래피에 투입하였다. 이때 사용된 용출 용매는 50mM NaPi, 0.145M NaCl, 10% PG, pH 7.0로 하였다.
이후 용출된 인터페론-베타 시료는 유기용매인 Acetonitrile 30%와 Trifluoracetic acid 0.1%를 버퍼용액으로써 사용하고, HPLC 역상크로마토그래피 컬럼(VYDAC C4; Agilent사)을 거쳐 용출시킨다. 이때, 용출되는 시료의 수집용기에는 20mM Sodium phosphate monobasic pH 2.9를 미리 넣어두어 시료가 용출되는 동시에 희석되도록 하며 인터페론-베타를 수득하였다.
이전 공정에서 7배 희석된 인터페론-베타 용출시료는 용량을 줄임과 동시에, 가장 효율적인 방법으로 정제되기 위하여, 한외 여과·농축을 위해 Millipore 사의 TFF 시스템(Pellicon Biomax 10; Millipore사)을 거쳐, 약 7배가량 농축을 진행하였다. 이때 교환하는 용액은 20mM Sodium phosphate pH 2.9로 하였으며, 농축의 농도는 보통 크기배제 크로마토그래피의 레진 특성에 따르는 것을 기본으로 한다.
마지막 공정으로 크기배제 크로마토그래피(Sephacryl 100HR; GE사)를 이용하여 불필요한 물질들을 제거하였으며, 이때 용출시료는 25mL씩 수집하였으고 최종적으로 인터페론-베타가 포함된 분획물을 수득하였다.
<실시예 3>
정제 방법의 평가
<3-1> 활성 및 수율 등의 평가
실시예 2 및 비교예 1의 정제 방법을 수율 (yield), 단백질 변형 여부, 비활성, 함량 및 전체 활성의 관점에서 평가하였다.
단백질 정량은 UV측정방법을 이용하였다. 0.5M NaOH와 크기배제 크로마토그래피 용출용매를 1:1로 넣은 용액으로써 영점을 맞추고, 크기배제 크로마토그래피에서 수득된 목적물과 0.5M NaOH를 1:1로 혼합하여 UV파장 290nm에서 측정하였다. 측정은 3회를 기본으로 하며, 다음과 같은 계산식으로 수치화하였다.
-(3회 측정값의 평균 ÷ 흡광계수) × 희석배수 (mg/mL)
수율은 블루 세파로즈를 통과한 용출물 기준(100%)으로 하여 이에 대한 상대적인 함량을 인터페론 베타에 특이적인 1차 항체를 이용한 효소면역측정법(ELISA)에 의해서 측정하였으며, 이때 사용된 효소면역측정방법은 다음과 같다. 효소접합 항체용액을 측정 플레이트에 농도에 맞게 분주한 뒤, 표준용액과 측정하고자 하는 시험용액을 최소 8개의 희석농도로 2반복이 되도록 첨가하였다. 이후 일정시간 반응 뒤에 세척과정을 거친 뒤, 발색반응을 일으키는 기질용액을 첨가하여 반응을 유도하였다. 이후 반응이 멈춘 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
단백질 변형 여부는 HPLC 장비를 이용한 펩티드 맵핑 (peptide mapping)을 수행하여 측정하였다. 크로마토그래피 시스템과 측정기를 이용하여 분석 시료를 주입하고, 214nm의 파장에서 측정된 수치에 대하여 머무름 값과 적분 값에 해당하는 단백질 구조 및 아미노산 변성을 확인하였다.
비활성의 측정은 세포 변성 효과 분석법(CPE(Cytopathic effect) assay)에 의해서 다음과 같이 측정하였다. 비활성 측정을 위한 표준물질 (standard)는 다음과 같이 준비하였다: NIBSC(National Institute for Biological Standads and Control)에서 구매한 인터페론 베타를 MEM 배양배지에 혼합하여 적정 Activity(standard stock solution (2,000IU/mL))로 만든 다음 STD Activity (IU/㎖)를 200부터 0.390625IU/㎖까지 순차적으로 희석하여 준비하였다.
정제된 각 샘플을 예상 activity가 50IU/㎖이 되도록 MEM 배양 배지를 사용해 희석하였고, (volume은 1500㎕이상), 이를 다시 50부터 0.390625IU/㎖까지 순차적으로 희석하여 측정용 샘플을 준비하였다.
측정용 샘플과 표준물질을 각각 96well culture plate에 나누어 담고, A549 cell을 3x104 세포/well로 웰에 투입한 다음 37℃, 5% CO2 조건으로 22시간동안 인큐베이션 (incubation)하였다. 플레이트에서 배지를 제거한 후 바이러스 용액 (virus solution, 1000 TCID50/㎖)을 각 well에 나누어 담고, 37℃, 5% CO2조건으로 22시간동안 인큐베이션 하였다. 플레이트에서 용액을 제거한 다음 Crystal Violet Solution으로 상온에서 염색하고, 2-Methoxyethanol로 탈염색한 다음 570nm에서 흡광도를 측정하여 비활성을 계산하였다.
각각의 분석항목의 결과는 다음 표와 같다.
| 분석 항목 | 비교예 1 | 실시예 2 |
| Final product Total quantity (UV) | 16.5 mg | 26.4 mg |
| Yield (ELISA, 1차) | 10.9% | 19% |
| Yield (ELISA, 2차) | 11.5% | 20.1% |
| N’-Met deletion form (Peptide mapping) |
3.6 % | 2.8 % |
| Specific activity (CPE/UV) | 327 MIU/mg | 247 MIU/mg |
| Total activity | 5395 MIU | 6520 MIU |
측정 결과, 비교예 1의 방법에 있어서는 전체 함량은 16.5mg, 수율은 11% 내외, 메티오닌이 결실된 형태 (Met deletion form)가 3.6%를 나타내었다. 비활성의 경우 327MIU/mg으로 본 발명의 방법에 비해서 높게 나왔으나, 정제된 함량이 16.5mg에 지나지 않아 전체적인 활성은 5395MIU에 그쳤다.
이에 비해서 본 발명의 방법에 있어서는 전체 함량은 26.4mg, 수율은 20% 내외, 메티오닌이 결실된 형태는 2.8%이며, 전체 활성은 6520MIU로 높게 나왔다.
따라서, 본 발명의 방법에 의하는 경우 2당화된 인터페론 베타를 우수한 품질 및 수율을 가지며, 더 높은 활성을 가지도록 분리/정제할 수 있음을 알 수 있었다.
<3-2> 불순물 평가
비교예 1 및 실시예 2에서의 정제시 불순물을 CHO 세포의 세포유래단백질 (CHO-HCP) 함량, 엔도톡신 함량, IEF에서의 패턴의 관점에서 확인하였다.
목적단백질인 인터페론-베타와 분리되야 하는 CHO 세포 유래의 단백질 함량의 측정은 효소면역측정법 (ELISA)를 이용하였다. 희석용액을 준비하여 플레이트에 분주해두고, 분석용 시료를 최종 절반까지 희석하였다. 희석된 시료와 더불어 표준용액을 분석용 키트에 포함된 플레이트에 옮겨 분주하고(이때 키트 부속 플레이트에는 효소접합 항체가 도포되어 있다), 발색반응을 나타내는 기질용액을 첨가하여 반응을 유도하였다. 이후 플레이트는 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 표준검량곡선 대비 CHO 세포 유래 단백량을 분석하였다.
잔존 Endotoxin 수준을 측정하고자 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 분석법을 활용하였다. Endotoxin 표준시료를 LAL분석전용증류수에 잘 섞어 녹인 뒤, 분석용 테스트튜브에 표준검량곡선을 그리고자 하는 농도로 준비하였다. 이후 준비된 농도별 표준시료, 영점용액, 분석시료를 플레이트에 같은양으로 분주하였다. 분석전용증류수에 LAL시약을 잘 녹인뒤, 앞서 준비된 플레이트에 고르게 분주하고 반응을 유도하였다. 반응이 끝난 플레이트는 405nm파장에서 흡광도를 측정하여 목적물질에 존재하는 endotoxin 수준을 측정하였다.
IEF 겔 분석에 쓰일 양·음극 버퍼를 준비하고, 분석시료와, 표준시료의 양이 같도록 계산하여 IEF분석버퍼(pH 3-10)와 각각 혼합하여 분석용 전개샘플을 만들었다. pH 3-10 IEG 겔을 전개용기에 결착시킨 후 전개용기의 안에는 양극버퍼를, 밖의 공간에 음극버퍼를 채우고 준비된 시료들을 겔에 주입하였다. 준비된 전개용기에 200V로 1시간, 500V로 30분 순으로 전개한 뒤, 완료된 겔을 분리하여 쿠마시 염색 및 탈색을 진행하고 화학발광분석기를 통해 단백질의 등전점을 파악하였다.
| 분석 항목 | 비교예 1 | 실시예 2 |
| CHO-HCP | 65ppm | 42ppm |
| Endotoxin | 0.00EU/ug | 0.00EU/ug |
| IEF 결과 (도 1) | 염기성 변이체 확인 | 염기성 변이체 미확인 |
그 결과, CHO 세포의 단백질은 비교예 1의 경우 65ppm이었으나, 본 발명의 방법에 따르면 42ppm으로 나타났다. 통상적인 기준치인 100ppm이하로 모두 나타났으나, 본 발명에서는 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 좀 더 낮게 나타나는 것으로 확인되었다.
엔도톡신의 경우 두 경우 모두 함유되지 않았으며, IEF의 결과를 확인한 결과 (도 1), 비교예 1에서는 약 pH 7.7 근방에 미량의 염기성 변이체 (basic variant)가 확인되는 것에 비해서 (화살표), 본 발명의 방법에서는 염기성 변이체가 확인되지 않아 좀 더 순도 높은 정제방법임을 알 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 인터페론-베타 단백질의 정제 방법은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 수율이 현저히 우수하고, 대량 배양에서의 제조 관리 및 품질관리가 용이하며, 의약품으로 사용하는 데에 있어서의 규제에 적합한 우수한 품질의 2당화된 인터페론-베타 단백질을 분리할 수 있어 산업상 이용가능성이 크다.
Claims (10)
- 하기 단계를 포함하는, 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법:
(a) 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 인터페론-베타 단백질은 서열번호 1의 펩타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 CHO (chinese hamster ovary) 세포인 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피는 블루 세파로스를 레진(resin)으로 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 부틸 세파로스를 레진(resin)으로 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 Q 레진을 레진(resin)으로 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 SP 세파로스를 레진(resin)으로 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
- 제1항의 정제 방법에 의해서 수득된 2당화된 인터페론-베타 단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 인터페론 베타 단백질은 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 25번째 아미노산 및 80번째 아미노산에 당쇄를 가지는 것을 특징으로 하는 인터페론 베타 단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 인터페론 베타 단백질은 A2G2, FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA2G2S*2, FA3G3S1, FA3G3S3, FA3G3S*3, FA4G4S1, FA4G4S3, FA4G4S4, FA4G4S*3, FA4G4S*4, FA4G4Lac1S3, FA4G4Lac1S*3, FA4G4Lac1S4, FA4G4Lac2S3, FA4G4Lac1S*3 중 어느 2개의 당쇄 구조를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 인터페론 베타 단백질.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190087244A KR20210009982A (ko) | 2019-07-18 | 2019-07-18 | 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 |
| PCT/KR2020/008847 WO2021010638A1 (ko) | 2019-07-18 | 2020-07-07 | 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 |
| US17/627,840 US20220259260A1 (en) | 2019-07-18 | 2020-07-07 | Method for purifying diglycosylated interferon-beta protein |
| EP20839773.7A EP4001291A4 (en) | 2019-07-18 | 2020-07-07 | METHOD FOR PURIFYING A DIGLYCOSYLATED INTERFERON-BETA PROTEIN |
| BR112022000825A BR112022000825A2 (pt) | 2019-07-18 | 2020-07-07 | Método para purificar uma proteína interferon-beta diglicosilada e proteína interferon-beta diglicosilada |
| CN202080056509.1A CN114206917A (zh) | 2019-07-18 | 2020-07-07 | 纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法 |
| JP2021576305A JP7425936B2 (ja) | 2019-07-18 | 2020-07-07 | 二糖化インターフェロンβタンパク質の精製方法 |
| AU2020313592A AU2020313592A1 (en) | 2019-07-18 | 2020-07-07 | Method for purifying diglycosylated interferon-beta protein |
| CA3145656A CA3145656A1 (en) | 2019-07-18 | 2020-07-07 | Method for purifying diglycosylated interferon-beta protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190087244A KR20210009982A (ko) | 2019-07-18 | 2019-07-18 | 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210009982A true KR20210009982A (ko) | 2021-01-27 |
Family
ID=74211044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190087244A KR20210009982A (ko) | 2019-07-18 | 2019-07-18 | 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220259260A1 (ko) |
| EP (1) | EP4001291A4 (ko) |
| JP (1) | JP7425936B2 (ko) |
| KR (1) | KR20210009982A (ko) |
| CN (1) | CN114206917A (ko) |
| AU (1) | AU2020313592A1 (ko) |
| BR (1) | BR112022000825A2 (ko) |
| CA (1) | CA3145656A1 (ko) |
| WO (1) | WO2021010638A1 (ko) |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2224290T5 (es) * | 1996-12-24 | 2012-03-12 | Biogen Idec Ma Inc. | Formulaciones l�?quidas estables de interferón. |
| SG155183A1 (en) * | 2005-08-26 | 2009-09-30 | Ares Trading Sa | Process for the preparation of glycosylated interferon beta |
| JP2010525821A (ja) * | 2007-05-02 | 2010-07-29 | アンブルックス，インコーポレイテッド | 修飾ＩＦＮβポリペプチドおよびこれらの使用 |
| US20120177603A1 (en) * | 2009-07-07 | 2012-07-12 | Biogenerix Ag | Method for the purification of interferon-b |
| DE102009032179A1 (de) * | 2009-07-07 | 2011-01-13 | Biogenerix Ag | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta |
| CN102219848B (zh) * | 2011-05-25 | 2014-01-22 | 浙江海正药业股份有限公司 | 重组人干扰素β-1a的纯化方法 |
| CA2777978A1 (en) * | 2011-05-27 | 2012-11-27 | Abbott Biotherapeutics Corp. | Dac hyp compositions and methods |
| ES2895173T3 (es) * | 2012-06-29 | 2022-02-17 | Emd Millipore Corp | Métodos para inactivar virus durante un proceso de purificación de proteínas |
| US10611794B2 (en) | 2013-09-25 | 2020-04-07 | Bioverativ Therapeutics Inc. | On-column viral inactivation methods |
| CN104193818B (zh) * | 2014-08-29 | 2017-06-16 | 中国科学院过程工程研究所 | 重组人干扰素β‑1b的高压复性和组合层析制备方法 |
| KR102062512B1 (ko) | 2018-01-16 | 2020-01-03 | 장희성 | 볼트형 임플란트 |
-
2019
- 2019-07-18 KR KR1020190087244A patent/KR20210009982A/ko not_active Application Discontinuation
-
2020
- 2020-07-07 AU AU2020313592A patent/AU2020313592A1/en active Pending
- 2020-07-07 BR BR112022000825A patent/BR112022000825A2/pt unknown
- 2020-07-07 CN CN202080056509.1A patent/CN114206917A/zh active Pending
- 2020-07-07 WO PCT/KR2020/008847 patent/WO2021010638A1/ko unknown
- 2020-07-07 JP JP2021576305A patent/JP7425936B2/ja active Active
- 2020-07-07 EP EP20839773.7A patent/EP4001291A4/en active Pending
- 2020-07-07 CA CA3145656A patent/CA3145656A1/en active Pending
- 2020-07-07 US US17/627,840 patent/US20220259260A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112022000825A2 (pt) | 2022-05-31 |
| EP4001291A4 (en) | 2023-07-26 |
| EP4001291A1 (en) | 2022-05-25 |
| AU2020313592A1 (en) | 2022-03-03 |
| CN114206917A (zh) | 2022-03-18 |
| JP2022541112A (ja) | 2022-09-22 |
| JP7425936B2 (ja) | 2024-02-01 |
| US20220259260A1 (en) | 2022-08-18 |
| WO2021010638A1 (ko) | 2021-01-21 |
| CA3145656A1 (en) | 2021-01-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Morgenstern et al. | Effect of PEG molecular weight and PEGylation degree on the physical stability of PEGylated lysozyme | |
| Selsted et al. | Purification, primary structure, and antimicrobial activities of a guinea pig neutrophil defensin | |
| ES2670827T3 (es) | Proceso para la purificación del factor estimulador de colonias de granulocitos, G-CSF | |
| Jeong et al. | Soluble expression and partial purification of recombinant human erythropoietin from E. coli | |
| US5196323A (en) | Process for preparing and purifying alpha-interferon | |
| EP0228452B1 (en) | Protein purification | |
| Sauer et al. | A two-step process for capture and purification of human basic fibroblast growth factor from E. coli homogenate: Yield versus endotoxin clearance | |
| Utsumi et al. | Characterization of four different mammalian‐cell‐derived recombinant human interferon‐β1s: Identical polypeptides and non‐identical carbohydrate moieties compared to natural ones | |
| Lu et al. | Isolation and characterization of three recombinant human granulocyte colony stimulating factor His→ Gln isoforms produced in Escherichia coli | |
| KR20210009982A (ko) | 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 | |
| US4908432A (en) | Novel polypeptide having gamma-interferon activity | |
| Nellis et al. | Characterization of recombinant human IL-15 deamidation and its practical elimination through substitution of asparagine 77 | |
| Reynolds et al. | Peptide fragments of a β-defensin derivative with potent bactericidal activity | |
| JP2023145793A (ja) | アミノ酸枯渇治療のための組成物の使用方法 | |
| KR940010024B1 (ko) | α-인터페론의 제조 및 정제 방법 | |
| RU2795430C1 (ru) | Способ очистки дигликозилированного белка интерферон-бета | |
| JP2009062372A (ja) | 高分子質量レクチンの生産 | |
| Shaaban et al. | Molecular and biological characterization of a prepared recombinant human interferon alpha 2b isoform | |
| WO2021233094A1 (zh) | 干扰素-κ突变体及其制备方法 | |
| RU2780675C1 (ru) | Способ подтверждения структуры рекомбинантного интерферона бета-1b | |
| US20230127949A1 (en) | Purification of recombinantly produced polypeptides | |
| EP1310559A1 (en) | Process for the production of alpha interferon of therapeutical degree | |
| US20150314012A1 (en) | Protein Conjugates | |
| KR100297927B1 (ko) | 인간에리스로포이에틴의정제방법 | |
| US20210196787A1 (en) | Agent for enhancing phagocytosis ability of neutrophils |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |