CN114206917A - 纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种纯化二糖基化干扰素‑β蛋白质的方法，更具体地，涉及一种纯化二糖基化干扰素‑β蛋白质的方法，其中获得含有在宿主细胞中表达的干扰素‑β的培养液，并进行亲和层析、低pH灭活、疏水作用层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析，以及涉及通过该方法分离的二糖基化干扰素‑β蛋白质。

Description

纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法
技术领域
本申请要求于2019年7月18日提交的韩国专利申请号10-2019-0087244的优先权，其全部内容作为本申请的参考。
本发明涉及一种纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法，更具体地，涉及一种纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法和通过该方法分离的二糖基化干扰素-β蛋白质，其中该方法包括步骤(a)获得包含在宿主细胞中表达的干扰素-β的培养液；(b)对步骤(a)中得到的培养液进行亲和层析；(c)将步骤(b)中得到的溶液低pH灭活；(d)对步骤(c)中得到的溶液进行疏水作用层析；(e)对步骤(d)中得到的溶液进行阴离子交换层析；以及(f)对步骤(e)中得到的溶液进行阳离子交换层析。
背景技术
人干扰素(IFN)目前已知为8种类型，根据理化和功能特征将其分为1型和2型两种类型。1型干扰素包括α、β、κ、δ、ε、τ和ω-干扰素，而2型干扰素包括γ-干扰素。
干扰素(IFN)可以抑制病毒的复制，表现出抗病毒活性，抑制细胞增殖，并调节免疫应答。其中，干扰素-β是在病毒感染等的反应中产生的细胞因子，特别是作为多发性硬化(MS)治疗剂等使用，并且还表现出抗癌活性，可用作癌症治疗剂。
目前，有两种类型的干扰素-β用于治疗。首先，干扰素-β-1a是一种由包括人干扰素-β基因的中国仓鼠卵巢(CHO)产生的糖基化蛋白，其由166个氨基酸残基组成，大小为25kD。其次，干扰素-β-1b是一种由大肠杆菌产生的由165个氨基酸残基组成的蛋白质，其中缺失了糖，缺失了作为第1位氨基酸的甲硫氨酸残基，并且第17位的半胱氨酸残基被丝氨酸取代。目前已商业化的干扰素-β-1a包括Rebif和Avonex，干扰素-β-1b包括Betaseron和Extavia。
另一方面，糖蛋白是一种含有与多肽侧链共价连接的寡糖链的蛋白质。糖蛋白具有非常多样的生理功能，包括结构、保护、携带、激素或酶功能，并且众所周知，连接的糖链对这些生理功能起重要作用。糖蛋白目前可以在重组中产生，但需要广泛的纯化方法以从细胞培养物收集物中提取目标糖蛋白。由于在生产/表达和纯化过程中糖链的脱离、修饰等影响生理功能，因此重要的是配置每个过程以便在生产/表达过程中正确形成或以便在纯化过程中不脱离和修饰糖链。
干扰素也是一种糖蛋白，在野生型干扰素-β的情况下，糖链与第80位的氨基酸连接。特别是，在2004年，开发了一种引起干扰素糖基化突变的干扰素-β突变蛋白，并进行了将该蛋白用作治疗剂的研究。为了将干扰素-β用作治疗剂，干扰素-β具有足够的蛋白量和高纯度，并且应以适于长期保存的形式纯化。由于干扰素-β稳定性较差，在纯化过程中，通常会发生分解反应，诸如肽键断裂、脱酰胺和甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸硫化物以及二硫化物交换(US2012/0177603)，因此在纯化过程中必须考虑这些分解反应。
此外，在一般的纯化方法中，由于可以使用多种不同的层析方法，为了找到合适的纯化方法，需要测试大量的组合。在这些组合中，可以组合并使用不同的顺序，甚至不同数量的层析方法，但根据这些组合，纯化效果不足或纯化的蛋白质可能受损，因此，为了纯化糖基化的蛋白质，本领域中总是需要以合适的顺序确定层析步骤的方法。
特别是，在相关领域中，存在的缺点是，由于在纯化方法中使用有机溶剂，在大规模生产中需要专用设备，且纯化过程复杂，成本高。因此，有必要开发一种易于大量纯化、简单经济、不使用有机溶剂且收率高的纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法。
发明内容
技术问题
因此，本发明人进行了研究以开发纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法，结果发现使用亲和层析、疏水作用层析和离子交换层析的纯化是一种新的纯化方法，其具有足够的蛋白量和高纯度，并且具有较少的糖基化修饰或干扰素-β的其它修饰，然后完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法，其包括步骤(a)获得包含在宿主细胞中表达的干扰素-β的培养液；(b)对步骤(a)中得到的培养液进行亲和层析；(c)将步骤(b)中得到的溶液低pH灭活；(d)对步骤(c)中得到的溶液进行疏水作用层析；(e)对步骤(d)中得到的溶液进行阴离子交换层析；以及(f)对步骤(e)中得到的溶液进行阳离子交换层析。
本发明的另一个目的是提供通过本发明的纯化方法获得的二糖基化干扰素-β蛋白质。
技术方案
为了实现该目的，本发明提供了一种纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法，其包括步骤(a)获得包含在宿主细胞中表达的干扰素-β的培养液；(b)对步骤(a)中得到的培养液进行亲和层析；(c)将步骤(b)中得到的溶液低pH灭活；(d)对步骤(c)中得到的溶液进行疏水作用层析；(e)对步骤(d)中得到的溶液进行阴离子交换层析；以及(f)对步骤(e)中得到的溶液进行阳离子交换层析。
为了实现另一目的，本发明提供了通过本发明的纯化方法获得的二糖基化干扰素-β蛋白质。
在下文中，将详细描述本发明。
一般层析方法及其应用是本领域技术人员已知的。
本文所用的术语“层析材料”是指可以不经额外修饰而用作层析材料的固体材料，例如，羟基磷灰石或亲和层析材料，并且是指包括主体核心材料(bulk core material)的材料，层析官能团优选通过共价键连接至该主体核心材料。主体核心材料表示基本上不进行层析过程，即待分离的多肽与层析材料的层析官能团之间的相互作用。层析材料用于提供固定的3D骨架，使得含有与层析材料简单连接或分离的材料的溶液可接近层析官能团。优选地，主体核心材料为固体形式。因此，优选地，“层析材料”为固相，层析官能团优选通过共价键连接到其上。优选地，“层析官能团”为可电离的疏水性或疏水性基团，其中不同的层析官能团组合而成的复合基团仅与一些类型的多肽，或共价键合的带电基团结合。
本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”根据常规含义使用，即氨基酸残基的聚合物。多肽不限于特定的长度，但在本发明的上下文中，通常指全长蛋白质的片段。多肽或蛋白质可包括翻译后的修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其它修饰(天然存在的修饰和非天然存在的修饰)。本发明的多肽和蛋白质可以使用各种已知的重组和/或合成技术中的任何一种来制备。
本文所用的术语“结合模式”和“洗脱模式”是指层析方法的操作类型，其中含有所需物质(例如，二糖基化干扰素-β)的溶液与静止相(优选固相)接触，其中所需物质与固相层析材料结合。结果，所需物质附着在固相上，而不需要的物质沿溶剂流或与上清液一起被去除。此后，将所需物质从固相中洗脱并与洗脱溶液一起从固相中回收。不一定意味着完全去除不需要的物质，但是去除50％或更多，优选75％或更多，更优选85％或更多，最优选95％或更多的不需要的物质。
本文所用的术语“连续洗脱”和“连续洗脱方法”是指，例如，引起洗脱(即，结合材料与层析材料分离)的物质的浓度连续增加或减少。即，通过一系列改变物质浓度的小步骤改变浓度，使得在每个步骤中洗脱不大于2％，优选1％。在这种“连续洗脱”中；层析方法的一个或多个条件，例如pH、离子强度、盐浓度和/或流速线性变化或几何变化。优选地，该变化为线性变化。
本文所用的术语“分步洗脱”和“分步洗脱方法”是指，例如，层析方法，其中引起洗脱(即，结合材料与层析材料分离)的物质的浓度连续增加或减少一次，即以一个值/水平至下一个值/水平。在“分步洗脱”中，将层析法的一种或多种条件，例如pH、离子强度、盐浓度和/或流速从第一值(例如，起始值)改变一次至第二值(例如，终值)。在该步骤的改变中，引起洗脱的物质的浓度改变为大于5％，优选10％。“分步洗脱”递增地改变，即与线性变化相反逐步地改变。在“分步洗脱法”中，每次增加后收集新的级分。每次增加后，在洗脱方法的下一步骤中保持该条件。
在本说明书中，术语“分离的蛋白质”和“分离的多肽”是基本上没有被污染的细胞组分诸如与烃、脂质或多肽性质相关的其它蛋白质杂质的多肽。通常，分离的蛋白质制剂含有非常纯的，即约80％纯，约90％或更纯，约95％或更纯，95％或更纯，或99％或更纯的多肽。显示特定蛋白质制剂含有分离的多肽的方法是例如在蛋白质制剂电泳并用考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)染色凝胶后显示单一条带。然而，术语“分离的”不排除存在不同物理形式的相同多肽，诸如二聚体、衍生形式、正确展开形式、不正确二硫键交联形式或混杂形式。
本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。除非另有限定，“多核苷酸”或“核酸”还包括以与天然产生的核苷酸相似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。
本文所用的术语“人干扰素-β的活性”定义为在人干扰素-β的已知活性中，任何多肽足以鉴定为人干扰素-β的一种或多种活性。这些活性可以包括，例如，降低、减轻或治疗多发性硬化的活性、抗病毒活性、细胞生长抑制活性、抗生长活性、抗增殖活性、淋巴细胞毒性增强活性、免疫调节活性、靶细胞的分化诱导或抑制活性、增加的细胞因子产生活性、增加的细胞毒性T细胞的作用活性、增加的巨噬细胞的作用活性、增加的自然杀伤细胞的活性、癌症预防或治疗活性、自动免疫缺陷预防或治疗活性、病毒感染预防或治疗活性、HIV相关疾病的预防或治疗活性、丙型肝炎预防或治疗活性、类风湿性关节炎预防或治疗活性等。
本文所用的术语“表达”是指在细胞中产生蛋白质或核酸。
本文使用的氨基酸的单个字母(三个字母)是指根据生物化学领域中的标准缩写规则的以下氨基酸：A(Ala)：丙氨酸；C(Cys)：半胱氨酸；D(Asp)：天冬氨酸；E(Glu)：谷氨酸；F(Phe)：苯丙氨酸；G(Gly)：甘氨酸；H(His)：组氨酸；I(IIe)：异亮氨酸；K(Lys)：赖氨酸；L(Leu)：亮氨酸；M(Met)：甲硫氨酸；N(Asn)：天冬酰胺；O(Ply)：吡咯赖氨酸；P(Pro)：脯氨酸；Q(Gln)：谷氨酰胺；R(Arg)：精氨酸；S(Ser)：丝氨酸；T(Thr)：苏氨酸；U(Sec)：硒代半胱氨酸；V(Val)：缬氨酸；W(Trp)：色氨酸；Y(Tyr)：酪氨酸。
本发明提供了一种纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法，其包括以下步骤：
(a)获得包含在宿主细胞中表达的干扰素-β的培养液；
(b)对步骤(a)中得到的培养液进行亲和层析；
(c)将步骤(b)中得到的溶液低pH灭活；
(d)对步骤(c)中得到的溶液进行疏水作用层析；
(e)对步骤(d)中得到的溶液进行阴离子交换层析；以及
(f)对步骤(e)中得到的溶液进行阳离子交换层析。
在本发明的纯化方法(或分离方法)中，各步骤如下。
步骤(a)：获得包含在宿主细胞中表达的干扰素-β的培养液；
本发明的干扰素-β(干扰素-β多肽或干扰素-β蛋白质)可以为野生型干扰素-β第27位的精氨酸(R27)位点突变为苏氨酸(R27T)的干扰素-β。优选地，本发明的干扰素-β可以为由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽。本发明的干扰素-β应理解为具有干扰素-β活性的多肽，其中糖链与SEQ ID NO：1的第25和80位氨基酸的两个位点结合。优选地，本发明的干扰素-β代表人干扰素-β。
本发明的干扰素-β可以从转化的宿主细胞中表达，从而使基因在细胞内或细胞外位置表达。在本发明中，可以选择宿主细胞以调节插入序列的表达或以特定方式进行基因产物。不同的宿主细胞具有蛋白质翻译和加工以及翻译后变异的特征和特异性机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统以提供表达的异质蛋白质的优选变异和加工。在酵母中的表达可以产生生物活性产物。在真核细胞中的表达可增加天然折叠的可能性。
在本发明中，可以在稳定干扰素-β的同时连续表达的宿主细胞甚至可以使用本领域已知的任何宿主细胞，但原核生物的宿主细胞可不用于表达二糖基化干扰素-β。本发明的宿主细胞可以为，例如，酵母(酿酒酵母)、昆虫细胞、动物细胞和人细胞，优选中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞系，最优选CHO细胞系。
在本发明中，培养可以在能够表达靶蛋白干扰素-β的适当条件进行，并且这种条件可以根据已知方法进行。转化的宿主细胞可以通过常规培养方法大量培养。培养基可以与由碳源、氮源、维生素和矿物质组成的培养基一起使用，例如，与诸如SFM4CHO、optiCHOSFM的培养基一起使用，200mM L-谷氨酰胺等可以用作添加剂。宿主细胞培养物可在常规宿主细胞培养条件培养，例如，可在15℃至45℃的温度范围内培养10小时至40小时。为了除去培养液中的培养基并仅回收浓缩的细胞，可以进行离心或过滤，本领域技术人员可以根据需要进行该步骤。
步骤(b)：对步骤(a)中得到的培养液进行亲和层析
本文所用的术语“亲和层析”是指使用亲和层析材料的层析方法。在亲和层析中，根据与层析官能团的静电相互作用、疏水结合和/或氢结合，多肽基于其生物活性或化学结构来分离。为了从亲和层析材料中回收特异性结合的多肽，添加竞争配体，或改变层析条件诸如缓冲液的pH值、极性或离子强度。亲和层析材料是一种包括复合层析官能团的层析材料，复合层析官能团与不同的单一层析官能团结合，从而仅与某类型的多肽结合。这种层析材料根据层析官能团的特异性与某类型的多肽特异性结合。
在本发明中，亲和层析材料可以是与干扰素(优选干扰素-β)具有亲和力的染料亲和层析，并且可以使用蓝色琼脂糖(Blue Sepharose)作为树脂。染料亲和层析可以是用例如Blue Dextran Sepharose R或Cibacron R Blue固定的基质。例如，可以使用Amicon的Matrex Gel Blue A、Merck的Fraktogel 45TSK AF-Blue或GE Healthcare的Blue-Sepharose R 6FF(fastflow)。
在本发明的示例性实施方案中，二糖基化干扰素-β蛋白质证实干扰素-β蛋白质被分离，特别是，通过使用Blue-Sepharose R 6FF的亲和层析保持糖基化状态，并且干扰素-β蛋白质被分离。因此，在本发明中，优选地，Blue-Sepharose R 6FF可用作亲和层析材料。
采用Blue-Sepharose R 6FF染料亲和层析分离纯化干扰素-β在本领域各种技术文献中是已知的，技术文献中层析的方法包括在本说明书中作为参考。
干扰素-β与Blue-Sepharose R 6FF强结合，因此结合的蛋白质在洗脱前可用各种缓冲液进行洗涤。由于在常规条件干扰素-β即使在低浓度也能很好地与Blue-Sepharose R6FF结合，因此该步骤适合作为本发明纯化方法的第一层析步骤。作为用于洗脱IFN-β的试剂，可以使用离液剂、盐等，并且可以使用包含还原剂(诸如乙二醇或丙二醇)的水性溶液。优选地，对于该步骤中的洗脱，可以使用丙二醇水性溶液，并且可以使用20％至40％的丙二醇水性溶液。
步骤(c)：将步骤(b)中得到的溶液低pH灭活
本文所用的术语“低pH灭活”表示通过加入酸在pH 4.0或更低的酸性条件下灭活病毒外部物质以灭活包膜病毒。
优选地，低pH灭活通过加入酸以改变为pH 2.0至pH 4.0，更优选pH 3.0至pH 4.0或pH 3.5至pH 4.0来进行。处理时间和温度可以为10℃至30℃或15℃至25℃和30分钟至4小时。在处理之后，如果需要，使用碱性溶液将酸性溶液中和至pH 6至pH 7.5，优选pH 6.5至pH 7.5，并进行随后的步骤。
加入的酸可以是无机酸，诸如磷酸、盐酸和硫酸，或有机酸，诸如乙酸和草酸，且优选磷酸水性溶液。
在本发明的实施方案中，低pH灭活通过以下进行：向步骤(b)的洗脱液中加入pH3.5的10x稀释的磷酸水性溶液以将pH降低至4或更低，并在15℃至25℃处理磷酸水性溶液1小时，然后使用2M Trizma碱进行中和。
步骤(d)：对步骤(c)中得到的溶液进行疏水作用层析
本文所用的术语“疏水作用层析”是指使用疏水作用层析材料的层析方法。疏水作用层析材料是一种结合有疏水基团(例如，丁基、辛基或苯基)作为层析官能团的层析材料。多肽可以通过暴露于其表面的疏水区与疏水作用层析材料的疏水基团相互作用来分离。多肽和层析材料之间的相互作用可能受温度、溶剂和溶剂离子强度的影响。由于氨基酸侧链的移动增加且包埋在多肽中的疏水性氨基酸侧链在较低温度可接近，因此升高的温度进一步增加例如多肽与疏水作用层析材料之间的相互作用。而且，疏水相互作用也被亲液盐(kosmotropic salt)促进，而被亲液盐降低。
疏水作用层析材料可以为例如苯基琼脂糖CL-4B、6FF、HP，苯基superose，辛基琼脂糖CL-4B、4FF和丁基琼脂糖4FF，使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖和辛基琼脂糖，优选丁基琼脂糖，更优选丁基琼脂糖4FF作为树脂。
步骤(e)：对步骤(d)中得到的溶液进行阴离子交换层析
本文所用的术语“阴离子交换层析”是指使用阴离子交换层析材料的层析方法。阴离子交换层析材料是指具有阴离子带电基团作为层析官能团的固相聚合材料和阴离子交换材料。通常，抗衡离子与阴离子交换层析材料结合，并且阴离子交换层析材料可以用抗衡离子交换环境溶液中类似带电的阴离子。
例如，阴离子交换层析可以为例如使用商业阴离子交换层析材料的层析，并且可以使用由制造商诸如Biorad Laboratories、Cyphergen、GE Healthcare等提供的阴离子交换层析材料。
阴离子交换层析可以使用季铵作为阴离子交换树脂(优选Q树脂作为树脂，更优选Capto Q ImpRes)进行。
优选地，阴离子交换层析首先在离子交换层析中进行。这是有效除去碱性变体(basic variant)、病毒、宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA(HCD)和内毒素(其对应于干扰素-β纯化过程中的杂质)所需的步骤。
步骤(f)：对步骤(e)中得到的溶液进行阳离子交换层析
本文所用的术语“阳离子交换层析”是指使用阳离子交换层析材料的层析方法。阳离子交换层析材料是指具有带阳离子电荷的基团作为层析官能团的固相聚合材料和阳离子交换材料。通常，抗衡离子与阳离子交换层析材料结合，并且阳离子交换层析材料可以用抗衡离子交换环境溶液中类似带电的阳离子。
取决于带电基团的性质，阳离子交换层析材料可具有例如磺酸基团(SP)或羧甲基基团(CM)。此外，根据带电基团的性质，阳离子交换层析材料可根据带电取代基的强度进一步分类为强阳离子交换层析材料或弱阳离子交换层析材料。例如，强阳离子交换层析材料具有磺酸基团作为层析官能团，而弱阳离子交换层析材料具有羧酸基团作为层析官能团。
例如，阳离子交换层析可以为使用例如商业阳离子交换层析材料的层析，并且可以使用由制造商诸如Biorad Laboratories、Cyphergen、GE Healthcare等提供的阳离子交换层析材料。阳离子交换层析可优选使用SP琼脂糖，更优选使用葡聚糖凝胶S.F.F.作为树脂进行。
通过本发明纯化分离的干扰素-β具有人干扰素-β的活性，具有干扰素-β的生物学和/或免疫学特征以适用于药品生产质量管理规范(GMP)方面的一般处理，并且优选满足法规的批准要求(验证、再现性)以及具有干扰素-β特异性生化特征(诸如疏水性等)。
分离的二糖基化干扰素-β的失活性(inactivity)可以是至少2×108IU/mg，优选至少3×108IU/mg，更优选至少4×108IU/mg。可以测量的IFN-β的两种基本生物活性是抗病毒作用和抗增殖作用。这些生物活性可以分别通过标准方法通过抑制病毒的细胞修饰作用来测量。干扰素-β活性的测量可以使用本领域已知的方法。
本发明的二糖基化干扰素-β的纯化方法不包括，优选反相层析、超滤或透析以及尺寸排阻层析。由于作为通常使用的缓冲剂的乙腈是有机溶剂，反相层析的缺点是需要额外的设备诸如防爆设备用于大量培养和纯化，而超滤或透析的缺点是其不适合于大量培养和纯化，并且可能产生大量废液。此外，尺寸排阻层析的缺点在于其不适于大量培养和纯化。
优选地，反相层析、超滤或透析以及尺寸排阻层析被排除的原因是可以从根本上排除影响安全和环境的几个限制因素，诸如需要大量劳动力，必须使用需要大量投资的昂贵设备，或处理易燃溶剂，爆炸保护以及废液。
此外，本发明提供了通过本发明的纯化方法获得的二糖基化干扰素-β蛋白质。优选地，本发明的干扰素-β蛋白质具有SEQ ID NO:1的碱基序列，并且在氨基酸第25和80位具有糖链。
干扰素-β蛋白质的糖链可以是具有根据oxford标记法表示的A2G2、FA2G2、FA2G2S1、FA2G2S2、FA2G2S*2、FA3G3S1、FA3G3S3、FA3G3S*3、FA4G4S1、FA4G4S3、FA4G4S4、FA4G4S*3、FA4G4S*4、FA4G4Lac1S3、FA4G4Lac1S*3、FA4G4Lac1S4、FA4G4Lac2S3和FA4G4Lac1S*3结构的糖链，优选具有这些糖链的两种糖链结构。
(F＝核心岩藻糖基化；
A2，两个GlcNAc以β1-2连接的双天线(biantennary)；
A3，三天线，其中GlcNAc通过β1-2与两个甘露糖连接，第三个GlcNAc通过β1-4与α1-3连接的甘露糖连接；
A3'，三天线，其中GlcNAc通过β1-2与两个甘露糖连接，第三个GlcNAc通过β1-6与α1-6连接的甘露糖连接；
A4，GlcNAc作为A3连接，另外的GlcNAcβ1-6与α1-6甘露糖连接；
Gx，通过β1-4与天线连接的半乳糖的数目(x)；
Sx，与半乳糖连接的唾液酸的数目(x)；唾液酸处于α2-3键，除非由*指示，其中α2-6键也存在；
Lacx，乳糖胺(Gal-GlcNAc)延伸的数目(x)。
其它可能的乳糖胺结构以斜体列出)
在本发明的示例性实施方案中，以5L规模培养细胞，表达干扰素-β，然后使用本发明的二糖基化干扰素-β的纯化方法进行纯化。二糖基化干扰素-β的纯化如下进行：依次使用Blue sepharose 6fast flow树脂进行亲和层析，使用通过酸加入低pH灭活和丁基琼脂糖(butyl 4fast flow)树脂进行疏水作用层析，使用Capto Q ImpRes树脂进行阴离子交换层析，以及使用SP sepharose fast flow柱进行阳离子交换层析。
作为对比性实施例，将通过相同培养物表达制备的干扰素-β根据干扰素-β蛋白质的常规纯化方法进行纯化，该方法通过以下进行：依次使用Blue sepharose 6fast flow柱进行亲和层析，使用CM sepharose fast flow树脂的阳离子交换层析进行反相色谱(VYDACC4)，超滤和浓缩，以及尺寸排阻层析(Sephacryl 100HR)。
在本发明的示例性实施方案中，在产率、蛋白质修饰、失活性、含量和总活性方面对根据每种纯化方法分离和纯化的干扰素-β进行了评价。结果，与对比性实施例的方法相比，本发明的方法在总含量、产率和Met缺失型方面均是优异的，与本发明的方法相比，对比性实施例的方法在失活性方面是高的，并且本发明的方法即使在考虑总纯化量的总活性方面也是显著优异的。因此，可以看出通过本发明的方法可以分离/纯化二糖基化干扰素-β，具有优异的质量和产率以及更高的活性。
在本发明的示例性实施方案中，根据CHO细胞的细胞来源蛋白(CHO-HCP)含量、内毒素含量和IEF模式，确认了根据每种纯化方法分离和纯化的干扰素-β的杂质。结果，可以确认CHO细胞的蛋白质和内毒素适合于一般参考值，但是通过本发明的方法检测到的杂质含量较少。此外，可以看出，由于没有碱性变体，本发明的方法是纯度比对比性实施例1的方法高得多的纯化方法。
通过如上所述的一系列方法，每个步骤的纯化产率和纯度示于下表1中。
表1
Figure BDA0003498171370000101
有益效果
本发明提供的干扰素-β蛋白质的纯化方法在二糖基化干扰素-β蛋白质的纯化产率方面显著优异，在大量培养中易于制造管理和质量管理，并且可以纯化出质量优异的二糖基化干扰素-β蛋白质，其适于将其用作药物的法规。
附图说明
图1示意性地说明了本发明的纯化方法。
图2说明了对根据本发明的纯化方法(右图)和对比纯化方法(左图)纯化的材料进行IEF实验的结果。红色箭头表示碱性变体。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
然而，以下实施例仅仅是对本发明的说明，本发明的内容不限于以下实施例。
实施例1：宿主细胞中二糖基化干扰素-β的表达和获得
通过使用基于Hyclone的optiCHO SFM的培养基以5L规模培养包含相应的二糖基化干扰素-β基因的生产型CHO细胞系，培养液表达干扰素-β。
将培养液在34.0℃的初始温度，pH 7.0和50％溶解氧下缓慢搅拌培养，培养9天，然后将从培养箱回收的培养液在4500rpm和4℃的条件离心30分钟。离心后，将上清液无菌下进行0.22μm过滤，并进行纯化。
实施例2：二糖基化干扰素-β的纯化
将实施例1中获得的干扰素-β加入到使用亲和层析的纯化工艺中。
首先，将收集的干扰素-β级分结合到Blue sepharose 6fast flow(GE)柱上，该柱用10mM磷酸钠、137mM NaCl、2.7mM KCl，pH 7.4的溶液预平衡，并用700mM硫氰酸钠溶液充分洗涤。然后，用20mM磷酸钠、1.4M NaCl、35％丙二醇，250mM L-精氨酸，pH 7.4的溶液洗脱干扰素-β级分，收集。
HPLC分析结果显示，纯度为94％至96％，且残留HCP检测结果为含量为6300ppm至9500ppm，第一次纯化完成。
在第二步中，加入pH 3.5的磷酸(99％，用蒸馏水稀释10倍)以调节pH至3.0。然后，将磷酸在22℃处理1小时，然后用2M Trizma碱中和以取样。
在第三步中，将级分结合到丁基琼脂糖(Butyl 4fast flow；GE)柱上，该柱用20mMTris、1.4M NaCl、300mM Arg，pH 7.4的溶液预平衡，然后用20mM Tris，pH 8.0的溶液洗脱以收集。
在第四步中，将获得的洗脱级分使用20mM Tris，pH 8.0的溶液进行阴离子交换层析，其填充有Capto Q ImpRes(GE)树脂。用于洗脱溶剂的溶液使用20mM Tris、140mM NaCl，pH 8.0。
在最后一步中，将之前在阴离子交换树脂中洗脱的级分加入到SP sepharosefast flow(GE)柱(其用50mM乙酸钠，pH 5.0平衡)中，通过150mM至500mM的盐浓度差进行阳离子交换层析。
结果，最终，以32％的产率获得的干扰素-β物质展示出95％或更高的纯度，HCP记录为100ppm(其为参考值)或更低，并且IEF和SDS-PAGE凝胶分析结果显示，最终产物无显著性差异。
对比性实施例1：根据常规纯化方法纯化干扰素-β蛋白质
将从培养物中获得的干扰素-β级分结合到Blue sepharose 6fast flow(GE)柱上，该柱用10mM磷酸钠、137mM NaCl、2.7mM KCl，pH 7.4的溶液预平衡，并用700mM硫氰酸钠溶液充分洗涤。然后，用20mM磷酸钠、1.4M NaCl、35％丙二醇，pH 7.0的溶液洗脱干扰素-β级分，收集。
将上述方法中获得的级分用20mM磷酸钠，pH 2.7的溶液稀释5倍，并加入到阳离子交换层析中，其作为使用CM sepharose fast flow(GE)树脂的第二种方法。此时使用的洗脱溶剂为50mM NaPi、0.145M NaCl、10％PG，pH 7.0。
然后，使用30％乙腈作为有机溶剂，0.1％三氟乙酸作为缓冲溶液，将洗脱的干扰素-β样品通过HPLC反相层析柱(VYDAC C4；Agilent)稀释。此时，将20mM磷酸二氢钠pH 2.9预装在洗脱样品的收集容器中，使样品同时洗脱和稀释，得到干扰素-β。
在前面的方法中，将7倍稀释的干扰素-β洗脱样品通过用于超滤和浓缩的Millipore的TFF系统(Pellicon Biomax 10；Millipore)浓缩约7倍，以便在降低容量的同时通过最有效的方法进行纯化。此时，交换溶液为20mM磷酸钠，pH 2.9，且浓缩物的浓度通常是基于尺寸排阻层析的树脂性质。
作为最后一步，使用尺寸排阻层析(Sephacryl 100HR；GE)去除不需要的物质，此时，收集25mL洗脱样品，最终获得包含干扰素-β的级分。
实施例3：纯化方法的评价
3-1.活性、产率等的评价
在产率、蛋白质修饰、失活性、含量和总活性方面对实施例2和对比性实施例1的纯化方法进行了评价。
蛋白质定量使用UV测量方法。通过加入0.5M NaOH和尺寸排阻层析洗脱溶剂1：1进行调零，将尺寸排阻层析所得产物和0.5M NaOH以1：1混合并在UV波长290nm下测量。测量基于三次，并通过以下方程式进行数字化。
－(3次测量值的平均值÷消光系数)×稀释倍率(mg/mL)
产率基于通过蓝色琼脂糖的洗脱液(100％)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)使用对干扰素-β具有特异性的一抗测量其相对含量，此时使用的ELISA如下。将酶缀合抗体溶液按照浓度分装到测量板中之后，将标准溶液和待测量的测试溶液分两次添加至至少8个稀释浓度。然后，在反应一定时间后进行洗涤处理，然后加入可引起显色反应的底物溶液以引发反应。反应停止后，在450nm下测量吸光度。
蛋白质修饰通过使用HPLC设备进行肽作图来测量。使用层析系统和测量仪上样分析样品，并且相对于在214nm的波长下测量的值确认对应于保留值和积分值的蛋白质结构和氨基酸变性。
失活性通过如下细胞病变效应(CPE)测定进行测量。如下制备用于测量失活性的标准物质：将National Institute for Biological Standads and Control(NIBSC)购买的干扰素-β在MEM培养基中混合，制备适当的活性标准储备溶液(2000IU/mL)，然后通过将STD活性(IU/mL)从200IU/mL连续稀释至0.390625IU/mL来制备。
使用MEM培养基稀释各纯化样品，使预期活性变为50IU/mL(体积为1500μl或更高)，并从50IU/mL至0.390625IU/mL连续稀释以制备测量样品。
将测量样品和标准物质分别分装至96孔培养板中，并将A549细胞以3×104个细胞/孔加入孔中，然后在37℃和5％CO2条件孵育22小时。从板中除去培养基，并将病毒溶液(1000TCID50/ml)分装至每个孔中，并在37℃和5％CO2条件孵育22小时。从板中取出溶液，然后在室温下用结晶紫溶液染色，并用2-甲氧基乙醇漂白，然后在570nm处测量吸光度以计算失活性。
各分析项目的结果如下表所示。
表2
Figure BDA0003498171370000131
测量结果显示，在对比性实施例1的方法中，总含量为16.5mg，产率为约11％，以及Met缺失型显示为3.6％。失活性高于本发明的方法，为327MIU/mg，并且纯化的含量不仅为约16.5mg，而且总活性仅为5395MIU。
相比之下，在本发明的方法中，总含量为26.4mg，产率为约20％，Met缺失型为2.8％，以及总活性高达6520MIU。
因此，可以看出通过本发明的方法可以分离/纯化二糖基化干扰素-β，具有优异的质量和产率以及更高的活性。
3-2.杂质评价
在对比性实施例1和实施例2的纯化中，根据CHO细胞的细胞来源的蛋白质(CHO-HCP)含量、内毒素含量和IEF模式确认杂质。
从目标蛋白干扰素-β分离的CHO细胞来源的蛋白质含量使用ELISA测量。制备稀释溶液并分装至板中，将分析样品稀释至最后一半。除了稀释的样品外，将标准溶液转移并分装至分析试剂盒中所含的板上(其中将酶缀合的抗体施加至试剂盒附带的板上)，并加入可引起显色反应的底物溶液以引发反应。然后，在板中，通过测量450nm波长处的吸光度来分析标准校准曲线的CHO细胞来源的蛋白质的量。
使用鲎变形细胞溶解物(LAL)测定来测量剩余的内毒素水平。将内毒素标准样品与LAL分析专用蒸馏水充分混合，然后在试管中制备成绘制标准校准曲线的浓度用于分析。将制备的每种浓度的标准样品、零点溶液和分析样品以相同的量分装至板上。将LAL试剂充分溶解于分析专用蒸馏水中，然后均匀分装至上述制备的板中以引发反应。在反应结束后的板中，通过测量405nm波长处的吸光度来测量目标物质中存在的内毒素水平。
制备用于IEF凝胶分析的阳性和阴性缓冲液，并通过计算分析样品和标准样品彼此相同的量与IEF分析缓冲液(pH 3-10)混合，以制备用于分析的显色样品。将pH 3-10的IEG凝胶贴到显色容器上，然后将阳性缓冲液填充至显色容器中，将阴性缓冲液填充至外部空间中，并将制备的样品上样到凝胶中。将样品在准备好的显色容器中按照200V1小时和500V 30分钟的顺序进行显色，然后将完成的凝胶分离并进行考马斯染色和漂白，并通过化学发光分析仪测定蛋白质的等电点。
表3
分析项目 对比性实施例1 实施例2
CHO-HCP 65ppm 42ppm
内毒素 0.00EU/ug 0.00EU/ug
IEF结果(图1) 确认碱性变体 未确认的碱性变体
结果，对比性实施例1中CHO细胞的蛋白质含量为65ppm，根据本发明的方法为42ppm。尽管对比性实施例1和本发明的蛋白质含量显示为100ppm或更低(作为一般参考值)，但在本发明中，通过在阴离子交换层析之后进行阳离子交换层析证实蛋白质含量略低。
在两种情况下均不含内毒素，并且作为证实IEF结果的结果(图1)，证实了在对比性实施例1中，在约pH 7.7附近(箭头)确认了非常少量的碱性变体，而在本发明的方法中，未确认碱性变体，并且该方法是一种纯度更高的纯化方法。
工业实用性
如上所述，本发明提供的干扰素-β蛋白质的纯化方法在二糖基化干扰素-β蛋白质的纯化产率方面显著优异，在大量培养中易于制造管理和质量管理，并且可以纯化出质量优异的二糖基化干扰素-β蛋白质，其适于将其用作药物的法规，因此具有较大的工业实用性。

Claims (10)

1.一种纯化二糖基化干扰素-β蛋白质的方法，其包含以下步骤：
(a)获得包含在宿主细胞中表达的干扰素-β的培养液；
(b)对步骤(a)中得到的所述培养液进行亲和层析；
(c)将步骤(b)中得到的所述溶液低pH灭活；
(d)对步骤(c)中得到的所述溶液进行疏水作用层析；
(e)对步骤(d)中得到的所述溶液进行阴离子交换层析；以及
(f)对步骤(e)中得到的所述溶液进行阳离子交换层析。
2.权利要求1所述的方法，其中所述干扰素-β蛋白质由SEQ ID NO:1的肽序列组成。
3.权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
4.权利要求1所述的方法，其中使用蓝色琼脂糖作为树脂进行所述亲和层析。
5.权利要求1所述的方法，其中使用丁基琼脂糖作为树脂进行所述疏水作用层析。
6.权利要求1所述的方法，其中使用Q树脂作为树脂进行所述阴离子交换层析。
7.权利要求1所述的方法，其中使用SP琼脂糖作为树脂进行所述阳离子交换层析。
8.一种通过权利要求1所述的纯化方法获得的二糖基化干扰素-β蛋白质。
9.权利要求8所述的二糖基化干扰素-β蛋白质，其中所述干扰素-β蛋白质具有SEQ IDNO:1的碱基序列并且在氨基酸第25位和80位具有糖链。
10.权利要求8所述的二糖基化干扰素-β蛋白质，其中所述干扰素-β蛋白质包括A2G2、FA2G2、FA2G2S1、FA2G2S2、FA2G2S*2、FA3G3S1、FA3G3S3、FA3G3S*3、FA4G4S1、FA4G4S3、FA4G4S4、FA4G4S*3、FA4G4S*4、FA4G4Lac1S3、FA4G4Lac1S*3、FA4G4Lac1S4、FA4G4Lac2S3和FA4G4Lac1S*3的任意两种糖链结构。
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